DE69621459T2

DE69621459T2 - Reagens und verfahren zur differentiellen bestimmung von leukozyten im blut

Info

Publication number: DE69621459T2
Application number: DE69621459T
Authority: DE
Inventors: Li; C. Veulens; Carole Young
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-12
Publication date: 2003-01-09
Anticipated expiration: 2016-12-13
Also published as: JP2000502187A; DE69621459D1; EP0874988B1; US5817518A; WO1997022878A3; EP0874988A2; WO1997022878A2; WO1997022878A8; JP3717939B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein lytisches Reagens und ein Verfahren zur Differenzierung von Leukozyten- Subpopulationen in Blutproben mittels geeigneter elektronischer Instrumente.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Analyse von Leukozyten-Populationen aus Blutproben ist ein wesentlicher und unentbehrlicher Teil von diagnostischen Verfahren, welche eine Vielzahl von pathologischen Befunden betreffen. Messungen der Eosinophilen, welche eine Subpopulation der Leukozyten sind, sind für die Diagnose von verschiedenen Krankheiten wichtig. Zum Beispiel wird eine Zunahme der Zahl der Eosinophilen bei der Hodgkin'schen- Krankheit, parasitären und allergischen Krankheiten gefunden.
Die traditionelle Analyse von Blutproben schließt das Schmieren einer Blutprobe auf einen Objektträger, gefolgt durch eine visuelle Analyse des Trägers, ein. Dieser Weg ist extrem zeitraubend und hängt auch von der Interpretation des Individuums ab, welches den Träger analysiert. Diese Faktoren haben zur Entwicklung der automatisierten Leukozytenanalyse unter Verwendung der Durchflußzytometrie geführt. Ein wesentlicher Schritt in der Leukozytenanalyse, welche automatisierte Hämatologiegeräte verwendet, ist die Lysis der roten Blutkörperchen. Bis jetzt sind verschiedene lytische Reagentien zur Verwendung für Vollblutproben verwendet worden.
U.S.-Patent Nr. 4 485 175 (Ledis et al.) beschreibt ein Reagenssystem und ein Verfahren zur Durchführung differentieller Leukozytenbestimmungen in drei Subpopulationen unter Verwendung einer automatischen Zellzählungsausrüstung. Dieses Reagenssystem enthält ein Blutverdünungsmittel und ein lytisches Reagens. Das lytische Reagens umfasst eine Mischung aus quartären Ammoniumgrenzflächenaktiven Mitteln. Dieses Reagenssystem hat jedoch seine Anwendung, die Differenzierung der Leukozyten nur in drei Subpopulationen zu bewirken: Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. Das Reagenssystem war nicht fähig, Granulozyten weiter in mehr als drei Subpopulationen zu differenzieren.
U.S.-Patent 4 751 179 (Ledis et al.) offenbart ein Reagenssystem und ein Verfahren zur Durchführung von differentiellen Leukozytenbestimmungen unter Verwendung einer automatisierten Zellzählungsausrüstung. Diese Reagenssystem umfasst: 1) ein lytisches Reagenssystem, umfassend entweder ein einzelnes, Saponin enthaltendes, lytisches Verdünnungsmittel oder zwei Lösungen, welche nacheinander zuzugeben werden, bestehend aus einem Vorverdünnungsmittel und einem Saponin enthaltenden lytischen Reagens; und 2) ein aktives quervernetzendes Mittel, wie Glutaraldehyd, als Fixierungsreagens. Nach dem Erhitzen der Mischung des Blutproben-lytischen-Reagenssystems und deren Analysieren durch DC und Lichtdurchlässigkeit können vier Subpopulationen von Leukozyten bestimmt werden. Diese vier Subpopulationen sind Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile. Dieses Verfahren benötigt Erhitzen der Probenmischung auf 60ºC bis 75ºC vor der Messung durch ein Gerät.
U.S.-Patent Nr. 5 155 044 (Ledis et al.) offenbart ein Reagenssystem und ein Verfahren zur schnellen Isolierung und Analyse von Leukozyten aus Vollblutproben und ermöglicht die automatisierte Differenzierung in fünf Subpopulationen unter Verwendung eines automatisierten Hämatologie-Analysegerätes, welches zur Leitfähigkeits(DC)-, Radiofrequenz(RF)- und Lichtstreuungs(LS)-Messungen fähig ist. Das Reagenssystem besteht aus einem wässrigen lytischen Reagens, welches eine Säure oder eine Mischung aus Säure und Saponin und eine wässrige Salzquenchlösung umfasst. Dieses Verfahren ist schnell und stellt eine fünffache Leukozyten-Differenzierung aus einer Vollblutprobe in einer Einzelschrittmessung bereit. Die Einzelschrittmessung wird mit einem einzelnen Aliquot einer Blutprobe mit dem gleichen lytischen Reagenssystem durchgeführt, um eine Differenzierung der Leukozyten zu erhalten. Das Verwenden dieses Reagenses und das Verfahren, um die Differenzierung von Leukozyten in fünf Subpopulationen zu erreichen, benötigt jedoch hochentwickelte und teure Lasergeräte. Wenn nur DC- und RF-Nachweise mit diesem Reagenssystem verwendet werden, werden die Granulozyten- Subpopulationen unzureichend in basophile, eosinophile und neutrophile Subpopulationen unterschieden. Die Granulozyten werden nicht unterschieden, da die DC- und RF-Signale der Subpopulationen untereinander unter den durch dieses Patent offenbarten Bedingungen überlappen.
Ein anderer Weg zur Differenzierung von Leukozyten in vier oder fünf Subpopulationen unter Verwendung von RF- und DC- Messungen ist, mehrere Reagentien und mehrere Messungen zu verwenden. Getrennte Reagentien werden für das Differenzieren der spezifischen Subpopulationen verwendet. Typischerweise wird das erste lytische Reagens, wie eines, offenbart in U. S. Patent 5 116 539 (Hamaguchi et al.) und U.S. Patent 5 389 549 (Hamaguchi et al.) verwendet, um die Leukozyten in drei Subpopulationen (d.h. Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten) unter Verwendung von DC- und RF-Messungen zu differenzieren.
In U.S.-Patent 5 116 539 wird ein zusätzliches lytisches Reagens mit einer zusätzlichen Messung verwendet, um die eosinophile Subpopulation zu erhalten. Dies ermöglicht eine vierfache Differenzierung von Lymphozyten, Monozyten, Eosinophilen und den verbleibenden Granulozyten. Das lytische Reagens ist eine hypotonische wässrige Lösung, bestehend aus einem nicht-ionischen, grenzflächenaktiven Mittel auf Polyoxyethylen-Basis, und einem Puffer zum Einstellen des pH- Wertes der Lösung innerhalb des Bereiches 3 bis 11. Das lytische Reagens lysiert nicht nur die roten Blutkörperchen, sondern auch die Leukozyten, ausgenommen die Eosinophilen, so dass die Eosinophilen, basierend auf ihrem verbleibenden Zellvolumen, gezählt werden können. Um jedoch die Eosinophilen-Trennungen zu erreichen, benötigt das Verfahren, welches das lytische Reagens verwendet, die Inkubation einer Probenmischung bei 40ºC für einen Zeitraum von 50 Sekunden. Diese erhöhte Temperaturerfordernis benötigt ein Gerät, welches bedeutend komplexer ist, da die Reaktionen thermostatisch kontrolliert werden müssen. Zusätzlich verringert die ausgedehnte Reaktionszeit direkt den Durchsatz durch das automatisierte Analysegerät.
In U.S.-Patent 5 389 549 werden zwei zusätzliche lytische Reagentien benötigt, und zwei zusätzliche Messungen sind nötig, um die eosinophilen und basophilen Subpopulationen zu erhalten, um so eine fünffache Differenzierung bereitzustellen. In dieser Offenbarung werden die gesamten eosinophilen und basophilen Subpopulationen, welche aus den getrennten Messungen erhalten werden, von der gesamten Granulozyten-Population abgezogen, um die neutrophile Subpopulation zu erhalten.
U.S.-Patent 5 196 346 (Lefevre et al.) offenbart ein lytisches Reagens und ein Verfahren, welches die gleiche automatisierte Bestimmung von Basophilen in Vollblutproben durch Lysis aller Blutzellen, einschließlich sowohl der Erythrozyten als auch der Leukozyten, mit Ausnahme der Basophilen verwendet. Das lytische Reagens bestand aus einem grenzflächenaktiven Mittel vom Polyoxyethylenether-Typ, einer Phthalsäure/HCl-Mischung, Natriumdodecylsulfat (SDS) und einem butylierten antioxidierenden Mittel vom Hydroxytoluol- Typ. SDS wurde als ein Protein-denaturierendes Mittel verwendet, um die Bildung von Ablagerungen in dem Messgerät zu reduzieren, und es wurde auch gefunden, daß es die Lysis der Zellen beschleunigt. Diese offenbarte Methode benötigt eine thermostatisch-kontrollierte Reaktionstemperatur zwischen 30 und 40ºC und ist auf das Zählen nur von Basophilen begrenzt.
WO 96/42015 offenbart ein lytisches Reagenssystem und ein Verfahren zur automatisierten Differenzierung von Leukozyten in fünf Subpopulationen unter Verwendung von DC-, RF- und Lichtstreuungs-Messvorrichtungen. Das lytische Reagenssystem besteht aus einem wässrigen lytischen Reagens, welches eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung und eine Säure umfasst, und aus einem stabilisierenden Reagens, welches eine hypertonische, alkalische Reagenszusammensetzung umfasst. Das offenbarte lytische Reagenssystem stellt eine fünffache Leukozyten-Differenzierung unter Verwendung einer Einzelmessung bereit, wenn DC-, RF- und Lichtstreuungs- Messungen verwendet werden. Wenn jedoch das lytische Reagens auf einem Hämatologie-Analysegerät, ausgerüstet nur mit DC- und RF-Messvorrichtungen, verwendet wird, können nur vier Subpopulationen erhalten werden, d.h. Monozyten, Lymphozyten, Basophile und die Summe aus Neutrophilen und Eosinophilen.
Außerdem offenbart WO 97/01757 ein lytisches Reagenssystem und ein Verfahren für die automatisierte Differenzierung von Leukozyten in fünf Subpopulationen unter Verwendung von DC-, RF- und Lichtstreuungs-Messvorrichtungen. Das lytische Reagenssystem besteht aus einem wässrigen lytischen Reagens, welches ein grenzflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen- Basis und eine Säure umfasst, und einer hypertonischen, Alkali-stabilisierenden Reagenszusammensetzung. Das offenbarte lytische Reagenssystem stellt ebenso eine fünffache Leukozyten-Differenzierung unter Verwendung einer Einzelmessung bereit, wenn DC-, RF- und Lichtstreuungs- Messungen verwendet werden. Wenn jedoch das lytische Reagens auf einem Hämatologie-Analysegerät, ausgerüstet mit nur DC- und RF-Messvorrichtungen, verwendet wird, können nur vier Subpopulationen erhalten werden, d.h. Monozyten, Lymphozyten, Basophile und die Summe aus Neutrophilen und Eosinophilen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft eine neue lytische Reagenszusammensetzung. Die lytische Reagenszusammensetzung ist eine saure, hypertonische wässrige Lösung, umfassend ein Alkalimetallsalz eines Alkylsulfates, ein eosinolytisches Mittel, ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und ein physiologisches Salz, wie in Anspruch 1 definiert. Die neue lytische Reagenszusammensetzung kann rote Blutkörperchen lysieren und die eosinophile Subpopulation selektiv beeinflussen und von anderen Granulozyten-Subpopulationen durch selektives Schrumpfen der Eosinophilen trennen. Dies ermöglicht die Differenzierung von mindestens einer der Leukozyten-Subpopulationen.
Die lytische Reagenszusammensetzung bietet den Vorteil, vollständig bei Raumtemperatur zu arbeiten. Für eine angemessene Trennung der eosinophilen Subpopulation arbeitete die Lysis gemäß dem Stand der Technik bei erhöhten Temperaturen, 30ºC oder höher. Diese erhöhte Temperaturbedingung erforderte Analysegeräte, welche bedeutend komplexer waren, da die Reaktionen thermostatisch kontrolliert werden mussten. Die vorliegende Erfindung überwindet die Notwendigkeit der thermostatischen Kontrolle durch optimales Arbeiten bei Raumtemperatur.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung für die automatische Bestimmung von Leukozyten-Subpopulationen im Blut. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst das Aussetzen einer Blutprobe einer lytischen Reagenszusammensetzung, die Inkubation der Probenmischung bei Raumtemperatur für weniger als 25 Sekunden und das Analysieren der Probenmischung mit einem automatisierten Hämatologiegerät. Der synergistische Effekt der grenzflächenaktiven Mittel stellt eine schnelle und selektive Wirkung gegen die eosinophile Subpopulation bereit, welche eine schnelle Trennung der eosinophilen Subpopulation von anderen Leukozyten-Subpopulationen mittels einfacher DC- und RF-Messungen erlaubt. Darüber hinaus bietet das Verfahren den Vorteil, die Notwendigkeit eines teuren Lasergerätes zur Bestimmung der eosinophilen Subpopulation zu beseitigen.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verwenden der neuen lytischen Reagenszusammensetzung in Kombination mit einem zweiten lytischen Reagenssystem, um mindestens eine fünffache Differenzierung von Leukozyten unter Verwendung nur von DC- und RF-Messungen zu erhalten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Abb. 1a und 1b zeigen die Eosinophilen-Differenzierung einer, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelten normalen Vollblutprobe. Abb. 1a zeigt ein zweidimensionales Diagramm von DC gegen OP (Opazität, eine Funktion von RF und DC) und Abb. 1b zeigt das Diagramm von RF gegen OP. Leukozyten-Subpopulationen werden wie markiert gezeigt.
Abb. 2 zeigt ein DC gegen rotierendes Lichtstreuungs- ("Rotated light scatter")-(RLS)-Diagramm einer, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelten Gesamtblutprobe, mit dem Unterschied, dass sie auf einem experimentellen Hämatologie- Analysegerät, ausgerüstet mit DC-, RF- und Lichtstreuungsgeräten unter Verwendung eines fokussierten Durchflussverfahrens analysiert wird.
Abb. 3a und 3b zeigen die zweidimensionalen Diagramme von Gesamtblutproben, die, wie in Beispiel II beschrieben, unter Verwendung eines Beispiels der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt wurden.
Abb. 4 zeigt die zweidimensionalen Diagramme von Gesamtblutproben unter Verwendung eines Beispiels des zweiten lytischen Reagenses, das in Beispiel IV beschrieben ist, und des stabilisierenden Reagenses, das in Beispiel VI beschrieben ist, und behandelt in Übereinstimmung mit Beispiel VII. Jedes Cluster stellt eine oder mehrere Leukozyten-Subpopulationen wie markiert dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die wässrige lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1 und ein Verfahren für die schnelle Differenzierung von mindestens einer Leukozyten- Subpopulation durch DC- und RF-Messungen. Die lytische Reagenszusammensetzung lysiert rote Blutkörperchen und schrumpft selektiv die eosinophile Subpopulation von den anderen Granulozyten-Subpopulationen. Darüber hinaus ermöglicht das lytische Reagens und das Verfahren zur Verwendung des lytischen Reagenses die Differenzierung und Zählung der Eosinophilen ohne Verwendung von Lasermessungen, basierend auf den Unterschieden im Volumen nach dem Aussetzen der Blutprobe einer lytischen Reagenszusammensetzung. Zusätzlich wird ein Verfahren zur Differenzierung von mindestens fünf Leukozyten-Subpopulationen nur unter Verwendung von DC- und RF-Messungen bereitgestellt.
In der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die wässrige lytische Reagenszusammensetzung ein Alkalimetallsalz eines Alkylsulfates, eine Säure, ein eosinolytisches Mittel, welches die selektive Schrumpfung der eosinophilen Subpopulation erleichtert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus organischen Phosphorsäureestern, Alkalimetallsalzen organischer Phosphorsäureester, ethoxylierten Phosphorsäureestern, ethoxylierten Mercaptanen, ethoxylierten Lanolinalkoholen, ethoxylierten Alkylphenolen, ethoxylierten Alkylalkoholen, ethoxylierten Alkenylalkoholen und Mischungen davon, einem nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel, welches die neutrophile Subpopulation vor Lysis schützt, und ein physiologisches Salz, ausreichend, um die Osmolalität der lytischen Reagenszusammensetzung zwischen 370 bis 720 mOsm einzustellen. Der synergistische Effekt dieser membranaktiven Chemikalien ermöglicht dem lytischen Reagens, die roten Blutkörperchen schnell zu lysieren und gleichzeitig selektiv zu schrumpfen und die Eosinophilen von anderen Leukozyten- Subpopulationen zu differenzieren.
Die Funktion des Alkalimetallsalzes eines Alkylsulfates in dem lytischen Reagens der vorliegenden Erfindung ist entscheident. Es lysiert die roten Blutkörperchen, wodurch die Möglichkeit der Leukozyten-Differenzierungsanalyse bereitgestellt wird. Zusätzlich beeinflusst es auch selektiv die Zellmembran der eosinophilen Subpopulation und schrumpft das Zellvolumen schnell herunter. Die Alkylkettenlänge des Alkalisalzes des Alkylsulfates beträgt von 10 bis 18 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 12 bis 14 Kohlenstoffatome. Bevorzugte Beispiele des Alkalisalzes eines Alkylsulfates schließen Natriumdodecylsulfat und Natriumtetradecylsulfat ein. Am meisten bevorzugt wird Natriumdodecylsulfat eingesetzt. Die Konzentration des Alkalisalzes des Alkylsulfates beträgt von etwa 0,02% bis etwa 0,16%, vorzugsweise von etwa 0,04% bis 0,12% (w/v).
Die Funktion der Säure ist, das selektive Lysieren der roten Blutkörperchen zu unterstützen und eine saure Umgebung für die selektive Schrumpfung der eosinophilen Subpopulation bereitzustellen. Es ist festgestellt worden, dass die selektive Schrumpfung der eosinophilen Subpopulation nur in saurem Medium stattfindet.
Ein breiter Bereich von Säuren kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche, mit einem pK-Wert unter 3, werden jedoch vorzugsweise verwendet. Die Säuren können eine organische Säure, eine anorganische Säure oder eine Mischung davon sein. Die Beispiele von geeigneten Säuren in dem lytischen Reagens der vorliegenden Erfindung sind Essigsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Propionsäure, Salzsäure, Phosporsäure, Schwefelsäure und Mischungen davon.
Die Säuremenge soll für die schnelle Lysis der roten Blutkörperchen ausreichend sein, während sie keine Schädigung der anderen Granulozyten-Subpopulation verursachen soll. Der pH-Wert des lytischen Reagenses sollte innerhalb eines Bereiches von etwa 1,4 bis etwa 3,4, vorzugsweise etwa 1,8 bis etwa 2,6 bleiben.
Eine Gruppe von grenzflächenaktiven Mitteln fungiert als eosinolytisches Mittel. Ihre Anwesenheit in der lytischen Reagenszusammensetzung unterstützt die Schrumpfung der Eosinophilen und hilft auch, den geschrumpften Eosinophilen eine unterschiedliche Anhäufung für die Differenzierungsanalyse zu bilden. Diese eosinolytischen Mittel umfassen organische Phosphorsäureester, Alkalimetallsalze von organischen Phosphorsäureestern, ethoxylierte Phosphorsäureester, ethoxylierte Mercaptane, ethoxylierte Lanolinalkohole, ethoxylierte Alkylphenole, ethoxylierte Alkylalkohole, ethoxylierte Alkenylalkohole und Mischungen davon.
Wegen der bedeutend unterschiedlichen chemischen Natur dieser grenzflächenaktiven Mittel ist die Art ihrer Wirkung unter den Bedingungen dieser Erfindung gegenwärtig unbekannt. Im Allgemeinen weisen die nicht-ionischen eosinolytischen Mittel ein hydrophiles lipophiles Gleichgewicht (HLB) auf, welches weniger als etwa 15 beträgt. Die nicht-ionischen eosinolytischen Mittel sind bekannt, stark zu sein, um die erythrolytischen Mittel in einem breiten pH-Bereich abzumildern. Dies erklärt jedoch nicht ihre selektiven Wirkungen auf die eosinophilen Zytoplasmamembranen und ihre Fähigkeit, die eosinophilen Subpopulationen von anderen Granulozyten-Subpopulationen zu differenzieren. Die Konzentration der eosinolytischen Mittel reicht von 0,05% bis 0,8% (w/v), abhängig von der Stärke der spezifisch verwendeten Chemikalie, welche empirisch bestimmt werden kann.
Eine andere Gruppe von nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln fungiert als leuko-schützende Mittel. Das leuko- schützende Mittel hat zwei Aufgaben. Eine Aufgabe ist, die selektive rote Blutkörperchen-Lysierung zu unterstützen. Die zweite Aufgabe ist, die Leukozyten, insbesondere die neutrophile Subpopulation, vor Schädigung während der lytischen Reaktion zu schützen. Geeignete Beispiele umfassen ethoxylierten Alkylalkohol oder ethoxylierten Alkenylalkohol und Mischungen davon mit einem HLB von 16 oder höher.
Wenn die neutrophile Subpopulation durch das lytische Reagens während der Analyse beeinflusst wird, schrumpfen sie auch in der Größe und interferieren bzw. wechselwirken mit der Klassifizierung der Eosinophilen. Wenn jedoch eine Überschussmenge des leuko-schützenden Mittels verwendet wird, würde die Eosinophilen-Subpopulation-Trennung nur mit einer verlängerten Reaktionszeit von typischerweise größer als ungefähr 45 Sekunden stattfinden oder praktisch unerreichbar werden. Daher ist eine geeignete Konzentration des leukoschützenden Mittels, welche experimentell bestimmt werden kann, erwünscht. Die Konzentration des ethoxylierten Alkylalkohols oder ethoxylierten Alkenylalkohols beträgt von etwa 0,5 bis etwa 3%, vorzugsweise von etwa 0,8% bis etwa 2% (w/v).
Ein physiologisches Salz wird verwendet, um die Osmolalität der lytischen Reagenszusammensetzung einzustellen. Es ist durch die Erfinder festgestellt worden, dass die Schrumpfung der Eosinophilen nur in einer hypertonen Umgebung in einem Bereich von etwa 370 bis 720 mOsm und vorzugsweise von etwa 400 bis 570 mOsm stattfindet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Alkalimetallsalze von Chloriden und Sulfaten zu diesem Zweck verwendet. Mit einer geeigneten Kombination von Alkalimetallsalzen von Chloriden und Sulfaten findet die Schrumpfung der Eosinophilen schnell statt und die geschrumpften Eosinophilen bilden eine unterschiedliche Population.
Geeignete Beispiele von physiologischen Salzen schießen Natrium- oder Kaliumchlorid und Natrium- oder Kaliumsulfat ein. Die Konzentration des Alkalimetallsalzes eines Chlorides reicht von etwa 0,1% bis etwa 1,2%, vorzugsweise von etwa 0,3% bis etwa 1,0% (w/v). Die Konzentration des Alkalimetallsalzes eines Sulfates reicht von etwa 0,4% bis etwa 2%, vorzugsweise von etwa 0,6% bis etwa 1,5%.
Gegebenenfalls können Polyoxyethylen- und Polyoxypropylen- Copolymere verwendet werden, um das Auflösen der Trümmer der roten Blutkörperchen zu unterstützen und das von den Trümmern erzeugte Rauschen zu reduzieren. Zusätzlich ist festgestellt worden, dass die Copolymere die eosinophile Subpopulation unterstützen können, eine unterschiedliche Anhäufung zu bilden. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet Pluronic-Copolymere (hergestellt durch BASF Corporation, Parsippany, New Jersey), wie Pluronic 10R5 und Pluronic L35.
Zusätzliche beliebige Zusatzstoffe können in die lytische Reagenszusammensetzung in Konzentrationen eingeschlossen werden, dass ihre Anwesenheit mit den primären funktionellen Komponenten der lytischen Reagenszusammensetzung kompatibel ist. Unter diesen Zusatzstoffen sind Konservierungsmittel, welche antioxidative Eigenschaften aufweisen, um die Lagerzeit der Zusammensetzung zu verlängern, und welche antimikrobielle Eigenschaften aufweisen. Konservierungsmittel, welche antioxidative Eigenschaften aufweisen, schließen EDTA und Butylmethylphenol ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Konservierungsmittel, welche eine antimikrobielle Aktivität aufweisen, schließen Dimethyloldimethylhydantoin und Isothiozolonderivate ein, sind aber nicht darauf begrenzt.
In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Lysis von roten Blutkörperchen in einer Blutprobe und zur Analyse der verbleibenden Leukozyten- Subpopulationen bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte: Schritt 1) Aussetzen einer Blutprobe einer lytischen Reagenszusammensetzung über einen Zeitraum, der ausreichend ist, die roten Blutkörperchen zu lysieren und mindestens eine Leukozyten-Subpopulation in der Blutprobe zu differenzieren, wobei das lytische Reagens ein Alkalimetallsalz eines Alkylsulfates, eine Säure, ein eosinolytisches Mittel, welches die selektive Schrumpfung der eosinophilen Subpopulation erleichtert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus organischen Phosphorsäureestern, Alkalimetallsalzen der organischen Phosphorsäureester, ethoxylierten Phosphorsäureestern, ethoxylierten Mercaptanen, ethoxylierten Lanolinalkoholen, ethoxylierten Alkylphenolen, ethoxylierten Alkylalkoholen, ethoxylierten Alkenylalkoholen und Mischungen davon, ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, welches die neutrophile Subpopulation vor Lysis schützt, und ein physiologisches Salz, geeignet, um die Osmolalität der lytischen Reagenszusammensetzung zwischen 370 bis 720 mOsm einzustellen, umfaßt, Schritt 2) das Differenzieren von mindestens einer Leukozyten-Subpopulation, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eosinophilen, Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen, und Schritt 3) das Berichten bzw. Listen der Ergebnisse der Differenzierung.
Die Blutprobe wird einer lytischen Reagenszusammensetzung für eine Zeit, ausreichend, um die roten Blutkörperchen zu lysieren und mindestens eine Leukozyten-Subpopulation in der Blutproben abzutrennen, ausgesetzt. Die Blutprobe wird dem lytischen Reagens durch Mischen des lytischen Reagenses mit einer Blutprobe ausgesetzt, so dass die Blutprobe ungefähr 45- bis 70-fach verdünnt wird. Die verdünnte Probenmischung wird bei Raumtemperatur inkubiert. Vorzugsweise liegt die Temperatur ungefähr zwischen 15 und 30ºC. Die Inkubationszeit liegt bei ungefähr 10 bis 25 Sekunden, vorzugsweise weniger als 18 Sekunden. Die Probenmischung wird in einem automatisierten Hämatologie-Gerät analysiert. Das Gerät misst und differenziert mindestens eine Leukozyten-Subpopulation, vorzugsweise die eosinophile oder neutrophile Subpopulation und am meisten bevorzugt die eosinophile Subpopulation.
Die Differenzierung wird unter Verwendung von mindestens zwei Typen von Messungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DC-, RF- und Lichtstreuungs-Messungen, durchgeführt. Vorzugsweise wird die Differenzierung nur unter Verwendung von DC- und RF-Messungen durchgeführt. Das DC-Verfahren weist jede Änderung nach, welche im elektrischen Strom auf das Konto der Differenz in der Leitfähigkeit zwischen den Teilchen und dem flüssigen Medium geht, wenn einer Probenmischung erlaubt wird, den engen Flüssigkeitskanal zu passieren. In dem DC-Verfahren ist die nachgewiesene Signalintensität im Wesentlichen zu dem Volumen der Teilchen proportional. In dem RF-Verfahren wird einer Probenmischung erlaubt, einen Flüssigkeitskanal zwischen eng benachbarten Elektroden zu passieren, und die Änderung, welche in dem elektrischen Scheinwiderstand zwischen den Elektroden auf das Konto der Differenz in der dielektrischen Konstante zwischen Teilchen und Flüssigmedium geht, wird nachgewiesen. In dem RF-Verfahren spiegelt die nachgewiesene Signalintensität Informationen bezogen auf die Teilchenstruktur und die Natur des Materials, aus welchem sie gemacht sind, wieder. Details der DC- und RF-Nachweisprinzipien und -techniken werden in U.S. Patent 2 656 508, erteilt für Coulter Elektronics, Inc., und U.S. Patent 4 298 836, erteilt für Coulter Electronics, Inc., gelehrt.
Das Verfahren, welches die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung für die Leukozyten-Differenzierungsanalyse einer Blutprobe verwendet, stellt ein schnelles Verfahren, welches ein lytisches Reagens verwendet, bereit. Die lytische Reagenszusammensetzung lysiert die roten Blutkörperchen und beeinflusst selektiv die Zytoplasmamembran der eosinophilen Subpopulation und schrumpft die Zellvolumen der eosinophilen Subpopulation. Die Granulozyten, außer den Eosinophilen, verbleiben im Wesentlichen intakt während der lytischen Reaktion.
Beispiel I beschreibt die Anwendung einer bevorzugten Ausführungsform der offenbarten lytischen Reagenszusammensetzung für Leukozytendifferenzierung und Auszählung einer Vollblutprobe. Abb. 1 zeigt die Differenzierungsanalyse einer, wie in Beispiel I beschrieben, behandelten Vollblutprobe unter Verwendung von DC- und RF- Messungen. Die Zellen fließen durch eine Apparatur, wo ein Scheinwiderstand-Messgerät die Antworten der Zellen auf die Radiofrequenz und den direkten Strom aufnimmt. Die elektrischen Signale werden aufbereitet und als ein zweidimensionales Diagramm, CD gegen Opazität oder RF gegen Opazität, wie in Abb. 1a bzw. 1b beschrieben, geplottet bzw. graphisch dargestellt. Wie gezeigt, ist nach dem Aussetzen einer Blutprobe einer lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung die eosinophile Subpopulation von anderen Leukozyten-Populationen vollständig getrennt. Obwohl dieses Beispiel mit einem nichtfokussierten Durchflussinstrument durchgeführt wurde, würden die gleichen Ergebnisse wie unter Verwendung eines fokussierten Durchflusssystemes, wie in Abb. 2 gezeigt, erhalten werden.
Es ist anzumerken, dass, obwohl die Größe der Eosinophilen dramatisch nach ihrem Aussetzen gegenüber dem lytischen Reagens reduziert wurde, ihre RF-Signale nicht wahrnehmbar beeinflusst wurden. Die Differenzierung zwischen den Neutrophilen und den Eosinophilen unter Verwendung der DC- und RF-Detektionstechnik wird hauptsächlich durch ihren bedeutenden Größenunterschied und durch Opazität erreicht. Wie in beiden Abb. 1a und 1b beschrieben, weist die eosinophile Subpopulation eine Rechtsverschiebung in der Opazität auf und bewegt sich vollständig von den Neutrophilen und anderen Leukozyten-Subpopulationen weg.
Abb. 2 zeigt die Bestätigung der eosinophilen Klassifizierung der vorliegenden Erfindung durch ein DC gegen "Rotated-Light-Scatter"-Diagramm unter Verwendung der gleichen, wie in Beispiel I beschriebenen, behandelten Blutprobe auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, das mit DC-, RF- und Lichtstreuungsgeräten ausgerüstet ist, unter Verwendung eines fokussierten Durchflussverfahrens. In der DC gegen "Scatter"- bzw. Lichtstreuungs-Dimension werden die Eosinophilen von den Neutrophilen sowohl durch ihre Größe als auch durch Lichtstreuungsunterschiede getrennt. Die Zahl der durch dieses Verfahren in der vorliegenden Erfindung als Eosinophile klassifizierten Zellen stimmte mit der Zahl der durch das herkömmliche manuelle Verfahren gezählten Eosinophilen überein.
In einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Lysis von roten Blutkörperchen in einer Blutprobe und zur Analyse der verbleibenden Leukozyten- Subpopulationen in mindestens fünf Leukozyten-Subpopulationen bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte: Schritt 1) das Behandeln eines ersten Aliquots einer Blutprobe mit einer ersten lytischen Reagenszusammensetzung über einen Zeitraum, der ausreichend ist, die roten Blutkörperchen zu lysieren und mindestens eine Leukozyten-Subpopulation in der Blutprobe zu differenzieren, Schritt 2) das Behandeln eines zweiten Aliquots der Blutprobe mit einem zweiten lytischen Reagenssystem, ausreichend, die roten Blutkörperchen zu lysieren und vier Leukozyten-Subpopulationen in der Blutprobe zu differenzieren, Schritt 3) das Analysieren des ersten Aliquots des behandelten Blutes unter Verwendung von DG- und RF-Messungen, Schritt 4) das Analysieren des zweiten Aliquots des behandelten Blutes unter Verwendung von DC- und RF- Messungen und Schritt 5) das Berichten über mindestens fünf Leukozyten-Subpopulationen.
Schritt 1, welcher ein erster Aliquot von Blut behandelt, wird unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung, welche in der ersten Ausführungsform der Erfindung beschrieben ist, erreicht. Schritt 3, welcher auf das Analysieren des ersten Blutaliquots gerichtet ist, wird durch das Verfahren, welches in der zweiten Ausführungsform dieser Erfindung beschrieben ist, durchgeführt.
Schritt 2 wird durch Behandeln eines zweiten Aliquots der Blutprobe mit einem zweiten lytischen Reagenssystem, ausreichend, die roten Blutkörperchen zu lysieren und vier Leukozyten-Subpopulationen in der Blutprobe zu differenzieren, erreicht. Das zweite lytische Reagenssystem differenziert die Leukozyten in die Lymphozyten, Monozyten, Basophile und Granulozyten, welche unterschiedlich von der basophilen Subpopulation sind. Die Blutprobe wird dem zweiten lytischen Reagens für weniger als 10 Sekunden ausgesetzt.
Das zweite lytische Reagenssystem schließt typischerweise ein lytisches Reagens und eine stabilisierende Reagenszusammensetzung ein. Ein Beispiel eines zweiten lytischen Reagenssystemes umfasst ein lytisches Reagens, umfassend eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel:
wobei R ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, m und n jeweils 1 oder mehr sind und m + n zwischen 20 und 40 liegen; und eine Säure, um den pH-Wert des lytischen Reagens auf den Bereich von 2,0 bis 3,6 einzustellen; und eine hypertonische, Alkali-stabilisierende Reagenszusammensetzung. Vorzugsweise ist R ein Alkylrest mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen. Zusätzlich ist bevorzugt, dass die zum pH-Wert-Einstellen verwendete Säure eine organische Säure umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die zum pH-Wert- Einstellen verwendete Säure eine wirksame Mischung aus Ameisensäure und einer Säure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Essig-, Zitronen-, Oxal-, Glykol-, Propion-, Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure und Mischungen davon.
Ein anderes Beispiel eines zweiten lytischen Reagenssystems umfasst ein lytisches Reagens, umfassend ein Polyoxyethylenbasiertes grenzflächenaktives Mittel, dargestellt durch die allgemeine Formel:
R&sub1;-R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-H
wobei R&sub1; ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R² -O- oder -COO- ist und n zwischen 20 und 35 liegt; und eine Säure, um den pH-Wert der lytischen Reagenszusammensetzung auf den Bereich von 2,0 bis 4,0 einzustellen, und eine hypertonische, Alkali-stabilisierende Reagenszusammensetzung. Vorzugsweise ist R ein Alkylrest mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen. Zusätzlich ist es bevorzugt, dass die zum pH-Wert-Einstellen verwendete Säure eine organische Säure umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die zum pH-Wert einstellen verwendete Säure eine wirksame Mischung aus Ameisensäure und einer Säure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Essig-, Zitronen-, Oxal-, Glykol-, Propion-, Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure und Mischungen davon.
Zwei Beispiele des zweiten lytischen Reagenses werden in den Beispielen IV und V bereitgestellt. Ein Beispiel für ein stabilisierendes Reagens, welches mit dem zweiten lytischen Reagens aus Beispiel IV und V verwendet wird, wird in Beispiel VI bereitgestellt.
Schritt 4 wird durch Analysieren des zweiten Aliquots des lysierten Blutes unter Verwendung von DC und RF erreicht. Abb. 4 stellt die vier Leukozyten-Subpopulationen dar, welche unter Verwendung des zweiten lytischen Reagenses, welches in Beispiel IV beschrieben ist, und der stabilisierenden Reagenszusammensetzung, welche in Beispiel VI beschrieben ist, aus einer, wie in dem Verfahren von Beispiel VII beschrieben, analysierten Blutprobe, erhalten wurden. Wie in Abb. 4 gezeigt, werden die vier Leukozyten-Subpopulationen der Lymphozyten, Monozyten, Basophilen und Granulozyten, welche unterschiedlich von den Basophilen sind, unter Verwendung der DC- und RF-Messungen deutlich differenziert.
Schritt S berichtet von mindestens fünf Leukozyten-Subpopulationen. Wie oben bemerkt, werden die Lymphozyten, Monozyten, Basophilen direkt in Schritt 4 erhalten. Die neutrophile Subpopulation wird durch Subtrahieren der in Schritt 3 erhaltenen eosinophilen Subpopulation von den in Schritt 4 erhaltenen Granulozyten, welche von den Basophilen unterschiedlich sind, erhalten.
Die lytische Reagenszusammensetzung, das zweite lytische Reagenssystem oder eine Kombination davon kann jeweils als ein Kit verkauft werden, wobei das lytische Reagens in einen Behälter, wie ein Plastikbehälter, verpackt ist. Anweisungen, wie diese Komponenten gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind vorzugsweise in oder auf dem Behälter enthalten.
Die Erfindung wird ferner unter Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche beabsichtigen, beschreibend und nicht begrenzend zu sein.

Beispiel I

Eine lytische Reagenszusammensetzung ist mit der folgenden Zusammensetzung formuliert worden:
1. T-Mulz 66H (Harcros Chemicals, Inc., 50% Kaliumsalz eines organischen Phosphorsäureesters) 5,0 g
2. Natriumdodecylsulfat 1,0 g
3. Hetoxol STA30 (Heteren, ethoxylierter Stearylalkohol) 10,0 g
4. Pluronic 10R5 (BASF) 15,0 g
5. Ameisensäure 0,2 ml
6. Natriumsulfat 9,0 g
7. Kaliumchlorid 6,0 g
8. BHT, vorgelöst in Ethanol 0,05 g
9. Proclin 300 (Rohm & Haas Co.) 0,5 ml
10. pH-Wert (eingestellt mit 4 M HCl) 2,2
11. Deionisiertes Wasser eingestellt auf 1 l
Zu 28 ml einer EDTA-anti-koagulierten normalen Vollblutprobe wurden 1800 ml der lytischen Reagenszusammensetzung hinzugegeben und die Mischung wurde vorsichtig durch Drehen bzw. Rühren für 9 Sekunden bei Raumtemperatur (ungefähr 21ºC) gemischt und war für die Differenzierungsanalyse etwa 13 Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung fertig. Die Blutmischung wurde auf saueren (pH-Wert etwa 2,2) und hypertonischen Bedingungen mit einer Osmolalität von 484 mOsm gehalten. Eine Differenzierungsanalyse wurde auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, welches mit DC- und RF-Geräten ausgerüstet war, unter Verwendung einer nichtfokussierten Durchflusstechnik durchgeführt. Die resultierenden zweidimensionalen Diagramme werden in Abb. 1a und 1b beschrieben. Die vertikalen und horizontalen Achsen von Abb. 1a sind DC bzw. Opazität und die vertikalen horizontalen Achsen von Abb. 1b sind RF bzw. Opazität. Die eosinophilen Populationen werden differenziert und durchgezählt und entweder als absolute Zahl oder als Prozentzahl, wenn sie gegen die Gesamt- Leukozytenzahl berechnet werden, berichtet.

Beispiel II

Eine lytische Reagenszusammensetzung, formuliert mit der folgenden Zusammensetzung, wurde für die Differenzierungsanalyse der Leukozyten-Subpopulationen verwendet. Zu 28 ml einer EDTA-anti-koagulierten normalen Vollblutprobe wurden 1600 ml der lytischen Reagenszusammensetzung hinzugegeben und die Mischung wurde vorsichtig durch Rühren für etwa 8 Sekunden bei Raumtemperatur (ungefähr 21ºC) gemischt und war für die Differenzierungsanalyse etwa 12 Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung fertig. Abb. 3a und 3b zeigen zwei DC gegen Opazitäts-Diagramme. Abb. 3a entspricht einer normalen Blutprobe und die Abb. 3b entspricht einer Blutprobe mit erhöhten Eosinophilen (12% von der manuellen Differenzierungszählung).
1. Burco TME (Burlington Chemical Co., Inc., ethoxyliertes Dodecylmercaptan, HLB = 13,0) 1,5 g
2. Natriumdodecylsulfat 1,0 g
3. Hetoxol STA30 (Heteren, ethoxylierter Stearylalkohol) 8,0 g
4. Pluronic L35 (BASF) 10,0 g
5. Zitronensäure 17,0 ml
6. Natriumsulfat 9,0 g
7. Kaliumchlorid 6,0 g
8. Deionisiertes Wasser eingestellt auf 1 l
9. pH-Wert 2,2

Beispiel III

Ein lytisches Reagens wurde unter Verwendung der folgenden Zusammensetzung formuliert. Das Reagens wurde für die Differenzierungsanalyse der Leukozyten-Subpopulationen verwendet. Zu 28 ml der EDTA-anti-koagulierten Gesamtblutprobe wurden ungefähr 1880 ml der lytischen Reagenszusammensetzung hinzugefügt und die Mischung wurde vorsichtig durch Rühren für 11 Sekunden bei Raumtemperatur (ungefähr 21ºC) gemischt und war für die Differenzierungsanalyse etwa 15 Sekunden nach Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung fertig. Die Probe wird danach in einem experimentellen Hämatologie-Instrument analysiert.
1. Tergitol NP-13 (Union Carbide, ethoxyliertes Nonylphenol) 1,0 g
2. Natriumtetradecylsulfat 1,0 g
3. Hetoxol STA30 (Heteren) 10,0 g
4. Ameisensäure 0,2 ml
5. Natriumsulfat 9,0 g
6. Kaliumchlorid 5,0 g
7. Pluronic 10R5 15,0 g
8. Deionisiertes Wasser eingestellt auf 1 l
9. pH-Wert (eingestellt mit 4M HCl) 2,2

Beispiel IV

Erstes Beispiel des zweiten lytischen Reagenses

Eine lytische Reagenszusammensetzung, welche die ethoxylierte langkettige Aminverbindung einschließt, ist mit der folgenden Zusammensetzung formuliert worden:
Eine kationische ethoxylierte langkettige Aminverbindung mit der Formel:
wobei m + n einen Wert von 30 aufweisen, wurde in deionisiertem Wasser in einer Konzentration von 20 g/l aufgelöst. Ameisensäure wurde verwendet, um den pH-Wert auf 3,2 einzustellen. Zusätzlich wurden die folgenden Konservierungsmittel hinzugefügt: 0,2 g/l EDTA, 0,5 g/l Proclin 300 (Rohm & Haas Co.) und 0,05 g/l 2,6-Di-tert.- butyl-4-methylphenol (vorgelöst in Ethanol).

Beispiel V

Zweites Beispiel des zweiten lytischen Reagenses

Eine lytische Reagenszusammensetzung, welche das grenzflächenaktive Mittel auf Polyoxyethylen-Basis enthält, ist mit der folgenden Zusammensetzung formuliert worden:
Ein grenzflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis mit der Formel:
C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7;O(CH&sub2;CH&sub2;O)nH
wobei n 30 ist, wurde in deionisiertem Wasser in einer Konzentration von 20 g/l aufgelöst. 0,8 g/l Natriumdodecylsulfat (SDS, Aldrich) wurden hinzugefügt. Ameisensäure wurde verwendet, um den pH-Wert auf 2,8 einzustellen.
Das zweite lytische Reagens wurde in Verbindung mit einem stabilisierenden Reagens verwendet, um ein lytisches Reagenssystem zu bilden, welches die Leukozyten in die Lymphozyten, Monozyten, Basophilen und Granulozyten, welche von den basophilen Subpopulation unterschiedlich sind, zu differenzieren. Ein Beispiel des stabilisierenden Reagenses ist in Beispiel VI beschrieben.

Beispiel VI

Stabilisierendes Reagens für das zweite lytische Reagens

Ein stabilisierendes Reagens ist, wie oben beschrieben, formuliert worden und aus 14 g/l NaCl, 32 g/l Na&sub2;SO&sub4; und 6,6 g/l Na&sub2;CO&sub3;-Puffer, pH-Wert eingestellt auf 11,0 zusammengesetzt. Die Osmolalität dieses Reagenses beträgt etwa 1080 mOsm.

Beispiel VII

Differenzierung der Leukozyten-Population in einer Blutprobe

Zu 28 ml einer EDTA-anti-koagulierten normalen Vollblutprobe wurden 488 ml der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel IV hinzugegeben und die Mischung wurde vorsichtig durch Rühren für 4 Sekunden bei Raumtemperatur (ungefähr 21ºC) gemischt. Die Lysierungsreaktion wurde durch die Zugabe von 209 ul stabilisierendes Reagens von Beispiel VI verzögert. Die Blutmischung wurde vorsichtig gemischt und war für die Differenzierungsanalyse etwa 15 Sekunden nach der Zugabe des Stabilisierungsreagenses fertig. Die endgültige Blutmischung wurde bei neutralem pH-Wert (etwa 7) und unter hypertonischen Bedingungen mit einer Osmolalität von etwa 445 mOsm gehalten. Abb. 4 zeigt eine Differenzierungsanalyse unter Verwendung von DC und RF.

Claims

1. Wäßrige lytische Reagenszusammensetzung, umfassend:

a) ein Alkalimetallsalz eines Alkylsulfates,

b) eine Säure in einer Menge, die wirksam eine Lysis von roten Blutkörperchen unterstützt und eine saure Umgebung zur Verminderung einer eosinophilen Subpopulation zur Verfügung stellt,

c) ein eosinolytisches Mittel mit einem hydrophilen-lipophilen Gleichgewicht (HLB) von weniger als 15, das eine selektive Verminderung einer eosinophilen Subpopulation von Leukozyten erleichtert, ausgewählt aus organischen Phosphatestern, Alkalimetallsalzen organischer Phosphatester, ethoxylierten Phosphatalkylphenolen, ethoxylierten Alkylalkoholen und ethoxylierten Alkenylalkoholen und Gemischen davon,

d) ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel mit einem HLB von größer als 16, das eine neutrophile Subpopulation von Leukozyten vor einer Lysis schützt, und

e) ein physiologisches Salz in einer Menge, die ausreichend für eine Osmolalität der Zusammensetzung von 370 bis 720 mOsm ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Alkylsulfat von 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, welche von 0,02% bis 0,16% (w/v) eines Alkalimetallsalzes umfaßt.

4. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche einen pH-Wert von 1,4 bis 3,4 aufweist.

5. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Säure eine organische Säure, eine anorganische Säure oder eine Mischung davon umfaßt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Säure aus Zitronensäure, Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Mischungen davon ausgewählt ist.

7. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche von 0,05% bis 0,8% (w/v) des eosinolytischen Mittels umfaßt.

8. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel einen ethoxylierten Alkylalkohol mit einem HLB von mindestens 16, einen ethoxylierten Alkylenalkohol mit einem HLB von mindestens 16 oder eine Mischung davon umfaßt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, welche 0,5% bis 3,0% (w/v) des nicht- ionischen grenzflächenaktiven Mittels umfaßt.

10. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche weiter Polyoxyethylen- und Polyoxypropylen-Copolymere in einer zur Erleichterung des Auflösens von Trümmern roter Blutkörperchen ausreichenden Menge beinhaltet.

11. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das physiologische Salz ein Alkalimetallchlorid, ein Alkalimetallsulfat oder eine Mischung davon umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, welche von 0,2% bis 1,3% (w/v) eines Alkalimetallchlorids umfaßt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, welche von 0,4% bis 2,0% (w/v) eines Alkalimetallsulfates umfaßt.

14. Verfahren zur Lysis roter Blutkörperchen in einer Blutprobe und Analyse der verbleibenden Leukozyten-Subpopulationen, umfassend:

a) das Aussetzen der Blutprobe einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche von 1 bis 13 über einen Zeitraum, der ausreichend ist, die roten Blutkörperchen zu lysieren und mindestens eine Leukozyten- Subpopulation in der Blutprobe zu differenzieren,

b) das Differenzieren von mindestens einer Leukozyten-Subpopulation, ausgewählt aus Eosinophilen, Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen unter Verwendung von mindestens zwei Typen von Messungen, ausgewählt aus DC-, RF- und Lichtstreuungsmessungen, und

c) das Berichten bzw. Listen der Ergebnisse der Differenzierung.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei mindestens eine Leukozyten- Subpopulation eine eosinophile oder neutrophile Subpopulation ist.

16. Verfahren zur Lysis roter Blutkörperchen in einer Blutprobe und Analyse der verbleibenden Leukozyten-Subpopulationen, umfassend:

a) das Behandeln eines ersten Aliquots der Blutprobe mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 über einen Zeitraum, der ausreichend ist, die roten Blutkörperchen zu lysieren und einen Nachweis von mindestens einer Leukozyten-Subpopulation in der Blutprobe zu ermöglichen,

b) das Behandeln eines zweiten Aliquots der Blutprobe mit einem zweiten lytischen Reagenssystem über einen Zeitraum, der ausreichend ist, die roten Blutkörperchen zu lysieren und einen Nachweis in der Blutprobe von vier Leukozyten-Subpopulationen, umfassend Lymphozyten, Monozyten, Basophile und andere Granulozyten als Basophile, zu ermöglichen,

c) das Analysieren des ersten behandelten Aliquots unter Verwendung von DC- und RF-Messungen zum Erhalt des Nachweises von mindestens der eosinophilen Subpopulation,

d) das Analysieren des zweiten behandelten Aliquots unter Verwendung von DC- und RF-Messungen zum Erhalt des Nachweises der vier Leukozyten-Subpopulationen und

e) die Verwendung der Ergebnisse von Schritt c und d zum Berichten bzw. Listen von mindestens fünf Leukozyten-Subpopulationen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Zeitraum von Schritt (b) weniger als 10 Sekunden beträgt.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das zweite lytische Reagenssystem

a) bei einem pH-Wert von 2,0 bis 3,6, eine ethoxylierte langkettige Aminverbindung mit der allgemeinen Formel:

RH [(CH&sub2;CH&sub2;O)mH][(CH&sub2;CH&sub2;O)nH]

wobei R ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, m und n jeweils eine ganze Zahl sind und m + n zwischen 20 und 40 liegt, und eine Säure und

b) eine hypertonische Alkali-stabilisierende Reagenszusammensetzung umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das zweite lytische Reagenssystem

a) bei einem pH-Wert von 2,0 bis 4,0 ein grenzflächenaktives Mittel auf Polyoxyethylen-Basis mit der allgemeinen Formel:

R&sub1;-R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-H

wobei R&sub1; ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R&sub2; -O- oder -COO- ist und n zwischen 20 und 35 liegt, und eine Säure und

b) eine hypertonische Alkali-stabilisierende Reagenszusammensetzung umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das zweite lytische Reagenssystem weiter Natriumdodecylsulfat umfaßt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei die Differenzierung oder Analyse des ersten Aliquots unter Verwendung von DC- und RF- Messungen durchgeführt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei der Zeitraum von Schritt (a) 10 bis 25 Sekunden beträgt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei das oder jedes Lysieren der roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur, z.B. bei 15ºC bis 30ºC, durchgeführt wird.