DE69419053T2

DE69419053T2 - Reagenz zur Messung von unreifen Leukozyten

Info

Publication number: DE69419053T2
Application number: DE69419053T
Authority: DE
Inventors: Yukio Hamaguchi; Takashi Morikawa; Yukio Tsujino
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-17
Publication date: 1999-10-21
Anticipated expiration: 2014-03-18
Also published as: JPH06273413A; JP3301646B2; DE69419053D1; ES2132352T3; AU665508B2; EP0617281A2; KR100287583B1; US5413938A; CN1088194C; KR940022088A; CA2119390C; AU5785694A; CA2119390A1; EP0617281B1; CN1095481A; EP0617281A3; TW297093B

Description

1. Fachgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Reagens zur Klassifikation und Zählung von unreifen Zellen, die in einer Flüssigkeitsprobe, z. B. Blut, enthalten sind.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Im peripheren Blut einer Normalperson sind verschiedene Blutzellen, z. B. Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten enthalten. Die Blutzellen werden im Knochenmark produziert und in den Blutstrom gebracht, während sie unter Differenzierung ihrer selbst aus unreifen Zellen wachsen.
Beispielsweise werden Leukozyten wie z. B. neutrophile, eosinophile und basophile aus unreifen Zellen zu reifen Zellen differenziert, und zwar über (Myeloblast → Promyelozyt → Myelozyt → Metamyelozyt) zu (Stabkerniger → Blastomer). In peripherem Blut, das einer Normalperson entnommen wurde, treten unreife Zellen, z. B. Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten nicht in Erscheinung; Stabkerniger treten in geringer Zahl auf. Allerdings kommen unreife Leukozyten in einigen speziellen Fällen in Blut vor, z. B. in Blut, das Patienten entnommen wurde, die an Blutkrankheiten wie z. B. Leukämie, Krebsmetastasen am Knochenmark und einer schweren Infektionskrankheit leiden. Somit ist es wichtig und bedeutend, zur Diagnose solcher Erkrankungen die unreifen Leukozyten zu bestimmen.
Als eine Technik für eine automatisierte Klassifikation und Zählung von Blutzellen ist ein Verfahren der Aufzeichnung und Verarbeitung von Zellbildern bekannt. In einem anderen Fall werden Blutzellen automatisch klassifiziert und gezählt, indem sie in einem Verdünnungsmittel suspendiert durch eine Apertur geführt werden und die von den jeweiligen Körperchen erhaltenen Signale verarbeitet werden. Neuerdings wird das zuletzt genannte Strömungssystem im Hinblick auf Genauigkeit, Kosten oder dgl. bevorzugt verwendet.
Nach dem Strömungssystem werden Blutzellen in einem Verdünnungsmittel suspendiert und durch Signale, die auf den jeweiligen Zellen basieren, nachgewiesen, z. B. durch Signale, die auf der Differenz in einer optischen Eigenschaft oder einer elektrischen Eigenschaft basieren. D. h., sie können festgestellt werden, indem ein Zytometer zum Nachweis von Streulicht oder Fluoreszenzlicht verwendet wird, was auf dem Unterschied in einer optischen Eigenschaft basiert, oder indem ein Blutzellenzählgerät zum Nachweis elektrischer Signale verwendet wird, welche von Blutzellen erzeugt werden, wenn die Blutzellen durch eine Aperture gehen, an die ein elektrischer Strom angelegt wird, was auf dem Unterschied in einer elektrischen Eigenschaft beruht. Die zuletzt genannte kann weiter entweder in ein Gleichstromverfahren unter Anlegung von Gleichstrom, um Signale auf der Basis der Differenz beim elektrischen Widerstand von Blutzellen nachzuweisen, und in ein Hochfrequenzverfahren unter Anlegung von Hochfrequenzstrom mit mehreren MHz, um Signale auf Basis der Differenz bei der Dielektrizitätskonstante von Blutzellen nachzuweisen, eingeteilt werden. Das Gleichstromverfahren ermittelt Signale, deren Größe im Verhältnis zum Volumen der Zellen steht, während das Hochfrequenzverfahren Signale ermittelt, die eine Information über die innere Struktur (die Kerngröße) und die am Aufbau beteiligten Substanzen der Zellen widergeben.
Beispielsweise beschreiben (1) WO 88/09504 und (2) die europäische Patentanmeldung Nr. 044240 A1 eine Kombination des Gleichstromverfahrens und des Hochfrequenzverfahrens zur Klassifikation und Zählung von 5 Leukozyten-Typen und abnormen Zellen.
Die oben zitierte Referenz (1) beschreibt die Klassifikation und Zählung von 5 Typen normaler (reifer) Leukozyten, d. h. Lymphozyten, Monozyten, neutrophile Leukozyten, eosinophile Leukozyten und basophile Granulozyten, und abnormen Zellen unter Verwendung eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels auf Polyoxyethylen-Basis oder eines anionischen oberflächenaktiven Mittels auf Polyoxyethylen-Basis. Fig. 18 erläutert z. B. die Verteilung von Lymphoblasten n, Myeloblasten 1, anderen unreifen Granulozyten k und eine linksverschobene Verteilung j, wobei es scheint, daß die linke Verschiebung die Erhöhung von neutrophilen Leukozyten bezeichnet, die eine geringere nukleäre Segmentierung (neutrophile Stabkerniger-Leukozyten) zeigt.
Die Referenz (2) beschreibt die Klassifikation und Zählung von 5 Leukozytentypen und anderen abnormen Zellen unter Verwendung eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels auf Polyoxyethylenbasis unter sauren und hypotonen Bedingungen. Fig. 5 veranschaulicht die Verteilung von abnormen Zellen e, z. B. leukämischen Zellen.
Mittlerweile ist auch eine Reihe von Verdünnungsmitteln und konservierenden Lösungen für Blut bekannt. Beispielsweise sind konservierende Lösungen bekannt, die Aminosäuren enthalten, welche unter Adsorption an der äußeren Zellmembran wirken und ihre Morphologie aufrecht erhalten (Zellschutz).
Die Referenzen (1) und (2) haben die Nachteile, daß nichtklassifizierte unreife Zellen zurückbleiben und eine unzureichende Genauigkeit der Klassifikation besteht, da sie in erster Linie darauf abzielen, reife Leukozyten in 5 Typen einzuteilen; unreife Zellen werden zusätzlich klassifiziert und gezählt. Wenn beispielsweise nur ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis verwendet wird, werden reife Leukozyten und unreife Leukozyten wegen einer unzureichenden Schrumpfung reifer Leukozyten und unzureichender Auflösung von Erythrozyten nicht klar unterschieden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Reagens zum Messen unreifer Leukozyten bereit, das:
(1) ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis, das die allgemeine Formel (I) hat, in einer Menge, die ausreicht, um Zytoplasmen und Zellmembranen von unreifen Leukozyten fixieren zu können:
R&sub1;-R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-H (I)
worin R&sub1; eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 10 bis 25 Kohlenstoffatomen ist; R&sub2; -O-, -(C&sub6;H&sub4;)-O- oder -COO- ist, und n eine ganze Zahl von 10 bis 40 ist;
(2) einen Lösungsvermittler in einer Menge, die ausreicht, um Zellmembranen von anderen Blutzellen als unreife Leukozyten schädigen und sie schrumpfen zu können;
(3) eine Aminosäure in einer Menge, die ausreicht; Zytoplasmen und Zellmembranen von unreifen Leukozyten stabilisieren zu können; und
(4) ein wäßriges Medium, das den pH auf einen Wert im Bereich von 5,0 bis 9,0, die Osmolarität auf einen Wert im Bereich von 150 bis 600 mOsm/kg bzw. die elektrische Leitfähigkeit auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0 mS/cm einstellt, umfaßt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Reagenzes, das die Genauigkeit der Klassifikation und der Zählung unreifer Zellen verbessert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfrequenz- Signalintensität schematisch, wenn eine Blutprobe unter Verwendung eines Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemessen wird.
Fig. 2 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfreqeunz- Signalintensität, wenn peripheres Blut, das Patienten, die an chronischer Myelozytenleukämie leiden, entnommen wurde, unter Verwendung des Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemessen wird.
Fig. 3 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochgrequenz- Signalintensität, wenn peripheres Blut, das Patienten, die lymphozytische unreife Zellen haben, entnommen wurde, unter Verwendung des Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemessen wird.
Fig. 4 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfrequenz- Signalintensität, wenn peripheres Blut, das Normalpersonen entnommen wurde, unter Verwendung des Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemessen wird.
Fig. 5 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfrequenz- Signalintensität, wenn peripheres Blut, das Patienten, die an akuter lymphozytischer Leukämie leiden, entnommen wurde, unter Verwendung des Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemessen wird.
Fig. 6 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfrequenz- Signalintensität, wenn peripheres Blut, das Patienten, die an akuter myeloider Leukämie leiden, entnommen wurde, unter Verwendung des Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemessen wird.
Fig. 7 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfrequenz- Signalintensität, das im Vergleichsbeispiel I gemessen wurde.
Fig. 8 zeigt ein zweidimensionales Streuungsdiagramm mit den Achsen Gleichstrom-Signalintensität und Hochfrequenz- Signalintensität, das im Vergleichsbeispiel II gemessen wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylen-Basis, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein oberflächenaktives Mittel, das fähig ist, Zytoplasmen und Zellmembranen von unreifen Leukozyten zu fixieren und das durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
R&sub1;-R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-H (I)
worin R&sub1; eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 10 bis 25 Kohlenstoffatomen ist; R&sub2; -O-, -(C&sub6;H&sub4;)-O- oder -COO- ist, und n eine ganze Zahl von 10 bis 40 ist. Vorteilhafte Beispiele sind die mit der Formel (I), worin R&sub1; eine Alkenyl- Gruppe oder eine Alkinyl-Gruppe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, R&sub2; -O- ist, und n eine ganze Zahl von 10 bis 30 ist, da solche oberflächenaktive Mittel die zwei Merkmale eines Auflösens von Erythrozyten und eines Fixierens von Leukozyten in einem guten Gleichgewicht aufweisen. Insbesondere werden C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub6;H und C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;H verwendet.
Das oberflächenaktive Mittel kann in einer Konzentration von 5 bis 50 g/l, bevorzugter von 20 bis 28 g/l in dem Reagenz enthalten sein.
Der in dem Reagenz der vorliegenden Erfindung enthaltene Lösungsvermittler wird verwendet, um eine Zellmembran von anderen Blutzellen als unreife Leukozyten zu schädigen und sie zu schrumpfen.
Beispiele für die Lösungsvermittler sind:
(1) Ein Sakosin-Derivat mit der allgemeinen Formel (II):
worin R&sub3; eine Alkyl-Gruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, und m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; oder ein Salz desselben;
(2) ein Cholsäure-Derivat mit der allgemeinen Formel (III):
worin R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl-Gruppe ist;
oder ein Salz derselben;
(3) ein Methylglucanamid mit der allgemeinen Formel (IV):
worin y eine ganze Zahl von 5 bis 7 ist; und
(4) n-Octyl-β-glucosid, Saccharosemonocaprat und N- Formylmethylleucylalanin.
Spezifische Beispiele für die Lösungsvermittler der Absätze (1) bis (3), die oben beschrieben wurden, sind: (1) Natrium- N-lauroylsarcosinat, Natrium-N-lauroyl-N-methyl-β-alanat und N-Lauroylsarcosin; (2) CHAPS (3-[(3- Chloramidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat) und CHAPSO (3-[(3-Chloramidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansulfonat); und (3) MEGA 8 (Octanoyl-N-methylglucamid), MEGA 9 (Nonanoyl-N-methylglucamid) und MEGA 10 (Decanoyl-N- methylglucamid). Unter den obigen Lösungsvermittlern ist Natrium-N-Lauroylsarcosinat bevorzugt.
Die Konzentration des Lösungsvermittlers kann entsprechend dem Typ des Lösungsvermittlers eingestellt werden. Er kann in einer solchen Konzentration eingesetzt werden, daß Erythrozytenschatten und reife Leukozyten mit nacktem Kern in effektiver Weise geschrumpft werden können. Beispielsweise wird das Sarcosin-Derivat (II) oder ein Salz davon in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 g/l verwendet; das Cholsäure- Derivat (III) oder ein Salz desselben wird in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 g/l verwendet; das Methylglucanamid (IV) wird in einer Konzentration von 1,0 bis 8,0 g/l verwendet; und n-Octyl-β-glucosid, Saccharosemonocaprat oder N-Formylmethylleucylalanin werden in einer Konzentration von 0,01 bis 50,0 g/l eingesetzt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Aminosäure sind solche, die fähig sind, Zytoplasmen und Zellmembranen abnormer Zellen zu stabilisieren. Die Aminosäure kann irgendeine Aminosäure sein, die ein Protein-bildenden Aminosäuren können in drei Gruppen eingeteilt werden, nämlich in neutrale Aminosäuren, saure Aminosäuren und basische Aminosäuren, wie dies in Tabelle 1 dargestellt ist.
Im Hinblick auf Stabilisierung und Klassifikation unreifer Zellen wird eine schwefelhaltige Aminosäure, z. B. Methionin, Cystin und Cystein, vorzugsweise Methionin verwendet.
Die zu verwendende Menge der Aminosäure zur Herstellung des erfindungsgemäßen Reagenzes ist nicht speziell begrenzt und kann entsprechend dem Typ der Aminosäure, die verwendet wird, eingestellt werden. Glutaminsäure, die eine saure Aminosäure ist, kann z. B. vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 50 g/l, bevorzugter von 8 bis 12 g/l, am günstigsten von 10 g/l verwendet werden. Im Fall der Verwendung von Valin, die eine neutrale Aminosäure ist, wird diese vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 50 g/l, bevorzugter von 8 bis 12 g/l, am günstigsten von 10 g/l eingesetzt. Außerdem wird Methionin vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 50 g/l, bevorzugter in einer Konzentration von 16 bis 24 g/l verwendet. TABELLE 1
Das wäßrige Medium der vorliegenden Erfindung umfaßt Wasser, ein organisches wäßriges Medium oder verschiedene Pufferlösungen, z. B. HEPES und Phosphat-Puffer und kann ein den pH einstellendes Agenz, z. B. Natriumhydroxid und ein die Osmolarität einstellendes Agenz enthalten, z. B. ein Salz, wenn dies notwendig ist. Die verschiedenen Pufferlösungen werden vorzugsweise eingesetzt.
Das Reagenz der vorliegenden Erfindung kann nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden, wobei die notwendigen Komponenten, wie sie oben genannt wurden, verwendet werden. Das Reagenz liegt üblicherweise in Form einer wäßrigen Lösung vor. Vorzugsweise werden pH, Osmolarität und elektrische Leitfähigkeit des Reagenzes so eingestellt, daß sie im Bereich von 5,0 bis 9,0, 150 bis 600 mosm/kg bzw. 6,0 bis 9,0 mS/cm liegen, und zwar beispielsweise durch Zusatz eines den pH einstellenden Agenzes, z. B. Natriumhydroxid, oder eines Agenzes zur Einstellung der Osmolarität, z. B. ein Salz, wenn dies erforderlich ist.
Um unreife Zellen zu klassifizieren und zu zählen, wird das auf diese Weise erhaltene Reagenz der vorliegenden Erfindung mit einer Probe, die unreife Leukozyten enthält, (in der Praxis mit einem Blut) vermischt, wodurch die in dem Reagenz der vorliegenden Erfindung enthaltenen Komponenten mit jeder der in der Probe enthaltenen Zellgruppen gleichzeitig reagieren können. Indem das Reagenz mit einer Probe vermischt wird, wird ein Unterschied in einer Größenordnung geschaffen, das jede der unreifen Leukozytengruppen von anderen Zellgruppen unterschieden werden kann. Das Vermischen wird bei 25 bis 40ºC, vorzugsweise bei 30 bis 34ºC durchgeführt.
Nachfolgend wird über den bedeutsamen Mechanismus des erfindungsgemäßen Reagenzes diskutiert.
(1) Unreife Leukozyten scheinen bei Einwirkung des nicht- ionischen oberflächenaktiven Mittels auf Polyoxyethylen-Basis im Reagens der Erfindung im Vergleich zu reifen Leukozyten gegenüber eines Schädigung ihrer Zellmembran resistent zu sein.
(2) Wenn die Zellmembran von unreifen Leukozyten allerdings teilweise beschädigt ist, wird angenommen, daß die Aminosäure und das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel durch den beschädigten Teil in die Zelle einwandern und den Zellmembranteil und die Zellkomponente stabilisieren.
Im allgemeinen ist bekannt, daß je geringer die Molzahl des Zusatzes n für das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylen-Basis ist, desto stärker ist die hämolytische Aktivität, und je größer die Molzahl des Zusatzes n ist, desto schwächer ist die hämolytische Wirksamkeit. Erfindungsgemäß wird festgestellt, daß, wenn die Molzahl des Zusatzes n für das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylen-Basis gleich 10 oder größer als 10 ist, das oberflächenaktive Mittel zur Stabilisierung der Zellen wirkt.
Es ist auch allgemein bekannt, daß die Festigkeit der Zellmembran sich in der Reihenfolge reife Leukozyten > unreife Leukozyten > Erythrozyten abschwächt. Allerdings wird sie unerwarteterweise im Fall einer Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes in der Reihenfolge unreife Leukozyten > reife Leukozyten > Erythrozyten schwächer. Unreife Leukozyten sind nämlich schwerer zu beschädigen als reife Leukozyten.
Wenn das Reagenz mit einem Blut vermischt wird, können die folgenden Phänomene auftreten.
Jede der Zellgruppen (z. B. unreife Leukozyten, reife Leukozyten und Erythrozyten) wird beschädigt, wenn das erfindungsgemäße Reagens, das ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis enthält, mit Blut bei einem pH von 5,0 bis 8,0 vermischt wird. Der Grad der Schädigung hängt vom Zelltyp ab. D. h., die Membranen der Erythrozyten werden beschädigt und unmittelbar danach werden sie aufgelöst. Die Membranen von reifen Leukozyten werden beschädigt, die Komponenten daraus werden aus der Zelle eluiert, so daß die Kerne nackt sind. Unreife Leukozyten werden ebenfalls beschädigt, aber bevor die Komponenten eluiert werden, dringen ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis und eine Aminosäure über den beschädigten Teil in die Zelle ein; dadurch werden die Zellmembran und darin enthaltene Komponenten fixiert. Das Resultat ist, daß unreife Leukozyten im Zustand eines Aufrechterhaltens der Membran und des Zytoplasma fixiert werden können.
Um Zellen zu klassifizieren ist es notwendig, eine Unterschied zwischen den einzelnen Zellgruppen in einem Ausmaß zu bewirken, daß jede von ihnen von anderen unterschieden werden kann und den Unterscheidungszustand über einen bestimmten Zeitraum aufrecht zu erhalten. Eine der herkömmlichen Techniken zur Erreichung dieses Ziels besteht in einem Versetzen der Zellen nach Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels mit einem Fixiermittel. Als Fixiermittel sind z. B. Formaldehyd und Glutaraldehyd im US- Patent Nr. 4 099 917 bzw. im US-Patent 4 751 179 offenbart. Der Fixiermechanismus der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem herkömmlichen dadurch, daß in der vorliegenden Erfindung das Fixieren innerhalb der Zellmembran durchgeführt wird, während es im herkömmlichen Fall außerhalb der Zellmembran durchgeführt wird.
Das oben beschriebene herkömmliche Verfahren kann unreife Leukozyten nicht klar von reifen Leukozyten und Erythrozytenschatten unterscheiden. Dagegen wirkt der im Reagens der vorliegenden Erfindung enthaltene Lösungsvermittler auf reife Leukozyten und Erythrozytenschatten und klassifiziert sie durch Schrumpfung von Erythrozytenschatten und reifen Leukozyten, deren Kerne nackt sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können unreife Leukozyten in stabiler und genauer Weise klassifiziert und gezählt werden, indem ein Unterschied in den morphologischen Merkmalen bewirkt wird, wie dies oben beschrieben ist, und die Zellen, die den Unterschied zeigen, einzeln gezählt werden.
Fig. 1 stellt ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm dar, das erhalten wird, indem das Gleichstrom- und das Hochfrequenzverfahren durchgeführt werden. In Fig. 1 stellen a, b, c und d eine Gruppe aus Stammzellen (a1 bezeichnet granulozytere Stammzellen und a2 bezeichnet lymphozytäre Stammzellen), Myelozyten bzw. Metamyelozyten, Promyelozyten, Stabkerniger dar. Der Referenzbuchstabe e stellt eine Gruppe von Erythrozytenschatten und reifen Leukozyten dar. Wie aus der Figur zu ersehen ist, werden Erythrozyten und reife Leukozyten in einem Grad geschrumpft, daß jeder der reifen Leukozyten vollständig unterschieden werden kann.
Wenn Blut zuerst mit einer Lösung, die eine Aminosäure enthält, vermischt wird, und dann das oben beschriebene oberflächenaktive Mittel dem Gemisch zugesetzt wird, wären die dem Blut zugesetzten Substanzen schließlich dieselben wie im Fall einer Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes. Wenn allerdings die Aminosäure dem Blut in dieser Reihenfolge zugesetzt wird, kann der Effekt der vorliegenden Erfindung nicht erhalten werden. Hinsichtlich Funktion und Wirkung gibt es einen deutlichen Unterschied zwischen dem obigen Verfahren und der vorliegenden Erfindung. Der Unterschied wird nachfolgend detailliert beschrieben.
In dem zuerst genannten Verfahren wirkt eine Aminosäure an der Außenseite der Zellmembran unter Aufrechterhaltung der morphologischen Merkmale der Zellen, bevor das oberflächenaktive Mittel zugesetzt wird. Das Resultat ist, daß Zellen bereits durch die Aminosäure geschützt sind, wenn das oberflächenaktive Mittel zugesetzt wird, so daß das oberflächenaktive Mittel nicht in ausreichender Weise funktioniert. Dementsprechend können unreife Leukozyten nicht klassifiziert werden. Zur Bewirkung eines ausreichenden Unterschieds zur Unterscheidung unreifer Leukozyten, muß die Zellmembran beschädigt werden, bevor die Zellschutzfunktion durch die Aminosäure an ihr wirkt, und muß die Aminosäure zur Zeit der Schädigung der Membran in die Zelle eindringen gelassen werden. Ferner kann der Effekt der vorliegenden Erfindung nicht erreicht werden, wenn die Aminosäure zugesetzt wird, nachdem die Zellmembran vollständig beschädigt ist. Daher ist es wichtig, daß die Aminosäure von der Innenseite der Zelle, nicht von der Außenseite wirkt, so daß die Aminosäure und das obige oberflächenaktive Mittel in derselben Lösung enthalten sein müssen.
Im Fall einer Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes ist es möglich, nicht nur ein Verfahren der elektrischen Impedanz, z. B. das Gleichstromverfahren und das RF-Verfahren, sondern auch die optische Durchflußzytometrie anzuwenden. Wenn ein Vorwärtsstreulicht (FSC) und ein Seitenstreulicht (SSC) bestimmt werden, kann ein fast gleiches Streudiagramm mit den Intensitäten von FSC und SSC als Achsen erhalten werden, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist. Das Vorwärtsstreulicht gibt das Volumen der Zellen wieder, und das Seitenstreulicht gibt eine innere Information (Kerngröße und Grad der Komplexität) an. Aus der Figur ist ersichtlich, daß die Intensitäten für DC bzw. RF den Intensitäten des Vorwärtsstreulichts und des Seitenstreulichts entsprachen.
Bevorzugte Beispiele für die Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend beschrieben:

BEISPIEL I

Reagenzzusammensetzung

(1) nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub6;-H 24,0 g
(2) Lösungsvermittler (anionisches oberflächenaktives Mittel) Natrium-N-lauroylsarkosinat 1,5 g
(3) Aminosäure (schwefelhaltige Aminosäure) DL-Methionin 20,0 g
(4) Puffer HEPES 12,0 g NaOH (1 N) 0,3 g
(5) die Osmolarität einstellendes Agens NaCl 4,0 g
(6) Wasser ad 1000 ml
Blut wurde unter Verwendung des Reagenzes mit der obigen Zusammensetzung unter den Bedingungen pH = 6,8, π (Osmolarität) = 350 mosm/kg · H&sub2;O, p (elektrische Leitfähigkeit) = 7,4 mS/cm und Lösungstemperatur = 33ºC 256-fach verdünnt. Die Verdünnung wurde 13 s inkubiert und die Teilchen wurden für 6 s durch das Hochfreguenz/Gleichstrom-Verfahren gemessen.
Die Fig. 2, 3 und 4 zeigen die erhaltenen Resultate der Messung verschiedener Blutproben durch ein zweidimensionales Streudiagramm mit den Achsen Hochfrequenz-Signalintensität und Gleichstrom-Signalintensität. Die Fig. 2, 3 und 4 zeigen die Resultate der Messungen peripheren Bluts, das Patienten, die an chronischer Myelozyten-Leukämie leiden, Patienten, die nachgewiesene unreife Lymphozytenzellen haben bzw. Normalpersonen entnommen worden war.
Es wird beobachtet, daß die in Fig. 2 dargestellte Blutprobe eine Reihe von Myeloblasten, Myelozyten, Metamyelozyten, Promyelozyten und Stabkerniger enthält, die in Gruppe a1 für Myeloblasten, Gruppe b für myelozyten und Metamyelozyten, Gruppe c für Promyelozyten und Gruppe d für Stabkerniger verteilt waren. Für jede der Gruppen a1, b, c und d wurde bestätigt, daß sie Myeloblasten, Myelozyten, Metamyelozyten, Promyelozyten und Stabkernige sind, indem jede der obigen Fraktionen, die aus einer Blutprobe abgetrennt worden waren, gemessen wurde und ein Korrelationstest zwischen Messung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes und visueller Betrachtung durchgeführt wurde. Der Referenzbuchstabe e bezeichnet eine Gruppe, die Erythrozytenschatten und reife Leukozyten umfaßt. Es wird erkannt, daß alle anderen Gruppen außer unreifen Leukozyten vollständig geschrumpft sind und keine Störungen bei der Klassifikation unreifer Leukozyten verursachen.
Die in Fig. 3 dargestellte Blutprobe enthält unreife Lymphozytenzellen (Lymphomzellen und atypische Lymphozyten) als unreife Zellen, die in Gruppe f verteilt waren. Durch ein Verfahren, das dem obigen entspricht, wurde bestätigt, daß Gruppe f unreife Lymphozytenzellen waren. Der Referenzbuchstabe e bzeichnet eine Gruppe, die Erythrozytenschatten und reife Leukozyten umfaßt.
Die in Fig. 4 dargestellte Blutprobe war einer Normalperson entnommen worden. Die Blutprobe enthält nur Stabkerniger (neutrophile Stabkerniger-Leukozyten). Die Probe enthielt keine anderen unreifen Zellen. Die Stabkerniger-Zellen waren in Gruppe d verteilt, was derselbe Bereich ist, in dem sie in Fig. 2 verteilt waren.
Fig. 5 und 6 zeigen die Resultate der Messung von Blut von Patienten, die an akuter Lymphozyten-Leukämie leiden, bzw. von Patienten, die an akuter myeloider Leukämie leiden. Gruppe a2 und a1 bezeichnen Lymphoblasten bzw. Myeloblasten. Dies wurde unter Verwendung eines Zellsortierers bestätigt.
Auf diese Weise wurden Leukozyten von reifen Leukozyten unterschieden und in Stammzellen, Myelozyten, Metamyelozyten, Promyelozyten und Stabkerniger eingeteilt. Außerdem können Lymphoblasten und Myeloblasten unterschieden werden.
Zusätzlich zu der oben beschriebenen Zusammensetzung wurden Tests mit jeder Komponente in verschiedenen Mengen durchgeführt; bevorzugte Effekte wurden im folgenden Bereich gezeigt.
(1) C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub6;-H 5-50 g (20-28 g)
(2) Natrium-N-lauroylsarkosinat 0,1-2,0 g (1,2-2,0 g)
(3) DL-Methionin 1-50 g (16-24 g)
(4) pH 5,0-10,0 (6,0-8,0)
(5) π 150-500 mOsm/kg · H&sub2;O (250-380)
(6) ρ 3,0-12,0 (6,0-9,0)
(7) Verdünnungsverhältnis 100-500-fach (200-300)
(8) Lösungstemperatur 25,0-40,0ºC (30,0-34,0)
* In Klammern angegebenen Zahlen geben vorteilhaftere Bereiche an.
Die Zusammensetzung der Reagenzien, die in Beispiel I verwendet werden, ist in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2

BEISPIEL II

Beispiel II wurde in der gleichen Weise wie Beispiel I durchgeführt, außer daß Glutaminsäure als saure Aminosäure anstelle der Aminosäure von Beispiel I (schwefelhaltige Aminosäure: Methionin) in einer Menge von 10,0 g (bei 10,0 g/l) verwendet wurde. Die Menge an Glutaminsäure kann in dem Bereich von 1 bis 50 g, vorzugsweise im Bereich von 8 bis 12 g verändert werden, um eine bevorzugte Wirkung zu erzielen.
Die Zusammensetzung der Reagenzien, die in Beispiel II verwendet wurden, ist in Tabelle 3 aufgelistet. TABELLE 3

BEISPIEL III

Beispiel III wurde in der gleichen Weise wie Beispiel I durchgeführt, außer daß Valin als verzweigte Aminosäure anstelle der Aminosäure von Beispiel I (schwefelhaltige Aminosäure: Methionin) in einer Menge von 10,0 g (bei 10,0 g/l) verwendet wurde. Die Menge an Valin kann im Bereich von 1 bis 50 g, vorzugsweise 8 bis 12 g unter Erreichung eines bevorzugten Effektes verändert werden.
Die Zusammensetzung der in Beispiel III verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 4 aufgeführt TABELLE 4

BEISPIEL IV

Beispiel IV wurde in der gleichen Weise wie Beispiel I durchgeführt, außer daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylen-Basis und der Lösungsvermittler durch C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;-H bzw. CHAPS ersetzt wurden. C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;-H und CHAPS wurden in einer Menge von 5,0 g (bei 5,0 g/l) bzw. 0,3 g (bei 0,3 g/l) verwendet. Die Menge an C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;-H und CHAPS kann im Bereich von 1 bis 9 g, vorzugsweise 3 bis 7 g bzw. im Bereich von 0,1 bis 0,5 g, vorzugsweise 0,2 bis 0,4 g unter Erreichung eines bevorzugten Effektes variiert werden.
Die Zusammensetzung der in Beispiel IV verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 5 aufgeführt. TABELLE 5

BEISPIEL V

Beispiel V wurde in der gleichen Weise wie Beispiel I durchgeführt, außer daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylenbasis, der Lösungsvermittler und die Aminosäure durch C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;-H, MEGA8 bzw. Valin ersetzt wurden. C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;-H. MEGA8 und Valin wurden in einer Menge von 5,0 g(bei 5,0 g/l), 5,0 g (bei 5,0 g/l) und 20,0 g (20,0 g/l) verwendet. Die Menge an C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub5;-H, MEGA8 und Valin können im Bereich von 1 bis 9 g, vorzugsweise 3 bis 7 g, im Bereich von 1 bis 8 g, vorzugsweise 4 bis 6 g bzw. im Bereich von 1 bis 50 g, vorzugsweise 16 bis 24 g unter Erreichung eines bevorzugten Effektes variiert werden.
Bei Vergleich der Beispiele I bis V kann festgestellt werden, daß jede Gruppe unreifer Leukozyten im selben Bereich auftrat. Die Resultate der Klassifikation (gemessene Werte) waren fast genau wie in Beispiel I und die Genauigkeit fällt von Beispiel I bis V in der genannten Reihenfolge.
Die Zusammensetzung der Reagenzien, die in Beispiel V verwendet wurden, ist in Tabelle 6 aufgelistet. TABELLE 6
Anmerkung:
Verdünnungsverhältnis: 100- bis 500-fach (vorzugsweise 200- bis 300-fach).

VERGLEICHSBEISPIEL I

Das Vergleichsbeispiel I wurde in der gleichen Weise wie Beispiel I durchgeführt, außer daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylen-Basis nicht enthalten ist. Das Resultat ist in Fig. 7 dargestellt. Wie aus Fig. 7 zu ersehen ist, wurde die Zellmembran zerstört und Cytoplasma wurde aus der Zelle eluiert.

VERGLEICHSBEISPIEL II

Das Vergleichsbeispiel II wurde in der gleichen Weise wie Beispiel I durchgeführt, außer daß der Lösungsvermittler nicht enthalten ist. Das Resultat ist in Fig. 8 dargestellt. Wie aus Fig. 8 zu ersehen ist, treten, obgleich Zellmembran und Kern stabilisiert wurden, viele Erythrozyten auf, die nicht aufgelöst sind.
Die Zusammensetzung der Reagenzien, die in den Vergleichsbeispielen I und II verwendet wurden, ist in Tabelle 7 angegeben.

TABELLE 7

Vergleichsbeispiel I Zusammensetzung

Lösungsvermittler anionisches oberflächenaktives Mittel N-Lauro 1,5 g
Aminosäuren schwefelhaltige Aminosäure DL-Methionin 20,0 g
Puffer HEPES 12,0 g 1N NaOH 0,3 g
die Osmolarität einstellendes Agens NaCl 4,0 g
Wasser ad 1000 ml

Tabelle 7 (Fortsetzung)

Vergleichsbeispiel II Zusammensetzung

oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub6;H 24,0 g
Aminosäuren schwefelhaltige Aminosäure DL-Methionin 20,0 g
Puffer HEPES 12,0 g 1N NaOH 0,3 g
die Osmolarität einstellendes Agens NaCl 4,0 g
Wasser ad 1000 ml
Nach der vorliegenden Erfindung wird eine genaue Unterteilung von unreifen Leukozyten verfügbar gemacht.
Da das Reagens der vorliegenden Erfindung in einer Einzelpackung hergestellt wird, wird es vorzugsweise in einem automatischen Analysator angewendet. Darüber hinaus kann das Reagens der vorliegenden Erfindung nicht nur in einer Apparatur zum Nachweis der elektrischen Impedanz, sondern auch in einem optischen Gerät angewendet werden.

Claims

1. Reagens zum Messen von unreifen Leukozyten, das

(1) ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis, das die allgemeine Formel (I) hat, in einer Menge, die ausreicht, um Zytoplasmen und Zellmembranen von unreifen Leukozyten fixieren zu können:

R&sub1;R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-H (I)

worin R&sub1; eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 10 bis 25 Kohlenstoffatomen ist; R&sub2; -O-, -(C&sub6;H&sub4;)-O- oder -COO- ist, und n eine ganze Zahl von 10 bis 40 ist;

(2) einen Lösungsvermittler in einer Menge, die ausreicht, um Zellmembranen von anderen Blutzellen als unreife Leukozyten schädigen und sie schrumpfen zu können;

(3) eine Aminosäure in einer Menge, die ausreicht, um Zytoplasmen und Zellmembranen von unreifen Leukozyten stabilisieren zu können; und

(4) ein wäßriges Medium, das den pH auf einen Wert im Bereich von 5,0 bis 9,0, die Osmolarität auf einen Wert im Bereich von 150 bis 600 mosm/kg bzw. die elektrische Leitfähigkeit auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0 mS/cm einstellt, umfaßt.

2. Reagens nach Anspruch 1, in dem n des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels eine ganze Zahl von 10 bis 20 ist.

3. Reagens nach Anspruch 1, in dem der Lösungsvermittler ein Sarkosin-Derivat, das die allgemeine Formel (II) hat:

worin R&sub3; eine Alkyl-Gruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, und m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist;

oder ein Salz desselben ist.

4. Reagens nach Anspruch 1, in dem der Lösungsvermittler ein Cholsäure-Derivat, das die allgemeine Formel (III) hat:

worin R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl-Gruppe ist,

oder ein Salz desselben ist.

5. Reagens nach Anspruch 1, in dem der Lösungsvermittler ein Methylglucanamid ist, das die allgemeine Formel (IV) hat, ist:

worin y eine ganze Zahl von 5 bis 7 ist.

6. Reagens nach Anspruch 1, in dem das löslich machende Mittel n-Octyl-β-glucosid, Saccharosemonocaprat oder N- Formylmethylleucylalanin ist.

7. Reagens nach Anspruch 1, in dem die Aminosäure eine schwefelhaltige Aminosäure ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methionin, Cystin und Cystein ausgewählt ist.

8. Reagens nach Anspruch 1, in dem das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 5 bis 50 g/l enthalten ist.

9. Reagens nach Anspruch 3, in dem das löslich machende Mittel in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 g/l enthalten ist.

10. Reagens nach Anspruch 4, in dem das löslich machende Mittel in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 g/l enthalten ist.

11. Reagens nach Anspruch 5, in dem das löslich machende Mittel in einer Konzentration von 1,0 bis 8,0 g/l enthalten ist.

12. Reagens nach Anspruch 6, in dem das löslich machende Agens in einer Konzentration von 0,01 bis 50,0 g/l enthalten ist.

13. Reagens nach Anspruch 1, das eine wäßrige Lösung ist, die 20 bis 28 g C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub6;H als nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, 1,2 bis 2,0 g Natrium-N- lauroylsarcosinat als löslich machende Mittel und 16 bis 24 g DL-Methionin als Aminosäure, bezogen auf 1 l Lösung, enthält, wobei die Lösung so eingestellt ist, daß sie einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0, eine Osmolarität von 250 bis 380 mOsm/kg und eine elektrische Leitfähigkeit von 6,0 bis 9,0 ms/cm zeigt.