DE69217757T2

DE69217757T2 - Probenvorbereitungsverfahren zur Leukozytenzählung und -klassifikation

Info

Publication number: DE69217757T2
Application number: DE69217757T
Authority: DE
Inventors: Mitsue Ito; Takashi Sakata
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2012-06-27
Also published as: EP0525397A2; CA2071731C; US5308772A; JPH0534342A; DE69217757D1; CA2071731A1; AU1842392A; EP0525397A3; EP0525397B1; JP3067849B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zur Klassifikation und Zählung von Blutkörperchen in der Praxis der klinischen Untersuchung. Genauer gesagt betrifft sie ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zur Verwendung bei der Leukozytenklassifikation und -zählung mit einem Durchflußzytometer mittels optischer Messungen an den Blutkorpuskeln.
Das periphere Blut von normalen Personen enthält fünf Typen von Leukozyten, nämlich Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile.
Diese Leukozyten unterscheiden sich voneinander in der Funktion und die Klassifikation und Zählung der Leukozyten, die in dem peripheren Blut enthalten sind, ist sehr nützlich bei der Diagnose verschiedener Krankheiten.
Es ist wohlbekannt, daß das periphere Blut eines Patienten mit beispielsweise Leukämie unreife Granulozyten enthält, welche gewöhnlich nicht im peripheren Blut, sondern im Knochenmark beobachtet werden. Es ist daher äußerst wichtig, diese unreifen Granulozyten für diagnostische Zwecke aufzufinden, zu klassifizieren und zu zählen.
Die Leukozytenklassifikation und -zählung wurde gewöhnlich meist mit dem Differentialzählverfahren ausgeführt, welches auch als visuelles Zählverfahren oder einfach auch als manuelles Verfahren bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe auf ein Objektglas gestrichen und die Blutkörperchen in dem Abstrich werden für eine mikroskopische Untersuchung fixiert und angefärbt. Der Techniker identifiziert den Typ der individuellen Leukozyten gemäß ihren morphologischen Merkmalen und dem Grad der Farbaufnahme und führt so die Klassifikation und die Zählung durch. In üblichen Laboratorien werden gewöhnlich bei jeder Probe 100 bis 200 Leukozyten gezählt und der Prozentgehalt der gesamten Leukozytenzahl, welche jeder Typ der Kirperchen besitzt, wird als gemessener Wert aufgezeichnet.
Das Differentialzählverfahren weist verschiedene Nachteile auf, daß nämlich die Herstellung der zu untersuchenden Probe beschwerliche Arbeitsgänge erfordert; daß die Klassifikation durch mikroskopische Beobachtung von einer fachlich geschulten Person durchgeführt werden muß und die gemessenen Werte von Techniker zu Techniker beträchtlich voneinander abweichen; daß die kleine Anzahl von zu zählenden Leukozyten große statistische Fehler verursacht und daß es für den Techniker eine große Belastung ist, die Leukozyten mit diesem Verfahren zu klassifizieren und zu zählen.
Es wurden daher Versuche unternommen, eine Anzahl von Leukozyten automatisiert zu klassifizieren und zu zählen, um dadurch die Genauigkeit zu erhöhen und Arbeit zu ersparen. Kürzlich sind automatisierte Vorrichtungen, die auf einem Durchflußsystem beruhen, auf den Markt gekommen, um die oben erwähnten Probleme zu lösen.
Diese automatisierten Vorrichtungen können grob in die folgenden drei Typen klassifiziert werden, abhängig von den Prinzipien der Messung.
Eine Vorrichtung des ersten Typs besteht in drei lysierenden Mitteln und in drei Typen von Nachweiseinheiten. In der ersten Stufe werden in einer Blutprobe enthaltene Zellen, die keine Leukozyten sind, mit dem ersten lysierenden Mittel lysiert und die RF- und DC-Signale der zurückbleibenden Leukozyten werden gemessen. Dann werden die Leukozyten in drei Typen klassifiziert, nämlich Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten, abhängig von dem Unterschied in der Intensität der Signale.
Die RF und DC Signale werden nun erläutert.
Ein Gleichstrom (DC) wird zwischen Elektroden angelegt, die sich an beiden Seiten einer kleinen Öffnung befinden. Dann wird ein Signal, welches durch eine Änderung in der Impedanz nach Durchfließen eines Partikels durch die Öffnung erzeugt wird, als DC- Signal bezeichnet. Andererseits wird ein Signal, welches durch eine Änderung der Impedanz nach Durchfließen eines Partikels durch die Öffnung erzeugt wird, wenn ein Hochfrequenzstrom (RF) von mehreren Zehnern MHz zwischen den Elektroden angelegt wird, als RF-Signal bezeichnet. Es ist unnötig festzustellen, daß diese Stromarten gleichzeitig angelegt werden können und somit die RF- und DC-Signale beide nachgewiesen werden können.
In der zweiten Stufe werden in der Blutprobe enthaltene Zellen, die keine Eosinophile sind, mit dem zweiten lysierenden Mittel lysiert und die DC-Signale der zurückbleibenden Zellen werden gemessen. Somit werden die Eosinophile allein klassifiziert und gezählt, abhängig von dem Unterschied in der Signalintensität.
In der dritten Stufe werden in der Blutprobe enthaltene Zellen, die keine Basophile sind, mit dem dritten lysierenden Mittel lysiert und die DC-Signale der zurückbleibenden Zellen werden gemessen. Somit werden die Basophile allein klassifiziert und gezählt, abhängig von dem Unterschied in der Signalintensität.
Schließlich werden die Neutrophilen durch Subtraktion der Eosinophilen, die in der zweiten Stufe bestimmt wurden, und der Basophilen, die in der dritten Stufe bestimmt wurden, von den Granulocyten, die in der ersten Stufe bestimmt wurden, berechnet.
Eine Vorrichtung des zweiten Typs besteht in einem lysierenden Mittel und in einer Nachweiseinheit. Wie JP-A- 1502533 detailliert beschreibt, umfaßt dieses Verfahren die Behandlung einer Blutprobe mit einem lysierenden Mittel, wodurch Blutkörperchen, die keine Leukozyten sind, ohne Schädigung der Leukozyten lysiert werden können, die gleichzeitige Messung von RF-, DC- und Streulichtsignalen, und dann die Klassifizierung und Zählung der fünf Typen von Leukozyten durch zweckentsprechendes Kombinieren der oben genannten drei Signale.
Eine Vorrichtung des dritten Typs besteht aus zwei Mitteln und zwei Nachweiseinheiten. In diesem Verfahren werden andere Blutkörperchen als Leukozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, zuerst mit einem lysierenden Mittel lysiert und dann mit einer Farblösung einer Peroxidase- Anfärbung unterworfen. Dann werden die Extinktion und das Streulichtsignal von jedem Leukozyt gemessen und die Leukozyten werden in vier Typen (Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile) klassifiziert und gezählt, abhängig von der Signalintensität. Dann wird die Blutprobe mit einem anderen lysierenden Mittel behandelt, das fähig ist, andere Blutkörperchen als Basophile zu lysieren. Nach dem Messen von zwei Typen von Streulichtsignalen werden die Basohpilen klassifiziert und gezählt, abhängig von der Signalintensität.
Die oben erwähnten Nachteile des manuellen Verfahrens werden durch jedes dieser automatisierten Verfahren gelöst. Insbesondere vom Gesichtspunkt der Genauigkeit aus wurde eine beachtliche Verbesserung erreicht. Somit sind diese automatisierten Verfahren in der Praxis der klinischen Untersuchung nahezu zufriedenstellend.
Keines dieses Verfahren ermöglicht es jedoch, unreife Granulozyten spezifisch zu klassifizieren und zu zählen. Dementsprechend gibt es das Problem, daß eine Probe, die unreife Granulozyten enthält, nicht genau analysiert werden kann oder daß das Vorhandensein von unreifen Granulozyten per se nicht nachgewiesen werden kann. In im Handel befindlichen Vorrichtungen wird eine Unregelmäßigkeit in einem Streulichtdiagramm aufgrund des Auftretens von unreifen Granulozyten nachgewiesen und eine Warnung, beispielsweise durch eine anormale oder verdächtige Markierung, wird gegeben, so daß eine nochmalige Untersuchung durch einen Techniker mit dem manuellen Verfahren dringend erforderlich ist, um so das Übersehen von Unregelmäßigkeiten möglichst gering zu halten. In diesem Fall ist jedoch die nochmalige Untersuchung mit dem manuellen Verfahren erforderlich, was bedeutet, daß das Ziel der Arbeitsersparnis nicht vollständig erreicht wurde.
Getrennt hiervon wurde über einige Verfahren berichtet, wobei Fluoreszenz oder Streulicht jedes Leukozyten in einer fluorochromgefärbten Blutprobe mit einem Durchflußzytometer gemessen wird, um so die Leukozyten zu klassifizieren. Die wichtigsten Beispiele für diese Verfahren werden in JP-A-63134957, JP-B-59000853, JP-A-5020820 und JP-A-6370166 beschrieben.
Ferner haben wir Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten unter Verwendung des oben erwähnten Durchflußzytometers in JP-A-6313497 mit dem Titel "METHOD OF CLASSIFYING LEUKOCYTES BY FLOWCYTOMETRIE" und in JP-A-63134958 mit dem Titel "METHOD OF CLASSIFYING LEUKOCYTES BY FLOWCYTOMETRIE AND REAGENTS USED IN THE METHOD" beschrieben.
Wenn eine Probe, die unter Ausschaltung der Einflüße von Blutkörperchen, die keine Leukozyten sind, durch ein geeignetes Verfahren in einer hämatologischen Probe mit einem im Handel befindlichen Durchflußzytometer, wie er in der Figur 1 gezeigt wird, untersucht wird, so wird, wie allgemein bekannt ist, ein Streulichtdiagramm, wie es in der Figur 2 gezeigt wird, erhalten und die Leukozyten werden in drei Subpopulationen unterteilt, umfassend Lymphozyten 1', Monozyten 2' und Granulozyten 3', hauptsächlich von der Differenz der Intensität des rechtwinkligen Streulichts abhängig, und jede dieser Subpopulationen kann leicht klassifiziert und gezählt werden. Es ist ferner auch möglich, die Granulozyten in Subpopulationen aufzuteilen, die Eosinophile, Basophile und Neutrophile umfassen, indem man die genannten Verfahren mit der oben erwähnten Fluorochromfärbung kombiniert.
In der JP-A-63134958 haben wir bereits ein Verfahren zur Auftrennung der Leukozyten in fünf Subpopulationen und zum Klassifizieren und Zählen jeder Subpopulation unter Verwendung eines Durchflußzytometers und Reagentien, die in diesem Verfahren verwendet werden sollen, beschrieben. In diesem Verfahren werden Eosinophile und Basophile mit Astrazongelb 3G spezifisch fluorochromgefärbt. Als Resultate von fortgesetzten Untersuchungen fanden wir, daß Astrazongelb 3G außerdem spezifisch unreife Granulozyten anfärbt und es so ermöglicht wird, daß unreife Granulozyten eine spezifische Fluoreszenz in einem Grad emittieren, der vergleichbar mit den Eosinophilen ist, wie die Figur 3 zeigt. 1', 2', 3", 4' bezw. 5' bedeuten Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und unreife Granulozyten, und Basophile.
Bei diesem Verfahren sind jedoch Eosinophile äquivalent zu den unreifen Granulozyten hinsichtlich ihrer Intensität der Fluoreszenz und Fluoreszenzwellenlänge und ebenso hinsichtlich ihrer Intensität des rechtwinkligen Streulichtsignals. Es ist daher unmöglich, Eosinophile und unreife Granulocyten in verschiedene Subpopulationen aufzut rennen.
In der JP-A-63134957 haben wir ferner ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten in fünf Typen unter Verwendung einer Kombination von Neutralrot, welches spezifisch Eosinophile anfärbt, mit Astrazonorange G, welches spezifisch Basophile anfärbt, beschrieben. Mit diesem Verfahren ist es ebenfalls nicht möglich, spezifisch unreife Granulozyten anzufärben und die Granulozyten können daher nicht von den unreifen Neutrophilen getrennt werden.
Andererseits beschreibt US-A-4.500.509 ein manuelles Verfahren zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten, worin alle Leukozyten einschließlich unreifer Granulozyten mit Basisorange 21 fluorochromgefärbt und dann unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden. Die oben erwähnten Nachteile des manuellen Verfahrens können jedoch mit diesem Verfahren nicht gelöst werden. So stellt dieses U.S.Patent kein automatisiertes Verfahren zur Verfügung.
Wie oben beschrieben wurde, bezweckt die vorliegende Erfindung, unreife Granulozyten aufzufinden, zu klassifizieren und zu zählen, was mit den konventionellen automatisierten Methoden nicht erreicht werden kann, und ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe für die Durchflußzytometrie zur Verfügung zu stellen, um unreife Granulozyten zu klassifizieren und um Leukozyten, die unreife Granulozyten enthalten, zu klassifizieren und zu zählen.
Die oben erwähnten Ziele der vorliegenden Erfindung können erreicht werden, indem Leukozyten mit Astrazongelb 3G, das fähig ist, spezifisch Basophile und unreife Granulozyten anzufärben, und mit Neutralrot, das fähig ist, Eosinophile spezifisch anzufärben und die spezifische Anfärbung von Eosinophilen mit Astrazongelb 3G zu unterdrücken, bei einem pH-Wert behandelt wird, der zum Anfärben geeignet ist, um hierbei spezifisch Basophile, unreife Granulozyten und Eosinophile mit Fluorochrom anzufärben.
Die Figur 1 ist eine schematische Ansicht, welche die Konstruktion eines im Handel befindlichen Durchflußzytometers zeigt, wie er für die Verwirklichung der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Die Figur 2 ist ein Streulichtdiagramm, das durch Messen einer Probe, welche vorbereitet wurde, indem die Einflüsse von anderen Blutkörperchen als Leukozyten einer hämatologischen Probe eliminiert wurden, mit einem Durchflußzytometer erhalten wurde.
Die Figur 3 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der Fluoreszenz und die Intensität des rechtwinkligen Streulichts aufgrund des Anfärbens mit Astrazongeib 3G allein auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 4 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der grünen Fluoreszenz und die Intensität der roten Fluoreszenz aufgrund des Anfärbens mit Astrazongeib 3G auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 5 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechwinkligen Streulichts und die Intensität der grünen oder roten Fluoreszenz, die durch Anfärben einer Probe mit Astrazongelb 3G allein erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 6 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz, die durch Anfärben einer Probe mit Neutralrot allein erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 7 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechwinkligen Streulichts und die Intensität der roten Bluoreszenz, die durch Anfärben einer Probe mit Neutralrot allein erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 8 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der grünen Fluoreszenz und die Intensität des rechwinkligen Streulichts, die durch Anfärben einer Probe in Koexistenz von Astrazongelb 3G und Neutralrot erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 9 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz, die durch Anfärben einer Probe in Koexisteriz von Astrazongelb 3G und Neutralrot erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 10 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz, die durch Anfärben einer Probe mit Astrazongelb 3G und Neutralrot erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 11 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der grünen oder roten Fluoreszenz der Meßwerte, die von dem Fenster 1 [W1] der Figur 10 erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 12 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität des Vorwärtsstreulichts, die erhalten wurden, wenn Erythrozyten gleichzeitig durchfließen, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 13 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensitt der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 14 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte, die aus dem Fenster 2 [W2] der Figur 13 erhalten wurden, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 15 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des Vorwärtsstreulichts und die Intensität des rechtwinkligen Streulichts auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 16 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A8] in der Figur 15 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 17 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der grünen oder roten Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A9] in der Figur 16 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 18 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 19 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A11] in der Figur 18 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 20 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 21 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A13] in der Figur 20 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 22 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der Probe, die im Beispiel 1 erhalten wird auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 23 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A14] in der Figur 22 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 24 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der Probe, die im Beispiel 2 erhalten wird, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 25 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A16] in der Figur 24 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 26 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des Vorwärtsstreulichts und die Intensität des rechtwinkligen Streulichts der Probe, die im Beispiel 3 erhalten wird, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 27 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A18] in der Figur 26 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 28 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A19] in der Figur 27 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 29 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der Probe, die im Beispiel 4 erhalten wird, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 30 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A20] in der Figur 29 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 31 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz der Probe, die im Beispiel 5 erhalten wird, auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
Die Figur 32 ist ein Streulichtdiagramm, worin die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz der Meßwerte der Subpopulation [A21] in der Figur 31 auf die Koordinatenachsen bezogen werden.
In diesen Figuren weist jedes Symbol die folgende Bedeutung auf.
1: Lichtquelle,
2: Linse,
3: Kondensorlinse,
4: Kondensorlinse,
5: Strahlenhemmer,
6 - 9: Lichtnachweiseinheiten,
10 - 11: Dichromatischer Spiegel,
13: Partikel,
14: Zulauf der Abschirmungsflüssigkeit,
15: Signalaufbereitungs-Einheit,
16: Analyseneinheit,
17: Düse,
18: Durchflußzelle,
20: Durchflußbereich des Partikels,
21: Vorwärtsstreulicht,
22: Rote Fluoreszenz,
23: Grüne Fluoreszenz,
24: Rechtwinkliges Streulicht,
1': Lymphozyten,
2': Monozyten,
3': Granulozyten,
3": Neutrophile,
4': Eosinophile, unreife Granulozyten,
5': Basophile,
[R] : Erythrozyten,
[Eo] : Eosinophile,
[Granul]: Granulozyten,
[Lym]: Lymphozyten,
[Mono): Monozyten,
[Ba]: Basophile,
[Im]: Unreife Granulozyten,
[Im1]: Unreife Granulozyten Gruppe 1,
[Im2]: Unreife Granulozyten Gruppe 2,
[A1]: Subpopulation, umfassend Leukozyten außer Basophilen, Eosinophile und unreifen,
[A2): Subpopulation, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen,
[A3]: Subpopulation, umfassend Leukozyten außer Basophilen und unreifen Granulozyten,
[A4]: Subpopulation, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen, Basophilen und unreifen Granubzyten,
[A5]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Eosinophilen,
[A6]: Subpopulation, umfassend Lymphozyten und Blutkörperchen außer Leukozyten,
[A7]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Leukozyten,
[A8]: Subpopulation, umfassend nur Leukozyten,
[A9]: Subpopulation, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen,
[A10]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Leukozyten,
[A11]: Subpopulation, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen,
[A12]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Leukozyten,
[A13]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Eosinophilen,
[A14]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Eosinophilen,
[A15]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Basophilen und unreifen Granulozyten,
[A16]: Population, umfassend Blutkörperchen außer Eosinophilen,
[A17]: Subpopulation, umfassend Blutkörperchen außer Monozyten, Neutrophilen, unreifen Granulozyten 1, unreifen Granulozyten 2 und Basophilen,
[A18]: Population, umfassend nur Leukozyten,
[A19]: Population, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen,
[A20]: Population, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen,
[A21]: Population, umfassend Leukozyten außer Eosinophilen,
[W1] bis [W58]: Fenster 1 bis 58.
Nun wird die Erfindung detaillierter beschrieben werden, indem beispielhaft eine Probe angeführt wird, aus der Plättchen und Erythrozyten, die gewöhnlich in einer hämatologischen Probe enthalten sind, mit einem geeigneten Verfahren eliminiert wurden.
Das charakteristische Prinzip der vorliegenden Erfindung beruht auf den Funktionen von zwei Farbstoffen. Wenn die Probe mit Astrazongelb G3 allein angefärbt wird, werden Basophile, unreife Granulozyten und Eosinophile spezifisch fluorochromgefärbt. Nach Untersuchung mit einem Durchflußzytometer wird ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der grünen Fluoreszenz und jene der roten Fluoreszenz auf Koordinatenachsen bezogen werden, wie in der Figur 4 gezeigt wird. Somit können Leukozyten in zwei Subpopulationen geteilt werden, abhängig von dem Intensitätsunterschied der grünen oder der roten Fluoreszenz, nämlich eine, die Basophile umfaßt, eine, die unreife Granulozyten [Im] und Eosinophile [Eo] umfaßt, und eine andere, die andere Leukozyten [A1] umfaßt. Alternativ wird ein anderes Streulichtdiagramm gebildet, in dem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der grünen oder der roten Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie es in der Figur 5 gezeigt wird. Somit können die Leukozyten in drei Subpopulationen getrennt werden, abhangig von dem Intensitätsunterschied der grünen oder der roten Fluoreszenz und der Intensität des rechtwinkligen Streulichts, nämlich eine, die Basophile [Ba] umfaßt, eine, die unreife Granulozyten [Im] und Eosinophile umfaßt, und eine, die andere Leukozyten [A1] umfaßt. Es ist jedoch mit diesem Verfahren nicht möglich, unreife Granulozyten allein zu klassifizieren und zu zählen.
Wenn die Probe mit Neutralrot allein angefärbt wird, werden Eosinophile andererseits spezifisch rot fluorochromgefärbt. Nach Untersuchung mit einem Durchflußzytometer wird ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie in der Figur 6 gezeigt wird. Alternativ wird ein anderes Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie die Figur 7 zeigt. Somit können Leukozyten in zwei Subpopulationen geteilt werden, abhängig von der Differenz derIntensität der roten Fluoreszenz, nämlich eine, die Eosinophile [Eo] umfaßt, und eine andere, die andere Leukozyten außer Eosinophilen [A2] umfaßt. Es ist jedoch mit diesem Verfahren nicht möglich, unreife Granulozyten allein abzutrennen.
Wenn eine Probe in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in Koexistenz von Astrazongelb 3G und Neutralrot fluorochromgefärbt wird, färbt Astrazongelb 3G spezifisch Basophile und unreife Granulozyten. Das Anfärben von Eosinophilen mit Astrazongelb 3G wird durch Neutralrot unterdrückt und somit wird kein spezifischer Unterschied in der Intensität der grünen Fluoreszenz beobachtet. Eosinophile werden jedoch mit Neutralrot spezifisch rot angefärbt. Nach Untersuchung mit einem Durchflußzytometer wird ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der grünen Fluoreszenz und die Intensität des rechtwinkligen Streulichts auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie in der Figur 8 gezeigt wird. Somit können Leukozyten in drei Subpopulationen auf getrennt werden, nämlich eine, die Basophile umfaßt [Ba], eine, die unreife Granulozyten umfaßt [Im] und eine, die andere Leukozyten umfaßt [A3].
Wenn ein Streulichtdiagramm gebildet wird, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie in der Figur 9 gezeigt wird, können die Leukozyten abhängig von der Differenz der Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz in drei Subpopulationen aufgetrennt werden, nämlich eine, die Basophile [Ba] und unreife Granulozyten [Im] umfaßt, eine, die Eosinophile umfaßt und eine, die andere Leukozyten [A4] umfaßt.
Obwohl der färbende Mechanismus jedes Farbstoffs niemals voll aufgeklärt worden ist, wird angenommen, daß das Anfärben etwa folgendermaßen vonstatten geht. Es ist bereits bekannt gewesen, daß jeder Leukozyt die unten angeführten Substanzen enthält.
1. Basophile enthalten saure Mucopolysaccharide wie Heparin in basophilen Körnchen.
2. Unreife Granulozyten enthalten Mucopolysaccharide in Primärkörnchen.
3. Eosinophile enthalten für Eosinophile charakteristische stark basiche Substanzen in eosinophilen Körnchen.
Es wird angenommen, daß Astrazongelb 3G spezifisch die oben unter 1. und 2. beschriebenen Mucopolysaccharide anfärbt, während neutralrot spezifisch die oben unter 3. beschriebenen stark basischen Substanzen anf ärbt und daher ein Unterschied in der Intensität der Fluoreszenz, wobei Blutkörperchen voneinander getrennt werden können, beobachtet wird, wenn mit einem Durchflußzytometer analysiert wird.
Wie oben beschrieben wurde, können unreife Granulozyten, Basophile und Eosinophile mittels spezifischer Fluoreszenz getrennt werden. Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile jedoch, die in einer Blutprobe enthalten sind, enthalten kaum die oben erwähnten Substanzen und können daher nicht spezifisch angefärbt werden. Obwohl Astrazongelb 3G unspezifisch und schwach Körnchen anfärbt, die in Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen enthalten sind, und somit diese Leukozyten eine schwache Fluoreszenz emittieren, können diese Leukozyten kaum aufgrund der Intensität der Fluoreszenz voneinander getrennt werden. Um diese Leukozyxten zu klassifizieren, wird ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und diejenige der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wird, wie in der Figur 10 gezeigt wirdo Dann werden die Meßwerte einer Subpopulation, die Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile [Lym + Mono + Neut] umfaßt, einem Fenster 1 [W1] entnommen und ein weiteres Streulichtdiagramm wird gebildet, in welchem die Intensität des rechtwinklige Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie es in der Figur 11 gezeigt wird, So können Lymphozyten [Lym], Monozyten [Mono] und Neutrophile in drei Subpopulationen getrennt werden, von denen jede einen einzigen Typ von Leukozyten umfaßt, hauptsächlich abhängig von dem Intensitätsunterschied in dem rechtwinkligen Streulicht.
Eine Arbeitsweise zum Herausnehmen einer einzigen Subpopulation auf einem Streulichtdiagramm, indem sie innerhalb eines Bereichs (z.B. ein Fenster), eingeschlossen wird, die in der Durchflußzytometrie allgemein verwendet wird, wird gewönlich "gating" genannt.
Ferner können Leukozyten in jeder Subpopulation gezählt werden, indem die genannte Subpopulation innerhalb eines Fensters eingeschlossen wird und dann die Blutkörperchen darin gezählt werden.
Die Blutkörperchen können z.B. gezählt werden, indern die Subpopulation [Im] in der Figur 8, die Blutkörperchen enthält, in ein Fenster eingeschlossen wird und dann die Blutkörperchen gezählt werden. In ähnlicher Weise kann jede Leukozytensubpopulation in ein Fenster eingeschlossen werden und anschließend die darin befindlichen Blutkörperchen gezählt werden.
Hämatologische Proben, die gewöhnlich in klinischen Untersuchungslaboratorien analysiert werden, sind peripheres Blut, das andere Blutkörperchen als Leukozyten enthält, hauptsächlich Erythrozyten. Wenn Erythrozyten in Proben enthalten sind, müssen die folgenden Einflüsse wahrgenommen werdeno

Einflüsse der Erythrozyten

Allgemein enthält eine Blutprobe etwa eine Anzahl von 1.000 mal so vielen Erythrozyten als Leukozyten. Erythrozyten werden jedoch niemals mit dem oben erwähnten Fluorochromfärbeverfahren angefärbt und emittieren somit eine geringe Fluoreszenz. Somit üben Erythrozyten keinen Einfluß auf die Klassifikation und das Zählen von unreifen Granulozyten, Eosinophilen und Basophilen aus, von denen alle eine spezifische Fluoreszenz emittieren.
Wenn Leukozyten, die keine spezifische Fluoreszenz emittieren (insbesondere Lymphozyten), klassifiziert und gezählt werden sollen, verursacht jedoch die Gegenwart von Erythrozyten ein Problem. Lymphozyten können z.B. abhängig von der Intensität des Vorwärtsstreulichts oder der Intensität des rechtwinkligen Streulichts nicht vollständig von Erythrozyten getrennt werden. In diesem Fall ist es daher unmöglich, Leukozyten genau zu klassifizieren.
Wenn eine große Menge von Erythrozyten eine Nachweiseinheit eines Durchflußzytometers gleichzeitig mit Leukozyten passiert, wird überdies die Intensität des Streulichtsignals der Leukozyten ungenau und die Klassifikation der Lymphozyten [Lymph], Monozyten [Mono] und Granulozyten [Granul], die vom Streulicht abhängt, wird schwierig. Die Figur 12 zeigt die beobachtete Verteilung der Streulichtintensität von Leukozyten, wenn Erythrozyten gleichzeitig passieren. Der Bereich [R], der mit einer strichpunktierten Linie eingezeichnet ist, bedeutet die Verteilung der Erythrozyten. Wie die Figur 12 zeigt, sind die Intensität des Vorwärtsstreulichts und die Intensität des rechtwinkligen Sreulichts von Erythrozyten identisch mit Lymphozyten und daher können die Lymphozyten nicht von den Erythrozyten getrennt werden. Verglichen mit der Figur 2 (ein Streulichtdiagramm einer Probe, aus welcher der Einfluß von Erythrozyten eliminiert wurde) ist die Verteilung der Intensität des rechtwinkligen Streulichts von jedem Leikozyt erweitert, was es schwierig macht, die Leukozytensubpopulationen voneinander zu trennen. Es ist daher erforderlich, die Einflüsse von Erythrozyten aus einer Blutprobe zu eliminieren, um die Leukozyten exakt zu klassi-fizieren. Obwohl mehrere Verfahren zur Entfernung von Erythrozyten aus einer Blutprobe bekannt waren, sind diese konventionellen Verfahren darin unvorteilhaft, daß z.B. eine mühsame Arbeitsweise erforderlich ist oder daß die Anfärbung von Leukozyten verhindert wird.
Probleme bei dem Färben von Leukozyten sind detailliert in der JP-A-63134958 und der JP-A-63134957 beschrieben. Ferner werden in diesen Druckschriften Verfahren zum Eliminieren des Einflußes von Erythrozyten auf das Anfärben von Leukozyten offenbart. Diese Verfahren können für die Fluorochrom-Färbung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, unerwarteterweise ohne eine wesentliche Modifikation, angewendet werden.
Nunmehr werden diese Verfahren detailliert beschrieben.

Erste Stufe für die Eliminierung der Einflüße von Erythrozyten

In dieser Stufe werden Erythrozyten allein zu Fragmenten reduziert, um die Streulichtintensität der Erythrozyten zu verringern. So knnen die Einflüße auf das Streulicht der Leukozyten aufgrund des gleichzeitigen Durchfließens von Erythrozyten und Leukozyten eliminiert werden und die Erythrozytenfragmente können von den Leukozyten (insbe-sondere Lymphozyten) abgetrennt werden.
Um die Erythrozyten zu Fragmenten zu reduzieren, ohne das Anfärben der Leukozyten zu beeinträchtigen, wird eine hämatologische Probe auffolgende-Weise behandelt. Zuerst wird die hämatologische Probe unter hypotonen und sauren Bedingungen behandelt, um dabei die Erythrozyten zu Fragmenten zu reduzieren. Genauer gesagt werden die Erythrozyten in Ghosts überführt und dann zu Fragmenten reduziert. Wenn die Erythrozyten vollkommen lysiert sind, wird der pH- Wert und der osmotische Druck auf ein Niveau eingestellt, das keine Schädigung der Leukozyten verursacht. Somit können die Erythrozyten zu Fragmenten reduziert werden, ohne die Leukozyten zu schädigen.
Als Ergebnis wird die Streulichtintensität der Erythrozyten auf ein Niveau reduziert, welches der Hälfte bis zu einem Drittel desjenigen der Lymphozyten entspricht. Somit kann der gleichzeitige Durchfluß von Erythrozyten mit Leukozyten in der Praxis vernachlässigt werden.
Wenn dieses Verfahren auf das oben erwähnte Färbeverfahren angewendet wird, kann die Streulichtintensität von Leukozyten mit einer enorm hohen Genauigkeit gemessen werden. Wie z.B. die Figur 13 zeigt, werden die Meßwerte einer Subpopulation [A5], die andere Blutkörperchen als Eosinophile enthält, herausgenommen, indem sie auf einem Streulichtdiagramm, worin die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, in ein Fenster 2 [W2] eingeschlossen werden. Wie die Figur 14 zeigt, wird ein Streulichtdiagramm gebildet, worin die Intensitat der grünen Fluoreszenz und die Intensität des rechtwinkligen Streulichts auf die Koordina-tenachsen bezogen werden. Dann wird die Subpopulation [A5], die andere Blutkörperchen als Eosinophile umfaßt, in sechs Subpopulationen aufgeteilt, nämlich eine, die Basophile [Ba], eine, die Neutrophile [Neut], eine, die Monozyten [Mono], eine, die Lymphozyten und Erythrozytenfragmente [A6], und unerwarteterweise zwei Subpopulationen von unreifen Granub-zyten [Im1] und [Im2], umfaßt. Jede der Leukozytensubpopula-tionen wird in ein Fenster eingeschlossen und die Leukozyten darin werden gezählt. Diese sechs Subpopulationen können klassifiziert und gezählt werden.
Andererseits wird, wie die Figur 15 zeigt, die Subpopulation [A7], die Erythrozytenfragmente und Plättchen umfaßt, eliminiert und die Meßwerte der Subpopulation [A8], die allein Leukozyten umfaßt, werden herausgenommen, abhängig von der Differenz in der Intensität des Vorwärtsstreulichts. Dann wird ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden (Figur 16). So werden die Leukozyten in Eosinophile [Eo] und in eine Subpopulation, die andere Leukozyten als Eosinophile umfaßt [A9], aufgetrennt. Ferner wird die Subpopulation [A9] mit dem Fenster 4 [W4] herausgenommen und ein Streulichtdiagramm wird gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wird, wie in der Figur 17 gezeigt wird. So wird die Subpopulation [A9] in sechs Subpopulationen aufgetrennt, nämlich eine, welche Lymphozyten [Lym], eine, die Monozyten [Mono], eine, die Neutrophile [Neut], eine, die Basophile [Ba], eine, die unreife Granulozyten 1 [Im1], und eine andere, die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt. Es können daher in diesem Falle sieben Leukozytensubpopulationen klassifiziert und gezählt werden.

Zweite Stufe für die Eliminierung der Einflüße von Erythrozyten

Um Leukozyten (insbesondere Lymphozyten), welche nicht mit dem oben erwähnten Astrazongelb 3G oder Neutralrot angefärbt werden, von Erythrozyten zu trennen, werden die Leukozyten mit einem dritten Farbstoff behandelt, der imstande ist, statt unspezifisch Leukozyten zu färben, die Leukozyten exklusivzu färben. Dann werden Erythrozyten abhängig von der Differenz in der Intensität der Fluoreszenz von Leukozyten getrennt.
Ein Fluoreszenzfarbstoff, der hier verwendet werden soll, wird unter jenen ausgewählt, die niemals die spezifische Anfärbung mit Astrazongelb 3G oder Neutralrot hemmen und Substanzen färben können, die exklusiv in Leukozyten enthalten sind. Komponenten, die in Leukozyten vorkommen, enthalten allein Nuclei und Cytoplasma, da Eosinophile weder Nuclei noch Cytoplasma aufweisen.
Dementsprechend sollte hier ein Farbstoff ausgewählt werden, der fähig ist, entweder Nuclei oder Cytoplasma oder beide dieser Substanzen anzufärben. Beispiele für einen Farbstoff, der diese Erfordernisse erfüllt, sind folgende.
(1) Astrazonorange R (CI-No. 48.040, CU Basisorange 22)
(2) Astraviolett (CI-No. 48070, Basisrot 12)
(3) Rhodamin 6G (CI-No. 45160)
(4) Rhodamin 19
(5) Rhodamin B (CI-No. 45170, Basisviolett 10)
(6) Rhodamin 3GO (CI-No. 45210, Basisrot 3)
(7) Pyronin B (CI-No. 45010)
(8) Cyanosin
(9) 3,3'-Dimethylthio-carbocyaniniodid
(10) 3,3'-Diethylthio-carbocyaniniodid
(11) 3,3'-Dipropyloxa-carbocyaniniodid
(12) 3,3'-Dihexyloxa-carbocyaniniodid
(13) 3,6-Bis-(dimethylamino)-10-dodecyl-acridiniumbromid
(14) 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol
(15) 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol
(16) Astrazonrot 68 (CI-NO. 48020, Basisviolett 7).
Obwohl die Effekte dieser Farbstoffe von uns bestätigt wurden, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese beschränkt. Es kann nämlich jeder Farbstoff verwendet werden, der die oben genannten Erfordernisse erfüllt.
Wenn dieses Verfahren mit dem oben erwähnten Färbeverfahren kombiniert wird, können Leukozyten schließlich in mindestens sechs Subpopulationen klassifiziert werden, welche Eosinophile, unreife Granulozyten, Basophile, Neutrophile, Monocyten und Lymphozyten umfassen, und die in jeder Subpopulation enthaltenen Blutkörperchen können gezählt werden. Wenn ein Streulichtdiagramm gebildet wird, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden (Figur 18), werden z.B. eine Subpopulation, die andere Blutkörperchen als Leukozyten [A10] umfaßt, eine Subpopulation, die Eosinophile [Eo] umfaßt, eine Subpopulation, die andere Leukozyten als Eosinophile [A11] umfaßt, beobachtet werden und die Eosinophilen können klassifiziert und gezählt werden.
Dann werden die Meßwerte der Subpopulation [A11], die andere Leukozyten als Eosinophile umfaßt, mit einem Fenster 5 [W5] herausgenommen und ein Streulichtdiagramm wird gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie es in der Figur 19 gezeigt wird. So wird die Leukozytensubpo-pulation [A11] in fünf Subpopulationen geteilt, nämlich eine, die Lymphozyten [Lym] umfaßt, eine, die Monozyten [Mono] umfaßt, eine, die Neutrophile umfaßt, eine, die Basophile umfaßt, und die Leukozyten in jeder Subpopulation können klassifiziert und gezählt werden.
Bei diesem Verfahren kann jedoch das Phänomen nicht verneint werden, daß der gleichzeitige Durchfluß von Erythrozyten und Leukozyten die Streulichtintensität der Leukozyten etwas ungenau macht. Somit ist es schwierig, unreife Granulozyten in zwei Gruppen zu teilen.

Drittes Verfahren zur Eliminierung der Einflüsse von Erythrozyten

Die zwei Stufen zur Eliminierung der Einflüsse von Erythrozyten, wie sie oben beschrieben sind, können entweder getrennt oder gleichzeitig auf das oben erwähnte Verfahren zum Anfärben von Leukozyten, ohne wesentliche Modifikation, angewendet werden. Somit können alle Leukozyten einschließlich Lymphozyten von anderen Blutkörperchen abgetrennt werden und können abhängig von der Differenz in der Intensität der Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichts genau gemessen werden. Wenn ein Streulichtdiagramm gebildet wird, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und die Intensität der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden, wie es in der Figur 20 gezeigt wird, werden drei Subpopulationen beobachtet, nämlich eine, die andere Blutkörperchen als Leukozyten [A12] umfaßt, eine, die Eosinophile [Eo] umfaßt, und eine, die andere Leukozyten als Eosinophile [A13] umfaßt. So können Eosinophile klassifiziert und gezählt werden.
Dann werden die Meßwerte der Subpopulation [A13] herausgenommen, indem sie innerhalb eines Fensters 6 [W6] eingeschlossen werden, und ein Streulichtdiagramm wird gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen werden (siehe Figur 21). So werden sechs Subpopulationen gebildet, einschließlich einer, die Lymphozyten [Lym] umfaßt, einer, die Monozyten [Mono] umfaßt, einer, die Neutrophile umfaßt, einer, die Basophile [Ba] umfaßt, einer, die unreife Granulozyten 1 [Im1] umfaßt und einer anderen, die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt, und die Leukozyten in jeder Subpopulation können klassifiziert und gezghlt werden.
Nun werden die Strukturformeln des Farbstoffs angegeben, der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll. Astrazongelb 3G (CI-No. 48.055, CI Basisgelb 11) Neutralrot (CI-NO. 50.040, CI Basisrot 5) Astrazonorange R (CI-No. 48.040, CU Basisorange 22) Astrazonviolett (CI-NO. 48070, Basisrot 12) Rhodamin 6G (CI-No. 45160)
In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;HC&sub2;H&sub5;,
R&sub2;: -NH-C&sub2;H&sub5;,
R&sub3;: -COOC&sub2;H&sub5;,
R&sub4;, R&sub5;: -CH&sub3;.
Rhodamin 19
In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;H-C&sub2;H&sub5;,
R&sub2;: -NH-C2H5,
R&sub3;: -COOH,
R&sub4;, R&sub5;: -CH&sub3;.
Rhodamin B (CI-No. 45.170, Basisviolett 10)
In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;H&sub2;,
R&sub2;: -NH&sub2;,
R&sub3;: -COOCH&sub3;,
R&sub4;, R&sub5;: -H.
Rhodamin 3GO (CI-No. 45210,- Basisrot 3)
In der Formel (I), R&sub1;: =N&spplus;H-CH&sub3;,
R&sub2;: -NH&sub2;,
R&sub3;: -COOCH&sub3;,
R&sub4;: -CH&sub3;,
R&sub5;: -H. Pyronin B (CI-No. 45010) Cyanosin 3,3'-Dimethylthio-carbocyaniniodid
In der Formel (II), R&sub1;: -CH&sub3;,
R&sub2;: -S-.
3,3'-Diethylthio-carbocyaniniodid
In der Formel (II), R&sub1;: -C&sub2;H&sub5;,
R&sub2;: -S-.
3,3'-Dipropyloxa-carbocyaniniodid
In der Formel (II), R&sub1;: -C&sub3;H&sub7;,
R&sub2;: -O-.
3,3'-Dihexyloxa-carbocyaniniodid
In der Formel (II), R&sub1;: -C&sub6;H&sub1;&sub3;,
R&sub2;: -O-. 3,6-Bis-(dimethylamino)-10-dodecyl-acridiniumbromid 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol Astrazonrot 68 (CI-NO. 48.020, Basisviolett 7)
Die Bezeichnung "hämatologische Probe", wie sie hier verwendet wird, bedeutet eine biologische Probe, die hauptsächlich Blutzellen enthält, welche aus dem peripheren Blut oder aus dem Knochenmark eines Tieres (insbesondere eines Menschen) erhalten wurde. Ein bevorzugtes Beispiel hierfür ist venöses Blut, welches mit einem Antikoagulans behandelt wurde. Ferner kann in der vorliegenden Erfindung eine Probe bevorzugt verwendet werden, die erhalten wurde, indem vorher andere Blutkörperchen als Leukozyten aus der oben erwähnten hämatologischen Probe mittels eines geeigneten Verfahrens, wie Dichtegradient-Zentrifugieren, eliminiert wurden.
Die Bezeichnungen "Basophile" bezw. "Eosinophile", wie sie hier verwendet werden, bedeuten Basophile und Eosinophile, die mit dem manuellen Verfahren mittels Romanowsky-Färbung identifiziert wurden. Unreife Granulozyten bestehen aus Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten, identifiziert mit dem manuellen Verfahren. Die oben erwähnten zwei Gruppen von unreifen Granulozyten umfassen die unreifen Granulozyten Gruppe 1, die hauptsächlich Promyelozyten umfaßt, in welchen das Vorhandensein von Primärkörnchen (Azurgranula) identifiziert wird, und eine andere Gruppe 2, die hauptsächlich Myelozyten und Metamyelozyten umfaßt, in welchen wenige Primärkörnchen identifiziert werden.
Ein Durchflußzytometer ist eine Vorrichtung, mit welcher mindestens drei optische Meßwerte (rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz, rechtwinkliges Streulicht), bevorzugt vier optische Meßwerte (Vorwärtsstreulicht und die oben erwähnten drei Faktoren) gemessen werden können, wie in der Figur 1 gezeigt wird. Somit können Zelltypen abhängig von diesen vier optischen Meßwerten analysiert werden. In der vorliegenden Erfindung können ein üblicher im Handel befindlicher Durchflußzytometer oder solche, die hiermit vergleichbar sind, verwendet werden. Eine detaillierte Beschreibung des Durchflußzytometers wird später geliefert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine hämatologische Probe mit einer wäßrigen Lösung gemischt, die Asztrazongelb 3G in einer Menge, die mindestens für die spezifische Färbung von Basophilen und unreifen Granulozyten ausreicht, Neutralrot in einer Menge, die für die spezifische Färbung der Eosinophilen ausreicht, und einen Puffer zur Einstellung des pH-Werts auf ein Niveau, das geeignet ist für die spezifische Färbung von Basophilen, unreifen Granulozyten und Eosinophilen in der genannten hämatologischen Probe umfaßt, um hiermit mindestens die Basophilen, unreifen Granulozyten und Eosinophilen spezifisch fluorochromzufärben. Die Menge von Astrazongelb 3G, die für die spezifische Färbung von Basophilen und unreifen Granulozyten ausreicht, entspricht einer Konzentration von 50 mg/l oder darüber in der wäßrigen Lösung. Es wurde bestätigt, daß die obere Grenze der Konzentration von Astrazongelb 3G, um die Effekte der vorliegenden Erfindung zu ereichen, bei 1.000 mg/l liegt. Das bedeutet jedoch nicht, daß die Effekte der vorliegenden Erfindung bei einer Konzentration, die das obige Niveau übersteigt, aufhören würden.
Die Menge von Neutralrot, die für die spezifische Färbung von Eosinophilen ausreicht, entspricht einer Konzentration von 1 mg/l oder darüber in der wäßrigen Lösung. Die Konzentration von Neutralrot liegt noch mehr bevorzugt im Bereich von 1/50 bis 1/10 der Konzentration von Astrazon-gelb 3G. Die Färbung mit Astrazongelb 3G konkuriert mit der Färbung mit Neutralrot, daher würde eine extrem hohe Konzentration von Neutralrot im Vergleich zu der Konzentration von Astrazongelb 3G nicht nur das Färben von Eosinophilen mit Astrazongelb 3G verhindern, sondern auch das spezifische Färben von Basophilen und unreifen Granulozyten.
Der pH-Wert der Mischung der genannten wäßrigen Lösung mit der hämatologischen Probe, der geeignet ist für die spezifische Färbung von Basophilen, unreifen Granulozyten und Eosinophilen, liegt im Bereich von 7,0 bis 11,0, noch mehr bevorzugt von 7,5 bis 10,0. Wenn der pH-Wert der Mischung niedriger ist als 7,0, können Basophile und unreife Granulozyten kaum mit Astrazongelb 3G effektiv gefärbt werden. Wenn der pH-Wert 11,0 übersteigt, können andererseits Leukozyten ernsthaft beschädigt und oft in ihrer Form geändert werden. Ferner verursacht in diesem Fall die Zersetzung von Astrazongelb 3G die Bildung von Ausfällungen, welche die Messung mit einem Durchflußzytometer stören.
Die am meistern geeignete Arbeitsweise, um den pH- Wert der Mischung auf einem für das Färben geeigneten Niveau zu halten, ist die Verwendung eines Puffers. Jeder Puffer kann in der vorliegenden Erfindung beliebig ohne Einschränkung verwendet werden, so lange sein pka (Säuredissoziationskonstante) um 9,0 + 2,0 herum liegt. Die Konzentration des Puffers kann bevorzugt in dem Bereich von 5 bis 100 mM/l liegen, obwohl sie nicht besonders eingeschränkt ist. Bei der Verwirklichung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist, die Verwendung eines Puffers nicht unbedingt erforderlich. Es kann nämlich jede andere Methode verwendet werden, um den pH- Wert von 7,0 bis 11,0 einzustellen.
Das Mischungsverhältnis pro Volumen der hämatologischen Probe zu der wäßrigen Losung ist nicht speziell beschränkt. Bei der Messung mit einem Durchflußzytometer kann das Mischungsverhältnis bevorzugt im Bereich von 1 : 5 bis 1 : 200 liegen.
Die Zeit, die bis zur Beendigung der Färbung benötigt wird, hängt etwas von der Temperatur ab. Bei Raumtemperatur (18 bis 25&sup5;C) kann die Färbung innerhalb von 10 bis 40 Sekunden beendet werden. Die Färbungszeit wird bei einer höheren Temperatur etwas verkürzt und, im Gegensatz hierzu, bei einer niedrigeren Temperatur etwas verlängert.
Um die Beschädigung der Leukozyten zu verhindern und um mindestens die Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile in einer Form zu erhalten, die für eine Abtrennung abhängig von Streulicht erforderlich ist, kann der osmotische Druck im Bereich von 100 bis 500 mOsm/kg, mehr bevorzugt von 200 bis 400 mOsm/kg liegen.
Wenn der osmotische Druck nicht in dem Bereich liegt, wie er oben vorgegeben ist, wird empfohlen, ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zu der wäßrigen Lösung zuzugeben. Als die Osmolarität kompensierendes Mittel können bevorzugt solche verwendet werden, die allgemein für die Aufrechterhaltung von biologischen Zellen auf einem physiologischen osmotischen Druck verwendet werden (z.B. Alkalimetallsalze und Saccharide), obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Wenn die so erhaltene Probe mit einem Durchflußzytometer untersucht wird, können Leukozyten in wenigstens drei Subpopulationen getrennt werden, die Basophile [Ba], unreife Granulozyten [Im] und Eosinophile [Eo] umfassen, wie die Figuren 8 und 9 zeigen. So kann jede Subpopulation klassifiziert und gezählt werden.
Nun wird ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe beschrieben, worin eine Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozy-ten einen ersten Teilschritt der Lysierung von Erythrozyten umfaßt.
Zuerst wird eine hämatologische Probe mit einer ersten wäßrigen Lösung gemischt, die einen sauren pH aufweist und hypoton ist, und so werden die Erythrozyten in Ghosts überführt und dann zu Fragmenten reduziert.
Nach Vollendung der Lyse der Erythrozyten wird eine zweite wäßrige Lösung, welche einen Puffer für die Neutralisation der Säure und ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Regelung des osmotischen Drucks auf einem Niveau zur Beibehaltung der Form der Leukozyten, zu der Mischung zugegeben, bevor die Leukozyten morphologische Änderungen durchmachen. So wird eine hämatologische Probe erhalten, aus der die Einflüsse von Erythrozyten eliminiert worden sind.
Die obige Stufe für die Reduktion von Erythrozyten allein in Fragmente unter Verwendung einer sauren subtonischen Lösung wird detaillierter in der JP-A-63134957 beschrieben.
Die hämatologische Probe, aus der die Einflüsse von Erythrozyten eliminiert wurden, wie es oben beschrieben wurde, wird dann mit Astrazongelb G3 und Neutralrot fluorochromgefärbt. So wird eine Probe zur Messung mit einem Durchflußzytometer erhalten.
Die Bezeichnung "sauer", wie sie oben benutzt wurde, bedeutet bevorzugt einen pH-Wert von 2,0 bis 5,0, mehr bevorzugt von 2,5 bis 4,0.
Der Puffer, der in der ersten Lösung verwendet werden soll, ist nich speziell beschränkt und solche mit einem pKa von 3,0 ± 2,0 können hierfür bevorzugt verwendet werden.
Der Puffer wird in einer Konzentration verwendet, die erforderlich ist, um den pH-Wert der Mischung von 2,0 bis 5,0 zu halten. Es wird bevorzugt, daß die Pufferkonzentration im Bereich von 5 bis 50 mM/l liegt.
Wenn der pH-Wert niedriger als 2,0 ist, wird die spezifische Färbung von Leukozyten offensichtlich gehindert. Wenn der pH-Wert 5,0 übersteigt, wird andererseits die Reduktion von Erythrozyten in Fragmente offensichtlich gehemmt.
Die Bezeichnung "hypotonisch", wie sie oben verwendet wird, bedeutet einen osmotischen Druck von 100 mOsm/kg oder darunter. Wenn der osmotische Druck 100 mOsm/kg übersteigt, wird die Reduktion von Erythrozyten in Fragmente offensichtlich gehemmt.
Die Reaktionszeit der ersten wäßrigen Lösung mit der hämatologischen Probe, die für die Reduktion von Erythrozyten in Fragmente benötigt wird, hängt etwas von der Temperatur ab. Bei Raumtemperatur (18 bis 25ºC) ist sie innerhalb von 5 bis 20 Sekunden vollendet.
Die Reaktionszeit wird bei einer höheren Temperatur etwas verkürzt und, im Gegensatz hierzu, bei einer niedrigeren Temperatur etwas verlängert.
Die Stufe für die spezifische Fluorochromfärbung von Basophilen, unreifen Granulozyten und Eosinophilen kann gleichzeitig mit der Stufe für die Reduktion der Erythrozyten in Fragmente durchgeführt werden.
Dies kann z.B. folgendermaßen erreicht werden. Zuerst wird eine hypotonische (und saure) erste wäßrige Lösung, die Astrazongelb G3 und Neutralrot für die spezifische Färbung von Leukozyten und einen Puffer, um die Lösung sauer zu halten, umfaßt, mit einer härnatologischen Probe gemischt und so werden die Erythrozyten zu Fragmenten reduziert. Dann wird ferner eine zweite wäßrige Lösung zugegeben, die einen Puffer zur Neutralisierung der genannten Säure in dem Puffer in der ersten Lösung und zum Aufrechterhalten eines pH, der für die Färbung geeignet ist, und ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Regelung des osmotischen Drucks auf einem Niveau zur Beibehaltung der Form der Leukozyten umfaßt.
Wenn die Probe, die mit diesem Verfahren vorbereitet wurde, mit einem Durchflußzytometer untersucht wird, können Leukozyten in sechs Subpopulationen getrennt werden, nämlich eine, die Eosinophile [Eo] umfaßt, eine, die Monozyten [Mono] umfaßt, eine, die Neutrophile [Neut] umfaßt, eine, die Basophile [Ba] umfaßt, eine, die unreife Granulozyten 1 [Im1] umfaßt und eine andere, die die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt, wie die Figuren 13 und 14 zeigen. So kann jeder Leukozyt klassifiziert und gezählt werden.
In dem obigen Beispiel enthalten die optischen Informationen, die gemessen werden sollen, drei Faktoren, das heißt grüne Fluoreszenz, rote Fluoreszenz und rechtwinkliges Streulicht. Wenn vier optische Faktoren gemessen werden (Vorwärtsstreulicht wird zu den oben erwähnten dreien hinzugefügt), können Leukozyten in sieben Subpopulationen getrennt werden, nämlich eine, die Eosinophile umfaßt, eine, die Lymphozyten [Lym] umfaßt, eine, die Monozyten [Mono] umfaßt, eine, die Neutrophile [Neut] umfaßt, eine, die Basophile [Ba] umfaßt, eine, die unreife Granulozyten 1 [Im1] umfaßt und eine andere, die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt, wie die Figuren 15, 16 und 17 zeigen. So kann jeder Leukozyt klassifiziert und gezählt werden.
Nun wird ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe beschrieben werden, worin eine Stufe zur Eliminierung des Einflußes der Erythrozyten eine zweite Stufe zum Färben ausschließlich von Leukozyten umfaßt.
In dieser zweiten Stufe wird ein Farbstoff verwendet, der fähig ist, Leukozyten (insbesondere Lymphozyten) zu färben, die nicht mit Astrazongelb 3G oder Neutralrot fluorochromgefärbt werden, ohne die Färbung mit Astrazongelb 3G oder Neutralrot zu behindern. So wird eine Probe zur Trennung von Leukozyten von Erythrozyten abhängig von der Differenz der Fluoreszenzintensität bei der Messung mit einem Durchflußzytometer erhalten.
Der Farbstoff, der in dieser Stufe verwendet werden soll, kann aus solchen ausgewählt werden, die fähig sind, Substanzen zu färben, die in Leukozyten allein enthalten sind, ohne Erythrozyten zu färben. Für diesen Zweck muß ein Farbstoff verwendet werden, der fähig ist, entweder Nuclei oder Cytoplasma oder beide von ihnen zu färben.
Spezielle Beispiele von Farbstoffen, die für diesen Zweck verwendbar sind, sind folgende.
(1) Astrazonorange R (CI-No. 48040, CU Basisorange 22)
(2) Astraviolett (CI-No. 48070, Basisrot 12)
(3) Rhodamin 6G (CI-No. 45160)
(4) Rhodamin 19
(5) Rhodamin B (CI-No. 45170, Basisviolett 10)
(6) Rhodamin 3G0 (CI-No. 45210, Basisrot 3)
(7) Pyronin B (CI-No. 45010)
(8) Cyanosin
(9) 3,3'-Dimethylthio-carbocyaniniodid
(10) 3,3'-Diethylthio-carbocyaniniodid
(11) 3,3'-Dipropyloxa-carbocyaniniodid
(12) 3,3'-Dihexyloxa-carbocyaniniodid
(13) 3,6-Bis-(dimethylamino)-10-dodecyl-acridiniumbromid
(14) 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol
(15) 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol
(16) Astrazonrot 68 (CI-No. 48020, Basisviolett 7).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine hämatologische Probe mit einer wäßrigen Lösung gemischt, die Astrazongelb 3G, welches fähig ist, Basophile und unreife Granulozyten spezifisch zu färben, Neutralrot, welches fähig ist, Eosinophile spezifisch zu färben, einen Puffer zum Einstellen des pH-Werts der Mischung auf ein Niveau, welches zum Färben geeignet ist und mindestens einen Farbstoff, ausgewählt aus den oben genannten, umfaßt. Die wäßrige Lösung kann ferner ein die Osmolarität kompensierendes Mittel enthalten.
Die optimale Konzentration des Farbstoffs, der fähig ist, mindestens eines von Nuclei und Cytoplasma der Leukozyten zu färben, variiert von Farbstoff zu Farbstoff. Daher muß die optimale Konzentration experimentell bestimmt werden.
Wenn die Probe, die mit diesem Verfahren vorbereitet wurde, mit einem Durchflußzytometer untersucht wird, können die Leukozyten in sechs Subpopulationen getrennt werden, die jeweils Eosinophile [Eo], Lymphozyten [Lym], Monozyten [Mono], Neutrophile [Neut], Basophile [Ba] und unreife Granulozyten [Im] umfassen, wie die Figuren 18 und 19 zeigen. So kann jeder Leukozyt klassifiziert und gezählt werden.
Diese zweite Stufe zum Färben der Nuclei oder des Cytoplasmas kann gleichzeitig mit der ersten Stufe zur Reduzierung der Erythrozyten in Fragmente durchgeführt werden.
Das kann z.B. folgendermaßen erreicht werden. Zuerst wird eine saure und hypotone erste wäßrige Lösung, die Astrazongelb 3G und Neutralrot zum spezifischen Färben von Leukozyten und mindestens einen Farbstoff, ausgewählt aus jenen, die oben aufgezählt sind, und einen Puffer, um die Lösung sauer zu halten, umfaßt, mit einer hämatologischen Probe gemischt und die Erythrozyten werden so zu Fragmenten reduziert. Dann wird ferner eine zweite wäßrige Lösung zugegeben, die einen Puffer zur Neutralisierung der genannten Säure in dem Puffer in der ersten Lösung und zum Aufrechterhalten eines pH-Werts, der für die Färbung geeignet ist, und ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Regelung des osmotischen Drucks auf einem Niveau zur Beibehaltung der Form der Leukozyten, umfaßt.
Wenn die Probe, die mit diesem Verfahren vorbereitet wurde, mit einem Durchflußzytometer untersucht wird, können die Leukozyten in sieben Subpopulationen getrennt werden, nämlich eine, die Eosinophile [Eo] umfaßt, eine, die Lymphozyten [Lym] umfaßt, eine, die Monozyten [Mono] umfaßt, eine, die Neutrophile [Neut] umfaßt, eine, die Basophile [Ba] umfaßt, eine, die unreife Granulozyten 1 [Im1] umfaßt und eine andere, die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt, indem einfach drei optische Signale (das heißt rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz, rechtwinkliges Streulicht) gemessen werden, wie die Figuren 20 und 21 zeigen. So kann jeder Leukozyt klassifiziert und gezählt werden.

Beispiele

Um eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weiter zu erläutern, und nicht um sie einzuschränken, werden die folgenden Beispiele geliefert.
Nun wird ein Durchflußzytometer, wie er bei der Verwirklichung der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, erläutert. Die Figur 1 ist eine schematische Abbildung, welche die Konstruktion eines üblichen Durchflußzytometers zeigt. In der Figur 1 ist 1 eine Lichtquelle des Durchflußzytometers, von der Licht mit einer Wellenlänge, die für die Erregung der spezifischen Fluoreszenz mindestens von Eosinophilen, Basophilen und unreifen Granulozyten, die mit Astrazongelb 3G und Neutralrot gefärbt sind, geeignet ist, emittiert wird. Als Lichtquelle 1 wird bevorzugt ein Argonionenlaser oder ein Quecksilberlichtbogen, die fähig sind, Licht mit einer wellenlänge von 400 bis 520 nm zu emittieren, verwendet. Das Licht von der Lichtquelle wird in einen Durchflußbereich von Partikeln 20 mit einer Linse 2 in der Form eines flachen Kreises kondensiert und ein Partikel 13 (Zelle usw.), das hindurchfließt, wird damit bestrahlt. So wird Vorwärtsstreulicht 21 von dem Partikel 13 vorwärts emittiert, während rote Fluoreszenz 22, grüne Fluoreszenz 23 und rechtwinkliges Streulicht 24 von diesem seitwärts emittiert werden.
Die Partikel strömen aus einer Düse 17, die von einer Abschirmungsflüssigkeit umhüllt ist, die von einem Zulauf der Abschirmungsflüssigkeit 14 versorgt wird und dann einen Abschirmungsdurchfluß in einer Durchflußzelle bildet.
Direktes Licht wird aus dem Vorwärtsstreulicht 21 mit einem Strahlenhemmer 5 entfernt und das Streulicht wird zu einer Lichtnachweiseinheit 6 über eine Kondensorlinse 4 weiterbefördert. Andererseits wird das seitwärts emittierte Licht 22, 23 und 24 zu Lichtnachweiseinheiten über eine Kondensorlinse 3 weiterbefördert. Das rechtwinklige Streulicht 24 wird auf einem dichromatischen Spiegel 10 reflektiert und dann zu einer Lichtnachweiseinheit 7 weiterbefördert. Die rote Fluoreszenz 22 wird auf einem dichromatischen Spiegel 11 reflektiert und zu einer Lichtnachweiseinheit 8 weiterbefördert. Die grüne Fluoreszenz 23 geht durch einen dichromatischen Spiegel 11 hindurch und wird zu einer Lichtnachweiseinheit 9 weiterbefördert. Dann wird das Licht, das zu den Lichtnachweiseinheiten 6, 7, 8 bezw. 9 befördert wurde, in elektrische Signale umgewandelt, die in einer Signal-Aufbereitungseinheit 15 verstärkt und in einer Analyseneinheit 16 analysiert wird.
Die Bezeichnung "Vorwärtsstreulicht", die hier verwendet wird, bedeutet Streulicht, das von einer Zelle, die durch eine Nachweiseinheit durchfließt, mit einem engen Winkel von fast 0º, bezogen auf die Emissionsachse der Lichtquelle, emittiert wird.
Die Bezeichnung "rechtwinkliges Streulicht", wie sie hier verwendet wird, bedeutet Streulicht, das von einer Zelle emittiert wird und mit einem Winkel von nahezu 90º, bezogen auf die Emissionsachse der Lichtquelle, nachgewiesen werden muß. Die Bezeichnung "rote Fluoreszenz" bedeutet eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 560 nm und darüber unter solchen, die von einer Zelle in allen Richtungen emittiert werden. Eine Fluoreszenz von nahezu 0º oder 90º von der Emissionsachse einer Lichtquelle kann mit einem üblichen Durchflußzytometer kondensiert werden.
Die Bezeichnung "grüne Fluoreszenz" bedeutet eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge um 520 bis 560 nm unter solchen, die von einer Zelle in allen Richtungen emittiert werden. Eine Fluoreszenz von nahezu 0º oder 90º von der Emissionsachse einer Lichtquelle kann mit einem üblichen Durchflußzytometer kondensiert werden.
Nun werden die Behandlungsstufen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Beispiele beschrieben werden. Die Reagentien, die in diesen Beispielen verwendet werden, werden aus im Handel erhältlichen analysenreinen chemischen Materialien hergestellt. Ein Durchflußzytometer mit einer Konstruktion, die ähnlich derjenigen in der Figur 1 gezeigten ist, wurde für die Auswertung verwendet.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe gezeigt, die verwendet werden soll, um Leukozyten in mindestens drei Subpopulationen zu trennen (nämlich eine, die Eosinophile umfaßt, eine, die Basophile umfaßt, und eine, die unreife Granulozyten umfaßt), indem drei optische Faktoren, umfassend rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz und rechtwinkliges Streulicht, gemessen werden.
Zusammensetzung Beispiel 1:
Astrazongelb 3G 300 mg
Neutralrot 20 mg
TRIS 3,6 g
NaOH ausreichend zur Einstellung des pH = 9,
NaCl ausreichend zur Einstellung des
osmotischen Drucks = 280 mOsm/kg
Gereinigtes Wasser 1 l.
0,95 ml eines Reagens der obigen Zusammensetzung Beispiel 1 wurden mit 0,05 ml peripherem Blut gemischt und dann 10 Sekunden oder länger stehen gelassen. So wurde eine Probe für die Untersuchung erhalten. Die Leukozyten wurden durch Messung der roten Fluoreszenz, der grünen Fluoreszenz und des rechtwinkligen Streulichts jeder Zelle mit einem Durchflußzytometer und anschließender Analyse der erhaltenen Meßwertde, z.B. mit der folgenden Methode, gemessen und gezählt. Es wurde nämlich ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie es in der Figur 22 gezeigt wird. So wurden mindestens zwei Subpopulationen einschließlich einer, die Eosinophile [Eo] umfaßt, und einer anderen, die andere Blutkörperchen [A14] umfaßt, erhalten. Dann wurden Eosinophile allein mit einem Fenster 11 [W11] herausgenommen ("gated") und gezählt. Als nächstes wurden die Meßergebnisse von Blutkörperchen, die nicht Eosinophile sind, mit einem Fenster 12 [W12] herausgenommen ("gated") und ein Streulichtdiagramm wurde gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie es in der Figur 23 gezeigt wird. So wurden die Leukozyten in drei Subpopulationen getrennt, einschließlich einer, die Basophile [Ba] umfaßt, einer, die unreife Granulozyten umfaßt [Im] und einer, die andere Blutkörperchen [A15] umfaßt. Die Basophilen und unreifen Granulozyten wurden mit einem Fenster 13 [W13] bezw. einem anderen Fenster 14 [W14] herausgenommen ("gated") und anschließend gezählt.
Die Bezeichnung "Fenster", wie sie hier verwendet wird, bedeutet einen spezifischen Bereich in einem Streulichtdiagramm, während die Bezeichnung "herausnehmen" ("gating"), wie sie hier verwendet wird, eine Arbeitsweise bedeutet, bei der ausschließlich die Meßdaten des Bereichs, der mit einem Fenster definiert ist, herausgenommen werden. Ferner können die Meßwerdte in einem Fenster durch Aufzeichnen eines spezifischen Bereichs mit dem Fenster gezählt werden.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird ein Verfahren gezeigt, welches eine erste Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozyten umfaßt, um eine Probe vorzubereiten, die verwendet werden soll, um Leukozyten in mindestens sechs Subpopulationen durch Messung von drei optischen Faktoren, einschließlich roter Fluoreszenz, grüner Fluoreszenz und rechtwinkligem Streulicht, auf zutrennen. Zusammensetzung Beispiel 2:
Erste Reagentienlösung:
Astrazongelb 3G 300 mg
Neutralrot 20 mg
Citronensäuremonohydrat 2,10 g (pH 2,62)
Gereinigtes Wasser 1 l
Zweite Reagentienlösung:
TRIS 36,3 g
NaCl 58,4 g
NaOH 18,8 g
Gereinigtes Wasser 1 l
0,90 ml der ersten Reagentienlösung der obigen
Zusammensetzung Beispiel 2 wurden mit 0,05 ml peripherem Blut gemischt und dann 5 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. Dann wurden weiter 0,10 ml der zweiten Reagentienlösung zugegeben und die erhaltene Mischung wurde über weitere 10 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. So wurde eine Probe für die Untersuchung erhalten. Die Leukozyten wurden klassifiziert und gezählt, indem die rote Fluoreszenz, die grüne Fluoreszenz und das senkrechte Streulicht jeder Zelle mit einem Durchflußzytometer gemessen und dann die erhaltenen Meßwerte mit beispielsweise folgendem Verfahren analysiert wurden. Es wurde nämlich ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachse bezogen wurden, wie in der Figur 24 gezeigt wirdo So wurden mindestens zwei Subpopulationen einschließlich einer, die Eosinophile [Eo] umfaßt, und einer anderen, die andere Blutkörperchen [A16] umfaßt, erhalten. Dann wurden Eosinophile allein innerhalb eines Fensters 21 [W21] herausgenommen ("gated") und gezählt. Als nächstes wurden die Meßwerte der Subpopulation [A16], welche andere Blutkörperchen als Eosinophile umfaßt, mit einem Fenster 22 [W22] herausgenommen ("gated") und ein Streulichtdiagramm wurde gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie die Figur 25 zeigt. So wurden die Leukozyten in sechs Subpopulationen getrennt, nämlich eine, die Monozyten [Mono) umfaßt, eine, die Neutrophile umfaßt, eine, die unreife Granulozyten 1 [Im1] umfaßt, eine andere, die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt, eine, die Basophile [A17] umfaßt.
Die Basophilen, die unreifen Granulozyten 1, die unreifen Granulozyten 2, die Monozyten und die Neutrophilen wurden jeweils mit einem Fenster 23 [W23], einem Fenster 24 [24], einem Fenster 25 [W25), einem Fenster 26 [W26] und einem Fenster 27 [W27] herausgenommen ("gated") und anschließend gezählt.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird ein Verfahren gezeigt, welches eine erste Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozyten enthält, um eine Probe vorzubereiten, die verwendet werden soll, um Leukozyten in mindestens sieben Subpopulationen auf zutrennen, indem vier optische Faktoren, einschließlich roter Fluoreszenz, grüner Fluoreszenz, rechtwinkligem Streulicht und Vorwärtsstreulicht gemessen werden.
0,90 ml der ersten Reagentienlösung der obigen Zusammensetzung Beispiel 2 wurden mit 0105 ml peripherem Blut gemischt und dann 5 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. Dann wurden weiter 0,10 ml der zweiten Reagentienlösung zugegeben und die erhaltene Mischung wurde über weitere 10 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. Dann wurden vier optische Faktoren (rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz, rechtwinkliges Streulicht und Vorwärtsstreulicht) jeder Zelle mit einem Durchflußzytometer gemessen.
Zuerst wurde ein Streulichtdiagramm gebildet, indem das Vorwärtsstreulicht und das rechtwinklige Streulicht auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie in der Figur 26 gezeigt wird. Dann wurde eine Population, die Leukozyten allein umfaßte [A18] mit einem Fenster 31 [W31] herausgenommen ("gated"), um hiermit die Gesamtzahl der Leukozyten zu zählen. Als nächstes wurde ein Streulichdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie es in der Figur 27 gezeigt wird. Dann wurden die Eosinophile [Eo] allein mit einem Fenster 32 [W32] gezählt. Als nächstes wurden die Meßwerte der Leukozyten, die nicht Eosinophile sind, mit einem Fenster 33 [W33] herausgenommen ("gated") und ein Streulichtdiagramm wurde gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie in der Figur 28 gezeigt wird. So wurden die Leukozyten in sechs Subpopulationen getrennt, einschließlich einer, die Lymphozyten [Lym] umfaßt, einer, die Monozyten [Mono] umfaßt, einer, die Neutrophile [Neut] umfaßt, einer, die unreife Granulozyten 1 [Im1] umfaßt, einer anderen, die unreife Granulozyten 2 [Im2] umfaßt, und einer, die Basophile [Ba] umfaßt. Die Basophilen, die unreifen Granulozyten 1, die unreifen Granulozyten 2, die Lymphozyten, die Monozyten und die Neutrophilen wurden jeweils mit einem Fenster 34 [W34], einem Fenster 35 [W35], einem Fenster 36 [W36], einem Fenster 37 [W37], einem Fenster 38 [W38] und einem Fenster 39 [W39] herausgenommen ("gated") und anschließend gezählt.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird ein Verfahren gezeigt, welches eine zweite Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozyten enthält, um eine Probe vorzubereiten, die verwendet werden soll, um Leukozyten in mindestens sechs Subpopulationen aufzutrennen, indem drei optische Faktoren, einschließlich roter Fluoreszenz, grüner Fluoreszenz und rechtwinkligem Streulicht, gemessen werden. zusammensetzung Beispiel 3:
Astrazongelb 3G 300 mg
Neutralrot 20 mg
Astrazonorange R 300 mg
TRIS 3,6 g
NaOH ausreichend zur Einstellung des pH = 9,
NaCl ausreichend zur Einstellung des
osmotischen Drucks = 280 mOsm/kg
Gereinigtes Wasser 1 l.
0,95 ml eines Reagens der obigen Zusammensetzung Beispiel 3 wurden mit 0,05 ml von peripherem Blut gemischt und 10 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. So wurde eine Probe für die Untersuchung erhalten. Die Leukozyten wurden klassifiziert und gezählt, indem die rote Fluoreszenz, die grüne Fluoreszenz und das rechtwinklige Streulicht jeder Zelle mit einem Durchflußzytometer gemessen wurden und die erhaltenen Meßwerte z.B. mit dem folgenden Verfahren analysiert wurden. Es wurde nämlich ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie es in der Figur 29 gezeigt wird. Dann wurden die Eosinophilen allein innerhalb eines Fensters 41 [W41] herausgenommen ("gated") und gezählt. Als nächstes wurden die Meßwerte der Population [A20] von Leukozyten, die keine Eosinophile sind, mit einem Fenster 42 [W42] herausgenommen ("gated") und ein Streulichtdiagramm wurde gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden. So wurden die Basophilen, die unreifen Granulozyten, die Lymphozyten, die Monozyten und die Neutrophilen jeweils mit einem Fenster 43 [W43], einem Fenster 44 [W44], einem Fenster 45 [W45], einem Fenster 46 [W46] und einem Fenster 47 [W47] klassifiziert und anschließend gezählt.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird ein Verfahren gezeigt, welches eine erste und eine zweite Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozyten enthält, um eine Probe vorzubereiten, die verwendet werden soll, um Leukozyten in mindestens sieben Subpopulationen auf zutrennen, indem drei optische Faktoren, einschließlich roter Fluoreszenz, grüner Fluoreszenz und rechtwinkligem Streulicht, gemessen werden.

Zusammensetzung Beispiel 4

Erste Reagentienlösung:
Astrazongelb 3G 300 mg
Neutralrot 20 mg
Astrazonorange R 300 mg
Citronensäuremonohydrat 2,10 g (pH 2,62)
Gereinigtes Wasser 1 1
Zweite Reagentienlösung:
TRIS 36,3 g
NaCl 58,4 g
NaOH 18,8 g
Gereinigtes Wasser 1 1
0,90 ml der ersten Reagentienlösung der obigen Zusammensetzung Beispiel 4 wurden mit 0,05 ml peripherem Blut gemischt und dann 5 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. Dann wurden weiter 0,10 ml der zweiten Reagentienlösung zugegeben und die erhaltene Mischung wurde über weitere 10 Sekunden oder länger inkubieren gelassen. So wurde eine Probe für die Untersuchung erhalten. Die Leukozyten wurden klassifiziert und gezählt, indem die rote Fluoreszenz, die grüne Fluoreszenz und das senkrechte Streulicht jeder Zelle mit einem Durchflußzytometer gemessen und dann die erhaltenen Meßwerte mit beispielsweise folgendem Verfahren analysiert wurden. Es wurde nämlich ein Streulichtdiagramm gebildet, indem die Intensität der roten Fluoreszenz und jene der grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie in der Figur 31 gezeigt wird. Dann wurden die Eosinophilen allein innerhalb eines Fensters 51 [W51] herausgenommen ("gated") und gezählt. Als nächstes wurden die Meßwerte der Subpopulation [A21], welche Leukozyten umfaßt, die keine Eosinophile sind, mit einem Fenster 52 [W52] herausgenommen ("gated") und ein Streulichtdiagramm wurde gebildet, indem die Intensität des rechtwinkligen Streulichts und die Intensität der roten oder grünen Fluoreszenz auf die Koordinatenachsen bezogen wurden, wie die Figur 32 zeigt. So wurden die Basophilen , die unreifen Granulozyten 1 [Im1], die unreifen Granulozyten 2 [Im2], die Lymphozyten [Lym], die Monozyten [Mono] und die Neutrophilen jeweils mit einem Fenster 53 [W53], einem Fenster 54 [54], einem Fenster 55 [W55], einem Fenster 56 [W56], einem Fenster 57 [W57] und einem Fenster 58 [W58] herausge-nommen ("gated") und anschließend gezählt.
1. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zur Verfügung, welches in einem Durchflußzytometer verwendbar ist, wobei unreife Granulozyten von anderen Leukozyten mit einer spezifischen Fluorochromfärbung der unreifen Granulozyten mit Astrazon 3G und Neutralrot abgetrennt werden können. Somit wird es möglich, unreife Granulozyten zu klassifizieren und zu färben, was mit keinem der bekannten Verfahren erreicht werden kann.
2. Wenn das oben erwähnte Verfahren mit einer Stufe zur Eliminierung der Einflüße von Erythrozyten kombiniert wird, kann ferner die Klassifikation und die Zählung von Leukozyten, einschließlich der Klassifikation und der Zählung von unreifen Granulozyten, mit der Untersuchung einer einzigen Probe erreicht werden. Leukozyten können in mindestens sieben Subpopulationen klassifiziert und gezählt werden, indem geeignete Verfahren zur Vorbereitung einer Probe in passender Weise kombiniert werden.

Claims

1. Ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten in mindestens drei Gruppen, einschließlich unreifer Granulozyten, durch Untersuchung einer einzigen Probe mit einem Durchflußzytometer, welches die folgenden Stufen umfaßt:

(1) eine Stufe zur Einstellung des pH-Werts einer hämatologischen Probe auf ein Niveau, das zum Färben geeignet ist; und

(2) eine Stufe zum Färben der Leukozyten, die in der genannten hämatologischen Probe enthalten sind, mit mindestens zwei Farbstoffen, die wie folgt spezifiziert sind:

(3) Astrazongelb 3G, das fähig ist, mindestens Basophile und unreife Granulozyten zu färben; und

(4) Neutralrot, das fähig ist, mindestens Eosinophile zu färben.

2. Ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe zum Klassifizieren und Zählen von Leukozyten in mindestens sechs Gruppen, einschließlich unreifer Granulozyten, durch Untersuchung einer einzigen Probe mit einem Durchflußzytometer, welches die folgenden Stufen umfaßt:

(1) eine Stufe zur Eliminierung der Einflüsse von Erythrozyten aus einer hämatologischen Probe, ohne die Leukozyten morphologisch zu verändern;

(2) eine Stufe zur Einstellung des pH-Werts einer hämatologischen Probe auf ein Niveau, das zum Färben geeignet ist; und

(3) eine Stufe zum Färben der Leukozyten, die in der genannten hämatologischen Probe enthalten sind, mit mindestens zwei Farbstoffen, die wie folgt spezifiziert sind:

i) Astrazongelb 3G, das fähig ist, mindestens Basophile und unreife Granulozyten zu färben; und

ii) Neutralrot, das fähig ist, mindestens Eosinophile zu färben.

3. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die genannte Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozyten aus einer hämatologischen Probe, ohne die Leukozyten morphologisch zu verändern, durch Reduktion der Erythrozyten in Fragmente durchgeführt wird, umfassend

(1) Fragmentierung der Erythrozyten in der genannten hämatologischen Probe durch Zugabe einer ersten hypotonischen wäßrigen Lösung, die einen Puffer umfaßt, um den pH-Wert der Lösung sauer zu halten, zu der genannten hämatologischen Probe;

(2) Zugabe einer zweiten wäßrigen Lösung, die ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Aufrechterhaltung der Morphologie der Leukozyten, und einen Puffer zur Neutralisation der in der ersten wäßrigen Lösung enthaltenen Säure umfaßt, zu der obigen Lösung (1);

um hierbei die Leukozyten in der hämatologischen Probe in sechs Gruppen zu klassifizieren, die jeweils Monozyten, Neutrophile, Eosinophile, Basophile, unreife Granulozyten 1 und unreife Granulozyten 2 umfassen, und anschließend zu zählen.

4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die genannte Stufe zur Eliminierung der Einflüße der Erythrozyten in einer hämatologichen Probe, ohne die Leukozyten morphologisch zu verändern,

eine Stufe zum Färben der Leukozyten in der hämatologischen Probe mit mindestens einem Farbstoff, der fähig ist, mindestens entweder NuCLei oder Cytoplasma von Leukozyten zu färben, um die Leukozyten von anderen Blutkörperchen, abhängig von der Differenz in der Intensität der Fluoreszenz bei der Messung mit einem Durchflußzytometer, abzutrennen, umfaßt;

um hierbei die Leukozyten in der hämatologischen Probe in sechs Gruppen zu klassifizieren, die jeweils Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile, Basophile und unreife Granulozyten umfassen, und anschließend zu zählen.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der genannte Farbstoff, der fähig ist, mindestens Nuclei oder Cytoplasma von Leukozyten zu färben, zumindest ein Farbstoff ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Farbstoffen besteht:

(1) Astrazonorange R

(2) Astraviolett

(3) Rhodamin 6G

(4) Rhodamin 19

(5) Rhodamin B

(6) Rhodamin 3G0

(7) Pyronin B

(8) Cyanosin

(9) 3,3'-Dimethylthio-carbocyaniniodid

(10) 3,3'-Diethylthio-carbocyaniniodid

(11) 3,3'-Dipropyloxa-carbocyaniniodid

(12) 3,3'-Dihexyloxa-carbocyaniniodid

(13) 3,6-Bis-(dimethylamino)-10-dodecyl-acridiniumbromid

(14) 7-Benzylamino-4-nitrobenzoxadiazol

(15) 7-Fluor-4-nitrobenzoxadiazol

(16) Astrazonrot 68.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die genannte Stufe zur Eliminierung der Einflüsse der Erythrozyten aus einer hämatologischen Probe, ohne die Leukozyten morphologisch zu verändern, das

(1) Fragmentierung der Erythrozyten in der genannten hämatologischen Probe durch Zugabe einer ersten hypotonischen wäßrigen Lösung, die einen Puffer umfaßt, um den pH-Wert der Lösung sauer zu halten, zu einer hämatologischen Probe;

(2) Zugabe einer zweiten wäßrigen Lösung, die ein die Osmolarität kompensierendes Mittel zur Aufrechterhaltung der Morphologie der Leukozyten, und einen Puffer zur Neutralisation der in der ersten wäßrigen Lösung enthaltenen Säure umfaßt, zu der obigen Lösung (1); und

(3) Färbung der Leukozyten in der hämatologischen Probe mit mindestens einem Farbstoff, der fähig ist, mindestens entweder Nuclei oder Cytoplasma von Leukozyten zu färben, um dabei die Leukozyten von anderen Blutkörperchen, abhängig von der Intensität der Fluoreszenz bei der Messung mit einem Durchflußzytometer, abzutrennen, umfaßt,

um hierbei die Leukozyten in der hämatologischen Probe in sieben Gruppen zu trennen, die jeweils Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile, Basophile, unreife Granulozyten 1 und unreife Granulozyten 2 umfassen, und anschließend zu zählen.

Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der genannte Farbstoff, der fähig ist, mindestens Nuclei oder Cytoplasma von Leukozyten zu färben, zumindest ein Farbstoff ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden Farbstoffen besteht: