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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen hämatologische Kontrollzusammensetzungen
und -systeme und im Besonderen eine hämatologische Kontrollzusammensetzung
und ein hämatologisches
Kontrollsystem, das zur Messung einer Vielzahl von Parametern in
einer Blutprobe mit einem automatisierten Multiparameter-Hämatologie-Instrument
verwendet wird.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Hämatologische
Kontrollen für
verschiedene automatisierte Instrumente, die beispielsweise rote
und weiße
Blutkörperchen-Zählungen
und Blutplättchen-Zählungen
aufnehmen, sind im Fachgebiet bekannt und werden in den folgenden
US-Patentschriften Nrn. 3,558,522 ;
3,873,467 ;
4,179,398 ;
4,219,440 ;
4,299,726 ;
4,324,687 ;
4,358,394 ; und
4,436,821 beschrieben. Derzeit macht
eine Blutanalyse die Verwendung von einem oder mehreren verschiedenen
Einzelinstrumenten und daraus folgend von verschiedenen Blutproben
und Blutprobenpräparaten
zur Analyse der verschiedenen Blutkomponenten erforderlich. Einige
hämatologische Instrumente
verfügen
nun allerdings über
die Möglichkeit,
verschiedene Blutparameter zu messen, ohne das Erfordernis getrennter
Probenpräparation
für jeden
Parameter, der gerade getestet wird. Solche Instrumente umfassen
das Beckman Coulter STKS- oder Gen-S-System, Abbott Cell-Dyn 4000 Hematology
System, Bayer ADVIA 120 und das Sysmex XE2100 System. Diese verbesserten
automatisierten Instrumente können
eines oder mehrere der Folgenden messen: 1) Retikulozyten, 2) rote
Blutkörperchen,
3) nukleierte rote Blutkörperchen,
4) Plättchen,
5) retikulierte Plättchen,
6) weiße
Blutkörperchen,
einschließlich
Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile, Basophile, und
7) weiße
Blutkörperchen
mit sämtlichen
Phänotypen.
Somit wäre
es wünschenswert,
eine hämatologische
Kontrollzusammensetzung bereitzustellen, die als Kontrolle in Verbindung
mit diesen Instrumenten verwendet werden könnte.
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Bei
der bevorzugten Ausführungsform
umfasst eine hämatologische
Kontrollzusammensetzung zur Verwendung mit einem automatisierten
Multiparameter-Hämatologie-Instrument
eine flüssige
Suspension von teilchenförmigen
Substanzen, die messbare Merkmale wie Vollblut aufweist. Die Kontrollzusammensetzung umfasst
eine oder mehrere Blutkörperchen
(d.h. Zellen, die gehandhabt oder behandelt werden, um eine solche
Komponente nachzustellen, wie sie im Vollblut vorkommt) oder ihre Analoga
(insgesamt als Blutzellkomponenten bezeichnet), die fixiert, stabilisiert
oder durch andere Behandlung vor der Endsuspension präpariert sein
können
oder nicht. Bei verschiedenen Ausführungsformen können die
Blutzellenkomponenten aus einer Quelle stammen, die die Größe, Form
oder andere messbare Merkmale von menschlichem, tierischem oder anderem
Vollblut aufweist. Beispielsweise enthalten die
US-Patentschriften
Nrn. 4,198,206 ;
4,436,821 ;
5,008,021 ;
5,262,327 ;
5,270,208 ;
5,432,089 ;
5,460,797 ;
5,672,474 ;
5,677,145 ;
5,731,205 ;
5,811,099 und
5,981,282 jeweils Beispiele für diese
Typen von Blutzellenkomponenten. Die Kontrolle besitzt eine oder
mehrere Blutkomponenten, die den entsprechenden Komponenten in Vollblut
gleichen, bei Messung durch das automatisierte Multiparameter-Hämatologie-Instrument. Bei einer
solchen Messung würde
die Kontrollzusammensetzung die Kalibrierung, den Betrieb und die
Akkumulation von Qualitätssicherungsdaten
für das
automatisierte Multiparameter-Hämatologie-Instrument
unterstützen.
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Ebenfalls
von potentiellem Interesse können
die
US-Patentschrift Nr. 5,888,790 und "Improved Isolation
of Normal Human Reticulocytes via Exploitation of Chloride-Dependent Potassium
Transport", Sorette
et al., Blood, Bd. 80, Nr. 1 (1. Juli) 1992; Ss. 249-254 sein.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
wird eine hämatologische
Kontrolle und ein System zur hämatologischen
Multiparametermessung bereitgestellt. Die hämatologische Kontrolle stellt
die Werte für
die verschiedenen Blutbestandteile bereit, die das Multiparameter-Hämatologie-Instrument zu messen
vermag. Die hämatologische
Kontrollzusammensetzung umfasst Komponenten zur Simulation von Retikulozyten-,
weißen
Blutkörperchen-,
roten Blutkörperchen-,
Plättchen-
oder retikulierten Plättchenbestandteilen
von Vollblut.
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Verfahren
zur Herstellung und Verwendung der hämatologischen erfindungsgemäßen Kontrollzusammensetzung
werden hier ebenfalls bereitgestellt.
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Das
erfindungsgemäße System
umfasst auch ein Hämatologie-Instrument,
eine Kontrolle und kann weiterhin Ausgabe- oder Lesevorrichtungen
einschließen.
Bei einer Ausführungsform
umfasst das System weitere periphere Vorrichtungen, wie eine Vorrichtung
zur Probennachführung
und zu ihrer Zuordnung zu bestimmten Daten, wie ein Strichcodescannersystem.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
erfindungsgemäße hämatologische
Kontrollzusammensetzung umfasst Komponenten zum Simulieren von einer
oder mehreren der folgenden Bestandteile von Vollblut: Retikulozyten,
weiße
Blutkörperchen, rote
Blutkörperchen,
nukleierte rote Blutkörperchen,
Plättchen
oder retikulierte Plättchen.
Bei einer Ausführungsform
werden die Komponenten in einem isotonischen Medium, das vorzugsweise
Lipoprotein einschließt, suspendiert.
Die erfindungsgemäße hämatologische
Kontrollzusammensetzung stellt Werte für verschiedene Blutbestandteile
bereit, die ein Hämatologie-Instrument,
wie ein hämatologisches
Multiparameter-Instrument, zu messen vermag. Beispiele für hämatologische
Multiparameter-Instrumente umfassen diejenigen, die im Handel unter
den Bezeichnungen Beckman Coulter STKS oder Gen-S-Systems, Abbott Cell-Dyn 4000 Hematology
System, Bayer ADVIA 120 System, Sysmex XE2100 System oder dergleichen
uneingeschränkt
erhältlich
sind.
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Die
vorliegende Diskussion umfasst mehrere Ansätze, eine erfindungsgemäße Kontrolle
vorzunehmen, wobei anerkanntermaßen eine sehr stark bevorzugte
Ausführungsform
eine Kontrolle mit Komponenten in Betracht zieht, welche die Merkmale
von Vollblut simuliert, um Anzeigen auf einem Beckman Coulter GEN-S-Instrument für rote Blutkörperchen,
die fünf
Populationen von weißen
Blutkörperchen,
Retikulozyten und Plättchen
zu erhalten. Somit wird eine Suspension bereitgestellt, die eine
Vielzahl von Teilchen einschließt, die ähnliche
Lichtstreuungs-, Leitfähigkeits-,
Impedanz-, optische (einschließlich
Fluoreszenz), photometrische oder auf anderen Eigenschaften beruhende
Reaktionen aufweisen, die durch das Instrument bei Betrieb nachgewiesen
werden, wie es für
die entsprechenden Komponenten von Vollblut der Fall wäre.
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Es
wird davon ausgegangen, dass der Begriff "Kontrollzusammensetzung", wie hier verwendet,
eine oder mehrere Blutkomponenten (d.h. Blutbestandteile sowie Analoge
davon) bedeutet, die, bei Kombination oder bei alleiniger Verwendung
in ausreichender Weise, die relevanten Merkmale von Vollblut simulieren,
die das Instrument testet. Das Folgende befasst sich mit der Herstellung
von verschiedenen konstitutiven Komponenten. Die erfindungsgemäße Kontrolle
betrachtet ein Gemisch von zwei oder mehreren Blutkomponenten und
vorzugsweise einer Retikulozyten-Komponente und einer Komponente,
die mindestens drei und vorzugsweise fünf Subpopulationen von weißen Blutkörperchen
simuliert. Die Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anderweitig
angegeben, auf das Volumen.
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Retikulozyten-Komponente
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Die
Retikulozyten-Komponente der Kontrollzusammensetzung umfasst eine
Komponente, die die relevanten Merkmale zum Nachweis von Retikulozyten
unter Verwendung eines erfindungsgemäßen hämatologischen Instruments aufweist.
Demnach kann die Kontrolle zweckmäßigerweise stabilisierte Retikulozyten (d.h.
unreife denukleierte rote Blutkörperchen,
die etwas Ribonucleinsäure
enthalten) oder ein Analoges davon enthalten. Beispielsweise kann
die Retikulozyten-Komponente unter den möglichen Ausführungsformen
echte Säuger-Retikulozyten
umfassen, die beispielsweise durch Säuger (z. B. Human)-Erythrozytenverkapselung oder
durch Isolierung aus Vollblut hergestellt werden. Die Retikulozyten-Komponente
wird auf jede beliebige geeignete Weise hergestellt. Siehe z. B.
US-Patentschrift Nr. 5,432,089 .
Alternativ ist es möglich,
geeignete Retikulozyten durch Erhalt von Blut aus einem anämischen
Tier (z. B. einem Schwein, einer Ziege, einem Kaninchen oder dergleichen)
zu erhalten.
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Bei
einer bestimmten bevorzugten Ausführungsform wird die Retikulozyten-Komponente durch
ein Verkapselungsverfahren unter Verwendung von Nichtretikulozyten-Blutkörperchen,
wie rote Blutkörperchen, aus
einem Menschen oder einer anderen Quelle hergestellt. Die roten
Blutkörperchen
werden verkapselt und stabilisiert. Zur Veranschaulichung werden
bei einer Ausführungsform
rote Blutkörperchen
mit einem relativ hohen MCV (z. B. etwa 85 bis etwa 95 fl und stärker bevorzugt
von etwa 88 bis etwa 92 fl) bereitgestellt.
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Die
Zellen werden in einem geeigneten Verdünnungsmittel (z. B. etwa 0,15
M NaCl) in einem oder in mehreren Waschschritten gewaschen. Die
Zellen werden anschließend
auf einen gewünschten
Hämatokritwert
konzentriert, z. B. größer als
etwa 50% und stärker
bevorzugt größer als
etwa 70%.
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Anschließend werden
die Zellen mit RNA verkapselt. Beispielsweise wird RNA in die roten
Blutkörperchen
durch einen geeigneten Lyseschritt, z. B. durch hypotonische Lyse,
eingekapselt. Dies kann auf vielen Wegen erfolgen, einschließlich durch
Mischen roter Blutkörperchen
mit einer RNA-Lösung
mit einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Osmolarität. Beispielsweise
kann die Lösung
eine kleinere Menge an RNA (stärker
bevorzugt etwa 1%) enthalten und besitzt einen pH zwischen etwa
7 und 8 (stärker
bevorzugt etwa 7,6). Die Lösung
wird eingestellt (z. B. mit NaCl), um eine Osmolarität von etwa
40 mOsm zu erhalten.
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Die
roten Blutkörperchen
werden mit der RNA-Lösung
in einem geeigneten Anteil, der wie gewünscht variieren kann, vermischt.
Bei einer vorliegenden bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumenverhältnis von
gepackten roten Blutkörperchen
etwa 0,8 bis etwa 1,2: etwa 1 bis etwa 2 und stärker bevorzugt beträgt es etwa
1:1,4. Vor der Lyse oder in einem frühen Stadium der Lyse werden
die roten Blutkörperchen
und die RNA-Lösung
vorinkubiert, wie durch Erwärmen
auf über
Raumtemperatur (z. B. etwa 37°C).
Die Zellen werden in dem Gemisch lysiert, und anschließend werden
die roten Blutkörperchen
wieder verschlossen. Beispielsweise werden die roten Blutkörperchen
wieder verschlossen, indem sie in eine Kochsalzlösung eingebracht und anschließend über Raumtemperatur
erhitzt werden (z. B. Zugabe von etwa 0,5 Volumina von etwa 12% NaCl-Lösung und
anschließendes
Erwärmen
oder Tempern der Zellen bei etwa 37°C für etwa 1 h).
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Das
resultierende Gemisch wird in einen Scheidetrichter gegossen und
für einen
geeigneten Zeitraum, z. B. mindestens etwa 18 h, bei Raumtemperatur
inkubieren gelassen. Anschließend
werden die Zellen vom unteren Teil des Trichters gesammelt (z. B.
von etwa 70% ab dem Boden oder niedriger). Die Zellen werden mit
einem geeigneten Verdünnungsmittel,
wie dem Verdünnungsmittel
aus Tabelle 1 oder 4, gewaschen. Gegebenenfalls werden etwa 0,5
bis etwa 5% und stärker
bevorzugt etwa 0,75% Streck Laboratories Produkt Nr. 233301, auch
als STA-Cell bekannt (von Streck Laboratories (Omaha, Nebraska)
erhältlich),
zugesetzt. Bei der vorliegenden erläuterten Ausführungsform
werden die Zellen somit auf eine Weise behandelt, die sie gegenüber einer
Nachweisfärbung
(z. B. Methylenblau) empfindlich macht.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird die Retikulozyten-Komponente (wie mit einem Aldehyd oder einem
anderen geeigneten Fixierungsmittel) in einem Lactose- oder einem anderen
geeigneten Verdünnungsmittel
fixiert. Ein gleichartiges Verdünnungsmittel
ohne das Fixierungsmittel kann ebenfalls zum Waschen eingesetzt
werden.
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Weiße
Blutkörperchen-Komponente
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Bei
der vorliegenden Ausführungsform
wird die Komponente der Kontrolle, die die Merkmale von weißen Blutkörperchen
in Vollblut simulieren soll, aus einem biologischen Material hergestellt.
Insbesondere ist das Material ein zellbiologisches Material, und
vorzugsweise umfasst das Material menschliche weiße Blutkörperchen
(wenngleich Blutkörperchen
aus einem beliebigen geeigneten Tier eingesetzt werden können). Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst die weiße Blutkörperchen-Komponente Materialien
zur Replikation der relevanten messbaren Merkmale für einige
oder alle von jedem der fünf
weißen Blutkörperchentypen,
nämlich
Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile,
und sie werden wiederum in ihren in der Technik offenbarten Konzentrationen
(siehe z. B. Tabelle 6) bereitgestellt.
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Die
weiße
Blutkörperchen-Komponente
der hämatologischen
Kontrollzusammensetzung umfasst ein Blutkörperchen (z. B. ein weißes Blutkörperchen)
oder ein Analoges davon, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus weißen Blutkörperchen für verschiedene Zelltypen, weißen Blutkörperchen
für alle
Phänotypen und
aus Gemischen davon. Die
US-Patentschriften
Nrn. 5,270,208 und
5,262,327 stellen
Beispiele für
eine geeignete weiße
Blutkörperchen-Komponente
bereit (siehe auch
US-Patentschrift Nr.
5,529,933 ). Natürlich
erkennt der Fachmann, dass die vorliegende Erfindung nicht auf weiße Blutkörperchen-Komponenten,
die nur aus weißen
Blutkörperchen
hergestellt werden, begrenzt ist. Analoge, die aus irgendeiner einer
Vielzahl von anderen Quellen hergestellt wurden, sind möglich, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf, rote Blutkörperchen
aus Vögeln,
Reptilien, Säugern,
etc.
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Die
Zellen werden gepackt bereitgestellt (z. B. 2 bis 3 Packungen pro
Flasche). Die Zellen werden mit einer Reihe von Schritten zur selektiven
Lyse von sämtlichen
unerwünschten
Blutkörperchen,
die in dem Material, wie bereitgestellt, vorhanden sind, behandelt;
zum Waschen der Zellen; und zum Fixieren oder zum anderweitigen
Stabilisieren der Zellen.
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Die
selektive Lyse kann auf jede beliebige Weise erreicht werden, beispielsweise
durch Kontaktieren der unerwünschten
Blutkörperchen
mit einem Lysemittel. Jedes beliebige geeignete Lysemittel kann
eingesetzt werden. Gepufferte Halogenide, wie Ammoniumchlorid und
Trizma-Base (z. B. etwa 7,5 g Ammoniumchlorid und 2 g Tris pro 1),
zeigen eine geeignete Klasse von Lysemitteln auf, dort, wo die unerwünschten
Zellen rote Blutkörperchen
einschließen.
Die Lyse wird durch eine Reihe von aufeinander folgenden Waschschritten
mit dem Lysemittel erreicht. Gegebenenfalls wird mit den Zellen
vor der Lyse ein Vorfixierungsschritt durchgeführt, wie durch ihr In-Kontakt-Bringen
mit einem geeigneten Fixierungsmittel, durch Erwärmen oder durch beides. Beispielsweise
werden die Zellen mit einer gepufferten antimikrobiellen Kochsalzlösung, (die
gegebenenfalls ein Verdünnungsmittel,
wie in Tabelle 4 beschrieben, enthält), zusammengebracht, die
eine geeignete Menge eines Fixierungsmittels (z. B. etwa 0,11% Formaldehyd)
einschließt.
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Die
Lyse kann in einem einzigen Schritt oder in einer Vielzahl von Schritten
(z. B. für
etwa 1 h, anschließend
für etwa
25 min) erfolgen, wobei nach jedem Schritt das Lysemittel entfernt
und frisches Mittel eingebracht wird. Nach der Lyse werden die Zellen
zur Entfernung des Lysemittels gewaschen. Jede geeignete Waschzusammensetzung
und jede Waschtechnik können
eingesetzt werden. Beispielsweise kann die zuvor genannte gepufferte
antimikrobielle Kochsalzlösung
(ohne ein Fixierungsmittel) eingesetzt werden. Unter Verwendung
dieser Lösung
werden die Zellen in mindestens einem Schritt und vorzugsweise in
zwei Schritten gewaschen, wobei die Zellen mit einer geeigneten
Geschwindigkeit (z. B. etwa 900 U/min für etwa 10 min) (z. B. etwa
200 × g)
zentrifugiert werden.
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Vor
dem Fixieren kann es bevorzugt sein, die Zellen ferner in einem
Albumin enthaltenden Verdünnungsmittel,
wie etwa 2% BSA in einem Verdünnungsmittel,
wie dasjenige von Tabelle 1, vorzubehandeln. Vorzugsweise besitzt
das Verdünnungsmittel
einen pH-Wert von etwa 8 und eine Osmolarität von etwa 175 bis etwa 300
(z. B. etwa 215). Jede geeignete Zeitdauer für die Vorbehandlung kann eingesetzt
werden, z. B. etwa 1 h, wenn sie bei etwa 6°C gehalten werden.
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Die
Zellen werden auf jede geeignete Weise fixiert, die zur Denaturierung
des Proteins auf der Zelloberfläche
ausreicht. Die Zellen können
erwärmt,
mit einem Fixierungsmittel kontaktiert werden oder beides. Der Fachmann
erkennt, dass, obwohl das bevorzugte Fixierungsmittel ein Aldehyd
ist, jedes geeignete Mittel (vorzugsweise in einer hypotonischen
Lösung),
einschließlich
beispielsweise derjenigen, die einen Aldehyd, einen Alkohol, einen
heterocyclischen Harnstoff (z. B. Diazolidinylharnstoff (bekannt
als DU), Imidazolidinylharnstoff (bekannt als IDU) oder ein Gemisch
davon) enthalten, oder ein Gemisch davon verwendet werden kann.
Unter den geeigneten Fixierungsmitteln ist ein besonders wirksames,
Alkohol enthaltendes Mittel 50 Vol.-% [1-Methyl-2-(5-methyl-3-oxazolidinyl)-ethoxy]methoxy]-methanol
(z. B. NUOSEPT 145, von HULS America, Inc.) oder ein Gemisch davon.
Bei einer vorliegenden bevorzugten Ausführungsform wird der Aldehyd
aus der Gruppe gewählt,
bestehend aus Formaldehyd, Glutaraldehyd und Gemischen davon.
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Zur
Veranschaulichung wird ein Fixiergemisch so hergestellt, dass es
etwa 10 Teile Zellen, etwa 20 Teile destilliertes Wasser, ein Mittel
zur Erhöhung
der Osmolarität durch
die Zellmembran, zur Unterstützung der
Bildung von Cluster in Streudiagrammpopulationsauslesungen oder
für beides
(z. B. etwa 5 g/l eines Zuckers, wie Sorbit), ein Mittel zur Unterstützung der
Stabilisierung der Auslesung von Monozyten (z. B. etwa 4% DU) und
ein Fixierungsmittel, wie etwa 4 Teile Formaldehyd und etwa 0,1
Teile Glutaraldehyd einschließt.
Das Fixieren wird für
einen geeigneten Zeitraum und bei einer geeigneten Temperatur durchgeführt. Unter
Verwendung dieses Fixierungsmittels wird das Fixieren etwa 2 bis
etwa 3 Tage lang bei etwa 22°C
(d.h. erwärmt
vor dem Fixieren nach der Kühlung)
durchgeführt.
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Die
fixierten Zellen werden mit einem geeigneten Spülmaterial (z. B. ein Zellstabilisator
in einem Verdünnungsmittel)
gewaschen, um das Fixierungsmittel zu entfernen. Zur Veranschaulichung
werden 2 Wäschen
während
Zentrifugation bei etwa 900 U/min für etwa 10 min (z. B. etwa 200
xg) in einer Lösung
vorgenommen, die einen Metallhalogenid-(z. B. etwa 5% NaF)-Zellstabilisator
in einem Verdünnungsmittel
(z. B. ein Verdünnungsmittel
mit der in Tabelle 2 ausgeführten
Zusammensetzung) enthält.
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Bei
einer weiteren erläuternden
Ausführungsform
werden beim Herstellen der weißen
Blutzellkomponente für
die erfindungsgemäße Kontrollzusammensetzung
die Zellen durch Standardabtrennung aus Vollblut oder aus einem
Teil des zuvor fraktionierten Vollbluts, das die gewünschte Zellpopulation
enthält,
erhalten. Die Zellen werden resuspendiert, beispielsweise in einer
Phosphat-gepufferten Lösung,
die Polyethylenglycol 20.000 (PEG), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
und Magnesiumgluconat mit 2% Rinderserumalbumin enthält. Die
Osmolarität
dieser Lösung
reicht vorzugsweise aus, um die weißen Blutkörperchen vor der Fixierung
(z. B. etwa 215 mosm) zu quellen. Anschließend können die Zellen in dieser Lösung z.
B. bei etwa 6°C
1 h gelagert werden.
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Die
Zellen werden in einem geeigneten Medium fixiert, um vorzugsweise
die Oberfläche
zu denaturieren oder um das Konservieren der Zellmorphologie anderweitig
zu erreichen. Zur Erläuterung
bei einer Ausführungsform
in einer Lösung
von destilliertem Wasser, das 5 g/l Sorbit, 7,4% Formaldehyd und
0,125% Glutaraldehyd enthält.
Natürlich
können
andere geeignete Fixierungsmittel in geeigneten Mengen verwendet
werden. Bei einer stark bevorzugten Ausführungsform werden die weißen Blutkörperchen
und die Fixierlösung
bei einer Temperatur gehalten, die zur Bereitstellung einer entsprechenden
weißen
Blutkörperchenzusammensetzung
ausreicht (z. B. zwischen etwa 4°C
und 12°C).
Das Fixierungsmittel wird den Zellen in einem geeigneten Verhältnis zugesetzt.
Beispielsweise wird bei einer Ausführungsform ein Verhältnis von
10 ml Zellsuspension zu 24 ml Fixierlösung verwendet. Das destillierte
Wasser in der Fixierlösung
quillt die weißen
Blutkörperchen weiter,
während
das Fixierungsmittel die Zellmembran stabilisiert. Die Zellen werden
somit 2 Tage bei Raumtemperatur in dem Fixierungsmittel belassen.
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Nach
der Fixierung werden die Zellen vorzugsweise gewaschen. Bei einem
Aspekt werden sie in einer Phosphat-gepufferten Lösung gewaschen.
Eine solche Lösung
enthält
Polyethylenglycol, (PEG), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),
Magnesiumgluconat und Rinderserumalbumin. Lipoproteinkonzentrat
wird in einer Menge von 150 mg/dl HDL zugesetzt, um die Zellen vor
der Verwendung zu lagern, um die Stabilität der Streudiagrammposition
zu verbessern, während
die weißen
Blutkörperchen
noch nicht den anderen Komponenten der Kontrollzusammensetzung zugesetzt
werden.
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Es
wird davon ausgegangen, dass weiße Blutkörperchen, die wie in der
US-Patentschrift Nr. 5,459,073 beschrieben
zur Durchflusscytometrie hergestellt werden, zur Phänotypisierung
eingesetzt werden können.
Durch Mischen der beiden Typen von weißen Zellen können beide
Anforderungen, d.h. weiße
Blutkörperchen
für verschiedene
Zelltypen und Phänotypen,
erfüllt
werden, da die zur Phänotypisierung
hergestellten Zellen im Allgemeinen nicht mit der Position von anderen
weißen
Blutkörperchen
auf den Histogrammen/Streudiagrammen interferieren sollten.
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In
Kontrollen für
bestimmte Instrumente müssten
weiße
Blutkörperchen
möglicherweise
verdünnt
oder konzentriert werden, beispielsweise ist für die Zell-Dyn-Instrumente eine
Verdünnung
auf eine Zellzahl von 10.000 bevorzugt.
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Rote Blutkörperchen-Komponente
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Bei
der vorliegenden Ausführungsform
wird die Komponente der Kontrolle, die die Merkmale von roten Blutkörperchen
im Vollblut simulieren soll, aus einem biokompatiblen Material hergestellt.
Insbesondere ist das Material ein zellbiologisches Material, und
vorzugsweise umfasst das Material menschliche rote Blutkörperchen
(obwohl gleichwertige Blutkörperchen
aus jedem beliebigen geeigneten Tier eingesetzt werden können).
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Die
Zellen, wie bereitgestellt, werden aus dem flüssigen Medium oder dem Überstand,
in dem sie geliefert werden, durch jede geeignete Trenntechnik abgetrennt, einschließlich, jedoch
nicht begrenzt auf, Zentrifugation, Filtration oder dergleichen.
Die Zellen werden nacheinander mit einem oder mehreren (z. B. 3)
aufeinanderfolgenden Waschschritten gewaschen, wonach überschüssiger Überstand
entfernt wird. Vorzugsweise werden die Zellen in einem Verdünnungsmittel
(z. B. wie das Verdünnungsmittel
von Tabelle 2) gewaschen und gegebenenfalls in einer oder mehreren
zusätzlichen
Komponenten, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Zellstabilisator, einem Albumin,
einem Mittel zur Verminderung der Zellhämolysewahrscheinlichkeit in
Gegenwart von Sauerstoff, und Gemischen davon, gewaschen. Bei einem
stärker
bevorzugten Aspekt werden die zusätzlichen Komponenten aus der
Gruppe ausgewählt,
bestehend aus einem Metallhalogenid-Zellstabilisator, Rinderserumalbumin
(RSA), einem Antioxidans und Gemischen davon. Bei noch einer stärker bevorzugten
Ausführungsform
ist das Verdünnungsmittel
eines, wie dasjenige aus Tabelle 4, und es enthält etwa 0,003 bis etwa 0,010
(und stärker
bevorzugt etwa 0,005%) NaF, etwa 2% RSA und etwa 0,005 bis etwa
0,020 (und stärker
bevorzugt etwa 0,010%) Sulfasalizin. Wenn gewünscht kann auch das Verdünnungsmittel
aus Tabelle 1 verwendet werden.
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Gegebenenfalls
werden je nach Endanwendung und kommerziellen Überlegungen ein oder mehrere Mittel
zur Herabsetzung der Zersetzungsgeschwindigkeit in einer geeigneten
Menge eingesetzt; beispielsweise etwa 0,25 bis etwa 2%, und stärker bevorzugt
etwa 0,75% eines Materials, das von Streck Laboratories (Omaha,
Nebraska) unter der Produktnummer 233301 oder der Bezeichnung STA-CELL
(welches Material auch zweckmäßigerweise
für eine
oder mehrere der anderen Komponenten zugesetzt werden kann) zur
Verfügung
steht. Weiterhin werden die Zellen gegebenenfalls vorzugsweise in
einer im Wesentlichen glucosefreien Umgebung hergestellt. Bei wieder
einer anderen fakultativen Ausführungsform
werden die Zellen nach dem Waschen fixiert (z. B. durch einen geeigneten
Proteindenaturierungsschritt, wie durch Glutaraldehydfixierung) und
anschließend
weiter gewaschen.
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Die
Zellen können
beliebig lange gewaschen und (in der gleichen Waschlösung oder
in einer anderen, z. B. in einer mit höherer Konzentration) beliebig
oft resuspendiert werden.
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Der
Fachmann wird erkennen, dass die roten Blutkörperchen von sämtlichem
anderen Zellmaterial freigewaschen werden können, wie durch Verwendung
eines Magnesiumgluconatverdünnungsmittels.
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Zur
weiteren Erläuterung-werden
bei einer anderen Ausführungsform
konzentrierte rote Blutkörperchen
bereitgestellt, die von dem dazugehörigen Überstand abgetrennt wurden,
und es werden konzentrierte menschliche rote Blutzellpackungen in
einer Lösung
(z. B. Phosphat-gepufferte Lösung,
die PEG (MW = 20.000) enthält)
suspendiert und über
Nacht absetzen gelassen. Der Überstand
wird anschließend
entfernt, und 0,5% NaCl mit PEG wird den gepackten roten Blutkörperchen
in einem gleichen Volumen zugesetzt und bei Raumtemperatur 4-5 h
stehen gelassen. Der Überstand
wird wieder entfernt, und die Zellen werden in der NaCl-Lösung resuspendiert
und über
Nacht bei 6°C
gelagert. Die Packungen werden weiterhin auf übermäßige Hämolyse untersucht und aus dem
Bestand genommen. Die verbleibenden Packungen werden auf der Grundlage
der MCV zu Chargen vereinigt, wobei 12-14 Packungen zur Herstellung
einer Charge zusammengefasst werden. Die Chargen werden wiederum
in der NaCl-Lösung
etwa 4-5 h bei Raumtemperatur resuspendiert. Natürlich können andere Zeiten und Temperaturen
eingesetzt werden.
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Jede
Charge wird in einer Phosphat-gepufferten Lösung, die PEG, EDTA und Magnesiumgluconat
enthält,
resuspendiert. Die Zellen werden absitzen gelassen, der Überstand
wird entfernt, und die Zellen werden in der obigen Lösung mit
niedrigeren PEG-Konzentrationen zur Aufbewahrung bis zu 90 Tagen
bei 6°C
resuspendiert.
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Ein
Verdünnungsmittel,
das zum Stabilisieren der roten Blutkörperchen auf dem Coulter STKS
wirksam ist, umfasst eine Phosphat-gepufferte Lösung, die PEG, Na2EDTA,
Magnesiumgluconat und ein Antioxidans (z. B. Sulfasalacin oder α-Tocopherol) enthält, wobei
das Antioxidans zugesetzt wird, um Hämolyse zu verhindern, wenn
das Lipoprotein der erfindungsgemäßen Kontrollzusammensetzung
zugesetzt wird. Die Endverdünnung
enthält
auch etwa 2% Rinderserumalbumin, um die Position der weißen Blutkörperchen
zu verbessern. Nachdem die Zellen in diesem Verdünnungsmittel gewaschen wurden,
wird STA-CELL von Streck Laboratories (Omaha, Nebraska) in einer
Menge von etwa 75% des Gesamtvolumens der roten Blutkörperchen
zugesetzt, um den MCV zusätzliche
Stabilität
zu verleihen.
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Gegebenenfalls
kann es bei bestimmten Anwendungen wünschenswert sein, die roten
Blutkörperchen nach
Entfernen von überschüssigen roten
Blutkörperchen
zu fixieren, wie durch langsame Zentrifugation. Beispielsweise wird
für eine
solche Ausführungsform
das Verdünnungsmittel
von Tabelle 1 eingesetzt. Die Zellen werden gewaschen und in dem
Verdünnungsmittel
auf eine geeignete Konzentration (z. B. etwa 4 × 106/mm3) resuspendiert. Vorzugsweise beträgt der pH
etwa 7, und in der Suspension befindet sich keine Glucose. Ungefähr 1:1 Anteile
der Zellen werden mit dem Verdünnungsmittel
und einer geeigneten Menge eines Fixierungsmittels (z. B. etwa 0,007%
bis etwa 0,01% Glutaraldehyd (pro Count)) für eine geeignete Zeitdauer
und bei einer geeigneten Temperatur (z. B. 22°C für etwa ein oder zwei Tage)
gemischt. Die resultierenden Zellen werden anschließend mehrmals
(z. B. etwa 3 bis etwa 8 Mal) in einem gleichen Verdünnungsmittel
(vorzugsweise bei einem pH zwischen 7 und 8) gewaschen. Die Zellen
werden bei etwa 1.500 etwa 15 min zentrifugiert. Dekantieren und
Ultrabeschallung werden, sofern benötigt, durchgeführt. Ferner
können
die Zellen weiterhin, wenn gewünscht,
durch die Zugabe einer geeigneten Menge von STA-CELL (z. B. etwa
0,75%) von Streck Laboratories, Inc. (Omaha, Nebraska) behandelt
werden.
-
Nukleierte rote Blutkörperchen-Komponente
-
Sofern
verwendet, umfasst die nukleierte rote Blutkörperchen-Komponente der erfindungsgemäßen Kontrollzusammensetzung
nukleierte rote Blutkörperchen
oder ein Analoges davon, wie aviäre
rote Blutkörperchen,
z. B. Truthahn- oder Hühner-Erythrozyten. Beispielsweise
werden Truthahn-Erythrozyten in einer Phosphatgepufferten Lösung gewaschen
und auf eine Zellzahl von etwa 1 × 106/mm3 eingestellt. Die Zellen werden mit einer
Phosphatlösung
(Volumen entsprechend dem Zellvolumen) + 0,4% Bd./Bd. Glutaraldehyd
bei Raumtemperatur 1 Tag lang fixiert und anschließend in
einem Phosphatpuffer gewaschen.
-
Die
fixierten Truthahn-Erythrozyten werden der erfindungsgemäßen Kontrollzusammensetzung
zugesetzt, um eine Zellzahl entsprechend mindestens 10% der weißen Blutkörperchenzählung zu
ergeben, um auf dem Coulter STKS oder dem Cell-Dyne 4.000, hergestellt
von Abbott Laborstories, NRBC-Indentifizierungssignale zu erzeugen.
Obwohl das vorliegende Beispiel die Verwendung von Truthahnzellen
betrachtet, können Zellen
aus anderen Zellquellen verwendet werden, wie es dem Fachmann bekannt
ist.
-
Plättchen-Komponente
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt die hämatologische Kontrollzusammensetzung
zusätzlich
eine Plättchenkomponente,
vorzugsweise eine simulierte Plättchenkomponente bereit.
Unter anderen möglichen
Typen kann die Plättchenkomponente
stabilisierte menschliche Plättchen oder
simulierte Plättchen
aus Ziegen-, Rinder- oder Schweine-Blutkörperchen einschließen. Bei
einer Ausführungsform
werden sie aus roten Blutkörperchen
hergestellt. Siehe
US-Patentschriften
Nrn. 4,160,644 und
4,198,206 ,
die ein Beispiel für
eine geeignete Plättchen-Referenzkontrolle
und Herstellungsverfahren offenbaren. Der Fachmann kennt eine Anzahl
von anderen Techniken zur Herstellung simulierter Plättchen.
-
Wie
die Plättchen
hergestellt werden, kann im Allgemeinen von der Quelle der Zellen
abhängen
(d.h. ob sie tierische Blutkörperchen
sind, die geschrumpft, gequollen oder anderweitig größen- oder
formbehandelt sind, um Plättchen
zu gleichen, oder ob sie Plättchen
aus Blut sind). Im Allgemeinen werden die Zellen gewaschen, gegebenenfalls
vorfixiert, größen- und
formbehandelt und dann fixiert oder anderweitig bezüglich Größe und Form
stabilisiert und neutralisiert.
-
Beispielsweise
wird die Plättchenkomponente
aus tierischen Blutkörperchen,
wie Ziegen-Erythrozyten, hergestellt. Die Zellen werden ein- oder
mehrmals (z. B. etwa dreimal) in einer geeigneten Pufferlösung, wie
gepufferte Kochsalzlösung
(z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), gewaschen. Die Lösung kann
eine geeignete Menge eines Chelatbildners (z. B. etwa 1% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA))
enthalten.
-
Gegebenenfalls
werden die Zellen in einer geeigneten Weise vorfixiert, um den Schritt
ihrer Größen- und
Formbehandlung zu unterstützen.
Zur Erläuterung
werden die Zellen mit einer geeigneten Vorfixierlösung (z.
B. 1:1 der ursprünglichen
Waschlösung
mit einem Fixierungsmittel (z. B. etwa 0,0085% Glutaraldehyd)) in Kontakt
gebracht. Die Menge eines solchen Fixierungsmittels kann natürlich zweckmäßigerweise
nach Bedarf eingestellt werden, um die Größeneinteilungsrate (z. B. die
Schrumpfrate) zu kontrollieren. Vorzugsweise wird die Vorfixierlösung auf
eine erhöhte
Temperatur (z. B. etwa 30°C)
erwärmt,
und das Vorfixieren wird eine ausreichende Zeit lang bei einer solchen
Temperatur (z. B. etwa 90 min) durchgeführt. Nach dem Vorfixierschritt wird
der Überstand
entfernt, wie durch Zentrifugieren, Absaugen oder durch beides.
-
In
Fällen,
in denen die Größen- und
Formbehandlung durchgeführt
werden, um die Zellen zu schrumpfen und um eine simulierte Plättchenstruktur
zu bilden, werden die Zellen vorzugsweise auf geeignete Weise (z.
B. unter Verwendung eines Lysemittels, wie Ammoniumchlorid-Tris)
lysiert. Während
des Lysierens können Zellgröße und Zellform
unter Verwendung eines geeigneten Instruments, wie das H3 von Bayer
Corporation (ein hämatologischer
Analysator mit einem laseroptischen Nachweissystem), überwacht
werden. Anschließend
werden die Zellen ein- oder mehrmals mit einem geeigneten Verdünnungsmittel
(z. B. das Verdünnungsmittel
von Tabelle 3) gewaschen.
-
Ebenso
wie die zuvor genannten Blutkörperchen
werden die simulierten Plättchen
auf jede geeignete Weise fixiert, vorzugsweise eine, die das Protein
auf der Zelloberfläche
denaturiert. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform
werden die Zellen in einer 1:1-Lösung
mit einem Verdünnungsmittel,
wie dasjenige von Tabelle 3, und etwa 0,1% Formaldehyd fixiert.
Vorzugsweise ist die Temperatur der Fixierungslösung für eine geeignete Zeitdauer
(z. B. etwa 3 Tage) erhöht
(z. B. etwa 37°C).
Anschließend
werden die Zellen mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen, um das Fixierungsmittel
zu entfernen, wobei vorzugsweise auch Maßnahmen zur Neutralisierung
von nicht umgesetztem Fixierungsmittel, welches nicht an die Zelloberfläche gebunden
hat, ergriffen werden. Zur Erläuterung,
insbesondere dort, wo das Fixierungsmittel ein Aldehyd ist, wird
eine geeignete Menge einer Glycinlösung bei der Waschlösung eingesetzt.
Ein oder mehrere zusätzliche Waschschritte
können
durchgeführt
werden, wobei nach Wunsch ein oder mehrere zusätzliche Waschlösungen eingesetzt
werden. Beispielsweise können
anschließende
Waschschritte unter Verwendung der Waschzusammensetzung von Tabelle
3, Tabelle 4 oder eines Gemisches davon durchgeführt werden.
-
Es
ist bekannt, dass die Plättchenkomponente
aus menschlichem Blut unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens
hergestellt werden kann. Beispielsweise wird menschliches Blut uneingeschränkt bevorzugt in
einem Verdünnungsmittel
mit einem Fixierungsmittel (z. B. ein Verdünnungsmittel, wie dasjenige
von Tabelle 4 mit etwa 0,10% Formaldehyd) bereitgestellt. Gegebenenfalls
werden die roten Blutkörperchen
entfernt, und die resultierenden Zellen werden mit den fixierten
Zellen vermischt. Beispielsweise werden die roten Blutkörperchen
in Mengen von etwa 400 ml pro Behälter etwa 10 min bei etwa 900
U/min) zentrifugiert.
-
Die
so bereitgestellten Zellen werden in ein Fixierungsmittel übergeführt (z.
B. etwa in Anteilen von 1:1 in ein Verdünnungsmittel, wie dasjenige
von Tabelle 3, mit einer geeigneten Menge an Fixierungsmittel (z.
B. etwa 0,075% Glutaraldehyd)). Das Fixieren erfolgt etwa 2 Tage
bei etwa 22°C.
Nach der Fixierung wird die Zentrifugation bei etwa 1.800 U/min
etwa 20 min (für
400 ml-Behälter)
durchgeführt.
Zwei getrennte Sammlungen von Zellen werden vereinigt und gewaschen
(wie in einer 1×-Verdünnung wie
derjenigen von Tabelle 1) und anschließend zentrifugiert (z. B. bei
etwa 1.800 U/min etwa 20 min). Gegebenenfalls werden die Zellen von
den restlichen roten Blutkörperchen
dekantiert. Ultrabeschallung kann, sofern gewünscht, verwendet werden, um
die Plättchenverklumpung
anzugehen. Das Dekantieren kann, sofern gewünscht, auch verwendet werden,
um zu gewährleisten,
dass Zellabfall und rote Blutkörperchen
entfernt werden.
-
Die
resultierenden Materialien werden sodann in einem Verdünnungsmittel
resuspendiert. Ein Beispiel für
ein geeignetes Verdünnungsmittel
wäre dasjenige
von Tabelle 1 ohne Glucose und mit einem pH von etwa 7.
-
Retikulierte Plättchenkomponente
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst die Kontrollzusammensetzung eine
retikulierte Plättchenkomponente.
Zur Erläuterung,
ohne Einschränkung,
würden
Ziegen-Erythrozyten mit verkapselten Nucleinsäuren ein Beispiel für eine retikulierte
Plättchenkomponente,
die für
die vorliegende Erfindung geeignet ist, darstellen. Weitere Analoge
können
ebenso verwendet werden.
-
Zur
weiteren Erläuterung
werden bei einer anderen Ausführungsform
retikulierte Plättchen
für die
erfindungsgemäße Kontrollzusammensetzung
durch Anregen einer porösen
Blutkörperchenmembran,
um den Eintritt von RNA in eine Zelle, den Austritt von Hämoglobin
oder beides zu erlauben, hergestellt. Anschließend werden die Zellen größen- oder
formbehandelt und stabilisiert. Zur Erläuterung werden Ziegen-Erythrozyten in einer
Lösung
von etwa 0,9% NaCl vorgelegt und auf 70-80% Hämatokrit (HCT) konzentriert.
Gleiche Volumina von konzentrierten roten Blutkörperchen und 4% RNA-Lösung (jeweils
20 ml) eingestellt auf 300 mosm mit einem geeigneten Salz (z. B.
KCl) werden miteinander vermischt und gegen 500 ml einer hypotonischen
Lösung, wie
eine Lösung,
die Glycerin enthält
(osm = 90-100), 90 min bei 6°C
dialysiert. Die Dialyse ist erforderlich, um die Osmolarität langsam
zu ändern,
ohne die Zellen zu beschädigen.
Die resultierende Osmolaritätsänderung in
der roten Blutkörperchenlösung erfolgt
von 300 mosm auf etwa 150 mosm. Dieser Prozess ruft in der Zellmembran
Löcher
hervor, um die RNA in der roten Blutkörperchenlösung in die roten Blutkörperchen
eindringen zu lassen.
-
Die
Osmolarität
wird durch Dialyse der roten Blutkörperchen, die RNA enthalten,
gegen eine isotonische Lösung
wieder auf Isotonie gebracht. Diese Dialyse erfolgt bei Raumtemperatur
für 30
min, und die End-Osmolarität
der Zellen beträgt
etwa 260 mosm. Dieses Verfahren verschließt die Löcher wieder, die durch die
hypotonische Dialyse hervorgerufen wurden, und schließt somit
die RNA im Inneren der Zellen ein.
-
80
ml des verschließenden
Verdünnungsmittels,
das 0,1% Nuosept 101 enthält,
werden den verkapselten roten Blutkörperchen zugesetzt, und das
Gemisch wird 3 h bei 37°C
erwärmt.
Dieser Erwärmungsschritt unterstützt die
Lyse der aus dem Verkapselungsprozess geschwächten Zellen und härtet die
Membranen der verkapselten roten Blutkörperchen.
-
Zur
Erläuterung
werden Ziegen-Erythrozyten von den anderen Bestandteilen des Ziegenvollbluts
abgetrennt. Beispielsweise werden die Zellen dreimal in PBS gewaschen,
um das Plasma und weiße
Blutkörperchen
zu entfernen. Die Konzentration wird auf 8 × 106/mm3 eingestellt und mit einem PBS-Volumen,
entsprechend demjenigen der Zellen, fixiert, die 0,224-0,320% Glutaraldehyd
enthalten, wobei die Menge an Schutz bereitgestellt wird, die benötigt wird,
um während
des Schrumpfungsschrittes die ordnungsgemäße Lyse zu ermöglichen.
Die Zellen werden bei 30°C
1 h inkubiert und bei 1.200 U/min 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird
entfernt, und das Zellvolumen wird auf 1/4 des fixierten Volumens
eingestellt.
-
Eine
Ammoniumchloridlösung
wird den Zellen zum Angleichen an das ursprüngliche Volumen der fixierten
Zellen zugesetzt. Ohne den Anspruch auf Theoriegebundenheit, ruft
die Ammoniumchloridlösung
in der Membran Löcher
hervor, um zu ermöglichen,
dass das Hämoglobin
die Zellen verlässt,
während
der Glutaraldehyd vor der völligen
Lyse schützt.
Die Zellen werden bezüglich
des Hämoglobinverlustes
auf der Grundlage der (MPV) Abnahmen auf einem Bayer H-1 überwacht.
Wenn das MPV bei 10 fl auf dem Bayer H-1 liegt, werden die Zellen
mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung verdünnt und bei 1.800 U/min 20
min zentrifugiert. Der Überstand
wird entfernt, und die Zellen werden gewaschen, um das freie Hämoglobin
zu entfernen und um die Membran um das Hämoglobin zu schrumpfen, damit
ein MPV von ungefähr
10 fl auf Impedanzinstrumenten, wie S + IV, hergestellt von Beckman
Coulter, erzeugt wird.
-
Wenn
das MPV bei 10 fl auf dem H-1 liegt, werden die Zellen mit einer
Phosphatgepufferten Lösung verdünnt und
bei 1.800 U/min 20 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, und
die Zellen werden gewaschen, um freies Hämoglobin zu entfernen und um
die Membran um das Hämoglobin
zu schrumpfen, damit ein MPV von ungefähr 10 fl auf Impedanzinstrumenten,
wie S + IV, hergestellt von Beckman Coulter, erzeugt wird.
-
Bei
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
werden die Zellen zur Verhinderung weiteren Hämoglobinverlustes und weiterer
Schrumpfung der Membran mehr als einmal beispielsweise mit 0,04%
Glutaraldehyd in einem Volumen Phosphatgepufferter Lösung, entsprechend
dem Zellvolumen bei einer Zählung
von 1 × 106/mm3, fixiert. Die
Zellen werden über
Nacht bei Raumtemperatur belassen und anschließend gewaschen. Obwohl das
vorliegende Beispiel die Verwendung von Ziegenzellen betrachtet,
können
Zellen von anderen Zellquellen eingesetzt werden, wie stabilisierte
menschliche Plättchen,
wie es dem Fachmann bekannt sein wird.
-
Suspensionsmedium
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
hämatologischen
Kontrollzusammensetzung zur Verwendung mit Multiparametersystemen,
umfassend den Schritt des Mischens von einer oder mehreren einer
Retikulozyten (Retik)-Komponente, einer weißen Blutkörperchenkomponente, einer roten Blutkörperchenkomponente,
einer nukleierten roten Blutkörperchenkomponente,
einer Plättchenkomponente und
einer retikulierten Plättchenkomponente
in einem isotonischen Suspensionsmedium.
-
Die
Komponenten der Kontrolle werden vorzugsweise in entsprechenden
Konzentrationen eines geeigneten Suspensionsmediums suspendiert,
das es erlaubt, dass die Kontrolle durch automatisierte Instrumente
durchgeführt
wird. Das Suspensionsmedium besitzt somit einen pH von etwa 6,5
bis etwa 8,5 und ist isotonisch. Beispielsweise kann das isotonische
Suspensionsmedium unter den möglichen
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung einen Puffer, ein Antioxidanz, ein Protein
oder ein Gemisch davon, z. B. Magnesiumgluconat/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)/Phosphatpuffer
mit nukleierten roten Blutkörperchen; den
gleichen Puffer mit den Zusatzstoffen HDL, Sulfasalazin und alpha-Tocopherol
oder den gleichen Puffer mit 3% Albumin einschließen.
-
Lipoprotein
-
Obgleich
das in jedem Verdünnungsmittel
vorhandende BSA die weiße
Blutkörperchenposition
auf dem Streudiagramm verbessert, wird auch Lipoprotein vorzugsweise
in einer Menge verwendet, die wirksam ist, um ein Streudiagramm
bereitzustellen, das Vollblut darstellt, einschließlich der
richtigen Positionierung der 5 Subpopulationen von weißen Blutkörperchen.
Siehe
US-Patentschriften Nrn.
5,270,208 und
5,262,327 .
Eine Lipoproteinquelle, vorzugsweise eine, die im Wesentlichen aus hoch
dichtem Lipoprotein (d.h. HDL) besteht, wird der Kontrollzusammensetzung
zu etwa 0,5 bis etwa 8,0 Vol.-% der Kontrolle und stärker bevorzugt
zu etwa 100 bis 175 mg/dl zugesetzt, und weiterhin wird der Lipoproteinquelle α-Tocopherol
zugesetzt, um Peroxide zu reduzieren, die durch Oxidation der Lipoproteine
erzeugt wurden. Ein Beispiel für
eine geeignete, im Handel erhältliche
Form von Lipoprotein ist SUPERTRATE (erhältlich von der Fa. Bayer).
-
Mischungskomponenten
-
Stammvolumina
der konstitutiven Komponenten werden in den folgenden ungefähren Konzentrationen
hergestellt:
| RBC: | 6,0 × 106/mm3 |
| WBC: | 150.000/mm3 |
| Plättchen: | 10 × 106/mm3 |
| Retikulozyten: | 50%
von 5,5 × 106/mm3 Retikulozyten-Zählung |
| NRBC: | 0,5 × 106/mm3 |
-
Zur
Herstellung der fertigen Kontrollzusammensetzung, beispielsweise
in einem 5-1-Volumen,
werden die Stammvolumina der konstitutiven Komponenten wie folgt
kombiniert:
| | ungefähre | ungefähres |
| | Zielzählung | Stammvolumen |
| RBC: | 4,5 × 106/mm3 | 3,750
ml |
| WBC: | 8,0 × 106/mm3 | 266
ml |
| Plt
(Plättchen): | 225 × 106/mm3 | 112
ml |
| Retikulozyten: | 3% | 370
ml |
| NRBC: | 0,01% | 4,5
ml |
-
Die
vereinigten Bestandteile werden durch Zugabe eines geeigneten Endverdünnungsmittels
(z. B. hergestellt gemäß der
US-Patentschrift Nr. 5,262,327 ,
hier durch Bezugnahme eingeschlossen, (vorzugsweise SUPERTRATE oder
eine gleichwertige Substanz enthaltend)) auf ein Endgesamtvolumen
von 5 l gebracht. Der Fachmann erkennt, dass es andere Mittel und
Verfahrensweisen gibt, um diese und andere Ausführungsformen der Erfindung
herzustellen. Ferner können
die Konzentrationen variiert werden, um Kontrollen mit zuvor festgelegten
abnormen Messdaten beim Testen bereitzustellen.
-
Kontrollverwendung
-
Das
Folgende erörtert
Beispiele von Verfahren zur Verwendung der Kontrollzusammensetzung,
um die Exaktheit und Reproduzierbarkeit des Betriebs eines automatisierten
Multiparameter-Hämatologie-Instruments
zu bestimmen. Beispielsweise wird ein automatisiertes Multiparameter-Hämatologie-Instrument,
wie ein Beckman Coulter STKS oder Gen-S System, das Abbott Cell-Dyn
4000 Hematology System, Bayer ADVIA 120, und das Sysmax XE2100 System
bereitgestellt, gegebenenfalls mit einem Objektträger-Präparationsmodul.
Die beanspruchte Kontrollzusammensetzung wird erhalten oder hergestellt,
die beispielsweise eine behandelte stabilisierte menschliche rote
Blutkörperchenkomponente
und eine Retikulozytenkomponente mit Qualitätskontrollwerten in einem ungefähren Bereich
beispielsweise von 1%, 2,5% bzw. 9% enthält. Sie wird vor der Verwendung
gekühlt.
Zu Beginn der Testung wird die Kontrollzusammensetzung etwa 15 min
auf Raumtemperatur aufwärmen
gelassen, per Hand gemischt und auf Resuspension des Inhalts überprüft.
-
Die
Kontrollzusammensetzung wird durch das gleiche Standardverfahren
wie die Testproben hergestellt und ausgewertet, die chargenweise
durch die Verwendung einer geeigneten Kassette mit Öffnungen
zur Aufnahme von Teströhrchen
getestet werden können.
Nach der Präparation
werden die Kontrollzusammensetzung und die Testproben durch Zählen der
Populationsanzahl eines jeden betreffenden Komponententyps mit einem
automatisierten Multiparameter-Hämatologie-Instrument,
das eine visuelle Anzeige der Messwerte ergibt, ausgewertet.
-
Für ein Coulter-System
kann das automatische Testinstrument die allgemein als VCS-Technologie (von
der Fa. Beckman Coulter auf dem Markt) bekannte Technologie einsetzen.
VCS analysiert im Allgemeinen Zellproben hinsichtlich gleichzeitiger
Volumenleitfähigkeits-
und Streumessungen. Üblicherweise
wird eine Ausgangsprobe in Kombination mit geeigneten Reagenzien
(die eine Komponente eines Testsatzes einschließen können) und physikalischem Rühren zur
Lyse und Zellmessung durch Durchflusszytometrie eingesetzt.
-
Demnach
kann die Probe durch das Coulter-Prinzip der "Gleichstrom"-Impedanz getestet werden, um das Zellvolumen
in einer isotonischen Suspension zu messen. Leitfähigkeit
kann beispielsweise durch Anlegen von Wechselstrom im Radiofrequenzbereich
angewendet werden. Die Energie kann die Zelle durch Kurzschließen der
bipolaren Lipidschicht der Zellmembran durchdringen.
-
Informationen über die
Zellen sind auch mit Lichtstreutechniken möglich, wie aus den Streucharakteristiken,
die an Zellen als Reaktion auf eine kohärente Lichtquelle, z. B. einen
Laserstrahl, nachgewiesen werden.
-
Natürlich ist
die Art und Weise der Probentestung keineswegs auf das Obige beschränkt. Wie
erwähnt können weitere
Prinzipien eingesetzt werden.
-
Die
jeweiligen Populationszählungen,
die aus der Analyse erhalten werden, werden entweder mit einem bekannten
Referenzwert für
jeden Komponententyp in der Kontrollzusammensetzung oder durch Vergleich
der Populationszählungen
für jeden
Komponententyp in der Testprobe mit den entsprechenden Werten der
Komponenten in der Kontrollzusammensetzung verglichen. Die Messwerte,
die die Messung von Komponenten in der Kontrollzusammensetzung und
in Testproben betreffen, werden gesammelt, aufgezeichnet, gespeichert,
verglichen und durch elektronische Mittel, wie ein Computer, der
mit der entsprechenden Software programmiert wurde und die entsprechende
Datenfilestruktur enthält,
ausgewertet. Tabelle
1
| Reagenzien | besonders
bevorzugte Konzentration |
| destilliertes
Wasser | 0,9
l |
| Methylparaben | 0,40
g/l |
| PEG
20.000 | 3,00
g/l |
| EDTA,
Dinatriumsalz | 7,04
g/l |
| Magnesiumgluconat | 3,92
g/l |
| Natriumphosphat,
2-basisch, | 2,68
g/l |
| wasserfrei | |
| Glucose | 6,0 g/l |
| Natriumhydroxidplätzchen | 0,8
g/l |
| Adenosin | 0,25
g/l |
| Inosin | 0,25
g/l |
| Neomycinsulfat | 0,40
g/l |
| Chloramphenicol | 0,15
g/l |
| *q.s.
auf 1 l | |
-
Konzentriertes
Rinderserumalbumin wird dem Produkt zu dem Zeitpunkt des Kombinierens
der verschiedenen Zelltypen zugesetzt, um die Proteinkonzentration
auf 3% des flüssigen
Teils des Produkts einzustellen. Tabelle
2
| Reagenzien | besonders
bevorzugte Konzentration |
| destilliertes
Wasser | 0,91 |
| Methylparaben | 0,4
g/l |
| PEG
20.000 | 3,00
g/l |
| EDTA,
Dinatriumsalz | 11,73
g/l |
| Magnesiumgluconat | 6,53
g/l |
| Natriumphosphat,
2-basisch, | |
| wasserfrei | 4,47
g/l |
| Glucose | 10
g/l |
| Natriumhydroxidplätzchen | 1,40
g/l |
| Adenosin | 0,25
g/l |
| Inosin | 0,25
g/l |
| Neomycinsulfat | 0,40
g/l |
| Natriumfluorid | 0,05
g/l |
| Chloramphenicol | 0,15
g/l |
| *q.s.
auf 1 l | |
Tabelle
3
| Reagenzien | besonders
bevorzugte Konzentration |
| destilliertes
Wasser | 0,91 |
| Methylparaben | 0,4
g/l |
| PEG
20.000 | 3,00
g/l |
| EDTA,
Dinatriumsalz | 16,75
g/l |
| Magnesiumgluconat | 9,33
g/l |
| Natriumphosphat,
2-basisch, | 6,39
g/l |
| wasserfrei | |
| Natriumhydroxidplätzchen | 2,04
g/l |
| Adenosin | 0,25
g/l |
| Inosin | 0,25
g/l |
| Neomycinsulfat | 0,40
g/l |
| Chloramphenicol | 0,15
g/l |
| *q.s.
auf 1 l | |
Tabelle
4
| Reagenzien | besonders
bevorzugte Konzentration |
| destilliertes
Wasser | 11 |
| Methylparaben | 0,40
g/l |
| PEG
20.000 | 3,00
g/l |
| EDTA,
Dinatriumsalz | 11,73
g/l |
| Magnesiumgluconat | 6,53
g/l |
| Natriumphosphat,
2-basisch, | 4,47
g/l |
| wasserfrei | |
| Glucose | 10
g/l |
| Natriumhydroxidplätzchen | 1,40
g/l |
| Adenosin | 0,25
g/l |
| Inosin | 0,25
g/l |
| Neomycinsulfat | 0,40
g/l |
| Natriumfluorid | 0,05
g/l |
| Rinderserumalbumin | 20
g/l |
| Sulfasalazin | 0,10
g/l |
| Chloramphenicol | 0,15
g/l |
-
*
Cholesterol Supertrate, das α-Tocopherol
enthält,
wird dem Produkt zu dem Zeitpunkt des Kombinierens der verschiedenen
Zelltypen zugesetzt. Cholesterol Supertrate wird zugesetzt (2 bis
3%), um die α-Tocopherol-Konzentration
auf etwa 5 mg% in dem Produkt einzustellen
-
Der
Fachmann erkennt, dass eine Anzahl der Bestandteile an Hand spezieller
Beispiele offenbart wurden, dass allerdings jedes beliebige aus
einer Anzahl von alternativen Bestandteilen in der vorgeschlagenen oder
in unterschiedlicher Konzentration zweckmäßigerweise für solche
Bestandteile ersetzt werden kann. Die folgende Tabelle 5 erläutert Beispiele
verschiedener Alternativen und umfasst auch eine kurze Abhandlung
der üblicherweise
eingesetzten Konzentrationsbereiche, bei Einsatz in den Verdünnungsmitteln
der Tabellen 1-4. Obwohl die Bestandteile unter Bezugnahme auf eine
bestimmte Funktion beschrieben sind, sollte klar sein, dass eine
solche Abhandlung ohne Ansinnen auf Theoriegebundenheit präsentiert
wird. In einigen Fällen
leistet der Bestandteil eine unterschiedliche oder eine zusätzliche
Funktion.
-
Ferner
erkennt der Fachmann, dass die Bezugnahme in Tabelle 5 auf die Funktionen,
im Zusammenhang mit den vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen,
zur Auswahl zusätzlicher
Alternativen erfolgen könnte.
Somit besteht nicht die Intention, an den Umfang eines bestimmten
erläuternden
Bestandteils oder einer bestimmten erläuternden Konzentration gebunden
zu sein, wo es offensichtlich ist, dass andere zweckmäßigerweise
zusätzlich
zu oder als Ersatz für
einen solchen Bestandteil eingesetzt werden können.
-
Gleichermaßen können, wenn
gewünscht,
Bestandteile aus dem Verdünnungsmittel
weggelassen werden. Somit kann zweckmäßigerweise eine Kombination
von einigen der Bestandteile eingesetzt werden, um bestimmte Ergebnisse
zu erzielen.
-
Vorzugsweise
umfasst das Verdünnungsmittel
ein oder mehrere Mittel, die als Tensid, Hämolyseinhibitor, Absetzhilfsmittel
für rote
Blutkörperchen,
MCV-Stabilisator, Puffer, Metabolit, Osmolaritätseinstellhilfsmittel, Mikrobizid,
Antimykotikum, Proteinquelle, Positionierhilfsmittel der weißen Blutkörperchensubpopulation, Antioxidanz,
Zellabfallverringerer, oder als ein Gemisch davon funktionieren. Tabelle 5
| Bestandteil | bevorzugte
Konzentration | Konzentrationsbereich | andere |
| Polyethylenglycol
(PEG MW 20.000) | 3,00
g/l | 1,00-10,00
g/l | PEG
8000, F68 |
| Dinatrium-EDTA | 11,75
g/l | 7,00-17,00
g/l | Tetranatrium-EDTA |
| Magnesiumgluconat | 6,50
g/l | 3,5-9,5
g/l | Lactose |
| Natriumphosphat | 4,50
g/l | 2,5-6,5
g/l | Citrat,
Borat, Trizma Base, Natriumbicarbonat |
| Glucose | 10,00
g/l | 0-10
g/l | andere
Zucker |
| Adenosin | 0,25
g/l | 0,1-1,0
g/l | Inosin |
| Neomycinsulfat | 0,40
g/l | 0,1-0,8
g/l | Streptomycin,
Kanamycin |
| Chloramphenicol | 0,15
g/l | 0,1-0,4
g/l | Piperacillin |
| Methylparaben | 0,40
g/l | 0,20-1,20
g/l | andere
Antimykotika |
| Rinderserumalbumin | 30,0
g/l | 0,0-60,0
g/l | andere
Proteinquellen |
| Chlolesterol
Supertrate | 30
ml/l | 20-50
ml/l | Triglycerid
Supertrate, Cholesterin, HDL-Supertrate,
Cholesterin (aller erhältlich über Bayer) |
| Natriumfluorid | 0,05
g/l | 0,0-0,50
g/l | andere
Halogenide |
| Sulfasalazin | 0,10
g/l | 0,0-0,50
g/l | andere
Antioxidantien |
| α-Tocopherol
(Vitamin E) | 0,05
g/l | 0,0-0,30
g/l | Ascorbinsäure, BHT, Deferoximinmesylat, Probucol,
Rutin |
Tabelle
6
| Zelle | Bereich
(ungefährer
Prozentsatz weißer
Blutkörperchen) |
| Lymphozyten | 20
bis 45% |
| Monozyten | 2
bis 10% |
| Neutrophile | 40
bis 75% |
| Eosinophile | 1
bis 6% |
| Basophile | bis
zu 1% |
-
Weitere alternative beispielhafte
Ausführungsform
-
Für die roten
Blutkörperchenkomponente
stabilisiert ein Verdünnungsmittel,
das Mg-Gluconat
und EDTA (z. B. etwa 3,92 g/l Mg Gluconat; 7,04 g/l EDTA-Dinatrium;
2,68 g/l NA2HPO4;
Glucose 6 g/l/; und Mikrobizide (pH 7,1 und Osmolarität unter
Verwendung von KCl von etwa 300)) enthält, rote Blutkörperchen
so, dass die Erythrozyten-Parameter 200 Tage lang stabil sind.
-
Die
weiße
Blutkörperchenkomponente
wird aus frischen menschlichen weißen Blutkörperchen hergestellt. Die Zellen
werden von roten Blutkörperchen
und Plättchen
unter Verwendung des obigen Verdünnungsmittels
freigewaschen. Die Zellen werden in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit
einer Osmolarität
von 280 und einem pH von 7,2 suspendiert. Eine Lösung von 20% Nuosept 145 (Huls
America) wird mit den weißen Blutkörperchen
1:1 vermischt, um eine Endkonzentration von etwa 10% (z. B. 9,11%)
zu ergeben. Das Gemisch wird auf eine Temperatur von etwa 37 bis
etwa 50°C
für 6 Tage
oder mehr gebracht. Anschließend
werden die Zellen ein- oder mehrmals (z. B. dreimal) in einem geeigneten
Verdünnungsmittel
gewaschen, z. B. einem Verdünnungsmittel
wie aus Tabelle 1, zentrifugiert (z. B. etwa 900 U/min für 10 min)
und in einem Verdünnungsmittel,
wie in Tabelle 1 (ohne Glucose und mit einem pH von etwa 7), resuspendiert.
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Die
Plättchenkomponente
wird durch Freiwaschen menschlicher Plättchen von Vollblutkomponenten durch
Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (900 U/min für 10 min)
hergestellt. Die Plättchen
werden anschließend
durch Zugabe einer niedrigen Konzentration an Glutaraldehyd stabilisiert.
Die Plättchen
werden durch 1:1 Mischen mit dem Magnesiumgluconat-Verdünnungsmittel,
das 0,075% Glutaraldehyd (Endkonzentration von 0,037% Glutaraldehyd)
enthält,
stabilisiert. Nach einer 22-°C-Inkubation werden
die Zellen wiederum in dem Verdünnungsmittel
gewaschen und sind gebrauchsfertig. Die gleiche Vorgehensweise kann
für Rinder-
oder Schweineplättchen
eingesetzt werden.
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Die
Retikulozyten werden durch Verkapseln von Hefe-RNA, wie in der
US-Patentschrift Nr. 5,432,089 beschrieben,
die durch Referenz miteingeschlossen ist, hergestellt.
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Die
weiße
Blutkörperchenkomponente
kann zusammen mit roten Blutkörperchen
zum Erreichen einer differentiellen Stabilität angesetzt werden, indem sie
20 Tage bei etwa 22°C
gehalten werden.
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Die
Endkontrolle enthält
die folgenden Zellkonzentrationen (Tabelle 7), zeigt ein Histogramm/Streudiagramm-Profil,
das ein entsprechend positioniertes fünfteiliges Differential von
weißen
Blutkörperchen
und Retikulozyten, das sich im wesentlichen Vollblut annähert und
200 Tage oder mehr stabil ist, einschließt. Diese Kontrolle stellt
solche Ergebnisse für
die Instrumente der Cell-Dyn-Serie, die Bayer H-3-Instrumente und
die Sysmex SF-Instrumente bereit.
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