DE3586619T2

DE3586619T2 - Haematologische zusammensetzungen als referenz fuer drei populationen von leukocyten, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung in ganzbluttestverfahren.

Info

Publication number: DE3586619T2
Application number: DE8585902765T
Authority: DE
Inventors: Jay Carver; John Gerula
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1984-05-18
Filing date: 1985-05-07
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2005-05-08
Also published as: WO1985005450A1; ES8609719A1; EP0181393A4; US4704364A; US5380664A; KR920010294B1; ES543228A0; AU592754B2; EP0181393B1; KR880700490A; JP2557837B2; JPS61502210A; DE3586619D1; CA1249208A; EP0181393A1; AU4352785A

Description

Die Erfindung betrifft hämatologische Kontrollzusammensetzungen und Verfahren zu deren Anwendung in einer Referenzstandardsubstanz für Teilchenanalysegeräte des Coulter®-Typs. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein mit bekannten Kontrollmitteln für rote Blutkörperchen und Blutplättchen kompatibles Dreikomponentensystem zur Simulierung der drei Hauptbestandteile von menschlichen Leukocyten, nämlich den Lymphocyten, mononukleären Zellen und Granulocyten, sowie wahlweise deren Untergruppen.
Mononukleäre Zellen sind Blutkörperchen mit nur einem Kern, die Monocyten und zahlreiche reife und unreife Arten von Lymphocyten, unreife Myelocyten und erythrocytische Blutzellen umfassen. Die abgewandelte COULTER COUNTER Modell S Plus-Vorrichtung kann reife Lymphocyten und polymorphische Granulocyten von der bei normalen und pathologischen Zuständen im zirkulierenden Blut vorkommenden allgemeinen Gruppe der mononukleären Zellen abgrenzen. Diese zirkulierenden mononukleären Blutzellen umfassen u. a. Promyelocyten, Myeolocyten sowie Monocyten. Da Monocyten die weitverbreiteste mononukleäre Zellpopulation unter normalen hämopoietischen Bedingungen ist, läßt sich der 90-160 fl-Bereich als der Monocytenbereich bezeichnen.
Die Verwendung elektronischer Teilchenzählvorrichtungen in der Hämatologie ist bereits bekannt. In der US-PS 26 56 508 wird eine grundlegende Vorrichtung beschrieben, die zu diesem Zweck das Coulter-Prinzip anwendet. Die US-PS 37 57 213 beschreibt mehrere dieser Vorrichtungen, die Schwellwertschaltungen umfassen. Schwellwertschaltungen schließen durch Rauschen und Hintergrundteilchen von folgewidrigen Teilchen in der Suspension verursachte zufällige Amplitudensignale aus. Sie lassen sich auch zur Begrenzung des Größenbereichs der gezählten Teilchen verwenden. Einstellbare Schwellwertschaltkreise mit Einstellvorrichtungen, die entsprechend einem mathematischen Zusammenhang markiert sind, werden häufig verwendet.
Diese Offenbarung ist zwar in erster Linie auf Ausführungsformen gerichtet, bei denen elektronische Teilchenzählvorrichtungen des COULTER-Typs verwendet werden, die hier beschriebenen Teilchenkontrollmittel und deren Anwendungsverfahren lassen sich jedoch mit Teilchenzählvorrichtungen im allgemeinen anwenden. Demzufolge ist der Begriff "elektronische Teilchenzählvorrichtung" so aufzufassen, daß er zusätzlich zu COULTER COUNTER®- Geräten auch alle anderen Arten von Teilchenzählvorrichtungen beinhaltet, die zwischen Teilchen unterschiedlicher Größe mittels elektronischer Diskriminatorenschaltungen ("Schwellen") unterscheiden, die elektronisch auf auf die Teilchengröße, Teilchenmasse oder das Teilchenvolumen hinweisende Signale ansprechen. COULTER und COULTER COUNTER sind eingetragene Warenzeichen der Coulter Electronics, Inc.
Der Stand der Entwicklung der Kalibriertestverfahren für die Zahl der roten Blutkörperchen (Erythrocyten), weißen Blutkörperchen (Leukocyten) und Blutplättchen (Thrombocyten) und deren physikalische Eigenschaften ist weit fortgeschritten. Das zur Prüfung der Kalibrierung verwendete Material, im folgenden als Kontrollmittel bezeichnet, läßt sich auch zur Kalibrierung eines hämatologischen Instrumentes verwenden. Die Verfahren zum Gebrauch eines Kontrollmittels umfassen im allgemeinen das Zählen bekannter Teilchenpopulationen, die in einem Flüssigkeitsträger in dem Kontrollpräparat suspendiert sind, das in der Regel vor dem Zählen im wesentlichen mit einem Verdünnungsmittel verdünnt wird. Bisher wurde jedoch noch kein Kontrollmittel zur Verwendung mit drei Leukocyten-Untergruppen, nämlich den Lymphocyten, mononukleären Zellen und Granulocyten, entwickelt, da die für das automatische Zählen dieser drei Untergruppen benötigte Ausrüstung noch nicht entwickelt war.
Es versteht sich von selbst, daß ein Kontrollprodukt auf Vergleichsbasis genaue Angaben darüber zu machen hat, was eine zu untersuchende frische Blutprobe in bezug auf die durchzuführenden Bestimmungen darstellt. Es versteht sich weiter, daß es sehr wichtig ist, daß das Kontrollprodukt frisches Blut simuliert, da Bestandteile des Bluts, wie z. B. rote Blutkörperchen, langsam hämolysieren können und somit ihre Größe und Form innerhalb weniger Stunden nach Entnahme vom Blutspender verändern können. Ähnlich unterliegen weiße Blutkörperchen solchen degenerativen Veränderungen.
Die Qualitätskontrolle ist seit langem ein notwendiges und routinemäßiges Verfahren in der klinischen Hämatologie. Die Genauigkeit beim Zählen von roten und weißen Blutkörperchen bei der Durchführung von Hämatokrit- und Hämoglobinbestimmungen des Serums des Patienten hängt teilweise von der Verwendung geeigneter Kontrollstandardsubstanzen ab. Die Genauigkeit bei manuellen Teilchenzählverfahren, wie z. B. beim klassischen Mikroskopverfahren, läßt sich dadurch überprüfen, daß man dem Laboranten eine sogenannte "Blindprobe" oder eine Kontrollstandardsubstanz zur Verfügung stellt, die eine bekannte Konzentration der zu bestimmenden Teilchen zum Vergleich mit den unbekannten Proben enthält. Bei den zahlreichen, derzeitig erhältlichen Arten von automatischen Teilchenzählvorrichtungen ist eine Qualitätskontrolle mit Kontrollstandardsubstanzen durch die Häufigkeit von Anlagenstörungen ebenfalls notwendig. Dies verdeutlicht die Wichtigkeit genauer und zuverlässiger Überprüfungen bei der Durchführung von hämatologischen Bestimmungen, die zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden können. Das herkömmliche Verfahren zur Durchführung eines Qualitätskontrollprogrammes bei automatischen Teilchenzählvorrichtungen bestand in der Verwendung von frischem menschlichen Blut als Standardsubstanz für Vollblut. Dieses frische Blut läßt sich jedoch nur einen Tag lang verwenden. Deshalb entwickelte man haltbare Blutprodukte, für die kein frisches menschliches Blut mehr notwendig war.
In der US-PS 44 85 175 ist ein automatisches Verfahren zur differentiellen Bestimmung von drei Leukocytenpopulationen unter Verwendung einer automatischen Blutzählvorrichtung des Typs COULTER COUNTER Modell S Plus beschrieben. Demzufolge besteht nun ein Bedarf nach einer zuverlässigen Überprüfung der Schwellwertkalibrierung und zusätzlicher Arbeitsgänge bei elektronischen Teilchenzählvorrichtungen, für die die derzeit vertriebenen COULTER COUNTER-Analysevorrichtungen stellvertretend dargestellt sind. Die Bedienperson kann dann die Volumenbereiche, in denen die drei Leukocytenpopulationen routinemäßig zu zählen sind, identifizieren und dokumentieren.
Des weiteren besteht in diesem Bereich ein Bedarf nach einem zuverlässigen Verfahren zum Nachweis der Instrumentenstabilität über einen längeren Nutzungszeitraum.
Menschliche Lymphocyten, mononukleäre Zellen und Granulocyten besitzen jeweils einen spezifischen Größenverteilungsbereich, und nach ihrer Stabilisierung (z. B. mit Formaldehyd als Fixiermittel) kann es sein, daß ihre Ansprechempfindlichkeit in Verdünnungsmitteln keine ordnungsgemäße Unterscheidung der Größe mehr erlaubt. Dies würde dazu führen, daß eine Bewertung der ordnungsgemäßen Instrumentenfunktion nicht möglich ist. In dem Referenzkontrollmaterial müssen sowohl die oberen als auch die unteren Größengrenzen für jede Leukocytenpopulation dargestellt sein. Zusätzlich sollte das mittlere Zellvolumen jeder Leukocytenpopulation in dem Referenzkontrollmaterial sich dem von normalem menschlichen Blut annähern. Bei einer derartigen genauen Angabe der oberen und unteren Größengrenzen und des mittleren Zellvolumens muß sich das Volumenverteilungshistogramm des Kontrollmaterials praktisch der normalen Verteilung von frischen menschlichen Blutzellen annähern. Diese Volumenverteilung muß relativ konstant bleiben, unabhängig von der Gesamtzahl der gezählten weißen Blutkörperchen und dem Verhältnisbereich für alle drei Populationen, die einen anormal niedrigen, normalen und anormal hohen Zustand für menschliche Leukocyten darstellen. Es ist deshalb notwendig, daß das bei der Herstellung der Referenzkontrollsuspension angewandte Konservierungsverfahren keine erhebliche Verkleinerung oder Vergrößerung der Zellen bewirkt. Es ist auch sicherzustellen, daß das Alter des Referenzkontrollmittels nicht den Kurvenverlauf des Volumenverteilungshistogramms oder andere Parameter beeinträchtigt. Ein weiteres Erfordernis für den Leukocytenbestandteil in einem Vollblutkontrollmittel für Mehrparameter-Meßvorrichtungen besteht darin, daß keine vollständige Lysierung der Zellen durch das lytische Reagens stattfinden darf. Angesichts der zunehmenden Verwendung automatischer Vorrichtungen, die zur Durchführung mehrerer hämatologischer Bestimmungen in der Lage sind, und angesichts der Einführung automatischer Verfahren zum Zählen der Zellen, liegt die Lösung des Problems nicht in der Suche nach effektiveren Möglichkeiten zur Stabilisierung "echter" menschlicher Leukocyten, sondern in der Schaffung eines Ersatzes, der den Spezifikationen entspricht, nach denen das Produkt hergestellt wird. Aus diesem Grund wurde nach Tierzellen gesucht, die sich in ein nützliches Kontroll- bzw. Kalibriermittel umwandeln lassen.
Hierzu gibt es einen umfassenden Stand der Technik, der zum Teil in dieser Anmeldung näher erläutert wird. Werden weitere Informationen zum vollständigen Verständnis der vorliegenden Erfindung benötigt, so sei auf folgende Druckschriften hingewiesen: US- Patente 41 79 398; 42 13 876; 42 64 470; 42 99 726; 43 89 490; 44 05 719 und 44 85 175.
Die vorliegende Erfindung schafft eine hämatologische Referenzkontrollflüssigkeitssuspension zur Bestimmung von mehreren hämatologischen Parametern in einer automatischen Blutkörperchenzähl- und Größenbestimmungsvorrichtung, gekennzeichnet durch eine vorbestimmte Anzahl von fixierten roten, in mindestens zwei der folgenden annähernden Größenbereiche zu zählenden Blutkörperchen:
35 bis 90 ± 3 fl
90 bis 160 ± 3 fl
160 bis 450 ± 3 fl
in einem kompatiblen wäßrigen und im wesentlichen isotonischen Stabilisierungsmittel, wobei die Blutzellen in den jeweiligen Größenbereichen eine Ersatzfunktion für jeweils eine von drei weißen Blutkörperchen-Subpopulationen in menschlichem Blut einnehmen, nämlich für Lymphocyten, Monocyten bzw. Granulocyten.
Die Erfindung schafft des weiteren eine hämatologische Referenzkontrollflüssigkeitssuspension zur Verwendung mit einer automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung, gekennzeichnet durch eine vorbestimmte Anzahl von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen, die die Funktion haben, menschliche Granulocyten zu simulieren und von Reptilien oder Fischen stammen.
Die Erfindung schafft des weiteren ein hämatologisches Referenzkontrollmittel, gekennzeichnet durch mindestens zwei Arten von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen, die mindestens zwei Leukocytenarten simulieren, wobei die Größe von jeder simulierten Leukocytenart und/oder das Verhältnis von mindestens zwei simulierten Leukocytenarten so angepaßt ist, daß ein festgelegter abnormer Zustand der menschlichen weißen Blutkörperchen dargestellt ist.
Die Erfindung schafft des weiteren eine hämatologische Referenzkontrollflüssigkeitssuspension zur Bestimmung mehrerer hämatologischer Parameter in einer automatischen Zellenzähl- und -größenbestimmungsvorrrichtung, gekennzeichnet durch:
eine Suspension aus stabilisierten menschlichen roten Blutkörperchen in einem wäßrigen Medium zur Hämoglobinbestimmung, wobei die menschlichen roten Blutkörperchen ihre Ansprechempfindlichkeit auf ein lysierendes Reagens durch Stromatolysierung beibehalten; größenmäßig angepaßte und fixierte rote Blutkörperchen, die weiße Blutkörperchen zur Bestimmung von Lymphocyten, Monocyten und Granulocyten simulieren;
und stabilisierte oder simulierte Blutplättchenzellen; wobei alle Zellen in so einem Verhältnis vorhanden sind, daß die Endparameter für rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen in einen vorbestimmten Bereich fallen, der erwartungsgemäß bei bestimmten menschlichen normalen und krankhaften Zuständen vorhanden ist.
Die Erfindung schafft des weiteren eine hämatologische Referenzflüssigkeitssuspension für die Messung eines isolierten Parameters zur Verwendung mit einer automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung, gekennzeichnet durch eine vorbestimmte Zahl von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen, die die Funktion haben, menschliche mononukleäre Zellen zu simulieren und von Truthähnen stammen.
Ein neues Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines stabilen, reproduzierbaren hämatologischen Kontrollmittels für drei Populationen von weißen Blutkörperchen. Bei einem Dreikomponenten-Leukocytensystem gemäß vorliegender Erfindung werden Verfahren zur Herstellung simulierter Lymphocyten von Säugern, z. B. menschliche Erythrocyten, simulierter mononukleärer Zellen von Geflügel, z. B. Truthahnerythrocyten, und simulierter Granulocyten von Reptilien- oder Fischerythrocyten, z. B. dem Mutterhai (Ginglymostoma cirratum) vorgegeben. Zusätzlich wird ein neues Verfahren zur Herstellung veränderter roter Blutkörperchen einer vorbestimmten Größe innerhalb bestimmter Grenzen durch Regelung des Alters der roten Blutkörperchen vor deren Behandlung sowie der Fixiermitteltemperatur und -konzentration beschrieben.
Man hat herausgefunden, daß der Mutterhai (Ginglymostoma cirratum) Eryhrozyten (rote Blutkörperchen) besitzt, die normalerweise in einen Größenbereich fallen, der leicht über dem der menschlichen Granulocyten liegt, und daß sich diese Erythrocyten derart verändern und fixieren lassen, daß sie hinsichtlich ihrer Volumenverteilung ähnlich der Volumenverteilung der menschlichen Granulocyten im Vollblut sind und sich somit als Referenzkontrollmittel für menschliche Granulocyten verwenden lassen. Das auf diese Weise hergestellte Granulocytenanalogon ist stabil und reproduzierbar zum Gebrauch als eigenständiges Referenzkontrollmittel oder in trimodalen Zusammensetzungen aus weißen Blutkörperchen, die zur Simulierung von menschlichen mononukleären Zellen auch veränderte und fixierte rote Blutkörperchen von Truthähnen sowie veränderte und fixierte menschliche rote Blutkörperchen zur Simulierung von menschlichen Lymphocyten enthalten. Die weißen Blutkörperchen-Analogone lassen sich auch in ein einziges hämatologisches Referenzkontrollmittel zur Analyse mehrerer Parameter einfügen, das nicht nur weiße Blutkörperchenbestandteile sondern auch Erythrocyten- und Blutplättchenparameter bestimmt. Das Verhältnis und der gesamte Zellzählwert für die drei Leukocytenpopulationen lassen sich derart anpassen, daß sowohl pathologische als auch normale Zustände in menschlichem Blut dargestellt werden. Diese Zusammensetzungen sind auch in Kontroll- und Kalibrierzusammensetzungen, insbesondere für nach dem Coulter-Prinzip arbeitende automatische Teilchenanalysevorrichtungen, nützlich.
Die durch die hier offenbarten Verfahren behandelten Zellen und die solche Zellen beinhaltenden Zusammensetzungen schaffen ein ausgezeichnetes System der Probe und Gegenprobe, das bei hämatologischen Bestimmungen von äußerster Wichtigkeit ist.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1A, 1B einen Vergleich der Leukocytenverteilungshistogramme einer Probe auf der automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung COULTER COUNTER Modell S Plus;
Fig. 1A ein Histogramm einer normalen Blutprobe;
Fig. 1B ein durch das erfindungsgemäße hämatologische Kontrollsystem und -verfahren erhaltenes Histogramm.
Die Erfindung ist so flexibel, daß die Herstellung von Lymphocyten, mononukleären Zellen und Granulocytenpopulationen, die größer oder kleiner als die in Fig. 1B gezeigten sind, möglich ist. Die Größenveränderungen können dann abnorme Größenverteilungen von weißen Blutkörperchen spiegeln, die für menschliche pathologische Zustände charakteristisch sind.
Bei jedem System zum automatischen differentiellen Zählen menschlicher Leukocyten, das drei Leukocytenpopulationen von anderen Zellen im Blut anhand des charakteristischen Größenbereichs und der Volumenverteilung unterscheiden kann, ist es erforderlich, daß das als solches verwendete Referenzkontrollmaterial den Größenbereich und die Volumenverteilungskenngrößen der entsprechenden Zellen in normalem menschlichen Blut so originalgetreu wie möglich simuliert. Das Problem besteht darin, Verfahren zu finden, mit denen sich Zellen genau in einer bestimmten Größe in reproduzierbaren und ausreichend vorhandenen Mengen herstellen lassen, wie sie zur Verwendung in Kontrollmitteln für automatische Zählvorrichtungen erforderlich sind.
Die US-PS 44 85 175 beschreibt ein Verfahren und Reagenziensystem zur Dreivolumen-Differentialbestimmung der Leukocytenpopulationen Lymphocyten, mononukleären Zellen und Granulocyten unter Verwendung eines Typs eines modifizierten COULTER COUNTER Modell S Plus-Instruments, das jetzt als das Modell S Plus IV diff und Model S Plus V vertrieben wird. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die drei Leukocytenklassen in Femtolitern (fl) in etwa wie folgt gezählt:
Lymphocyten 35 bis 90 ± 3 fl
mononukleäre Zellen 90 bis 160 ±+ 3 fl
Granulocyten 160 bis 450 ± 3 fl.
Die Leukocyten, die in dem als "mononukleäre Zellen" bezeichneten Bereich klassifiziert und gezählt werden, umfassen Monocyten.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die aus verschiedenen Quellen stammenden, behandelten roten Blutkörperchen mit einer Anzahl von Schwelleneinstellungen zwischen ca. 25 fl und ca. 700 fl für viele Arten von Blutzählinstrumenten in Einklang gebracht werden. Die anderen COULTER COUNTER-Instrumente, mit denen die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, sind vom Typ Modell S und Modell S Plus. Das COULTER COUNTER Modell S zählt Leukocyten von 25 fl bis Unendlich. Andere Arten von COULTER COUNTER Modell S Plus-Instrumenten zählen Lymphocyten von ca. 45 fl bis ca. 99 fl und mononukleäre Zellen und Granulocyten von ca. 99 fl bis Unendlich.
Es sind zwar Verfahren zur Herstellung von Kontrollzusammensetzungen für automatische Zählvorrichtungen bekannt, bei denen alle Leukocyten als eine einzige Gesamtpopulation gezählt werden, bislang wurden aber keine Verfahren zur Herstellung von Blutzellenkontrollmitteln für die differentielle Zählung von Einzelbestandteilen der Leukocytenpopulation beschrieben. Zur Überprüfung der Schwelleneinstellungen von elektronischen Teilchenzählvorrichtungen ist die Herstellung eines Analogons für die jeweiligen Leukocytenhauptbestandteile, wie die Lymphocyten, mononukleären Zellen und Granulocyten, erforderlich.
Bislang erhältliche Referenzkontrollprodukte zur Überprüfung der Leistungskenngrößen von Teilchenanalyseinstrumenten in Vollblutkontrollmitteln waren zur Bewertung des Zählwerts der gesamten weißen Blutkörperchen ausgelegt. Das einzige Erfordernis bestand in einem stabilen, nicht lysierbaren Bestandteil mit einer Mehrzahl von Teilchen über einer minimalen Schwelle, beispielsweise 35 bis 45 fl. Bei der derzeitigen Analyse von mehreren Zellpopulationen der weißen Blutkörperchen sind jedoch Teilchen spezifischer relativer Größe erforderlich. Des weiteren besteht ein Bedarf nach solch einem Referenzkontrollmittel, das über einen längeren Zeitraum hinweg verwendbar ist, ohne daß sich die damit erhaltenen Referenzwerte wesentlich ändern.
Die US-PS 38 73 467 offenbart eine Kontrollzusammensetzung für weiße Blutkörperchen unter Verwendung von roten Blutkörperchen, die dadurch stabilisiert wurden, daß das Blutplasma mittels eines Stabilisierungsmittels ersetzt wurde, wobei fixierte vergrößerte rote Blutkörperchen ein vergrößertes mittleres Zellvolumen aufweisen und alle vorhandenen Leukocyten ersetzen. Durch die Vergrößerung auf ein 50% größeres Volumen wird die spezifische Gravität der Zelle derart reduziert, daß sie im Bereich von 1,06 bis 1,08 liegt.
In der vorliegenden Erfindung werden fixierte menschliche rote Blutkörperchen nur als Ersatz für den geringeren Lymphocytenanteil der weißen Blutkörperchen verwendet. Mit diesen simulierten Lymphocyten werden von Tieren stammende, größere fixierte rote Blutkörperchen vermischt, die die beiden größeren Bestandteile der weißen Blutkörperchen repräsentieren sollen, nämlich die mononukleären Zellen und die Granulocyten. Auf diese Weise werden alle drei Populationen der weißen Blutkörperchen nachgewiesen. Die von den drei Wirbeltierarten stammenden roten Blutköperchen werden stets fixiert, so daß sie bei der Bestimmung der weißen Blutkörperchenparameter in der gleichen Blutkontrollprobe nicht lysiert werden. Zusätzlich kann das Verhältnis der Zählwerte untereinander für jede der drei Populationen variieren, ohne eine größere Verschiebung in der ursprünglichen Volumenverteilung zu bewirken.
Die Hauptverfahren in der vorliegenden Erfindung zur Regelung der Größe von Lymphocytenanalogonen bestehen in der richtigen Größenauswahl der nicht fixierten menschlichen roten Blutkörperchen, der Osmolalität der Fixierlösung und der Veränderung der Fixiertemperatur. Der Verkleinerung oder Vergrößerung der Blutkörperchen durch Manipulation ihrer osmotischen Umgebung vor der Fixierung sind durch den kritischen Fixierprozeß, der zur Stabilhaltung der veränderten Zellen während der Lysierung der nicht behandelten menschlichen roten Blutkörperchen in der Mischung erforderlich ist, Grenzen gesetzt.
Es ist auch notwendig, solche roten Blutkörperchen derart zu behandeln, daß sie ohne übermäßige Zellassoziation oder Hämolyse verkleinert oder vergrößert werden können, um sich in etwa an die erforderliche Größe anzunähern.
Die vorliegende Erfindung ist eine Zusammensetzung, die hergestellt wird durch Mischen einer Suspension aus fixierten roten menschlichen Blutkörperchen zur Simulierung menschlicher Lymphocyten, fixierten roten Blutzellen von Truthähnen zur Simulierung menschlicher mononukleärer Zellen und einer Suspension aus stabilisierten roten Blutkörperchen von Mutterhaien zur Simulierung menschlicher Granulocyten, wobei diese alle in einem flüssigen Medium in solchen Verhältnissen eingebracht werden, daß sie eine einzige Zusammensetzung zur Simulierung menschlicher weißer Blutkörperchen ergeben (siehe Fig. 1B). Diese Leukocytenanalogon-Zusammensetzung wird dann mit zu lysierenden menschlichen roten Blutkörperchen und stabilisierten Blutplättchen oder Blutplättchenanalogonen zum Schaffen eines einzigen Referenzkontrollmittels für die Analyse von mehreren Parametern gemischt. Das Verhältnis der simulierten weißen Blutkörperchenpopulation läßt sich derart einstellen, daß abnorm niedrige, normale und abnorm hohe Zustände dargestellt werden, ohne daß die Größenverteilung jeder Art von simulierten weißen Blutkörperchen beeinträchtigt wird. Eine Abwandlung der Zubereitungsschritte ermöglicht die Herstellung von Teilchen, die verschiedene Arten von weißen Blutkörperchen darstellen, die für abnorme Zustände von menschlichen weißen Blutkörperchen charakteristisch sind.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird das Medium gemäß den von den US-Patenten 42 99 726 und 43 58 394 offenbarten Lehren hergestellt; die Stabilisierung der Blutplättchen erfolgt gemäß den in den US-Patenten 42 64 470, 43 89 490 oder 44 05 719 offenbarten Verfahren; Inhaber all dieser Patente ist die Coulter Electronics Inc.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Auswahl von aus einer oder mehreren tierischen Quellen stammenden roten Blutkörperchen sowie spezifische Behandlungsschritte für diese. Allgemein ist es nicht möglich, rote Blutkörperchen um mehr als insgesamt ca. 30% bis 50% zu vergrößern oder zu verkleinern. Aus diesem Grund ist es notwendig, Zellen als Ausgangsmaterial zu nehmen, die sich der jeweiligen Population annähern, wie in den Fig. 1A und 1B dargestellt. Der wesentliche Punkt der vorliegenden Erfindung liegt in der Entdeckung, daß die von den vorstehend genannten Quellen stammenden roten Blutkörperchen Eigenschaften besitzen, durch die sie zur Verkleinerung oder Vergrößerung und zur Fixierung ohne übermäßige Zellassoziation und Hämolyse geeignet sind, um sich der Größe des entsprechenden Blutkörperchens mit einem schmalen Bereich von mittlerem Zellvolumen anzunähern.
Bei ihrer Gewinnung werden die roten Blutkörperchen in einem Antikoagulans suspendiert, wie z. B. einem Alkalimetallsalz aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), das in einer physiologischen Salzlösung (Natriumchlorid) aufgelöst ist. Natürlich können auch andere Antikoagulantien und Salze verwendet werden, so lange sie keine unerwünschte Hämolyse oder Zellassoziation verursachen.
Hinsichtlich EDTA wurde herausgefunden, daß das Antikoagulans je nach Konzentration und Einwirkungsdauer die Größe der Blutzelle beeinflußt. So behalten beispielsweise in 2,5 mM bis 10 mM EDTA suspendierte Zellen die gleiche Größe bis zu 24 Stunden nach ihrer Gewinnung. Bei einer Konzentration von mehr als 10mM EDTA, beispielsweise 20mM, fangen die Zellen innerhalb weniger als 24 Stunden an, sich zu vergrößern. Nach 24 Stunden nimmt die Größe der Zellen mit der Konzentration von EDTA sowie der Einwirkungsdauer zu. Die Erhaltung oder Zunahme der Zellengröße in Abhängigkeit von der EDTA-Konzentration und Einwirkungsdauer läßt sich durch Fixierung erhalten. Es wird davon ausgegangen, daß EDTA ein erhebliches Aufbrechen der Struktur der Zellmembran bewirkt, und dieses Aufbrechen verstärkt sich in Abhängigkeit von der Zeit. Hierdurch ist ein Manipulieren der Zellgröße durch Regelung der Antikoagulanskonzentration und der Einwirkungsdauer vor der Fixierung möglich.
Um universale Herstellungsverfahren für alle weißen Blutkörperchenanalogon-Populationen anzuwenden, werden vorzugsweise rote Blutkörperchen verwendet, die vorm Fixieren verkleinert werden müssen. Zum Zeitpunkt der Fixierung ist es wichtig, die Hypertonizität zu erhalten, um eine Vergrößerung der Zellen zu verhindern. Die effektive Endkonzentration der Salzlösung sollte sich in einem Bereich befinden, der gleich dem und bis zu viermal größer ist als der des normalen Serums, je nach dem Grad der Verkleinerung, der zur Simulierung einer spezifischen weißen Blutkörperchenpopulation erforderlich ist. Die Zusetzung eines Fixiermittels erhöht die Tonizität (Osmolalität) der Fixierlösung noch weiter.
Das Fixieren der verkleinerten Zellen ist wichtig, um die Zellmembran zu stärken und einen biologischen Abbau der Membrane zu verhindern. Dies erfolgt dadurch, daß die Zellsuspension mit einer Lösung aus einem organischen Aldehyd, einschließlich Monoaldehyden, wie z. B. Formaldehyd, oder Dialdehyden, wie z. B. Glutaraldehyd, in Berührung kommt. Glutaraldehyd ist hierbei das bevorzugte Aldehyd, da es schneller reagiert als Formaldehyd. Glutaraldehyd kann in höheren Konzentrationen als der Endkonzentration hinzugefügt werden, so lange die Endkonzentration davon in einem Bereich von ca. 0,1% bis 1,0% liegt. Gemäß dem vorstehenden Wertebereichbeispiel, aber unter Verwendung von Formaldehyd statt Glutaraldehyd, beträgt die Endkonzentration von Formaldehyd 2,5% bis 10%; die bevorzugte Konzentration liegt bei 5%. Bei der Auswahl eines geeigneten Aldehyds und dessen Konzentration ergeben sich lediglich praktische Beschränkungen hinsichtlich Beseitigung unerwünschter Zellassoziation und Hämolyse und evtl. unerwünschter elektrolytischer Wirkungen. Die für die jeweiligen Leukocytenbestandteile empfohlenen spezifischen Bedingungen sind in jedem der nachfolgenden Beispiele angegeben.
Es wurde herausgefunden, daß man die kleinsten roten Blutkörperchen mit der schmalsten Verteilungsbreite mit sämtlichen Blutarten unter Verwendung von Frischzellen oder Zellen, die nicht älter als vier Tage nach der Phlebotomie sind, mit einer niedrigen Koagulantienkonzentration erhält, das bei der Gewinnung des frischen Bluts verwendet wird. Eine höhere EDTA-Konzentration führt zu größeren sowohl nicht fixierten als auch fixierten Zellen, die dem Kriterium für den bestimmten gesuchten Größenbereich evtl. nicht entsprechen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Blutkörperchen einer gekühlten, hypertonischen, Glutaraldehyd enthaltenden Salzlösung zugesetzt. Es hat sich gezeigt, daß die herabgesetzte Temperatur eine qualitativ unterschiedliche Zelle liefert, wie auf einer Größenbestimmungsvorrichtung, beispielsweise einem COULTER COUNTER-Analysegerät, gemessen.
Ein qualitativer Unterschied besteht im Vergleich zur Fixierung bei Raumtemperatur mitunter in einem niedrigeren mittleren Zellvolumen. Dieser Unterschied wird jedoch erst bei der Behandlung der fixierten Zellen mit einem lysierenden Reagens, wie z. B. LYSE S® II-Reagens in ISOTON® II-Verdünnungsmittel, ersichtlich. LYSE S und ISOTON sind eingetragene Warenzeichen der Coulter Electronics, Inc.
Nach der Fixierung setzen sich die Zellen durch die Schwerkraft ab und werden von der flüssigen Phase getrennt. Anschließend werden sie mit einer phosphatgepufferten Salzlösung gewaschen und in eine Lagerlösung eingebracht.
Da alle drei Leukocytenbestandteile in einem einzigen Referenzkontrollmittel zur Verwendung mit dem bekannten lysierenden Reagens für die roten Blutkörperchen zu kombinieren sind, ist die Zubereitung des Verdünnungsmittels für die Messung aller drei Bestandteile des Leukocytenanalogons gleich. Die bevorzugte Rezeptur für dieses Verdünnungsmittel sowie die Rezeptur für das lysierende Reagens, das zur Lysierung der unbehandelten roten Blutkörperchen verwendet wird, die später den zusammengeführten weißen Blutkörperchen zugefügt werden, ist nachstehend angegeben: Verdünnungsmittel Vorzugsweise Bereich 1. Prokainhydrochlorid 2. N-(2-Acetamido)-Iminodiessigsäure (ADA) 3. Dimethylolharnstoff 4. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser Lysierendes Reagens 1. Dodecyltrimethyl-ammoniumchlorid-50%-Lösung 2. Tetradecyltrimethyl-ammoniumbromid 3. Kaliumcyanid 4. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser
Das Medium für die hämatologischen Referenzkontrollmittel, das eine Stabilität von bis zu sechs Monaten besitzt, umfaßt Laktose, Fungizide und Antibiotika sowie Hilfsstoffe, wie z. B. Purinnukleoside, Gallensalz und Cholsäurederivative, Phenothiazinverbindungen und deren Salze mit antihistaminischen Eigenschaften, und 4-Aminobenzoesäureester und Derivate und deren Salze mit anästhetischen Eigenschaften oder Kombinationen hiervon. Solche Stoffe werden ausführlicher in den US-Patenten 42 13 876; 42 99 726 und 43 58 394 beschrieben.
Das folgende spezifische Beispiel ist im US-Patent 42 99 726 offenbart: Stabilisierungsmittel für langfristige Stabilität von roten Blutkörperchen - bevorzugte Zubereitung Annähernde Menge Literformulierung 1. destilliertes Wasser 2. Propylparaben 3. Methylparaben 4. Prokainhydrochlorid 5. Deoxycholsäure 6. Laktose 7. Actidion 8. Trinatriumcitratdihydrat 9. Citronensäuremonohydrat 10. Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 11. Phenerganhydrochlorid 12. Colistimethat, Natrium 13. Penicillin G., Natrium Einheiten 14. Kanamycinsulfat 15. Neomycinsulfat 16. 5'-AMP 17. Adenin 18. Inosin 19. Dihydrostreptomycinsulfat 20. Tetracyclinhydrochlorid 21. 30% Rinderalbumin 22. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser
Zur Herstellung des Lymphocytenanalogons werden menschliche Erythrocyten mit Glutaraldehyd gemäß dem nachstehenden Beispiel 1 fixiert und anschließend in einer vorbestimmten Menge in Referenzkontrollmittel und Kalibriersubstanzen zusammen mit den mononukleären Zellanalogonen (Beispiel 2) und dem Granulocytenanologon (Beispiel 3) eingebracht oder in Vollblutkontrollmittel, die, zusätzlich zu den Lymphocytenanalogonen, gewaschene rote Blutkörperchen oder gewaschene rote Blutkörperchen und Blutplättchen enthalten.
Frische rote Blutkörperchen müssen zur Entfernung von spenderspezifischen Plasmaproteinen gewaschen werden. Hierdurch wird die Wahrscheinlichkeit einer Zellagglutination beim Mischen roter Blutkörperchen von mehreren Blutspendern reduziert.
Die Fixierung findet zwar fast vollständig innerhalb von zwei Stunden statt, aber dafür, daß die roten Blutkörperchen gegen die üblichen, in den automatischen COULTER COUNTER hämatologischen Instrument verwendeten lytischen Reagenzien für rote Blutkörperchen vollständig resistent werden, ist mehr Zeit erforderlich. Bei sorgfältiger Auswahl der menschlichen roten Blutkörperchen und deren Verdünnung in einer phosphatgepufferten Standardlösung liegt die Dauer der Fixierzeit mit Glutaraldehyd optimalerweise zwischen 48 und 72 Stunden. Weniger als 48 Stunden Fixierung kann zu teilweise fixierten roten Blutkörperchen führen, die ein mittleres Zellvolumen besitzen, das geringer ist als das für normale menschliche Lymphocyten. Eine teilweise Fixierung kann festgestellt werden, indem eine Linksverschiebung (Abfall im Zellvolumen) in einer teilweise fixierten Population nach Zugabe von 10 Vol-% LYSE S II® -Reagens in ISOTON II®-Verdünnungsmittel erfaßt wird. Bei der Zugabe eines lytischen Reagens zu einem Verdünnungsmittel, welches für die Modell S Plus COULTER COUNTER-Serie (z. B. Modell S Plus II, III und IV) geschaffen wurde, erhält man ähnlich Ergebnisse. Die Zubereitung dieser Verdünnungsmittel und lysierenden Reagenzien sind nachstehend beschrieben. Ein vollständig fixiertes menschliches rotes Blutkörperchen (z. B. 48-stündige Fixierung) zeigt eine leichte oder gar keine Linksverschiebung (d. h. Abnahme des scheinbaren Volumens) in der Teilchengrößenverteilung. Eine Überfixierung der roten Blutkörperchen mit Glutaraldehyd wird nach 72 bis 96 Stunden durch eine Abnahme der Teilchengröße registriert, die von der Auswirkung der vorstehend genannten lytischen Reagenzien für die roten Blutkörperchen auf 48 Stunden lang fixierte menschliche rote Blutkörperchen unabhängig ist. Die gewünschte Fixiermenge produziert Zellen, die im Bereich von ca. 35 bis 90 ± 3 fl unter Verwendung einer Analysevorrichtung des Typs COULTER COUNTER Modell S Plus gezählt werden.
Menschliche mononukleäre Zellen sind Leukocyten, die größenmäßig zwischen Lymphocyten und Granulocyten liegen und im Größenbereich bzw. Monocytenbereich zwischen 90 und 160 ± 3 fl gezählt werden. Diese Zellen sind größer als fixierte menschliche rote Blutkörperchen.
Von Vögeln stammende rote Blutkörperchen sind größer als fixierte menschliche rote Blutkörperchen und liegen nahe der Größe von menschlichen mononukleären Zellen. Zur Ausführung dieser Erfindung fand man heraus, daß die roten Blutkörperchen von Geflügel, wie z. B. die von Gänsen, Hühnern, Enten und vorzugsweise Truthähnen stammenden roten Blutkörperchen, der Größe und Form von menschlichen mononukleären Zellen sehr nahekommen und zum Stabilisierungsverfahren mit Aldehyd geeignet sind. Diese stabilisierten "simulierten" Monocyten stellen einen zufriedenstellenden Ersatz für menschliche mononukleäre Zellen in der erfindungsgemäßen Kontrollzusammensetzung dar.
Ein Verfahren zur Herstellung eines mononukleären Zellanalogons aus von Truthähnen stammenden roten Blutkörperchen ist in Beispiel 2 genauer beschrieben.
Unter den drei jetzt von der COULTER COUNTER Model S Plus automatisierten Zählvorrichtung gezählten Leukocytenpopulationen sind die menschlichen Granulocyten die größte. Die Granulocyten werden im Zählbereich zwischen ca. 160 und 450 ± 3 fl gezählt.
Man hat nun herausgefunden, daß die Größe der roten Blutkörperchen des Mutterhais (Ginglymostoma cirratum) durch sachgemäße Behandlung eine den menschlichen Granulocyten ähnliche Größe erhalten. Diese Erythrocyten weisen im allgemeinen eine ausgezeichnete Suspensionsstabilität und hoch reproduzierbare Volumenverteilungskenngrößen auf und sind im Handel erhältlich. Durch Fixierung mit einem Vernetzungsmittel, wie z. B. Glutaraldehyd, sind diese Erythrocyten der menschlichen Granulocyten-Untergruppe der weißen Blutkörperchen elektronisch ähnlich.
Andere nicht menschliche Wirbeltiere, von denen bekannt ist, daß sie rote Blutkörperchen besitzen, die sich in dem gewünschten Größenbereich für menschliche Granulocyten befinden, umfassen u. a. weitere Fische, insbesondere Mitglieder der Haifamilie und Reptilien, wie z. B. Alligatoren. Alle diese nicht menschlichen Wirbeltiere besitzen einen Kern aufweisende rote Blutkörperchen, die verwendet werden könnten. Es sind jedoch auch weitere Gesichtspunkte zu beachten, wie z. B. mengenmäßige Verfügbarkeit zu angemessenen Kosten. Rote Blutkörperchen des Mutterhais sind mengenmäßig ausreichend vorhanden. Die roten Blutkörperchen von Alligatoren sind dagegen weniger leicht verfügbar, da Alligatoren derzeitig eine durch das Gesetz geschützte Tierart sind.
Sowohl die Alligatorblutkörperchen als auch die der Mutterhaie weisen einen Zellkern auf. Das Vorhandensein eines Zellkerns ist aber für ihre Verwendung als Ersatz für menschliche weiße Blutkörperchen gemäß vorliegender Erfindung nicht wesentlich. Das Vorhandensein des Zellkerns in den roten Blutkörperchen des Hais ist insofern nicht schädlich, als daß die Zellen mit einem Vernetzungsmittel, wie z. B. Glutaraldehyd, stabilisiert werden, wodurch eine Freisetzung der Zellmembran und des Zytoplasmas vom Zellkern bei der Lysis verhindert wird. Das Prinzip der Differentialanalyse von frischen menschlichen weißen Blutkörperchen basiert zum Teil auf der Zeit der Zerstörung der Zytoplasmamembran, die für jede Art von weißer Blutkörperchenpopulation spezifisch ist.
Dem Verkleinern oder Vergrößern von roten Blutkörperchen durch Manipulieren derer osmotischen Umgebung vor der Fixierung sind durch den kritischen Fixierungsvorgang, der zur Erhaltung der Stabilität von veränderten Zellen erforderlich ist, Grenzen gesetzt. Im allgemeinen lassen sich Erythrocyten um nicht mehr als 30% bis 50% zu diesem Zweck verkleinern oder vergrößern. Aus diesem Grund muß man von Tiererythrocyten ausgehen, deren Größe sich den Zellen annähert, die man letztendlich zur Verwendung als menschlichen Granulocytenersatz benötigt.
Die Nützlichkeit von Erythrocyten von Mutterhaien als menschlicher Granulocytenersatz ist durch die Notwendigkeit beschränkt, diese in den Granulocyten-Größenbereich zu verkleinern. Werden die Erythrocyten hypo- oder hyperosmotischen Umgebungen ausgesetzt, so hat dies hauptsächlich die Wirkung, daß sich das mittlere Zellvolumen verändert, wodurch die Breiten des Größenverteilungshistogramms leicht erhöht oder verringert werden, was sich allerdings nur geringfügig auf die Symmetrie des Größenverteilungshistogramms auswirkt.
Eine standardisierte und stabilisierte Zusammensetzung aus roten Blutkörperchen von den Mutterhaien liefert ein geeignetes Referenzkontrollmittel, das bei der automatisierten Zählung von menschlichen Granulocyten unter Verwendung von nach dem Coulter-Prinzip arbeitenden Instrumenten oder verschiedener Mikroskopverfahren, wie z. B. Beleuchtungs- oder Phasenkontrastverfahren, nützlich ist.
Gemäß vorliegender Erfindung werden Mutterhai-Erythrocyten so verändert und stabilisiert, daß sie ein menschliches Granulocytenanalogon hinsichtlich Volumen in Femtolitern (fl) und Zahl als 1·10³ pro Mikroliter (um) simulieren. Basierend auf Volumenverteilung und Zahl sind diese fixierten Haizellen über vier Monate stabil. Das Produkt ist dazu ausgelegt, daß es sich so verhält, daß es frische menschliche Granulocyten so originalgetreu wie möglich simuliert. Zusätzlich ist das Produkt dazu ausgelegt, ein Merkmal aufzuweisen, das normalerweise bei frischen normalen Granulocyten nicht vorhanden ist, nämlich ein hohes Maß an Stabilität der von den damit angewendeten Zählvorrichtungen gemessenen Parameter.
Beispiel 3 ist ein spezifisches Beispiel der bevorzugten Reagenzien und Verfahren zur Behandlung der Haizellen. Die Zubereitungen dienen lediglich als Darstellungsbeispiel. Die beschriebenen Reagenzien und/oder Verfahren lassen sich auch auf rote Blutkörperchen übertragen, die nicht von Haien, sondern von anderen Tieren stammen. Andere Bestandteile und Mengenverhältnisse lassen sich in Einklang mit dieser Offenbarung verwenden. Die Größe einer Zelle in einer nicht-lytischen Lösung, wie z. B. einem Puffer, zeigt jedoch vielleicht nicht visuell die gesamte Auswirkung der in der vorliegenden Erfindung angewandten Behandlung. Das Verfahren erfordert die Regelung folgender Faktoren:
1. Konzentration des Antikoagulans bei der Gewinnung der Blutzellen;
2. Alter der antikoagulierten nicht fixierten Zellen;
3. Konzentration der Zellen während der Fixierung;
4. Osmolalität der Fixierlösung;
5. Temperatur der Fixierlösung; und
6. Einwirkungsdauer einer kalten hyperosmotischen Lösung vor der Fixierung.
Man hat herausgefunden, daß man die kleinste Größe der roten Blutkörperchen mit der schmalsten Verteilungsbreite dadurch erhält, daß man frische Zellen oder Zellen, die nicht älter als vier Tage nach der Phlebotomie sind, mit einer niedrigen EDTA-Konzentration verwendet. Durch Verwendung einer höheren EDTA-Konzentration bei Zellen, die älter als 24 Stunden sind, erhält man größere nicht fixierte und fixierte Zellen, die dem Kriterium von 160 bis 450 ± 3 Femtoliter für menschliche Granulocyten evtl. nicht entsprechen.
Durch Halten der Temperatur der Fixierlösung bei 0 bis 10ºC, vorzugsweise 4ºC, vor und nach dem Zusatz von gekühltem antikoagulierten Blut erhält man auch kleinere Blutkörperchen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Die durch das vorstehende Verfahren behandelten Haizellen sind bei ihrer Verwendung in der erfindungsgemäßen Referenzkontrollzusammensetzung äußerst stabil.
Die simulierten Granulocyten lassen sich in einem eigenständigen Kontrollmittel für Granulocyten oder in einem zusammengesetzten Gesamtkontrollstandardmittel zur Messung weiterer Parameter verwenden. Dieses neue Granulocytenkontrollmittel wird insbesondere in Kombination mit kompatiblen Kontrollmitteln für andere Leukocytenbestandteile, wie z. B. Lymphocyten und mononukleäre Zellen verwendet, um ein Leukocytenkontrollmittel zu schaffen, das wiederum in Kombination mit Referenzkontrollmitteln für rote Blutkörperchen- und Blutplättchenparameter verwendet wird.
Die nachstehenden Beispiele 1 bis 3 geben detaillierte Instruktionen für ein Verfahren zur jeweiligen Herstellung der drei Bestandteile des Leukocytenreferenzkontrollmittels. Beispiel 4 zeigt eine Gruppe der drei Leukocytenpopulationen. Diese Verfahrensschritte werden bis zum Schluß sorgfältig kontrolliert, um sicherzustellen, daß keine Beschädigung der Zellen erfolgt und daß die fixierten Zellen gegen das übliche lytische Reagens für rote Blutkörperchen völlig resistent werden. Die Zubereitungen dienen lediglich als Darstellungsbeispiel, und es können andere Bestandteile und Mengenverhältnisse in Einklang mit der Offenbarung der vorliegen Erfindung verwendet werden.

BEISPIEL I

LYMPHOCYTENANALOGON VON MENSCHLICHEN ROTEN BLUTKÖRPERCHEN

Im folgenden wird ein spezifisches Beispiel für bevorzugte Reagenzien und empfohlene spezifische Verfahrensschritte zur Behandlung von menschlichen roten Blutkörperchen gegeben, um ein Lymphocytenanalogon von normaler Größe zu erhalten. Die Zubereitungen und Verfahrensschritte dienen lediglich als Darstellungsbeispiel, und es können andere Bestandteile, Mengenverhältnisse und Verfahren in Einklang mit der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

ANTIKOAGULANTIEN ZUR GEWINNUNG VON VOLLBLUT

Eines oder mehrere der folgenden Antikoagulantien können nach Ermessen des Fachmanns verwendet werden.
1. Standard ACD (Säure-Citrat-Dextrose)
2. Standard CPD (Citrat-Phosphat-Dextrose)
3. Dinatrium EDTA (Ethylendiamintetraacetat), 2 mg/ml Blut.
STABILISIERUNGSMITTEL (LITERFORMULIERUNG), wie obenstehend und in bezug auf US-PS 42 99 726.

LÖSUNG ZUM WASCHEN VON FRISCHEM BLUT UND LÖSUNG ZUM ERNEUTEN SUS- PENDIEREN FÜR FIXIERTE ZELLEN (PHOSPHATGEPUFFERTE SALZLÖSUNG - LITERFORMULIERUNG)

1. Natriumphosphat einbasig 0,2 g
2. Natriumphosphat zweibasig ,7H&sub2;O 2,0 g
3. Natriumazid 0,1 g
4. Natriumchlorid 9,4 g
5. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser pH 7,3 bis 7,5 Osmolalität 320 bis 340 mOsm/kg.

ERYTHROCYTEN-VERDÜNNUNGSLÖSUNG

1. Natriumchlorid 6,96 g
2. Kaliumchlorid 0,30 g
3. Natriumphosphat monobasig 1,31 g
4. Natriumphosphat zweibasig ,7H&sub2;O 10,85 g
5. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser pH 7,3 bis 7,5 Osmolalität 320 bis 340 mOsm/kg

VERFAHREN

1. Auswahl menschlicher roter Blutkörperchen mit einem mittleren Zellvolumenbereich von ca. 81 bis 89 fl und einer roten Blutkörperchen-Verteilungsbreite von weniger als 18 fl.
Waschen der gepackten menschlichen roten Blutkörperchen mit der Lösung zum Waschen von frischem Blut.
2. Verdünnen der gewaschenen gepackten Zellen mit Erythrocyten-Verdünnungslösung auf eine Zahl von 1·10&sup6;/ul.
3. Herstellung eines Glutaraldehyd-Fixierreagens mit einem Glutaraldehydanteil von ca. 1,0% bis 10%, indem der Erythrocyten- Verdünnungslösung ein handelsübliches 25% iges-Glutaraldehydprodukt zugesetzt wird. Die bevorzugte Konzentration ist 5%.
4. Hinzufügen einer abgemessenen Menge des Fixiermittels von Schritt 3 zur gewaschenen roten Blutkörperchensuspension zum Erhalt einer Glutaraldehydendkonzentration von 0,1% bis 1,0%, ca. 20 Minuten langes Mischen. Übertragung in abgedichtete Behälter, die 12 bis 72 Stunden lang langsam gerollt werden.
5. Zentrifugieren der fixierten Zellen bei ca. 400 RCF für eine Dauer von ca. 5 Minuten. Entfernung der überstehenden Flüssigkeit, mehrfaches Waschen der Zellen mit der Frischblut-Waschlösung, dann erneutes Suspendieren in der Lösung zum Waschen und erneuten Suspendieren.
6. Bestimmung des mittleren Zellvolumens, um sicherzustellen, daß die Fixierung abgeschlossen ist. Eine Teilfixierung zeigt einen Abfall im Volumen nach der Zugabe von 10%-LYSE S II-Reagens in ISOTON II-Verdünnungsmittel, wie vorstehend beschrieben. Ein vollständig fixiertes rotes Blutkörperchen zeigt eine Veränderung des Scheinvolumens von weniger als 5 fl.
7. Für ein eigenständiges Kontrollmittel für Lymphocyten, erneutes Suspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in der Lösung zum erneuten Suspendieren und Anpassung der Konzentration zur Simulierung derjenigen der menschlichen Lymphocyten in normalem menschlichen Blut.
8. Für Kontrollmittel für mehrere hämatologische Parameter, erneutes Suspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in dem Stoff für das hämatologische Mehrparameter-Kontrollmittel, wobei die Zahl der Zellen zur Messung von Lymphocyten geeignet ist.
9. Die fixierten Zellen lassen sich über einen Zeitraum von bis zu ca. sechs Monaten lagern.
Wird bei dem vorstehenden Beispiel Formaldehyd anstelle von Glutaraldehyd verwendet, beträgt die Formaldehydendkonzentration 2,5% bis 10%. Die zur Fixierung mit Formaldehyd erforderliche Zeitspanne ist länger als die mit Glutaraldehyd.
Werden bei dem vorstehenden Beispiel andere Arten von von Säugetieren stammenden roten Blutkörperchen als Ausgangsmaterial verwendet, so erhält man ähnliche Ergebnisse.

BEISPIEL 2

MONONUKLEÄRES ZELLANALOGON VON VON TRUTHÄHNEN STAMMENDEN ROTEN BLUTKÖRPERCHEN

Im folgenden wird ein spezifisches Beispiel für bevorzugte Reagenzien und empfohlene spezifische Verfahrensschritte zur Behandlung von von Truthähnen stammenden roten Blutkörperchen gegeben, um das mononukleäre Zellanalogon zu erhalten. Die in dem vorstehend bezeichneten Bereich klassifizierten und als mononukleäre Zellen gezählten Leukocyten umfassen auch Monocyten.
Die Zubereitungen und Verfahrensschritte dienen lediglich als Darstellungsbeispiel, und es können andere Bestandteile, Mengenverhältnisse und Verfahren in Einklang mit der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

ANTIKOAGULANTIEN ZUR GEWINNUNG VON VOLLBLUT

Eines oder mehrere der folgenden Antikoagulantien können in geeigneter Menge nach Ermessen des Fachmanns verwendet werden.
1. Standard ACD (Säure-Citrat-Dextrose)
2. Standard CPD (Citrat-Phosphat-Dextrose)
3. Dinatrium EDTA (Ethylendiamintetraacetat), 2 mg/ml Blut.
STABILISIERUNGSMITTEL (LITERFORMULIERUNG), wie obenstehend und in bezug auf US-PS 42 99 726.

TRUTHAHN-ERYTHROCYTEN-WASCH- UND VERDÜNNUNGSLÖSUNG (LITERFORMULIERUNG)

1. Natriumphosphat einbasig 1,31 g
2. Natriumphosphat zweibasig 10,35 g
3. Natriumchlorid 2,50 g
4. Kaliumchlorid 0,3 g
5. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser pH 7 3 ± 0 1 Osmolalität 200 ± 10 mOsm/kg.

LÖSUNG ZUM WASCHEN UND ERNEUTEN SUSPENDIEREN FÜR FIXIERTE ZELLEN WIE IN BEISPIEL 1 ANGEGEBEN

VERFAHREN

1. Zentrifugieren von von Truthähnen stammendem frischen Vollblut bei 700 RCF für eine Dauer von 10 Minuten bei Umgebungstemperatur. Entfernen der überstehenden Flüssigkeit zusammen mit der Schicht, wobei darauf zu achten ist, daß die gepackten roten Blutkörperchen nicht beeinträchtigt werden.
2. Zweimaliges Waschen der roten Truthahn-Blutkörperchen mit 4 bis 10 Volumen der Truthahnerythrocyten-Wasch- und Verdünnungslösung.
3. Verdünnen mit Truthahnerythrocyten-Wasch- und Verdünnungslösung und Abmessen einer 2 ml-Probe zur Bestimmung der Zahl der roten Blutkörperchen (0,33·10&sup6; /ul) und Bewertung des mittleren Zellvolumens (ca. 155 fl).
4. Herstellung eines Glutaraldehyd-Fixiermittels mit einem Glutaraldehydanteil von ca. 1,0 bis 10,0% durch Zugabe eines handelsüblichen 25%-igen Glutaraldehydprodukts zur Truthahnerythrocyten-Wasch- und Verdünnungslösung. Die bevorzugte Konzentration beträgt 5%.
5. Hinzufügen 1 Volumens 1,0 bis 10,0% Glutaraldehyd-Fixierlösung zu 9 Volumen der gewaschenen roten Blutkörperchensuspension; ca. 3 bis 4 Minuten gründlich mischen. Übertragung in abgedichtete Behälter, die 20 bis 28 Stunden lang langsam gerollt werden.
6. Zentrifugieren der fixierten Zellen bei ca. 400 RCF für eine Dauer von ca. 5 Minuten. Entfernung der überstehenden Flüssigkeit, mehrfaches Waschen mit der Waschlösung.
7. Für ein eigenständiges Kontrollmittel für mononukleäre Zellen, erneute Suspendierung der gewaschenen fixierten Zellen in der Lösung zum erneuten Suspendieren und Anpassung der Konzentration zur Simulierung der Anzahl der mononukleären Zellen in normalem menschlichen Blut.
8. Für Kontrollmittel für mehrere hämatologische Parameter, erneutes Suspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in dem Stabilisierungsmittel, wie vorstehend beschrieben, für die Mehrparameter-Kontrolle in der geeigneten Konzentration zur Messung von mononukleären Zellen.
9. Die fixierten Zellen lassen sich über einen Zeitraum von bis zu ca. sechs Monaten lagern.

BEISPIEL 3

GRANULOCYTEN-ANALOGON VON DEN ROTEN BLUTKÖRPERCHEN DES MUTTERHAIS

Im folgenden wird ein spezifisches Beispiel für bevorzugte Reagenzien und empfohlene spezifische Verfahrensschritte zur Behandlung von den roten Blutkörperchen des Mutterhais (Ginglymostoma cirratum) zum Erhalt des Granulocytenanalogons gegeben. Die Zubereitungen und Verfahrensschritte dienen lediglich als Darstellungsbeispiel, und es können andere Bestandteile, Mengenverhältnisse und Verfahren in Einklang mit der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

ANTIKOAGULANTIEN ZUR GEWINNUNG VON VOLLBLUT

(LITERFORMULIERUNG)

1. Dinatrium EDTA (Ethylendiamintetraacetat) 16,8 g
2. Natriumchlorid 17 g
3. Harnstoff 21 g
4. Auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser
Das Blut des Hais weist für gewöhnlich einen hohen Harnstoffgehalt auf, wodurch das osmotische Gleichgewicht der roten Blutkörperchen gehalten wird. Aus diesem Grund wird hier zur Nachahmung der resultierenden osmotischen Bedingungen Harnstoff zugesetzt.
STABILISIERUNGSMITTEL (LITERFORMULIERUNG), wie vorstehend.
LÖSUNG ZUM WASCHEN UND ERNEUTEN SUSPENDIEREN FÜR FIXIERTE ZELLEN.

HAIZELLENFIXIERLÖSUNG (LITERFORMULIERUNG)

1. Natriumchlorid 100 g
2. auffüllen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser
3. Osmolalität 3000 ± 100 mOsm/kg

ENDFIXIERREAGENS (LITERFORMULIERUNG)

1. Haifixierlösung 0,940 l
2. Glutaraldehyd 25%-Lösung 0,040 l
3. gepackte rote Haiblutkörperchen 0,020 l

VERFAHREN

1. Gewinnung von frischem Vollblut von einem Mutterhai in einer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Antikoagulanslösung mit einer Endkonzentration von 2,5 bis 30 mM (typischerweise 5 mM). Dies ist eine gefilterte EDTA-Lösung mit einer Osmolalität von 1030 ± 30 mOsm/kg und einem pH-Wert von 7,0 ± 1.
2. Zentrifugieren der antikoagulierten Vollblutmischung innerhalb von 24 Stunden nach der Phlebotomie; Entfernung der überstehenden Flüssigkeit und der die weißen Blutkörperchen enthaltenden Schicht, wobei darauf zu achten ist, daß die gepackten roten Blutkörperchen nicht beeinträchtigt werden. Die Fixierung von Blut mit Glutaraldehyd kann innerhalb von vier Tagen stattfinden, wenn es in weniger als 20 mM EDTA gelagert ist; die Fixierung kann in weniger als einem Tag stattfinden, wenn es in 20 bis 30 mM EDTA gelagert ist.
3. Herstellung einer Glutaraldehydfixierlösung und Abkühlung auf ca. 0 bis 10ºC, die eine Glutaraldehydkonzentration von 1,0% und eine Osmolalität von 1000 bis 4000 mOs/kg (bevorzugte Konzentration ist 3000 ± 100 mOs/kg) besitzt. Der pH-Bereich liegt bei 4,5 bis 8; der bevorzugte pH-Wert ist 4,0 ± ,5.
4. Zentrifugieren; innerhalb von 60 Minuten nach dem Zentrifugieren Hinzufügen der nicht gewaschenen, gepackten roten Blutkörperchen unter Mischen zu der gekühlten Fixierlösung (siehe Endfixierreagens), so daß sich eine Glutaraldehydkonzentration von 1,0% ergibt. Fortsetzung des Fixiervorgangs für mindestens 6 Stunden bei 0 bis 10ºC und, soweit erforderlich, bis zu 48 Stunden.
5. Zwei- oder dreimaliges Waschen der fixierten Zellen mit ca. 5 Volumen phosphatgepufferter Salzlösung;
6. Lagerung der Zellen in der Lösung zum Waschen und erneuten Suspendieren über einen Zeitraum von bis zu 60 Tagen.
7. Für ein eigenständiges Kontrollmittel für Granulocyten, erneutes Suspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in der Lösung zum erneuten Suspendieren und Anpassung der Zellkonzentration zur Simulierung derjenigen der Granulocyten in normalem menschlichen Blut.
8. Für Kontrollmittel für mehrere hämatologische Parameter, erneutes Suspendieren der gewaschenen fixierten Zellen in dem Stabilisierungsmittel, wie vorstehend beschrieben, für die Mehrparameter-Kontrolle in der geeigneten Konzentration zur Messung von Granulocyten.
9. Die fixierten Zellen können über einen Zeitraum von ca. sechs Monaten gelagert werden.
Werden gemäß der vorstehenden Vorgehensweise und den Verfahren anstelle von den von Haien stammenden roten Blutkörperchen von anderen Quellen stammende rote Blutkörperchen verwendet, so erhält man ähnliche Ergebnisse für modifizierte Zellen, die zusätzlich zur Simulierung von Granulocyten für andere Zwecke nützlich sind.

BEISPIEL 4

In einer Untergruppe zur Bestimmung des Gesamtanteils der weißen Blutkörperchen einer normalen menschlichen Blutgruppe werden die folgenden Mengen der einzelnen Bestandteile verwendet: Vorratslösung Beispiel 1 Lymphocyten mononukleäre Zellen Granulocyten Verdünnungsmittel phosphatgepufferte Salzlösung
Diese Untergruppe kann über einen Zeitraum von bis zu ca. sechs Monaten gelagert werden.
Es wurde herausgefunden, daß unbehandelte menschliche rote Blutkörperchen, die durch Suspension in den vorstehend beschriebenen Medien stabilisiert wurden, zufriedenstellend den roten Blutkörperchenbestandteil der vorliegenden Zusammensetzung liefern können. Die unbehandelten roten Blutkörperchen werden problemlos in dem vorherigen Arbeitsschritt für die Zählung der weißen Blutkörperchen und anschließende Hämoglobinbestimmung hämolysiert.
Suspensionen aus unbehandelten menschlichen roten Blutkörperchen, simulierten weißen Blutkörperchen und stabilisierten oder simulierten Blutplättchen werden in solchen Verhältnissen gemischt, daß die Endzählwerte für die roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Blutplättchen sowie der Hämoglobingehalt und der Hämatokrit in den für menschliches Blut als normal angesehenen Bereich fallen.
Stabilisierte Blutplättchen werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren geliefert: Nützliche Verfahren sind u. a.:
1. Eine Kombination aus Iodoacetamid und einer Iminodiessigsäure oder einem Salz hiervon zusammen mit einem kompatiblen bakteriostatischen Mittel in einer wäßrigen Lösung, die in einem vorher ausgewählten pH-Bereich und Osmolalität gehalten wird, wie in der US-PS 44 05 719 beschrieben.
2. Eine Fixierungs-Stabilisierungszusammensetzung mit einer Glutaraldehydkonzentration von 0,1% bis 5% und einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, das ein Gemisch aus Ethoxylaten aus bestimmten isomerischen linearen Alkoholen ist, wie in der US-PS 43 89 490 ausführlicher beschrieben ist.
3. Ein menschliches Blutplättchenanalogon aus Ziegenerythrocyten, die je nach Erfordernis stabilisiert, kombiniert und vermischt wurden, um einen Größenbereich und eine Volumenverteilung zu erhalten, die sich der menschlicher Blutplättchen annähert, wie in der US-PS 42 64 470 beschrieben.
Werden die Blutplättchen als Kontrollmittel für Verfahren verwendet, die unfixierte, zu lysierende rote Blutkörperchen umfassen, so ist die Verwendung von fixierten Zellen als Leukocytenanalogon erforderlich. Diese lassen sich beispielsweise durch das in der US- PS 41 79 398 offenbarte Verfahren herstellen.
Die Werte für die jeweiligen hämatologischen Parameter lassen sich so verändern, daß sie abnorm niedrige und abnorm hohe Bedingungen darstellen. Die Zahl der weißen Blutkörperchen in normalem Blut beträgt 5000 bis 11 000 pro Mikroliter (ul) mit einem Lymphocytenwert von 20 bis 40%, einem mononukleären Zellwert von weniger als 10% und einem Granulocytenwert von 60 bis 80%. Der normale Bereich in menschlichem Blut für rote Blutkörperchen beträgt 4 000 000 bis 5 000 000 Zellen pro Mikroliter. Der normale Hämoglobinwert beträgt 12 bis 16 Gramm/100 ml. Der Begriff "Hämatokrit" ist als Volumenanteil von gepackten roten Blutkörperchen zum Volumen des Vollbluts definiert. Das normale Verhältnis liegt bei Menschen bei ca. 45%. Das mittlere Zellvolumen ist der Volumenanteil gepackter roter Blutkörperchen in ml pro Liter Blut zu roten Blutkörperchen in Millionen pro Mikroliter. Die mittlere Zellhämoglobinkonzentration ist ein Index, der das Mittel- oder Durchschnittsgewicht von Hämoglobin pro 100 ml gepackter roter Blutkörperchen perzentual anzeigt. Das mittlere Zellhämoglobin ist das Verhältnis des Hämoglobinanteils in Gramm pro Liter zu den roten Blutkörperchen in Millionen pro Mikroliter.
Ein Kontrollprodukt muß auf Vergleichsbasis genaue Angaben darüber machen können, was eine Untersuchungsprobe aus frischem Vollblut hinsichtlich sämtlicher vorstehender Bestimmungen darstellt. Es liegt auf der Hand, wie wichtig es ist, daß das Kontrollprodukt normale menschliche Zellen in einem Antikoagulans simuliert.
Die vorliegende Erfindung ist in erster Linie auf eine hämatologische Referenzkontroll-Lösung gerichtet, wobei deren Kontrollbereiche für weiße Blutkörperchen aus drei Arten von fixierten roten Blutkörperchen einer vorbestimmten Größenverteilung bestehen, um die vorbestimmten unteren und oberen Schwelleneinstellungen für jede Leukocytenklasse oder -unterklasse zu überprüfen, gemäß elektrischer Vorgabe in der Teilchenuntersuchungsvorrichtung. Die obere und untere elektronische Schwelleneinstellung für jede Leukocytenklasse wird durch das Verhältnis der Teilchenzahlen von jedem Diskriminatorenbereich verglichen mit den bekannten Werten überprüft. Jede simulierte Leukocytenart muß ihre Größe beibehalten, unabhängig von der Zellengesamtzahl und unabhängig von ihrer Proportionalität zu einer oder mehreren Arten von simulierten Leukocytenpopulationen.
Mit den durch das hier offenbarte Verfahren behandelten Zellen wird ein ausgezeichnetes System der Probe und Gegenprobe geschaffen, das gerade bei hämatologischen Bestimmungen äußerst notwendig ist.

Claims

1. Hämatologische Referenzkontrollflüssigkeitssuspension zur Bestimmung von mehreren hämatologischen Parametern in einer automatischen Blutkörperchenzähl- und Klassiervorrichtung, gekennzeichnet durch eine vorbestimmte Anzahl von fixierten roten, in mindestens zwei der folgenden annähernden Größenbereiche zu zählenden Blutkörperchen:

35 bis 90 ± 3 fl

90 bis 160 ± 3 fl

160 bis 450 ± 3 fl

in einem kompatiblen wäßrigen und im wesentlichen isotonischen Stabilisierungsmedium, wobei die Blutkörperchen in den jeweiligen Größenbereichen eine Ersatzfunktion für jeweils eine von drei weißen Blutkörperchen-Unterpopulationen in menschlichem Blut haben, nämlich von Lymphocyten, Monocyten bzw. Granulocyten.

2. Referenzkontrollsuspension nach Anspruch 1, bei der die fixierten roten Blutkörperchen diejenigen umfassen, die ein Volumen besitzen, das von der Vorrichtung im Größenbereich von 35 fl bis 90 ± 3 fl gemessen wird, von Säugerblut stammen, und die Funktion haben, menschliche Lymphocyten zu simulieren.

3. Referenzkontrollsuspension nach Anspruch 1 oder 2, bei der die fixierten roten Blutkörperchen diejenigen umfassen, die ein Volumen besitzen, das von der Vorrichtung im Größenbereich von 90 fl bis 160 ± 3 fl gemessen wird, von Geflügel stammen, und die Funktion haben, menschliche mononukleäre Zellen zu simulieren.

4. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die fixierten roten Blutkörperchen diejenigen umfassen, die ein Volumen besitzen, das von der Vorrichtung im Größenbereich von 160 bis 450 ± 3 fl gemessen wird, von Reptilien oder Fischen stammen, und die Funktion haben, menschliche Granulocyten zu simulieren.

5. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 1-4, bei der das Stabilisierungsmedium Lactose, Fungizide und Antibiotika sowie Zusatzstoffe umfaßt, die aus Purin-Nucleosiden, Gallensalzen und Cholsäurederivaten, Phenothiazin- Verbindungen und deren Salze mit Antihistamin-Eigenschaften und 4-Aminobenzoesäureesterderivaten und deren Salze mit lokal anästhetischen Eigenschaften ausgewählt sind.

6. Hämatologische Referenzkontrollflüssigkeitssuspension zur Verwendung mit einer automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung, gekennzeichnet durch eine vorbestimmte Anzahl von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen, die die Funktion haben, menschliche Granulocyten zu simulieren und von Reptilien oder Fischen stammen.

7. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei der die Reptilien Alligatoren (Alligator mississipiensis) sind.

8. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei der die Fische Haie (Ginglymostoma cirratum) sind.

9. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 6 bis 8, die des weiteren eine vorbestimmte Anzahl von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen beinhaltet, die die Funktion haben, menschliche mononukleäre Zellen zu simulieren und von Geflügel stammen.

10. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 6 bis 9, die des weiteren eine vorbestimmte Anzahl von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen beinhaltet, die die Funktion haben, menschliche Lymphocyten zu simulieren und von Säugern stammen.

11. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die des weiteren eine Suspension aus stabilisierten roten Blutkörperchen in einem wäßrigen Medium zur Hämoglobinbestimmung beinhaltet, wobei die roten Blutkörperchen ihre Ansprechbarkeit auf ein lysierendes Agens durch Stromatolysierung beibehalten.

12. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 1 bis 11, die des weiteren eine Zusammensetzung als Referenz für Blutplättchen beinhaltet.

13. Referenzkontrollsuspension nach Anspruch 12, bei der die Zusammensetzung als Referenz für Blutplättchen eine Suspension aus Blutplättchen beinhaltet, die durch Behandlung mit einer fixierenden und stabilisierenden Zusammensetzung aus Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,1% bis 5% und einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, das eine Mischung aus Ethoxylaten aus isomerischen linearen Alkoholen ist, stabilisiert ist.

14. Referenzkontrollsuspension nach Anspruch 12, bei der die Zusammensetzung als Referenz für Blutplättchen eine Suspension aus Blutplättchen umfaßt, die durch Behandlung mit einer Zusammensetzung aus Jodoazetamid und einer oder mehreren Verbindungen, die aus Iminodiessigsäure und deren Puffersalze in einem vorbestimmten pH- und Osmolalitätsbereich ausgewählt sind, stabilisiert ist.

15. Referenzkontrollsuspension nach einem der Ansprüche 12 bis 14, bei der die Zusammensetzung als Referenz für Blutplättchen eine Suspension aus einem menschlichen Blutplättchenanalogon aufweist, das von Ziegenerythrocyten stammt.

16. Hämatologische Referenzkontrollsuspension, gekennzeichnet durch mindestens zwei Arten von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen, die mindestens zwei Arten von Leukocyten simulieren, wobei die Größe von jeder simulierten Leukocytenart und/oder das Verhältnis von mindestens zwei simulierten Leukocytenarten so angepaßt ist, daß ein festgelegter abnormaler Zustand von menschlichen weißen Blutkörperchen dargestellt ist.

17. Hämatologische Referenzflüssigkeitssuspension zur Bestimmung von mehreren hämatologischen Parametern in einer automatischen Blutkörperchenzähl- und Klassiervorrichtung, gekennzeichnet durch eine Suspension aus stabilisierten menschlichen roten Blutkörperchen in einem wäßrigen Medium zur Hämoglobinbestimmung, wobei die menschlichen Blutkörperchen ihre Ansprechbarkeit auf ein lysierendes Agens durch Stromatolysierung beibehalten;

größenmäßig angepaßte und fixierte rote Blutkörperchen, die weiße Blutkörperchen zur Bestimmung von Lymphocyten, Monocyten und Granulocyten simulieren;

und stabilisierte oder simulierte Blutplättchenzellen; wobei alle Zellen in so einem Verhältnis vorhanden sind, daß die Endparameter für rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen in einen vorbestimmten Bereich fallen, der erwartungsgemäß bei bestimmten menschlichen normalen und krankhaften Zuständen vorhanden ist.

18. Hämatologische Referenzflüssigkeitssuspension für die Messung eines isolierten Parameters zur Verwendung mit einer automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung, gekennzeichnet durch eine vorbestimmte Zahl von größenmäßig angepaßten und fixierten roten Blutkörperchen, die die Funktion haben, menschliche mononukleäre Zellen zu simulieren und von Truthähnen stammen.

19. Verfahren zur Herstellung einer hämatologischen Referenzkontrollzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1, 6, 17 und 18, das das Sammeln von Blut in einem Antikoagulans in einer vorbestimmten Konzentration und das Zentrifugieren des gesammelten Blutes zum Erhalt von geballten roten Blutkörperchen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß

das Blut rote Blutkörperchen einer Größe beinhaltet, die sich zum Zählen in der automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung in den Größenbereich der Leukocyten-Unterpopulation verändern läßt, für welche die Blutkörperchen eine Ersatzfunktion einnehmen sollen,

und daß die Größe der roten Blutkörperchen zum Zählen in der automatischen Blutkörperchenzählvorrichtung durch Fixierung der geballten roten Blutkörperchen mit einer gekühlten hypertonischen Fixierlösung innerhalb von ca. 4 Tagen nach der Phlebotomie in den Größenbereich der Leukocyten-Unterpopulation verändert wird, für welche die Blutkörperchen eine Ersatzfunktion einnehmen sollen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem das Blut von Reptilien oder Fischen stammt.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, bei welchem die gekühlte Fixierlösung eine Temperatur von ca. 0º bis 10ºC besitzt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, bei welchem das Antikoagulans aus Äthylendiamintetraessigsäure und ihren Puffersalzen ausgewählt ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, bei welchem das Antikoagulans in einer Konzentration von 2,5 mM bis 30 mM vorhanden ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, bei welchem die Fixierlösung Glutaraldehyd ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, bei welchem die Fixierlösung Formaldehyd ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, bei welchem die Reaktion mit der Fixierlösung unter hyperosmotischen und leicht sauren bis annähernd neutralen Bedingungen stattfindet.

27. Verfahren nach Anspruch 26, bei welchem die hyperosmotischen Bedingungen zwischen ca. 1000 bis 4000 mOsm/kg liegen und der pH-Wert zwischen 4,0 und 8,0 liegt.