DE69329274T2

DE69329274T2 - Hämatologisches Kontrollprodukt mit Leukozytenanalogen; und Methoden zu ihrer Herstellung und Anwendung

Info

Publication number: DE69329274T2
Application number: DE69329274T
Authority: DE
Inventors: N. Elliott; J. Fischer; R. Naylor; Carole Young
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1992-02-24
Filing date: 1993-02-17
Publication date: 2001-04-12
Anticipated expiration: 2013-02-18
Also published as: EP0628167A4; US5512485A; KR950700539A; CA2129832A1; JP3391451B2; DE69329274D1; EP0628167B1; ATE195810T1; EP0628167A1; AU665413B2; WO1993017330A1; NO943115L; JPH07504038A; US5320964A; BR9305952A; NO943115D0; AU3736693A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Referenz- bzw. Bezugsblutzellanaloge für Vorrichtungen, die elektronische und optische Mittel verwenden, Suspensionsmedien dafür und Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Analogen und Suspensionsmedien in einem Kontrollprodukt.
Die Qualitätskontrolle ist seit langem ein notwendiges und routinemäßiges Verfahren in der klinischen Hämatologie. Die Genauigkeit bei der Zählung von roten Blutzellen und weißen Blutzellen, einschließlich der Unterscheidung bzw. Differenzierung zwischen den Subpopulationen weißer Blutzellen, hängt teilweise von der Verwendung geeigneter Kontrollprodukte ab. Bei der gegenwärtig verfügbaren Vielzahl von Gerätetypen zur Teilchenzählung ist eine Qualitätskontrolle durch die Verwendung von Kontrollprodukten notwendig, da immer die Möglichkeit der Fehlfunktion des Instruments vorhanden ist. Das traditionelle Verfahren zur Aufrechterhaltung eines Qualitätskontrollprogramms für ein Gerät zur automatischen Teilchenzählung bestand in der Bereitstellung von frischem humanen Blut als Vollblutstandard. Dieses Frischblut ist jedoch nur für einen einzigen Tag verwendbar, weshalb haltbare Blutprodukte entwickelt wurden.
Insbesondere sind hämatologische Kontrollprodukte, die Referenzblutzellanaloge enthalten, wichtig, welche die Genauigkeit und Präzision von Blutzellzählvorrichtungen überwachen. Es wird anerkannt, daß ein Bedarf an neuen Referenzblutzellanalogen zur Aufrechterhaltung der Genauigkeit der Differenzierung weißer Blutzellen und anderer Parameter, wenn derartige Blutzellenzählvorrichtungen verwendet werden, vorliegt.
Die Kontrollprodukte sollten denjenigen aus frischem Vollblut so nahe wie möglich kommen. Es wurden Versuche unternommen, Teilchen geeigneter Größe in stabilen Suspensionen durch Verwendung von Ambrosiapflanzenpollen, Polystyrol, Latex, verschiedenen organischen Materialien und fixierten humanen roten Blutzellen bereitzustellen. Es hat sich jedoch keine dieser Suspensionen zur Verwendung als Kontrollprodukt zur Differenzierung weißer Blutzellen von mindestens vier Leukocytensubpopulationen geeignet erwiesen.
Das zur Aufrechterhaltung der Qualitätskontrolle verwendete Material, nachstehend als hämatologisches Kontrollprodukt oder Kontrollprodukt bezeichnet, kann unter spezifischen Umständen auch zur Kalibrierung hämatologischer Instrumente verwendet werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthält das Kontrollprodukt ein oder mehrere in einem flüssigen Medium suspendierte Analoge, welche, wenn sie analysiert werden, mindestens eine physikalische oder biologische Bluteigenschaft simuliert bzw. simulieren, zu deren Messung das Instrument befähigt ist. In der vorliegenden Erfindung ist ein Analoges als ein Teilchen definiert, das mindestens eine physikalische oder biologische Eigenschaft einer Zielpopulation simuliert bzw. nachahmt. Als solche sind einige automatische Geräte dazu befähigt, nur bestimmte Komponenten bzw. Bestandteile eines Kontrollprodukts zu analysieren, obwohl das Kontrollprodukt zusätzliche Parameterkomponenten aufweist, die der Analyse durch andere Geräte zugänglich sind. Bislang wurden keine Analoge oder Suspensionsmedien zur Verwendung in einem Kontrollprodukt entwickelt, um Kontrollen für mindestens vier Leukocytenuntergruppen, nämlich Lymphocyten, Monocyten, Neutrophile und Eosinophile, bereitzustellen.
Es ist ersichtlich, daß ein Kontrollprodukt auf Vergleichsbasis genau anzeigen muß, woraus eine Testprobe von Frischblut hinsichtlich der infragestehenden Stimmungen aufgebaut ist. Des weiteren ist ersichtlich, wie wichtig es ist, daß das Kontrollprodukt Frischblut simuliert, da Blutkomponenten wie rote Blutzellen langsam hämolysieren und Veränderungen der Größe und der Form innerhalb von Stunden, nach dem sie einem Blutspender bzw. -donor entnommen wurden, unterliegen können. In ähnlicher Weise erleiden weiße Blutzellen degenerative Veränderungen.
Im allgemeinen richtete sich das Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung von Analogen auf die Verwendung roter Blutzellen, die ihr ursprüngliches Volumen vor der Fixierung erhalten oder vermindert hatten. Die Schrumpfung oder Ausdehnung der Zellen durch Manipulierung ihrer osmotischen Umgebung vor der Fixierung wies Einschränkungen auf. Bisher führte die Schrumpfung oder das Schwellen nichthumaner Erythrocyten um mehr als 30% bis 50% zu einer übermäßigen Zellassoziierung oder Zellysis.
Das U.S.-Patent Nr. 3,873,467 von Hunt lehrt eine hämatologische Referenzkontrolle, umfassend eine Suspension gewaschener, stabilisierter humaner roter Blutzellen in einem nicht-proteinhaltigen bzw. nicht-proteinartigen, wässerigen Suspensionsfluid, welches das Plasma in humanem Blut ersetzt. Die Stabilität der Referenzkontrolle wird durch Konditionierung der Zellen durch das Einschließen von Materialien in das wässerige Suspensionsfluid erreicht, welche dazu neigen, bei den Zellen eine sphärische Gestalt hervorzurufen, ohne das mittlere Zellvolumen der Zellen deutlich zu verändern, sowie den Zellen eine Beständigkeit gegenüber der normalerweise auftretenden Neigung zum Abbau mit der Zeit zu verleihen. Das wässerige Suspensionsfluid erzeugt des weiteren eine Umgebung der Zellen, welche die biologische Aktivität inhibiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist in der Referenzkontrolle des weiteren eine geringe Menge fixierter humaner roter Blutzellen enthalten, welche derart verarbeitet sind, daß sie ein deutlich vergrößertes mittleres Zellvolumen aufweisen. Die fixierten Zellen sind gegenüber einer Veränderung des Zellvolumens und gegenüber der Auflösung durch die Wirkung von lysierenden Reagenzien, welche die Lysierung der stabilisierten Zellen erzeugen, beständig. Die fixierten roten Blutzellen in der Referenzkontrolle ersetzen die weiße Zellpopulation im humanen Blut.
Im U.S.-Patent Nr. 4,704,364 von Carvar et al. werden Kontrollen für Grenzwerte und weitere bzw. zusätzliche Betriebsfunktionen von elektronischen Teilchenzählern offenbart, von denen die COULTER COUNTER® Analysatoren vom Typ Modell S Plus ein typisches Beispiel sind. Es liegt jedoch nunmehr ein Bedarf nach einem Gesamtblutzell-Kontrollprodukt für elektronisch-optische Teilchenzähler vor, für welche der COULTER® VCS-Analysator ein typisches Beispiel ist. Der VCS-Analysator erlaubt die Differenzierung von mindestens vier Leukocytenpopulationen.
Jedes System zur automatisierten, differentiellen Zählung humaner Leukocyten, das mindestens vier Leukocytenpopulationen von anderen Zellen im Blut auf Grundlage des Größenbereichs, der Volumenverteilung, des Lichtstreuungsbereichs und der elektrischen Opazitäts- und Leitfähigkeitsempfindlichkeiten unterscheidet, erfordert, daß das Kontrollprodukt den Bereich, die Verteilung und die Empfindlichkeitseigenschaften der betreffenden Zellen in normalem humanem Blut getreu bzw. genau simuliert. Das Problem besteht darin, Verfahren aufzufinden, welche genau Zellen mit gegebener Größe, gegebenem Volumen und gegebenen Lichtstreuungseigenschaften in reproduzierbaren Mengen erzeugen, die ausreichen, um im gewerblich zur Verwendung in Kontrollprodukten für automatische elektronisch-optische Teilchenzählinstrumente verwendbar zu sein.
Humane Lymphocyten, Monocyten, Neutrophile, Basophile und Eosinophile weisen einen spezifischen Größenverteilungsbereich und optische Charakteristika auf, und nach der Stabilisierung (beispielsweise mit einem Fixierungsmittel wie Glutaraldehyd) kann es auftreten, daß ihre Ansprechempfindlichkeit in einem Suspensionsmedium keine korrekte Unterscheidung erlaubt. Dies würde eine Unfähigkeit zur Bewertung des geeigneten bzw. korrekten Instrumentbetriebs ergeben. Es sollten sowohl die oberen als auch unteren Größengrenzwerte jeder Leukocytensubpopulation in einem Referenzkontrollprodukt vertreten sein. Außerdem sollte das mittlere Zellvolumen jeder Leukocytensubpopulation im Kontrollprodukt dem von normalem humanen Blut nahekommen. Darüber hinaus ist es notwendig, daß das flüssige Suspensionsmedium, welches für das Kontrollprodukt verwendet wird, kein bedeutsames Schrumpfen oder Quellen der Zellen hervorruft. Des weiteren sollte die Alterung des Kontrollprodukts keine Verschlechterung der Charakteristika des Volumenverteilungshistogramms oder anderer Parameter ergeben. Ein weiteres Erfordernis für die Leukocytenanalogen im Kontrollprodukt für Multiparameterinstrumente besteht darin, daß, um gezählt und unterschieden zu werden, die Zellanalogen in einem Vollblutkontrollprodukt nicht vollständig durch das lytische Reagenz lysiert werden dürfen.
Es sind verschiedene Medien in Verbindung mit Blutzellanalogen verwendet worden.
Im U.S.-Patent Nr. 4,299,726 werden ein Mehrzweckverdünnungsmittel und ein Medium offenbart. Das Verdünnungsmittel wird verwendet, um rote Blutzellen vorzubehandeln, und besteht im wesentlichen aus Lactose, Natriumazid und einem nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel, und sein pH-Wert und seine Osmolalität sind eingestellt. Das Medium wird als Träger des Vollblutkontrollprodukts verwendet und enthält Lactose, Fungizide und Antibiotika. Es enthält auch zusätzliche Komponenten, welche Membranen roter Blutzellen verändern, einschließlich Gallensäuresalze und Cholinsäurederivate, Phenothiazinverbindungen und Salze davon, die Antihistamineigenschaften aufweisen, und 4-Amino-benzoesäureesterderivate und ihre Salze, die örtlich betäubende Eigenschaften aufweisen.
Ein Nachteil der Medien aus dem Stand der Technik besteht darin, daß, wenn sie in Verbindung mit roten Blutzellen und fixierten humanen weißen Blutzellen oder weißen Blutzellanalogen verwendet werden, das Kontrollprodukt keine Vollblutprobe in Instrumenten simuliert, die mindestens vier Leukocytensubpopulationen unterscheiden. Die spezifischen Parameter der roten und weißen Blutzellen, deren Messung erwünscht ist, bestimmen einige der notwendigen Charakteristika eines geeigneten Mediums für ein Vollblut-Referenzkontrollprodukt. Es ist erwünscht, das Volumen der roten Zellen zu kennen. Sobald diese Messung ermittelt ist und die roten Zellen gezählt worden sind, kann das "packed cell"-Volumen oder Hämatokrit berechnet werden. Daher sollte das Suspensionsmedium des Kontrollprodukts dazu befähigt sein, das Volumen roter Blutzellen in der Probe derart zu äquilibrieren und zu stabilisieren, daß deren mittleres Zellvolumen (MCV) gemessen werden kann.
Ein Kontrollprodukt sollte auch kein partikuläres Material enthalten, das möglicherweise Störungen bei niedrigen Größengrenzwerten zeigen, die denjenigen der Größe und Verteilung humaner Blutplättchen entsprechen. Gleichzeitig würde die Suspension gegebenenfalls bakteriostatische Mittel einschließen, um das Wachstum von Mikroorganismen nach der Verpackung des Kontrollprodukts zu verhindern.
Obwohl rote Blutzellen (Erythrocyten) und weiße Blutzellen (Leukocyten) nominell verschiedene Größen aufweisen, besteht eine Neigung dazu, daß ihre Größenbereiche überlappen oder mindestens unter bestimmten Gesundheitszuständen überlap pen könnten. Darüber hinaus kann auch die Opazität dieser zwei Arten von Blutzellen überlappen. Unvorteilhafterweise überlappen sich die Zellgrößen von Erythrocyten und der lymphoiden Leukocyten beträchtlich, und es ist nicht durchführbar, die einen in Gegenwart der anderen allein durch Größenunterscheidung zu zählen. Die übliche Handlungsweise schloß die Verwendung eines starken lytischen Reagenz ein, das die Erythrocyten stromatolysiert, was sie zu sehr kleinen Teilchen verkleinert oder die Solubilisierung der Membran hervorruft, um sie von der Zählung auszuschließen, und das meiste, wenn nicht das gesamte, Cytoplasma der Leukocyten enffernt, was nur mehr deren gegenüber der Lyse beständigen Kerne zur Zählung hinterläßt. Da das ursprüngliche Leukocyten-Zellvolumen in drastischer Weise beeinflußt und auf ein Minimum verringert wird, ist bei dieser älteren Form der Blutzellgrößenanalyse nur eine einzige Leukocytenpopulation erkennbar.
Das U.S.-Patent Nr. 3,741,875 von Ansley et al. beschreibt ein Verfahren zum Erhalten einer differentiellen Zählung weißer Blutzellen. Es wird ein cytologisches Fixierungsmittel, das ein Monoaldehyd wie Formaldehyd ist, zu einer Blutprobe gegeben. Es wird ein Hämolysierungsmittel nach dem Fixierungsschritt zugegeben, um hervorzurufen, daß die roten Blutzellen ihren Hämoglobingehalt in die Lösung freisetzen. Die Zugabe eines spezifischen cytochemischen Substrats, eines chromogenen, präzipitierenden Kopplungsreagenz und eines pH-Puffers ruft die Abscheidung eines unlöslichen Farbstoffs in einem spezifischen, ein immobilisiertes Enzym enthaltenden Zelltyp hervor. Die Lösung, welche die gefärbten Blutzellen enthält, wird dann durch einen photometrischen Zähler durchgeleitet. Unter Verwendung verschiedener spezifischer Substrate für verschiedene Enzyme, die in den spezifischen Arten von Zellen enthalten sind, können absolute und relative Zählungen der verschiedenen Arten von Zellen erhalten werden. Die cytologische Fixierungslösung verwendete nur ein Monoaldehyd. Es wird behauptet, daß Dialdehyde ungeeignet sind, da sie vernetzen und extrazelluläre Präzipitate erzeugen.
Das U.S.-Patent Nr. 4,485,175 von Ledis et al. betrifft ein Verfahren und ein Reagenzsystem zur differentiellen Drei-Volumen-Bestimmung der lymphocytären, mononukleären und granulocytären Leukocytenpopulation unter Verwendung quaternärer Ammoniumsalze als Lysierungsmittel und dem automatischen Blutzähler COULTER COUNTER® Modell S Plus, welches nur Gleichstrom-Feldanregung verwendet.
Das U.S.-Patent Nr. 4,751,179 von Ledis et al. beschreibt ein Reagenzsystem, das Saponin in einem Lysierungsreagenz und ein schnell wirksames Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd als Fixierungsmittel einschließt, welches in reproduzierbarer Weise auf Vollblut einwirkt, um hervorzurufen, daß die roten Blutzellen stromatolysieren, und welches die Leukocyten zur Erzeugung von Daten modifiziert, um vier getrennte Cluster bzw. Gruppen zur Detektion und Klassifizierung mit Durchflußanalyseinstrumenten zu bestimmen bzw. zu definieren. Die Gruppen stellen die vier Hauptleukocytentypen bzw. -arten, Lymphocyten, Monocyten, Neutrophile und Eosinophile, die im Blut vorliegen, dar, um so ein Verfahren der differentiellen Leukocytenanalyse bereitzustellen. Gemäß Ledis et al. zeigten bisherige Verfahren der Durchflußanalyse unter Verwendung des durch Gleichstrom gemessenen Volumens oder der Lichtstreuung unter verschiedenen Winkeln nur drei Leukocytengruppen, welche den Lymphocyten, Monocyten und Granulocyten entsprechen. Die von Ledis et al. verwendeten Parameter zur Klassifizierung der Leukocyten schließen Kombinationen von zwei oder mehreren von durch Gleichstrom gemessenes (Coulter-)Volumen, Hochfrequenz (RF)-Größe, Coulter-Opazität (RF-Größe/durch Gleichstrom gemessenes Volumen), Lichtstreuung bei verschiedenen Winkelbereichen und Fluoreszenz bei Bestrahlung mit Licht verschiedener Wellenlängen ein.
Elektronische Zähler, welche das Coulter-Prinzip, das erstmalig im U.S.-Patent Nr. 2,656,508 beschrieben wurde, bringen eine wahrheitsgetreue bzw. genaue Widerspiegelung von Teilchenzahlen zum Ausdruck. Gemäß dem Coulter-Prinzip entsteht, wenn ein in einer Elektrolytfiüssigkeit suspendiertes Teilchen mikroskopischer Größe durch ein elektrisches Feld mit kleinen Dimensionen von einer Größenordnung, die sich denjenigen eines Teilchens annähern, durchgeleitet wird, eine momentane Änderung der Impedanz bzw. des Scheinwiderstands des elektrischen Felds. Falls das elektrische Feld durch einen Gleichstrom (DC) oder niederfrequenten Strom erregt wird, ist die elektrische Änderung nahezu proportional zum Volumen des Teilchens. In gewerblichen Geräten werden die Änderungen durch geeignete Mittel nachgewiesen und verwendet, um Zähler und Analysatoren zu betreiben. Die mit derartigen Geräten zusammenhängenden Analysatoren klassifizieren und teilen die Teilchen nach ihrer Größe in Populationen ein, basierend auf dem Teilchenvolumen, und zeichnen die erhaltenen Daten auf.
Die Erfindung des Coulter-Prinzips wurde materiell bzw. sachlich im U.S.-Patent Nr. 3,502,975 von Coulter et al. unter Verwendung des Radiofrequenz (RF)-Stroms zusätzlich zur Gleichstromfelderregung erweitert, um nicht nur die Information des durch Gleichstrom gemessenen Volumens, betreffend des untersuchte Teilchen, sondern auch die von der Zusammensetzung und der Natur des das Teilchen aufbauenden Materials ausgehende Information bereitzustellen. Dieses Patent offenbart ein Gerät, daß zur Unterscheidung zwischen Teilchen identischer Größe, aber aus verschiedenem Material, befähigt ist. Durch Erzeugung des das Teilchen abtastende bzw. wahrnehmende Feld mit Hilfe sowohl einer Erregung durch einen Niederfrequenz- oder Gleichstrom (DC) als auch einen Radiofrequenz (RF)-Strom, können zwei oder mehrere zueinander in Beziehung stehende Ausgangssignale aus dem Durchtritt eines einzelnen Teilchen durch das elektrische Feld gewonnen werden. Dies beruht auf der Tatsache, daß, obwohl die Teilchen wie Blutzellen fast immer gegenüber niederfrequenten oder Gleichstromfeldern Isolatoren sind, sie dazu befähigt sind, Radiofrequenzströme vom umgebenden Elektrolyt verschieden zu übertragen oder zu schwächen bzw. abzuschirmen. Dies kann auf den Unterschieden bezüglich der Elektrizitätskonstante im Fall homogener Teilchen oder auf der sackartigen Struktur im Falle von Blutzellen, die, von einer extrem dünnen Membran umschlossen, einen Inhalt mit vom Elektrolyt verschiedenen Leitfähigkeiten aufweisen, beruhen. Während daher der gesamte Gleichstrom eine Blutzelle umgibt, tritt etwas bzw. einiges vom RF-Strom durch sie hindurch. Die Mühelosigkeit mit welcher der RF-Strom durch ein Teilchen hindurchtritt ist, in Analogie zur Lichttransmission, ein Maß für seine sogenannte "elektrische Transparenz" bzw. "elektrische Durchlässigkeit" oder einfach "Transparenz", während die Fähigkeit eines Teilchens, den RF- Strom abzuschwächen, als seine "Opazität" bezeichnet wird. In neueren Veröffentlichungen ist die "Opazität" als die RF-Impedanz, geteilt durch die Gleichstromimpedanz, definiert.
Die relative elektrische Opazität eines Teilchens wird für Klassifizierungszwecke zu einem kennzeichnenden Merkmal des Teilcheninhalts und daher seines Teilchen typs. In dem Maß, wie unterschiedliche Arten von Teilchen jeweils eine unterschiedliche Opazität besitzen, ist der Unterschied zwischen ihnen nachweisbar. Deutlich verschiedene Teilchen können jedoch eine im wesentlichen gleiche Opazität aufweisen, und derartige Teilchen können nicht wirksam in dieser Weise klassifiziert werden. Im U.S.-Patent Nr. 3,836,849 von Coulter et al. wird gelehrt, daß es möglich ist, die Opazität von Teilchenarten durch Behandlung der Teilchen selektiv zu verändern, so daß nachweisbare Unterschiede resultieren.
Der automatische Blutzellzähler COULTER COUNTER® Modell S Plus ist derart ausgestaltet, daß eine Probe Vollblut in einem isotonischen Verdünnungsmittel verdünnt, ein lysierendes Mittel zugegeben wird und kurz danach das Zählen beginnt. Daher muß ein Verdünnungsmittel-Lysis-System Kinetiken der Erythrocytenlysis bereitstellen, die ausreichend schnell sind, um eine vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen (Erythrocyten) während der Lysiszeitspanne zu bewirken. Außerdem müssen Veränderungen des Leukocytenvolumens während dem Schritt der Datenaufnahme minimal sein und sollten idealerweise für einige Minuten stabil sein.
Das COULTER-Modell VCS ist ein halbautomatisches analytisches Instrument, das Blut unter Verwendung des durch Gleichstrom gemessenen (Coulter-) Volumens, der Coulter-Opazität und der Lichtstreuung bei verschiedenen Winkelbereichen analysiert. Das COULTER-Modell VCS verwendet ein Reagenzsystem, um eine fünfteilige Differenzierung der Gesamtleukocytenzahl zu erhalten, welche eine quantitative Analyse der Lymphocyten-, Monocyten-, Neutrophilen-, Eosinophilen- und Basiphilenpopulation bereitstellt. Das Reagenzsystem schließt einen Quench ein, der nach der schwachen "Säure"-Lysis zugegeben wird, dessen Funktion es ist, die lytische Einwirkung auf die weißen Zellen stark zu vermindern. Kurz nach dem Quench beginnt das Instrument mit dem Messen der Volumen-, Opazitäts- und Lichtstreuungseigenschaften der verbleibenden weißen Blutzellen. Das Modell VCS muß Kinetiken der Erythrocytenlysierung bereitstellen, die ausreichend schnell sind, um die vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen während der Lysierungszeitspanne zu bewirken, während die Volumen-, Coulter-Opazitäts- und Lichtstreuungseigenschaften der Leukocytenzellen nicht beeinflußt werden. Die COULTER COUNTER®-Instrumente, mit denen diese Erfindung verwendet werden kann, sind das VCS, das STKS und das MAXM. Die Modelle der Typen S und S-Plus sind jedoch nicht dazu befähigt, alle Subpopulationen der Leukocytenanalogen der vorliegenden Erfindung, welche sich in einem Vollblutkontrollprodukt befinden, zu unterscheiden, sondern können lediglich eine Gesamtzahl der Leukocytenanalogen bereitstellen. Bestimmte S-Plus-Typen sind des weiteren dazu befähigt, zwei Leukocytensubpopulationen zu unterscheiden.
Neue elektronisch-optische Teilchenzählvorrichtungen machen es erforderlich, Leukocytenanaloge und Suspensionsmedien für ein stabiles Vollblutkontrollprodukt bereitzustellen, das eine Vollblutprobe besser simuliert. Obwohl die vorliegende Beschreibung hauptsächlich auf Ausführungsformen eines hämatologischen Kontrollprodukts gerichtet ist, die mit Teilchenzählern vom COULTER®-Typ verwendbar sind, ist es selbstverständlich, daß die in der vorliegenden Erfindung offenbarten Suspensionsmedien, Analogen und Kontrollprodukte und die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verwendungsverfahren eine breite Anwendung mit Teilchenzählern im allgemeinen finden. Daher schließt der Ausdruck "elektronisch-optischer Teilchenzähler" jeden Teilchenzähler ein, der zwischen Teilchen verschiedener Größe durch die Verwendung von elektronischen Diskriminatorschaltkreisen ("Grenzwerte") unterscheidet, die elektronisch auf Signale reagieren, welche die Teilchengröße, Masse, Volumen, Opazität oder Lichtstreuung anzeigen, einschließlich COULTER COUNTER -Instrumente (COULTER und COULTER COUNTER sind eingetragene Markenzeichen der Coulter Corporation).
Die derzeitige Mehrfachanalyse weißer Blutzellpopulationen erfordert Analoge spezifischer Größe und Volumeninkremente und spezifische Lichtstreuungscharakteristika zur Verwendung als Qualitätskontrolle. Daher ist es derzeit notwendig, ein Analoges für jede der Hauptleukocytenkomponenten, einschließlich mindestens der Lymphocyten, Monocyten, Neutrophilen und Eosinophilen, herzustellen, um die Grenzwerteinstellung elektronisch-optischer Teilchenzähler zu kontrollieren bzw. zu überprüfen. Ein erhöhtes Volumen korrelierte mit einer erhöhten Lichtstreuung, was die Herstellung von mindestens vier unterschiedlichen Populationen von Leukocytenanalogen aus anderen als menschlichen weißen Blutzellen erschwerte.
US-A-4,704,364 (vorstehend besprochen) offenbart eine hämatologische Referenzlösung zur Verwendung in einem automatischen Analysator. Es werden Lymphocyten, mononukleäre Zellen und Granulocyten durch fixierte rote Zellen unterschiedlicher Spezies (Menschen, Fische, Reptilien, Vögel) und bestimmter Größe simuliert. Diese Analogen werden, falls erforderlich, gequollen oder geschrumpft.
US-A-4,751,179 (ebenfalls vorstehend besprochen) offenbart ein Verfahren und Reagenzien für die differentielle Bestimmung von vier Leukocytenpopulationen im Blut. Die verwendeten Parameter schließen Kombinationen von zwei oder mehreren von durch Gleichstrom gemessenes Volumen, RF-Größe, Opazität, Lichtstreuung und Fluoreszenz ein. Diese Parameter stellen Informationen über das Volumen, die Zusammensetzung und die Natur der das Teilchen aufbauenden Materialien bereit.
US-A-4,299,726 (ebenfalls vorstehend besprochen) offenbart die Herstellung von Vollblut-Referenzkontrollen mit Langzeitstabilität. Das Blut wird mit einem Vorbehandlungsverdünnungsmittel behandelt, welches das Volumen der roten Blutzellen schnell vermindert und deren Größenverteilungsbreite stabilisiert. Es enthält das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel Pluronic F68, Gallensäurensalze und andere Verbindungen, um die Membran der roten Zellen zu verändern. Eine höhere Menge an Cholesterin vergrößert die Oberfläche der roten Blutzellen und ihre Beständigkeit gegenüber der osmotischen Lyse.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung enthält ein hämatologisches Kontrollprodukt mindestens zwei Populationen von Leukocytenanalogen, umfassend rote Blutzellen, deren Hämoglobingehalt oder deren Volumen derart behandelt wurde, daß die Zellen gegenüber dem Abbau durch in hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt mindestens zwei unterschiedliche humane Leukocyten simuliert, wobei jede mindestens zwei physikalische Eigenschaften eines humanen Leukocyten aufweist, wobei die Eigenschaften aus
a. durch Gleichstrom gemessenes Volumen,
b. Hochfrequenz (RF)-Größe,
c. Opazität und
d. Lichtstreuung
ausgewählt sind.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein hämatologisches Kontrollprodukt Blutzellen, die derart behandelt wurden, daß sie gegenüber dem Abbau durch in hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt mindestens vier unterschiedliche Analoge enthält, die mindestens vier unterschiedliche humane Leukocyten simulieren, die jeweils mindestens zwei, wie vorstehend definierte physikalische Eigenschaften aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein hämatologisches Kontrollprodukt zur Verwendung in einem Teilchenzählinstrument. Die Erfindung stellt ein neues Kontrollprodukt bereit, umfassend ein oder mehrere Blutzellanaloge in einem flüssigen Medium, zur Verwendung in einer Vielzahl von Instrumenten, vorzugsweise Instrumente, die zwischen mindestens vier Leukocytenpopulationen unterscheiden können.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Instrument innerhalb der Spezifikation arbeitet,
a. Einbringen des Produkts der Erfindung in das Instrument,
b. Messen der physikalischen Eigenschaften des Kontrollprodukts und
c. Aufzeichnen der Ergebnisse der Messung.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von Leukocytenanalogen das Mischen einer roten Blutzelle mit einer hypoosmotischen Lösung zum Ausdehnen des Zellvolumens, Verändern des Hämoglobingehalts der Zelle, um die Lichtstreuungs- und Opazitätseigenschaften von humanen Leukocytenzellen zu simulieren und Fixieren der Zelle, so daß sie gegenüber dem Abbau durch im hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig ist. Die fixierte Zelle weist mindestens eine Lichtstreuung und ein Volumen auf, die den Eigenschaften humaner Leukocyten ähnlich sind. Das Verfahren zur Herstellung des eosinophilen Blutzellanalogen ist ähnlich, jedoch wird die Veränderung des Hämoglobingehalts durch dessen Denaturierung in der Zelle anstatt des Entfernens aus der Zelle erreicht. Diese zusätzliche Ausführungsform ergibt ein Analoges mit Volumen- und Lichtstreuungcharakteristika eines humanen Leukocyten.
Diese einzigartigen Analogen finden insbesondere als hämatologische Kontrollprodukte Anwendung, die Leukocytenanaloge umfassen, welche humane weiße Blutzellen in Instrumenten simulieren, die Lichtstreuungs-, Opazitäts- und volumetrische Messungen verwenden, um zwischen den Leukocytenpopulationen zu unterscheiden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Blutzellen aus unterschiedlichen Quellen bereit, um eine Vielzahl von Grenzwerteinstellungen in Bezug auf viele Typen von Blutzellinstrumenten abzugleichen. Bei der Auswahl der Blutzellen besteht die hauptsächliche Einschränkung im mittleren Zellvolumen der ursprünglichen Zellen, da es mit dem mittleren Zellvolumen des gewünschten Analogen in Beziehung steht. Ohne den Bereich dieses Verfahrens einzuschränken, bezieht es sich spezifisch auf rote Blutzellen bestimmter Tiere, wobei selbstverständlich rote und weiße Blutzellen anderer Tiere in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Gemäß einer Ausführungsform ermöglicht das vorliegende Verfahren die Ausdehnung der roten Blutzellen auf mehr als 50% ihres ursprünglichen Volumens, was einen breiteren Spielraum bei der Auswahl tierischer Zellen zur Herstellung der gewünschten Analoge bereitstellt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die roten Blutzellen auf mehr als 75% ihres ursprünglichen Volumens ausgedehnt.
Zum Zweck einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß sich rote Blutzellen von Geflügel, wie rote Blutzellen von Truthahn, Huhn, Ente und vorzugsweise Gans, für ein Aldehydstabilisierungsverfahren eignen, um die kleineren Lymphocytenanalogen herzustellen. Es wurde auch festgestellt, daß andere nicht-humane Wirbeltiere, einschließlich "Fische", insbesondere Mitglieder der Haifamilie, und Reptilien, vorzugsweise Alligatoren, rote Blutzellen im ge wünschten Größenbereich aufweisen, welcher bei geeigneter Behandlung ein Analoges ergibt, daß den größeren Größen der humanen Monocyten, Neutrophilen und Eosinophilen ähnlich ist. Diese Erythrocyten zeigen im allgemeinen eine hervorragende Suspensionsstabilität und sehr gute reproduzierbare Volumenverteilungscharakteristika. Es müssen jedoch Erwägungen wie die Verfügbarkeit in großer Menge bei angemessenem Preis in Betracht gezogen werden.
Diese stabilisierten Leukocytenzellanalogen stellen einen zufriedenstellenden Ersatz für humane Leukocytenzellen in einem Kontrollprodukt bereit. Darüber hinaus sind die roten Blutzellen fixiert, so daß sie gegenüber dem Abbau durch ein in den hämatologischen Testverfahren verwendetes lytisches Reagenz beständig sind, wenn die weißen Blutzellparameter in einem Vollblut-Kontrollprodukt bestimmt werden.
Die Zellen von Vögeln, Alligatoren und Ammenhaien weisen Kerne auf. Das Vorhandensein eines Kerns ist aber für deren Verwendung als Ersatz für humane weiße Blutzellen weder wesentlich noch schädlich, wenn das Verfahren der vorliegenden Erfindung, das eine regulierte Hämolyse der roten Blutzelle erlaubt, gegeben ist. Es werden vorzugsweise zwischen 20 Gew.-% bis 80 Gew.-% und am meisten bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% des Hämoglobins in der Zelle freigesetzt. Die Zellen werden weiter mit einem Fixierungsmittel wie einem organischen Aldehyd, der das Zerreißen der Zellmembran und einen weiteren Verlust von Hämoglobin verhindert, stabilisiert.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die durch Mischen einer Suspension fixierter roter Gänseblutzellen zum Simulieren von humanen Lymphocyten, fixierter roter Alligatorblutzellen zum Simulieren von humanen Monocyten, Neutrophilen und Eosinophilen hergestellt wird, die alle in einem Suspensionsmedium und in derartigen Verhältnissen zusammengefügt sind, um eine einzige Zusammensetzung zum Simulieren von humanen weißen Blutzellen bereitzustellen. Diese Zusammensetzung von Leukocytenanalogen wird dann mit lysierbaren humanen roten Blutzellen und stabilisierten Blutplättchen oder Blutplättchenanalogen vermischt, um ein einziges Kontrollprodukt zur Mehrfachanalyse bereitzustellen.
Im Sammelschritt werden die roten Blutzellen in einem Antikoagulationsmittel wie einem Alkalimetallsalz der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gelöst in einer physiologischen Salzlösung (Natriumchlorid), suspendiert. Andere Antikoagulationsmittel und Salze können auch verwendet werden, solange sie keine unverhältnismäßige Hämolyse oder Zellassoziierung hervorrufen.
Frische rote Blutzellen müssen gewaschen werden, um donorspezifische Plasmaproteine zu entfernen. Dies vermindert die Wahrscheinlichkeit der Zellagglutinierung wenn rote Zellen von mehreren verschiedenen Blutzelldonatoren bzw. -spendern vermischt werden. Die Zellen werden gesammelt, um eine homogene Zusammensetzung zu erhalten.
Der Zellpool kann mit einer Serumsubstanz als Verarbeitungshilfsmittel vorbehandelt werden. Die Vorbehandlung mit der Serumsubstanz erlaubt das Quellen der Zelle, ohne das Reißen der Zelle hervorzurufen. Die Erythrocyten einer hypoosmotischen Umgebung auszusetzen, hat die hauptsächliche Wirkung der Erhöhung des mittleren Erythrocytenvolumens und die Verminderung der Breite des Lichtstreuungshistogramms. Die Größe der Blutzellen wird als Ergebnis der hypoosmotischen Umgebung, welche eine Konzentration des Gelösten aufweist, die gegenüber der Konzentration des Gelösten der Zellen vermindert ist, erhöht. Wenn die Konzentration des Gelösten innerhalb der Zelle größer ist als die Konzentration außerhalb der Zelle, besteht eine Neigung des Wassers, sich in die Zelle zu bewegen, um die Konzentration auszugleichen. Die Bewegung des Wassers in die Zelle als solches ruft ein Quellen hervor. Die hypoosmotische Umgebung kann eine Lösung von Natriumverbindungen, Kaliumverbindungen oder sowohl Natrium als auch Kalium oder andere Zusammensetzungen einschließen, die einem Fachmann bekannt sind, um die gewünschte Konzentration des Gelösten bereitzustellen.
Die Serumsubstanz umfaßt eine wässerige Lösung von Serumlipiden. Wie es in der vorliegenden Erfindung definiert ist, umfassen die Serumlipide Cholesterin, Cholesterinester und Cholesterin, das mit einer oder mehrerer Verbindungen, die sich im Serumplasma befinden, verbunden hat, und Gemische davon. Vorzugsweise umfassen derartige andere Verbindungen Lipoproteine und Phospholipide, und Gemische davon. Es ist einem Fachmann bekannt, daß Cholesterin typischerweise ungefähr 30% Ester enthält. Es ist einem Fachmann weiter bekannt, daß das Lipoprotein erforderlich ist, um das Cholesterin in einer wässerigen Lösung zu halten. Vorzugsweise ist die Serumsubstanz in der Vorbehandlung ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Cholesterin, Cholesterinester, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinester, Cholesterin, kombiniert mit Phospholipiden, und Gemische davon. Am meisten bevorzugt umfaßt die Serumsubstanz Cholesterin in Kombination mit Phospholipiden. Ein geeignetes, im Handel erhältliches Beispiel einer derartigen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist Pentex® Cholesterin Super-Trate von Miles, Inc., das ein Lipoproteincholesterin hoher Dichte und Lipoproteincholesterinester in Kombination mit Phospholipiden ist. Daher ist, wenn kleinere Zellen um mehr als 30% bis 50% ihres ursprünglichen Volumens ausgedehnt werden, die Vorbehandlung notwendig. Es wird des weiteren angenommen, daß die Konzentration der verwendeten Serumsubstanz sowohl eine Funktion des Ausmaßes der Zellausdehnung, die durch die hypoosmotische Lösung hervorgerufen wird, als auch der Verfahrensbedingungen der Fixierungsreaktion ist, welche es dem Hämoglobin der Zelle erlaubt, aus der Zelle auszutreten. In Verfahren, welche die Zellen in weniger als ungefähr zwei Stunden hauptsächlich aufgrund der Aldehydkonzentration bei Raumtemperatur fixieren, und wobei der hypoosmotische Druck größer als ungefähr 150 Milliosmol beträgt, erscheint keine Vorbehandlung notwendig. Wenn die Vorbehandlung verwendet wird, beträgt die Konzentration des Cholesterins vorzugsweise 0,1 bis 5,0 Milligramm bei einer Zellzahl von 1 · 10&sup6; Zellen pro Mikroliter. Falls eine zu hohe Cholesterinkonzentration verwendet wird, neigen die Zellen dazu, zu lysieren. Falls eine zu geringe Cholesterinkonzentration verwendet wird, reißen die Zellen, wenn sie gequollen werden.
Versuche im Stand der Technik, die Zellen zu quellen, ohne sie zu zerreißen, haben sich auf die Verwendung eines Verarbeitungshilfsmittels wie Kaliumnatriumtatrat, das zum Verstärken der Zellmembran dient, gerichtet. Diese Vorgehensweise erlaubt jedoch weder eine Ausdehnung um mehr als die erwarteten 30 bis 50%, noch stattet es die Zellen mit einer regulierten Hämolyse aus.
Obwohl die vorliegende Erfindung mit Bezug auf das gleichzeitige Quellen und Fixieren der Zelle in einem einstufigen Verfahren offenbart wird, ist es in der vorliegenden Erfindung auch möglich, daß mehr als ein Schritt verwendet werden könnte, um die Zelle mit der Serumsubstanz zu behandeln, die Zellen zu quellen, um eine kontrollierte Freisetzung von Hämoglobin zu erlauben, und danach die Zellen zu fixieren. Von einem derartigen Verfahren wird jedoch erwartet, daß es Probleme bei der Kontrolle der Verfahrensbedingungen bei jedem Schritt und genauer bei der zeitlichen Steuerung der Fixierung der Blutzelle aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die hypoosmotische Lösung durch Kombinieren einer wässerigen Lösung von Natriumphosphat mit dem Fixierungsreagenz zum gewünschten osmotischen Druck hergestellt. Je geringer der osmotische Druck gegenüber dem normalen Spannungszustand des nativen Bluts ist, desto mehr wird die Zelle, teilweise aufgrund der Bewegung des Wassers von außerhalb der Zelle in die Zelle, quellen. Der osmotische Druck liegt vorzugsweise im Bereich von 0 bis 150 Milliosmol in Abhängigkeit von der ursprünglichen Teilgröße, der Zellzahl und der gewünschten Endzellgröße, mehr bevorzugt von 65 bis 96 Milliosmol beim Eosinophilanalogen, 0 bis 20 Milliosmol beim Monocytenanalogen, 5 bis 35 Milliosmol beim Lymphocytenanalogen und 45 bis 65 Milliosmol beim Neutrophilanalogen. Die vorstehenden bevorzugten Bereiche beziehen sich auf Blutzellen, die mit einer isotonischen Salzlösung gewaschen wurden und beziehen sich weiter auf eine Zellzahl bei der Fixierungsreaktion von ungefähr 20.000 bis 50.000 Zellen pro Mikroliter.
Gleichzeitig scheint die Temperatur nicht unabhängig die Quellrate bzw. -geschwindigkeit der Zelle zu beeinflussen, sie beeinflußt aber die Geschwindigkeit der Fixierungsreaktion. Wenn sich die Zelle ausdehnt, tritt das Hämoglobin aus der Zelle mit einer kontrollierten Geschwindigkeit aus, bis die Fixierungsreaktion die weitere Freisetzung von Hämoglobin verhindert. Die Hauptmenge des, Hämoglobins wird innerhalb der ersten fünf Minuten der hypoosmotischen Behandlung freigesetzt. So ermöglicht beim gleichzeitigen Quellen und Fixieren der Zellen die Verminderung der Temperatur bei der Fixierung in Lösung die Kontrolle der Fixierungsprozeß- und Hämoglobinfreisetzungsraten, während die Zelle quillt. Nach der Vervollständigung der Fixierungsreaktion ist die Zelle gegenüber der Auflösung oder dem Abbau unter dem Einfluß der üblichen, in hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Blutzellen zu einer gekühlten hypotonischen Lösung, die Glutaraldehyd enthält, gegeben. Die gekühlte Fixierungslösung weist eine Temperatur von 0ºC bis 15ºC, mehr bevorzugt von 1ºC bis 10ºC, auf. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Fixierungsbehandlung bei 2ºC bis 8ºC bei den Lymphocyten- und Monocytenanalogen und bei Raumtemperatur bei den Neutrophil- und Eosinophilanalogen durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß die verminderte Temperatur eine qualitativ verschiedene Zelle, wie es mit einem Größeneinteilungsgerät wie einem COULTER COUNTER® Modell VCR-Analysator gemessen wurde, bereitstellt. Ein qualitativer Unterschied schließt ein größeres mittleres Zellvolumen und eine geringere Lichtstreuung, verglichen mit der Fixierung bei Raumtemperatur, ein.
Die Fixierung der gequollenen Zellen ist wichtig, um die Zellmembranen zu verstärken und den Abbau der Membranen zu verhindern. Dies wird durch das Inkontaktbringen der Zellen mit einer Lösung eines organischen Aldehyds, der Monoaldehyde wie Formaldehyd oder Dialdehyde wie Glutaraldehyd einschließt, erreicht. Glutaraldehyd ist der bevorzugte Aldehyd, da er schneller als Formaldehyd reagiert. Glutaraldehyd kann in höheren Konzentrationen als die Endkonzentration zugegeben werden, solange die Endkonzentration im Bereich von etwa 0,05% bis 0,8% und mehr bevorzugt von 0,1% bis 0,6%, bezogen auf eine Zellzahl von ungefähr 20.000 bis 50.000 Zellen pro Mikroliter, liegt. Die praktischen Beschränkungen bei der Auswahl eines geeigneten Aldehyds und dessen Konzentration sind die funktionellen Beschränkungen der Anzahl der Zellen, die Entfernung übermäßiger Zellassoziationen und sind ein Parameter bei der Kontrolle der Fixierungsreaktion. Die Fixierungsreaktionsbedingungen sind hinsichtlich der verwendeten spezifischen Tierzelle und des hergestellten Leukocytenanalogen veränderlich.
Obwohl der Großteil der Raumtemperaturfixierung mit Glutaraldehyd innerhalb von zwei Stunden eintritt, ist bei den roten Blutzellen mehr Zeit erforderlich, um gegenüber dem üblicherweise in hämatologischen COULTER COUNTER Instrumenten verwendeten lytischen Agentien für rote Blutzellen vollständig beständig zu sein. Bei sorgfältiger Auswahl der roten Blutzellen liegt die Zeit zur Fixierung mit Glutaraldehyd zwischen 2 und 72 Stunden, vorzugsweise zwischen 3 bis 30 Stunden, in Abhängigkeit von der Temperatur, Glutaraldehydkonzentration, Anzahl der Zellen und der gewünschten Menge an freigesetztem Hämoglobin. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform liegt die Fixierungszeit für eine Zellzahl von ungefähr 20.000 bis 50.000 Zellen pro Mikroliter zwischen 10 bis 24 Stunden bei den Monocyten- und Lymphocytenanalogen und 3 bis 18 Stunden bei den Eosinophil- und Neutrophilanalogen. Eine Unterfixierung bzw. zu geringe Fixierung kann eine teilweise fixierte rote Blutzelle mit einem mittleren Zellvolumen ergeben, das geringer ist als das der humanen Leukocyten-Zielpopulation. Im allgemeinen basiert die obere Zeitgrenze der Fixierung auf der Zweckdienlichkeit bei der Herstellung. Nach der Fixierung werden die Zellen von der flüssigen Phase durch ein Mittel zur Zentrifugation oder Gravitation getrennt und werden dann mit einer phosphatgepufferten Salzlösung gewaschen.
Der pH der Fixierungslösung liegt im Bereich von 7,0 bis 9,0. Falls der pH der Fixierungslösung zu klein ist, kann eine Agglutinierung auftreten, und falls er zu hoch ist, kann die Zelle reißen. Außerdem beeinflußt der pH die Freisetzung von Hämoglobin. Falls die Fixierungsreaktion zu schnell eintritt, sind die Zellen nicht dazu befähigt, daß Hämoglobin austreten zu lassen. Daher liegt der pH-Bereich gemäß der vorliegenden Erfindung ungefähr bei 7,0 bis 9,0 und vorzugsweise bei 7,5 bis 8,5. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH der Fixierungslösung 8,0 ± 0,2 bei den Neutrophil- und Eosinophilanalogen und 7,8 ± 0,1 bei den Monocyten- und Lymphocytenanalogen.
Das Eosinophilanaloge wird in einem ähnlichen Verfahren hergestellt, außer daß sich die hypotonische Glutaraldehydlösung vorzugsweise bei Raumtemperatur befindet und die hypotonische Glutaraldehydlösung hauptsächlich dazu verwendet wird, das Hämoglobin in den Blutzellen zu vernetzen, anstatt die Zelle vollständig zu fixieren. Die Glutaraldehydkonzentration als solche für eine Zellzahl von ungefähr 20.000 bis 50.000 Zellen pro Mikroliter beträgt zwischen ungefähr 0,1 und 0,4% und mehr bevorzugt 0,2 bis 0,3%. Nach dem leichten Vernetzen des Hämoglobins und Waschen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung werden die Zellen weiter mit einem Protein-Denaturierungsreagenz wie einer quaternären Ammoniumverbindung oder einem anderen einem Fachmann bekannten Denaturierungsreagenz behandelt, um das Hämoglobin in der Zelle zu präzipitieren. Der pH der Denaturierungslösung sollte zwischen 9,0 und 12,0 und vorzugsweise zwischen 10,0 und 11,0 liegen. Diese Behandlung vermindert nicht das Volumen der Zelle. Die Behandlung mit dem Protein-Denaturierungsreagenz erhöht die Lichtstreuungscharakteristika der gequollenen Zelle, um die gequollene Zelle mit den erforderlichen, den humanen Eosinophilen ähnlichen Lichtstreuungscharakteristika auszustatten. Sowohl die Denaturierung des Hämoglobins als auch die kontrollierte Freisetzung des Hämoglobins haben die Wirkung der Veränderung der Hämoglobinzusammensetzung in der Zelle. Die Lichtstreuungseigenschaften unterscheiden sich jedoch zwischen der kontrollierten Freisetzung des Hämoglobins in den Monocyten- und Lymphocytenanalogen und der Denaturierung des Hämoglobins im Eosinophilanalogen deutlich. Im allgemeinen vermindert das Austreten von Hämoglobin aus der Zelle die Lichtstreuung und die Opazität der Zelle. Die Denaturierung des Hämoglobins in der Zelle erhöht die Lichtstreuung der Zelle.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Eosinophilanalogen umfaßt das Vorbehandeln des roten Zellpools mit einer wässerigen Serumsubstanz, Quellen der Zelle, Denaturieren des Hämoglobins in der Zelle und das Fixieren der Zelle. Ein Fachmann erkennt, daß man bei diesem Verfahren eine rote Blutzelle geeigneter Größe auswählen könnte, die nicht das Ausmaß des Quellens erfordert, welches die Vorbehandlung mit der Serumsubstanz notwendig macht. In einem derartigen Fall würde das Verfahren das Denaturieren des Hämoglobins in der Zelle, um die Lichtstreuungseigenschaften einer humanen Leukocytenzelle zu simulieren, und das Fixieren der Zelle umfassen, so daß sie gegenüber dem Abbau durch in hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagentien beständig ist. Als solche würde die behandelte rote Zelle Lichtstreuungs- und Volumeneigenschaften aufweisen, die denjenigen von humanen Leukocyten ähneln. Falls die Zelle jedoch nicht in einem gewissen Ausmaß gequollen ist, wird, da die rote Blutzelle nicht natürlicherweise kugelförmig ist, erwartet, daß die Standardabweichung der Lichtstreuung nicht innerhalb der Grenzen der Zielzellpopulation liegt. Das Hinzufügen eines Rundungsmittels bzw. eines Mittels zum Abrunden kann dieses Problem umgehen.
Durch Verwendung einer Kombination der vorstehend offenbarten Verfahrensschritte, des Quellens der Zellen, des Austretens des Hämoglobins aus der Zelle, der Denaturierung des Hämoglobins in der Zelle sowie der Schrumpfung der Zelle durch einem Fachmann bekannte Verfahren, werden Verfahren zur Ausgestaltung eines Analogen wirksam bereitgestellt, welches eine Mehrzahl unterschiedlicher physikalischer Parameter des durch Gleichstrom gemessenen Volumens, der RF-Größe, der Opazität und der Lichtstreuung aufweist. Genauer kann das Schrumpfen und das Quellen der Zelle alle der vorstehend aufgeführten Parameter beeinflussen, während die Veränderung des Hämoglobins in der Zelle die RF-Größen-, Opazitäts- und Lichtstreuungscharakteristika beeinflussen kann.
Das Referenzblutzellenkontrollprodukt kann eine oder mehrere der Leukocytenanalogen einschließen. Die Leukocytenanalogen können in irgendeinem geeigneten Suspensionsmedium gelagert werden. Beispiele derartiger Medien schließen phosphatgepufferte Salzlösung und eine wässerige Lösung einer Plasmasubstanz ein. Wie in der vorliegenden Erfindung definiert, umfaßt eine wässerige Lösung einer Plasmasubstanz eine wässerige Lösung einer Serumsubstanz (wie zuvor definiert), eine Serumsubstanz in Kombination mit einem Plasmaprotein und Gemische davon. Wie in der vorliegenden Erfindung weiter definiert, umfaßt das Plasmaprotein ein oder mehrere der im Plasma enthaltenen Proteine. Vorzugsweise umfassen derartige Plasmaproteine Albumin, Lipoproteine, Globuline, Fibrinogene und Gemische davon. Diese Medien können andere einem Fachmann bekannte Inhaltsstoffe enthalten, um eine Langzeitstabilität zu verleihen. Andere Beispiele geeigneter Medien sind genauer in den U.S.-Patenten Nr. 4,213,876, 4,299,726, 4,358,394 und 3,873,467 beschrieben.
Das folgende spezifische Beispiel ist im U.S.-Patent Nr. 4,299,726 offenbart: Stabilisierungsmedium zur Verleihung von Langzeitstabilität bei roten Blutzellen -bevorzugte Formulierung
Da viele der vorstehend aufgeführten Chemikalien im Handel unter verschiedenen Namen bekannt sind, ist der angegebene Name ein im Merck Index, 11. Auflage (1989), veröffentlicht von Merck und Co., Inc., Rahway, N. J., angegebener üblicher Name.
Vorzugsweise umfaßt das Kontrollprodukt ein oder mehrere Leukocytenanaloge in einer wässerigen Lösung einer Plasmasubstanz. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die Plasmasubstanz, wenn ein oder mehrere Leukocytenanaloge mit lysierbaren humanen roten Blutzellen kombiniert werden, um ein Referenzblutzellkontrollprodukt zur Mehrfachanalyse für Instrumente bereitzustellen, die lytische Reagenzien verwenden, aus der Gruppe, umfassend Cholesterin, Cholesterinester, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinester, Cholesterin, kombiniert mit Phospholipid, Cholesterin, kombiniert mit Albumin, Cholesterinester, kombiniert mit Albumin, Lipoproteincholesterin, kombiniert mit Phospholipiden, Lipoproteincholesterin, kombiniert mit Albumin, und Gemischen davon, ausgewählt. Am meisten bevorzugt umfaßt die Plasmasubstanz gebundenes Cholesterin. Ein geeignetes, im Handel erhältliches Beispiel der am meisten bevorzugten Plasmasubstanz ist Moducyte®, wie im U.S.-Patent Nr. 4,290,774, übertragen auf Miles, Inc., beschrieben, welches ein Lipoproteincholesterin hoher Dichte, verbunden mit Albumin, ist. Die Endkonzentration des Cholesterins im Suspensionsmedium liegt im Bereich von 400 bis 1.200 und vorzugsweise von 600 bis 1.000 mg pro Liter, in Abhängigkeit von der Zellzahl im Endkontrollprodukt.
Falls eine unzureichende Konzentration des Cholesterins in den Medien der mehr bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung verwendet wird, werden die roten Blutzellen im Referenzblutzellkontrollprodukt nicht wirksam lysiert, um die Zellmembran aufzulösen, so daß kein Rauschen und keine Trümmer vorliegen, wenn ein lytisches Saponinreagenzsystem verwendet wird, und die Leukocytenanalogen weisen ein mittleres Zellvolumen unterhalb der erforderlichen Größe aufgrund der lytischen Reaktion auf. Falls das Medium eine zu hohe Konzentration an Cholesterin enthält, lysieren die roten Blutzellen in der Referenzblutzellkontrolle in nicht wirksamer Weise, um die Zellmembran aufzulösen, so daß kein Rauschen und keine Trümmer vorliegen.
Genauer, wenn die mehr bevorzugte Ausführungsform des Kontrollprodukts in Instrumenten wie denjenigen, welche die Technologie des Coulter Modells VCS verwenden, das ein Reagenzsystem verwendet, wie es im U.S.-Patent Nr. 4,751,179 beschrieben wird, um zwischen mindestens zwei Leukocytenpopulationen, (1) Lymphoiden (Lymphocyten) und (2) Myeloiden (Neutrophile, Monocyten, Eosinophile und Basophile), ermöglicht es die wässerige Plasmasubstanz (wie zuvor definiert), daß die Reaktion zwischen dem schwächeren lytischen Reagenz und den nicht-fixierten roten Blutzellen eintritt, so daß die roten Blutzellen lysieren, während die Leukocytenanalogen im wesentlichen unbeeinflußt bleiben, was es ermöglicht, daß jeder Typ der Leukocytenanalogen gezählt wird. Wie im U.S.-Patent Nr. 4,751,179 gelehrt wird, weist das Lysierungsreagenz zwei Formen auf: (1) ein lytisches Verdünnungsmittel, das Saponin enthält, welches gleichzeitig zum Verdünnen der Vollblutprobe und zum Stromatolysieren seiner roten Blutzellen dient, oder (2) ein zweiteiliges System, daß ein nicht-lytisches Blutverdünnungsmittel, gefolgt von einem Saponin enthaltenden Reagenz, umfaßt.
Wenn Medien aus dem Stand der Technik, wie diejenigen, die im U.S.-Patent Nr. 4,213,876, 4,299,726 oder 4,358,395 beschrieben werden, in der mehr bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden, weisen die durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellten Leukocytenanaloge ein geringeres Volumen auf, als es für die Zielleukocytenpopulation erwünscht ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfaßt das im Kontrollprodukt verwendete Suspensionsmedium weiter die Zugabe eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels. Das grenzflächenaktive Mittel weist ein hohes Hydrophilie- Lipophilie-Gleichgewicht (HLB) auf. Das HLB weist typischerweise einen Wert von größer als 15 und mehr bevorzugt größer als 17 auf. Typischerweise liegt das grenzflächenaktive Mittel in einer Menge vor, die dazu wirksam ist, die lytische Wirkung gegenüber den roten Blutzellen spezifischer zu machen, ohne die Leukocytenanalogen nachteilig zu beeinflussen. Außerdem stabilisiert das grenzflächenaktive Mittel jegliches freies Cholesterin im Kontrollprodukt derart, daß es sich nicht in Lösung abtrennt. Ein Fachmann erkennt, daß die wirksame Menge des grenzflächenaktiven Mittels empirisch bestimmt werden kann, jedoch beträgt sie typischerweise weniger als 0,5 Gew.-% des Kontrollprodukts.
Geeignete nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel schließen Alkylpolyetheralkohole der allgemeinen Formel: R-X-(Y)n-H ein, wobei R eine lipophile C&sub8;-C&sub1;&sub6;- Kohlenstoffatomkette ist, wobei X -O-,
O, -COO- ist und Y CH&sub2;CH&sub2;-O- oder CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;O- ist, n ist eine ganze Zahl von 15 bis 50. Geeignete, im Handel erhältliche Beispiele dieser grenzflächenaktiven Mittel schließen Diazopan SS-837 von GAF Chemical Corp., Triton® X405 von Rohm und Haas und Pluronic F®-127 PRILL von BASF Wyandotte Corp. ein.
Ohne an eine Theorie der Erfindung gebunden zu sein, wird derzeit angenommen, daß eine Wechselwirkung zwischen roten Blutzellen, dem schwachen lytischen Reagenz (z. B. Saponin) und der Plasmasubstanz in den Suspensionsmedien vorliegt, welche hervorruft, daß die roten Blutzellen lysieren. Genauer wird derzeit angenommen, daß die Plasmasubstanz das Cholesterin der Zellmembran beeinflußt, welches weiter das Ansprechen der Leukocytenanalogen auf das lytische Reagenz beeinflußt. Darüber hinaus wird weiter angenommen, daß das grenzflächenaktive Mittel die lytische Reaktion spezifischer gegenüber den roten Blutzellen macht, jedoch die Leukocytenanalogen hinsichtlich gemessener Parameter nicht nachteilig beeinflußt. Außerdem wird weiter angenommen, daß das grenzflächenaktive Mittel auch das in der Zellmembran oder in der Plasmasubstanz befindliche Cholesterin beeinflußt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Leukocytenanalogen wird nachstehend in den Beispielen bereitgestellt. Beispiel 1 ist ein spezifisches Beispiel für bevorzugte Reagenzien und Techniken zur Behandlung von Gänsezellen, wobei die Formulierungen selbstverständlich nur der Veranschaulichung dienen. Die Beispiele 2, 3 und 4 sind spezifische Beispiele bevorzugter Reagenzien und Techniken zur Behandlung der Alligatorzellen, wobei die Formulierungen selbstverständlich nur der Veranschaulichung dienen. Beispiel 5 zeigt eine Zusammensetzung der vier Leukocytenpopulationen, wobei die Formulierung selbstverständlich nur der Veranschaulichung dient. Die beschriebenen Reagenzien und/oder Techniken können auch auf Blutzellen von anderen Tieren angewandt werden, die von Gänsen und Alligatoren verschieden sind. Es können andere Inhaltsstoffe und Verhältnisse gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden.

BEISPIEL 1

Lymphocytenanalopes aus roten Gänseblutzellen

Das Folgende ist ein spezifisches Beispiel bevorzugter Reagenzien und empfohlener spezifischer Verfahrensschritte zur Behandlung von roten Gänseblutzellen, um ein Lymphocytenanaloges normaler Größe zu erhalten. Selbstverständlich dienen die Formulierungen und die Verfahren nur der Veranschaulichung, und es können gemäß der Offenbarung der vorliegenden Erfindung andere Inhaltsstoffe, Verhältnisse und Verfahren verwendet werden.

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) Formulierung pro Liter

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,2 g
2. Dibasisches Natriumphosphat · 7 H&sub2;O: 2,0 g
3. Natriumazid: 0,1 g
4. Natriumchlorid: 9,4 g
5. mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen: pH ungefähr 7,4, Osmolalität 315 bis 345 mOsm/kg.

Hypotonische Lösung für Lymphocyten

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,2 g
2. Dibasisches Natriumphosphat · 7 H&sub2;O: 2,0 g
3. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen: pH ungefähr 7, 8, Osmolalität 15 bis 25 mOsm/kg.

Verfahren

1. Auswählen von roten Vogelblutzellen mit einem mittleren Zellvolumenbereich von etwa 140 bis 170 fl. Waschen der gepackten roten Vogelblutzellen mit der phosphatgepufferten Salzlösung (PBS).
2. Zugeben von 1,0 bis 5,0 Milligramm Cholesterin zu einer Zellzahl von 2 · 10&sup6; pro Mikroliter und Inkubieren für zwei bis sechs Stunden bei Raumtemperatur.
3. Herstellen eines Glutaraldehyd-Fixierungsreagenz mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% durch Hinzufügen eines im Handel erhältlichen 25%-Glutaraldehydprodukts zur gekühlten hypotonischen Lösung für Lymphocyten. Vorzugsweise beträgt die Temperatur 2º bis 8ºC. Die bevorzugte Konzentration des Glutaraldehyds beträgt ungefähr 0,35%.
4. Zugeben der gewaschenen roten Blutzellen zu einer abgemessenen Menge des Fixierungsmittels von Schritt 3 bei einer Verdünnung von 1 : 35. Überführen in verschlossene Behälter, die langsam für 18 bis 24 Stunden bei 2ºC bis 8ºC gerollt werden. Die Verminderung des Hämoglobingehalts ist auf ungefähr 60 Gew.-% berechnet.
5. Entfernen der Überstandsflüssigkeit, einige Male Waschen der Zellen mit PBS, dann Resuspendieren in einer geeigneten Lagerungslösung.
6. Für ein isoliertes bzw. "stand alone"-Lymphocytenanaloges, Resuspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in einem geeigneten Suspensionsmedium und Einstellen der Konzentration, um diejenige von humanen Lymphocytenzellen in normalem humanen Blut zu simulieren.
7. Für mehrfache hämatologische Parameter für ein Kontrollprodukt, Versetzen der gewaschenen und fixierten Zellen von Schritt 6 mit anderen hämatologischen Zusammensetzungen und den für das hämatologische Kontrollprodukt für Mehrfachparameter gewünschten Analogen, wobei die Zellzahl geeignet ist, um Lymphocytenverhältnissen zu entsprechen.
8. Die fixierten Zellen können mit geeigneten Stabilisatoren für eine Zeitspanne von mehr als 6 Monaten gelagert werden.
9. Gemäß dem vorstehenden Beispiel, jedoch ausgehend von anderen Arten von roten Säugerblutzellen, können vergleichbare Ergebnisse erhalten werden.

BEISPIEL 2

Monocytenzellanaloges aus roten Alligatorblutzellen

Das Folgende ist ein spezifisches Beispiel bevorzugter Reagenzien und empfohlener spezifischer Verfahrensschritte zur Behandlung von roten Alligatorblutzellen, um das Monocytenzellanaloge zu erhalten. Selbstverständlich dienen die Formulierungen und die Verfahren nur der Veranschaulichung, und es können andere Inhaltstoffe, Verhältnisse und Verfahren gemäß der Offenbarung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Hypotonische Lösung für Monocyten

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,1 g
2. Dibasisches Natriumphosphat: 1,0 g
3. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen, pH ungefähr 7, 8, Osmolalität 5 bis 16 masm/kg.
4. Waschlösung für Zellen (PBS) wie in Beispiel 1 angegeben.

Verfahren

1. Auswählen von roten Alligatorblutzellen mit einem mittleren Zellvolumenbereich von etwa 350 bis 450 fl. Waschen der gepackten roten Alligatorblutzellen mit PBS.
2. Zugeben von 1,0 bis 5,0 Milligramm Cholesterin zu einer Zellzahl von 1 · 10&sup6; pro Mikroliter und Inkubieren für 3 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur.
3. Herstellen eines Glutaraldehyd-Fixierungsreagenz mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% durch Zugeben eines im Handel erhältlichen 25%-Glutaraldehydprodukts zur gekühlten hypotonischen Lösung für Monocyten. Vorzugsweise beträgt die Temperatur 2ºC bis 8ºC. Die bevorzugte Konzentration des Glutaraldehyds beträgt ungefähr 0,15%.
4. Zugeben der gewaschenen roten Blutzellen zu einer abgemessenen Menge des Fixierungsmittels von Schritt 3 bei einer Verdünnung von 1 : 50. Überführen in verschlossene Behälter, die langsam für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur gerollt werden. Die Verminderung des Hämoglobingehalts ist auf ungefähr 40 Gew.-% berechnet.
5. Entfernen der Überstandsflüssigkeit, einige Male Waschen der Zellen mit PBS, dann Resuspendieren in einer geeigneten Lagerungslösung.
6. Für ein isoliertes Monocytenanaloges, Resuspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in einem geeigneten Suspensionsmedium und Einstellen der Konzentration, um diejenige von humanen Monocytenzellen in normalem humanen Blut zu simulieren.
7. Für ein hämatologisches Mehrfachkontrollprodukt, Versetzen der gewaschenen fixierten Zellen von Schritt 6 mit anderen hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen, die für das Mehrfachparameter-Kontrollprodukt gewünscht sind, in der geeigneten Konzentration, um Monocytenzellen zu entsprechen.
8. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für eine Zeitspanne von mehr als sechs Monaten gelagert werden.

BEISPIEL 3

Eosinophilanaloaes aus roten Blutzellen des Alligators

Das Folgende ist ein spezifisches Beispiel bevorzugter Reagenzien und empfohlener spezifischer Verfahrensschritte zur Behandlung von roten Blutzellen des Alligators, um das Eosinophilanaloge zu erhalten. Selbstverständlich dienen die Formulierungen und die Verfahren nur der Veranschaulichung, und es können andere Inhaltsstoffe, Verhältnisse und Verfahren gemäß der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Hypotonische Lösung für Eosinophile

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,32 g
2. Dibasisches Natriumphosphat: 8,08 g
3. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen: pH ungefähr 8,0, Osmolalität 75 bis 85 mOsm/kg.

Lösung zur Denaturierungsbehandlung von Eosinophilenhämoglobin

1. Dimethyldikokosammoniumchlorid 2,5 g
2. Tris(hydroxymethyl)aminomethan 6,06 g (organischer Puffer)
3. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen: pH ungefähr 10,5.

Nachbehandlungswaschlösung für Eosinophile

1. Polyoxethyliertes Alkylphenol 5 g (Diazopan SS-837 von GAF Chemical Corp.)
2. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen.
Waschlösung für Zellen (PBS) wie in Beispiel 1 angegeben.

Verfahren

1. Auswählen roter Alligatorblutzellen mit einem mittleren Zellvolumenbereich von etwa 400 bis 500 fl. Waschen der gepackten roten Alligatorblutzellen mit PBS.
2. Zugeben von 0,25 bis 1,25 Milligramm Cholesterin zu einer Zellzahl von 1 · 10&sup6; pro Mikroliter und Inkubieren für 2 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur. 3. Herstellen eines Glutaraldehyd-Vernetzungsreagenz mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% durch Zugeben eines im Handel erhältlichen 25%-Glutaraldehydprodukts zur hypotonischen Lösung für Eosinophile. Die bevorzugte Konzentration des Glutaraldehyds beträgt ungefähr 0,2%.
4. Zugeben der gewaschenen roten Blutzellen zu einer abgemessenen Menge des Vernetzungsreagenz von Schritt 3 bei einer Verdünnung von 1 : 50. Überführen in verschlossene Behälter, die langsam für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur gerollt werden.
5. Entfernen der Überstandsflüssigkeit, einige Male Waschen der Zellen mit PBS.
6. Zugeben der gewaschenen roten Blutzellen zur Lösung zur Denaturierungsbehandlung des Eosinophilenhämoglobins bei einer Verdünnung von 1 : 10. Überführen in verschlossene Behälter, die langsam für 2 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur gerollt werden.
7. Entfernen der Überstandsflüssigkeit, einige Male Waschen der Zellen mit der Nachbehandlungswaschlösung für Eosinophile, um die Lösung zur Denaturierungsbehandlung des Eosinophilenhämoglobins zu entfernen. Dann Resuspendieren in einer geeigneten Lagerungslösung.
8. Für ein isoliertes Eosinophilanaloges, Resuspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in einem geeigneten Suspensionsmedium und Einstellen der Konzentration, um diejenige von humanen Eosinophilenzellen in normalem humanen Blut zu simulieren.
9. Für hämatologische Mehrfachkontrollprodukte, Versetzen der gewaschenen fixierten Zellen von Schritt 8 mit anderen hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen, die für das Mehrfachparameter-Kontrollprodukt gewünscht sind, in der geeigneten Konzentration, um Eosinophilenzellen zu entsprechen.
10. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für eine Zeitspanne von mehr als sechs Monaten gelagert werden.

BEISPIEL 4

Neutrophilzellanaloges aus roten Alligatorblutzellen

Das folgende ist ein spezifisches Beispiel bevorzugter Reagenzien und empfohlener spezifischer Verfahrensschritte zur Behandlung von roten Alligatorblutzellen, um das Monocytenzellanaloge zu erhalten. Selbstverständlich dienen die Formulierungen und die Verfahren nur der Veranschaulichung, und es können andere Inhaltsstoffe, Verhältnisse und Verfahren gemäß der Offenbarung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Hypotonische Lösung für Neutrophile

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,23 g
2. Dibasisches Natriumphosphat: 5,32 g
3. Mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen, pH ungefähr 8,0, Osmolalität 45 bis 65 mOsm/kg.
Waschlösung für Zellen (PBS) wie in Beispiel 1 angegeben.

Verfahren

1. Auswählen von roten Alligatorblutzellen mit einem mittleren Zellvolumenbereich von etwa 400 bis 500 fl. Waschen der gepackten roten Alligatorblutzellen mit PBS.
2. Herstellen eines Glutaraldehyd-Fixierungsreagenz mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% durch Zugeben eines im Handel erhältlichen 25%-Glutaraldehydprodukts zur hypotonischen Lösung für Neutrophile. Die bevorzugte Konzentration des Glutaraldehyds beträgt ungefähr 0,4%.
3. Zugeben der gewaschenen roten Blutzellen bei einer Zellzahl von 1 · 10&sup6; zu einer abgemessenen Menge des Fixierungsmittels von Schritt 3 bei einer Verdünnung von 1 : 50. Überführen in verschlossene Behälter, die langsam für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur gerollt werden.
4. Entfernen der Überstandsflüssigkeit, einige Male Waschen der Zellen mit PBS, dann Resuspendieren in einer geeigneten Lagerungslösung.
5. Zugeben gepackter Zellen zu einer Lösung eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels. Die Lösung trägt zum Standardisieren des Volumens der Donorzellen bei. Die Lösung umfaßt 0,5 Gramm Octylphenoxypolyethoxyethanol mit einem HLB von ungefähr 13,5 (Triton® X-100 von Rohm und Haas Co.) in 1 Liter destilliertem Wasser.
6. Entfernen der Überstandsflüssigkeit, einige Male Waschen der Zellen mit PBS, dann Resuspendieren in einer geeigneten Lagerungslösung.
7. Für ein isoliertes Neutrophilanaloges, Resuspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in einem geeigneten Suspensionsmedium und Einstellen der Konzentration, um diejenige von humanen Neutrophilenzellen in normalem humanen Blut zu simulieren.
8. Für ein hämatologisches Mehrfachkontrollprodukt, Versetzen der gewaschenen fixierten Zellen von Schritt 7 mit anderen hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen, die für das Mehrfachparameter-Kontrollprodukt gewünscht sind, in der geeigneten Konzentration, um Neutrophilzellen zu entsprechen.
9. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für eine Zeitspanne von mehr als 6 Monaten gelagert werden.

BEISPIEL 5

in einer Unterzusammensetzung zur Simulation der Zielzusammensetzung von weißen Blutzellen in einer normalen humanen Blutprobe werden die folgenden Mengen der einzelnen Komponenten verwendet:
Zur Endzusammensetzung der vier Leukocytenpopulationen, Entfernen der Überstandsflüssigkeit, dann Resuspendieren der Zellen in 1,0 Liter einer wässerigen Lösung von Moducyte mit einer Endkonzentration von 800 Milligramm Cholesterin.
Diese Zusammensetzung kann bis zu sechs Monate unter Zugabe bekannter geeigneter Stabilisatoren gelagert werden.
Das Verhältnis und die Gesamtzellzahl der Leukocytenpopufationen kann eingestellt werden, um pathologische als auch normale Zustände in humanem Blut darzustellen. Diese Zusammensetzungen sind sowohl in Kontroll- als auch Kalibrierungsprodukten, insbesondere für automatisierte Teilchenanalyseinstumente verwendbar, welche das Coulter-Prinzip verwenden.
Suspensionen unbehandelter humaner roter Blutzellen, simulierter weißer Blutzellen und stabilisierter oder simulierter Blutplättchen können danach in derartigen Verhältnissen zugegeben werden, daß die Endzahl roter Blutzellen, weißer Blutzellen und Blutplättchen sowie der Hämoglobinendgehalt und das Endhämatokrit im gewünschten Bereich liegen.
Stabilisierte Blutplättchen werden durch im Fach bekannte Verfahren geliefert. Verwendbare Verfahren umfassen:
1. Eine Kombination von Iodacetamid und einer Iminodiessigsäure oder ein Salz davon, zusammen mit einem kompatiblen bakteriostatischen Mittel in einer wässerigen Lösung, die bei einem vorausgewählten pH- und Osmolalitätsbereich, wie im U.S.-Patent Nr. 4, 405, 719 beschrieben, gehalten wird.
2. Eine Fixierungsstabilisierungszusammensetzung, enthaltend eine Glutaraldehydkonzentration von 0,1% bis 5% und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, das ein Gemisch von Ethoxylaten bestimmter isomerer linearer Alkohole ist, wie es genauer im U.S.-Patent Nr. 4, 389, 490 beschrieben ist.
3. Ein humanes Blutplättchenanaloges, umfassend Ziegenerythrocyten, stabilisiert, kombiniert und vermischt, wie es erforderlich ist, damit sie einen Größenbereich und eine Volumenverteilung aufweisen, die denjenigen von humanen Blutplättchen ähneln, wie es im U.S.-Patent Nr. 4, 264, 470 beschrieben ist.
Die Werte für jeden der hämatologischen Parameter können verändert werden, um abnorm niedrige und abnorm hohe Zustände darzustellen. Die Zahl weißer Blutzellen in normalem Blut beträgt 5.000 bis 11.000 pro Mikroliter (ul) mit einem Lym phocytenwert von 20 bis 40%, einem Wert mononukleärer Zellen von weniger als 10%, einem Granulocytenwert von 60 bis 80%, einem Eosinophilenwert von weniger als ungefähr 5% und einem Basophilenwert von weniger als ungefähr 2%. Der normale Bereich roter Blutzellen in humanem Blut beträgt 4.000.000 bis 5.000.000 Zellen pro Mikroliter. Der normale Hämoglobinwert beträgt 12 bis 16 Gramm/100 ml. Der Begriff "Hämatokrit" ist als das Verhältnis des Volumens der gepackten roten Blutzellen zum Volumen des Vollbluts definiert. Das normale Verhältnis bei Menschen beträgt etwa 45%. Das mittlere Erythrocytenvolumen ist das Verhältnis des Volumens der gepackten roten Blutzellen in ml pro Liter Blut zu roten Blutzellen in Millionen pro Mikroliter. Die mittlere Hämoglobinkonzentration der Erythrocyten ist ein Index, der das mittlere oder durchschnittliche Hämoglobingewicht pro 100 ml gepackter roter Blutzellen, ausgedrückt in Prozent, angibt. Das mittlere Hämoglobin der Erythrocyten ist das Verhältnis des Hämoglobingehalts, in Gramm pro Liter, zu roten Blutzellen, in Millionen pro Liter.
Ein Kontrollprodukt muß auf Vergleichsbasis genau angeben, woraus eine Testprobe von frischem Vollblut hinsichtlich aller vorstehenden Bestimmungen aufgebaut ist.

Claims

1. Hämatologisches Kontrollprodukt, das mindestens zwei Populationen von Leukocytenanalogen enthält, umfassend rote Blutzellen, deren Hämoglobingehalt oder deren Volumen derart behandelt wurde, daß die Zellen gegenüber dem Abbau durch in hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt mindestens zwei unterschiedliche humane Leukocyten simuliert, wobei jede mindestens zwei physikalische Eigenschaften eines humanen Leukocyten aufweist, wobei die Eigenschaften aus

a. durch Gleichstrom gemessenes Volumen,

b. Hochfrequenz (RF)-Größe,

c. Opazität und

d. Lichtstreuung

ausgewählt sind.

2. Hämatologisches Kontrollprodukt, umfassend Blutzellen, die derart behandelt wurden, daß sie gegenüber dem Abbau durch in hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt mindestens vier unterschiedliche Analoge enthält, die mindestens vier unterschiedliche humane Leukocyten simulieren, die jeweils mindestens zwei, wie im Anspruch 1 definierte physikalische Eigenschaften aufweisen.

3. Produkt nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine der physikalischen Eigenschaften die Lichtstreuung ist.

4. Produkt nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die zum Simulieren einer der humanen Leukocyten verwendeten Blutzellen um mehr als 30% ihres Ausgangsvolums ausgedehnt wurden.

5. Produkt nach einem vorhergehenden Anspruch, das mindestens vier Leukocytenanaloge enthält, die innerhalb von mindestens vier unterschiedlichen Analysegrenzwerten verteilt sind, wobei die Analysegrenzwerte auf der Basis von Lichtstreuung, Volumen und Opazität aufgestellt werden.

6. Produkt nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die behandelten Blutzellen einen geänderten Hämoglobingehalt aufweisen.

7. Produkt nach Anspruch 6, wobei das Hämoglobin in den behandelten Blutzellen denaturiert wurde.

8. Produkt nach Anspruch 6, wobei das Hämoglobin aus den behandelten Blutzellen ausgetreten ist.

9. Produkt nach Anspruch 8, wobei 20 bis 80% des Hämoglobin aus den behandelten Blutzellen ausgetreten sind.

10. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Instrument innerhalb der Spezifikation arbeitet, umfassend:

a. Einbringen des Produkts nach einem vorhergehenden Anspruchs in das Instrument,

b. Messen der physikalischen Eigenschaften des Kontrollprodukts, und

c. Aufzeichnen der Ergebnisse der Messung.

11. Verfahren zur Herstellung von Leukocytenanalogen, umfassend:

a. Mischen einer roten Blutzelle mit einer hypoosmotischen Lösung zum Ausdehnen des Zellvolumens,

b. Verändern des Hämogolobingehalts der Zelle, um die Lichtstreu ungseigenschaften von humanen Leukocytenzellen zu simulieren und

c. Fixieren der Zelle, so daß sie gegenüber dem Abbau durch in einem hämatologischen Testverfahren verwendeten lytischen Reagenzien beständig ist, wobei die fixierte Zelle Lichtstreuungs- und Volumeneigenschaften aufweist, die humanen Leukocyten ähnlich sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Schritt (b) das Denaturieren des Hämoglobins in der Zelle umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Schritt (b) das Austreten des Hämoglobins aus der Zelle umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Hämoglobingehalt der Zelle um zwischen 20 bis 80% vermindert ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Zelle mit einer Serumsubstanz und dann mit der hypoosmotischen Lösung gemischt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Serumsubstanz aus Cholesterin, Cholesterinestern, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinestern, Cholesterin kombiniert mit Phospholipiden und Mischungen davon ausgewählt ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei die Zelle um mehr als 75% ausgedehnt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei die Zelle gleichzeitig ausgedehnt und fixiert wird.