DE69027593T2

DE69027593T2 - Verfahren und Reagenz zur Leukozytenklassifikation

Info

Publication number: DE69027593T2
Application number: DE1990627593
Authority: DE
Inventors: Yukio Hamaguchi; Hitomi Ohmi; Yukio Tsujino
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1990-03-01
Filing date: 1990-10-23
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2010-10-24
Also published as: EP0444240B1; JP2935529B2; CA2027452A1; DE69027593D1; CA2027452C; JPH03252556A; EP0444240A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Klassifizierung von Blutzellen in praxisgerechten klinischen Tests und insbesondere Verfahren zur Klassifizierung, Unterscheidung und Zählung von Leukozyten in einer Blutprobe und die in diesen Verfahren verwendeten Reagenzien.
Leukozyten im peripheren Blut von normalen Personen lassen sich in fünf Typen klassifizieren: Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile. Unterschiedliche Leukozytentypen haben unterschiedliche Funktionen. Die Zählung von Leukozyten im Blut unter Berücksichtigung ihres Typs liefert wertvolle Informationen für diagnostische Zwecke. Beispielsweise tritt bei Entzündungen und Erkrankungen, wie Myokardinfarkt und Leukämie, ein Anstieg der Anzahl an Neutrophilen auf. Bei viralen Erkrankungen, hypoplastischer Anämie, Agranulozytose und dergl. nimmt deren Anzahl ab. Andererseits kommt es bei Erkrankungen, wie Parasitose, Hodgkin-Krankheit und Allergosen zu einem Anstieg der Anzahl von Eosinophilen. Eine erhöhte Anzahl an Monozyten tritt entweder während der Rekonvaleszenzperiode von Patienten mit infektiösen Erkrankungen oder bei Krankheiten, wie monozytischer Leukämie, auf.
Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile sind in Blut vorhandene normale Zellen. Bei bestimmten Blutkrankheiten treten jedoch von diesen Zellen abweichende Zellen, d. h. abnormale Zellen, im peripheren Blut auf. Beispielsweise treten Blastzellen im peripheren Blut eines Patienten mit Leukämie auf.
Da zu abnormalen Zellen verschiedene unterschiedliche Zellarten gehören, ist es klinisch von Bedeutung, sie zu klassifizieren und die zu jeder abnormalen Zellgruppe gehörenden Zellen zu zählen.
Die Klassifizierung und Auszählung von Leukozyten wird üblicherweise durch das differentielle Zählverfahren durchgeführt, das auch als visuelles Zählverfahren oder einfach als manuelles Verfahren bezeichnet wird. Bei diesem Verfahren wird die Blutprobe auf einem Glasobjektträger ausgestrichen, und die Blutzellen im Ausstrich werden für die mikroskopische Untersuchung fixiert und gefärbt. Das technische Personal identifiziert den Typ der einzelnen Leukozyten gemäß ihrer morphologischen Merkmale (z. B. nach Größe, Morphologie von Kern und Zytoplasma und Anwesenheit oder Abwesenheit von Granula) oder nach dem Grad der Farbstoffaufnahme und führt dementsprechend die Klassifizierung und Zählung durch. Unter normalen Umständen werden üblicherweise für jede Probe 100-200 Leukozyten ausgezählt. Der prozentuale Anteil der Gesamtleukozytenzahl jedes Typs von Zellen wird als Meßwert aufgezeichnet.
Das differentielle Zählverfahren hat verschiedene Nachteile. Erstens müssen der mikroskopischen Betrachtung aufwendige Probenvorbereitungsschritte vorausgehen, die das Ausstreichen einer Blutprobe auf einem Glasobjektträger, das Fixieren der Zellen und deren Färbung umfassen. Zweitens stellt es für das technische Personal eine starke Belastung dar, die feinen Unterschiede zwischen den Teilchen durch mikroskopische Klassifizierung und Zählung zu identifizieren. Drittens ist es auch für ausgebildetes technisches Personal schwierig, durch das manuelle Verfahren zu übereinstimmenden Zählergebnissen zu kommen, da abgesehen von der geringen Anzahl an ausgezählten Leukozyten die ausgestrichene Probe häufig eine ungleichmäßige Verteilung der Blutzellen aufweist.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Beseitigung dieser Nachteile beim manuellen Verfahren der Leukozytenklassifizierung vorgeschlagen, die sich einer Automatisierung bedienen. Diese automatisierten Techniken lassen sich grob in zwei Typen einteilen. Die erste Methode besteht darin, die Bilder von Zellen mit einer Videokamera oder einer anderen geeigneten Abbildungsvorrichtung aufzuzeichnen und die Leukozyten durch Bildverarbeitung an einem Computer zu klassifizieren. Das Funktionsprinzip dieses Verfahrens ist ähnlich dem Prinzip des herkömmlichen visuellen Zählverfahrens, jedoch stellt dieses Verfahren vorwiegend aufgrund des Vorliegens von zahlreichen Zellen, die bei der Klassifikation unter Verarbeitung mit einem Computer Schwierigkeiten bereiten, noch keine ideale Alternative für das manuelle Verfahren dar. Ferner ist dieses Verfahren unwirtschaftlich, da es eine komplizierte, voluminöse und kostspielige Einrichtung erfordert.
Der zweite Weg zur automatischen Klassifizierung und Auszählung von Leukozyten basiert auf einem Durchflußsystem. Bei diesem Verfahren wird eine Blutprobe mit darin enthaltenen Zellen in einem Verdünnungsmittel suspendiert und so in eine Strömungsbahn gebracht, daß sie einzeln (eines nach dem andern) einen verengten Detektor passieren. Die Leukozytenklassifizierung wird durch Analyse des vom Detektor erzeugten Signals durchgeführt. Dieses zweite Verfahren zur Leukozytenzählung, das sich eines Durchflußsystems bedient, wird zusätzlich in zwei Kategorien unterteilt.
Bei einem Verfahren der ersten Kategorie läßt man einen Elektrolyten, in dem sämtliche vorhandenen roten Blutzellen mit einem Lysierungsmittel zerstört worden sind, so daß nur noch Leukozyten darin suspendiert sind, durch eine Öffnung strömen. Die Veränderung der elektrischen Impedanz, die an der Öffnung beim Passieren der einzelnen Zellen erfolgt, wird erfaßt, wobei die Größe des erfaßten Signals als Basis für die Klassifizierung von Leukozyten verwendet wird.
Zur ersten Kategorie gehört ein Verfahren, das das Anlegen eines hochfrequenten Stroms an die Öffnung und das Erfassen der Permittivitätsänderung, die sich an der Öffnung bei der Passage der Blutzellen ergibt, umfaßt. Dieses Verfahren wird als "HF-Verfahren" bezeichnet und basiert auf dem Prinzip von JP-B-508789 und US-3 390 326. Gemäß dem HF-Verfahren lassen sich Strukturen von Blutzellen und Eigenschaften von Substanzen, die diese Zellen bilden, neben den Größen der Blutzellen bestimmen.
Außerdem gehört zur ersten Kategorie ein Verfahren, das das Anlegen von Gleichstrom an die Öffnung und das Erfassen der Permittivitätsänderung, die bei der Passage von Blutzellen durch die Öffnung hervorgerufen wird, umfaßt. Dieses Verfahren wird als "Gleichstromverfahren" bezeichnet und ist in JP-B-217 947 und US-2 656 508 beschrieben. Beim Gleichstromverfahren sind die Größen der erfaßten Signale fast proportional zum Volumen von Blutzellen.
In JP-B-785859 und US-3 502 974 ist eine Vorrichtung zur Klassifizierung von Populationen unterschiedlicher Arten von Teilchen in einer Suspension unter Anwendung des HF- Verfahrens in Kombination mit dem Gleichstromverfahren beschrieben. Jedoch findet sich in diesen Patentveröffentlichungen kein Hinweis auf die Möglichkeit zur Klassifizierung und Zählung von Populationen unterschiedlicher Leukozytenarten.
Ein Verfahren der zweiten Kategorie ist durch die Verwendung eines Durchflußzytometers charakterisiert, der folgendes umfaßt: eine Lichtquelle, eine Durchflußzelle, die es ermöglicht, daß die Blutzellen in einer Probe einzeln nacheinander durch einen verengten Kanal strömen, eine Photometereinheit, die von jeder einzelnen Blutzelle ausgehendes Licht erfaßt, und einen Analysator zur Analyse des erfaßten Signals. Bei diesem Verfahren werden die Zellen in der Probe, die gefärbt sind, mit Licht bestrahlt. Die von den bestrahlten Zellen ausgesandte Fluoreszenz wird erfaßt, ggf. zusammen mit Streulicht, wobei die Leukozytenklassifizierung entsprechend der Intensität des erfaßten Signals vorgenommen wird.
Verfahren der zweiten Kategorie erfordern komplizierte Färbevorgänge und sind mit zahlreichen praktischen Problemen behaftet, wie die Verwendung einer komplizierten und teuren Vorrichtung unter Einschluß eines optischen Systems.
Andererseits gehören zu den in einem Verfahren der ersten Kategorie verwendeten zytolytischen Mitteln Saponine oder quaternäre Ammoniumsalze. Da jedoch Saponine keine stabile hämolytische Aktivität aufweisen und quaternäre Ammoniumsalze eine starke hämolytische Aktivität, die eine erhebliche Schädigung von Leukozyten hervorruft, aufweisen, besteht ein Problem darin, daß unter Verwendung dieser hämolytischen Mittel Leukozyten in mindestens drei Typen klassifiziert werden konnten.
Gemäß der Erfindung der Anmelderin (PCT/JP88/00514) werden weder Saponin noch quaternäre Ammoniumsalze als zytolytische Mittel verwendet, vielmehr wird ein Verfahren zum Klassifizieren von normalen Leukozyten in fünf Typen und zur Klassifizierung von abnormalen Zellen bereitgestellt, das die Verwendung eines nicht-ionogenen oder anionischen Tensids auf Polyoxyethylenbasis zur Hämolyse von Erythrozyten und zur angemessenen Schädigung der Leukozyten innerhalb von kurzer Zeit umfaßt, wobei die Ergebnisse unter Kombination des HFund des Gleichstromverfahrens der ersten Kategorie analysiert werden.
Ferner beschreibt JP-A-134957/88 (EP-A-259833) ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten (ein Verfahren der zweiten Kategorie), bei dem Erythrozyten in der ersten Lösung, die sauer und hypoosmotisch ist, hämolysiert werden, die saure Beschaffenheit der ersten Lösung neutralisiert wird und die Osmolarität unter Verwendung der zweiten Lösung eingestellt wird. Die Messung von Leukozyten wird zu deren Klassifizierung in einem Durchflußzytometer durchgeführt. Die Nationale Patentanmeldung 502931/89 (PCT/US88/00762) beschreibt ein Verfahren (ein Verfahren der ersten Kategorie) zur Klassifizierung von Leukozyten, bei dem Erythrozyten in der ersten Lösung, die sauer und hypoosmotisch ist, lysiert werden, die saure Beschaffenheit der ersten Lösung neutralisiert wird und die Osmolarität unter Verwendung der zweiten Lösung eingestellt wird. Die Klassifizierung und zählung von Leukozyten erfolgt unter Kombination des HF- und des Gleichstromverfahrens.
Jedoch lassen sich Erythrozyten-Bruchstücke (nachstehend als "Erythrozyten-Geister" bezeichnet) nicht in ausreichender Weise in einer sauren und hypoosmotischen Lösung hämolysieren, wie es bei den vorgenannten zwei Verfahren erfolgt. Daher kommt es bei der Messung von Leukozyten unter Anwendung der HF- und Gleichstromverfahren dazu, daß diese Geister und die Intensität der erfaßten Signale sich teilweise überlappen, so daß keine genaue Unterscheidung Blutanalysegeräts, das für die Durchführung derartiger Methoden erforderlich ist.
Obgleich im Handbuch Clinical Analysis (Rinsho Kensa), Ergänzungsband 1, "Pretreatment for Examination of Samples", S. 3, Hrsg. Kanahara Shuppan, ausgeführt wird, daß ein Ausstrich innerhalb von 4 Stunden nach der Blutentnahme hergestellt werden muß, werden in großen Institutionen, wie klinischen Untersuchungszentren, die Ausstriche häufig erst viele Stunden nach der Blutentnahme hergestellt. In derartigen Fällen nimmt die Schädigung von Leukozyten im zeitlichen Verlauf zu, wobei insbesondere Neutrophile und Monozyten erheblich geschädigt werden. Daher unterscheiden sich die Ergebnisse der Klassifizierung von Leukozyten, die 24 Stunden nach der Blutprobe erhalten werden, sehr stark von den Ergebnissen für Leukozyten, die unmittelbar nach der Blutentnahme bestimmt werden.
EP-A-0 325 710 beschreibt ein Reagenz zur Messung von Leukozyten und Hämoglobin in Blut, das bestimmte, nichtionogene Tenside auf Polyoxyethylenbasis enthält. Das Reagens enthält auch ein Pufferungsmittel, um den pH-Wert der Lösung im Bereich von 3-11 zu halten.
WO-88/07187 beschreibt ein Lysismittel zur Aufteilung einer Vollblutprobe in zwei Fraktionen, nämlich eine intakte Leukozytenfraktion und eine lysierte Erythrozytenfraktion. Der pH-Wert des Reagenz wird im Bereich von 2,6-4,0 gehalten.
EP-A-0 177 137 beschreibt ein Reagenz zur Bestimmung von Basophilen, das die Lysis anderer Leukozytenformen verursacht.
Es bestand somit ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur genauen Klassifizierung von Leukozyten in Blut, das viele Es bestand somit ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur genauen Klassifizierung von Leukozyten in Blut, das viele Stunden vorher entnommen worden war.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem weder Saponin noch quaternäres Ammonium als zytolytisches Mittel verwendet wird, bei dem aber ein anderes zytolytisches Mittel mit stabiler hämolytischer Aktivität zur Hämolyse von Erythrozyten und zur Stabilisierung von Leukozyten innerhalb von kurzer Zeit verwendet werden, wobei Erythrozyten-Geister von Lymphozyten unterschieden werden können und normale Leukozyten in fünf Typen klassifiziert und abnormale Zellen klassifiziert werden, wobei sich genaue Werte für die klassifizierten Leukozyten in Blutproben viele Stunden nach der Entnahme erhalten lassen. Ferner soll ein hierfür verwendetes Reagenz bereitgestellt werden.
Die vorerwähnten Schwierigkeiten lassen sich unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenziensatzes (Kit) und durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten unter Verwendung dieses Kits lösen.
Erfindungsgemäß wird ein Kit bereitgestellt, mit dem sich Leukozyten durch Lysieren von Erythrozyten und durch Einwirkung aufleukozyten klassifizieren und zählen lassen, wobei das Kit folgendes umfaßt:
(i) eine erste Lösung mit einem pH-Wert von 1,5-5,0 und einer Osmolarität von 10-120 mmol/kg (10-120 mcsm/kg) und mit einem Gehalt an einem nicht-ionogenen Tensid auf Polyoxyethylenbasis der allgemeinen Formel
R&sub1;-R&sub2;- (CH&sub2;CH&sub2;O)n-H
in der R&sub1; einen Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 12-22 Kohlenstoffatomen bedeutet; R&sub2; die Bedeutungen oder -COO- hat; und n eine ganze Zahl von 20-100 ist; oder der Formel
(ii) eine zweite Lösung mit einem Gehalt an einem Puffer und einem Mittel zur Einstellung der Osmolarität, das nach Zugabe zur ersten Lösung zu einem Gemisch mit einem pH-Wert von 5,0-12,0 und einer Osmolarität von 150-2000 mmol/kg (150-2000 mOsm/kg) führt.
Vorzugsweise enthält die zweite Lösung zusätzlich ein nichtionogenes Tensid auf Polyoxyethylenbasis der allgemeinen Formel
R&sub1;-R&sub2;- (CH&sub2;CH&sub2;O)n-H
in der R&sub1; einen Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 12-22 Kohlenstoffatomen bedeutet; R&sub2; die Bedeutung oder -COO- hat; und n eine ganze Zahl von 20-100 ist.
Die zweite Lösung kann ferner mindestens ein Solubilisierungsmittel enthalten, das aus folgenden fünf Untergruppen ausgewählt ist:

Untergruppe 1 (Harnstoffverbindungen):

Harnstoff
Thioharnstoff
1,1-Dimethylharnstoff
Ethylenharnstoff
Methylurethan
1,3-Dimethylharnstoff
Urethan (H&sub2;NCOOC&sub2;H&sub5;)

Untergruppe 2:

N-Octyl-β-D-glucosid
CHAPS (3-[(3-Chloramidopropyl)-dimethylammonio]-1- propansulfonat)
CHAPSO (3-[(3-Chloramidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansul fonat)
MEGA 8,9,10 (Octanoyl-, Nonanoyl- oder Decanoyl-N- methylglucamid)
Saccharosemonocaprat
N-Formylmethylleucylalanin

Untergruppe 3 (Guanidine):

Guanidinthiocyanat
Guanylguanidin
Guanidinhydrochlorid
Guanidinrhodanat
Guanidinnitrat
1,1,3,3-Tetraguanidin
Guanidincarbonat
Guanidinphosphat
Guanidinsulfat

Untergruppe 4 (Cholsäuren):

Natriumdesoxycholat
Taurocholsäure
Cholsäure

Untergruppe 5 (halogensubstituierte Essigsäuren):

Natriumtrichloracetat
Natriumtribromacetat
Natriumdichloracetat
Natriumdibromacetat
Natriummonochloracetat
Natriummonobromacetat.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten in mindestens drei Typen, d. h. Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten, bereitgestellt, wobei man das vorstehende Kit sowie ein spezielles Analyseverfahren, das unter einem Hochfrequenzverfahren (HF-Verfahren) und einem Direktstromverfahren ausgewählt wird, anwendet.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erfassung von abnormalen Zellen bereit, indem man das vorstehende Kit und ein spezielles Analyseverfahren, das unter HF-Verfahren und Direktstromverfahren ausgewählt wird, anwendet.
Es ist bekannt, daß Erythrozyten in einer hypoosmotischen Lösung hämolysiert werden, jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß Erythrozyten unter hypoosmotischen (10-120 mOsm/kg) und sauren Bedingungen in einer Lösung mit einem Gehalt an einem nicht-ionogenen Tensid hämolysiert werden können.
Wird die Lösung neutralisiert, ergibt sich eine stärkere Schädigung der Leukozyten und Erythrozyten-Geister nehmen nicht in ausreichendem Maße ab. Wird die Lösung andererseits alkalisch gemacht, kommt es zu einer sehr starken Schädigung von Leukozyten. Daher ist es wesentlich, die Hämolyse von Erythrozyten unter sauren Bedingungen durchzuführen. Erythrozyten-Geister nehmen nur ab, wenn die sauren und hypoosmotischen Bedingungen kombiniert werden.
Fig. 1 ist ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse der Leukozytenmessung unmittelbar nach der Blutentnahme unter Verwendung eines Reagenz, das nur aus einer Lösung besteht.
Fig. 2 ist ein Diagramm zur Darstellung der Verteilung der Ergebnisse, die bei Messung von Leukozyten 24 Stunden nach der Blutentnahme unter Verwendung eines nur aus einer Lösung bestehenden Reagenz erhalten wurden.
Fig. 3 ist ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse, die durch Messung der Leukozyten unmittelbar nach der Blutentnahme in einem Ausführungsbeispiel unter Verwendung eines aus zwei Lösungen bestehenden Kits erhalten wurden.
Fig. 4 ist ein Diagramm zur Darstellung der Verteilung der Ergebnisse, die bei Messung von Leukozyten 24 Stunden nach der Blutentnahme in einem Ausführungsbeispiel unter Verwendung eines aus zwei Lösungen bestehenden Kits erhalten wurden.
Fig. 5 ist ein Diagramm zur Darstellung der Verteilung der Ergebnisse, die bei Messung von Blut eines an akuter myelozytischer Leukämie leidenden Patienten in einem Ausführungsbeispiel unter Verwendung eines aus zwei Lösungen bestehenden Kits erhalten wurden.
Figg. 6 und 7 sind Diagramme zur Darstellung der Verteilungen der Ergebnisse, die bei Messung von Blut, das gemäß einem Vergleichsbeispiel nur in einer sauren und hypoosmotischen Lösung hämolysiert worden war, erhalten wurden. Fig. 6 ist ein Diagramm, das sich auf die Messung unmittelbar nach der Blutentnahme bezieht. Fig. 7 bezieht sich auf eine Messung 24 Stunden nach der Blutentnahme.
Fig. 8 ist ein Diagramm, das zum Vergleich die Verteilung zeigt, wenn die Additionszahl (n) des Polyoxyethylens unter dem erfindungsgemäß definierten Wert liegt (n = 10).
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen und nicht unter die Erfindung fallenden Vergleichsbeispielen erläutert, wobei diese Beispiele nicht als Beschränkung anzusehen sind.

Vergleichsbeispiel 1

Erythrozyten in einer Blutprobe wurden hämolysiert. Die Leukozyten in der Probe wurden unter Verwendung einer Reagenzlösung, deren pH-Wert auf 2,0 gehalten wurde und deren Osmolarität auf 80 mOsm/kg eingestellt war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Die horizontale Achse der in Fig. 6 dargestellten zweidimensionalen Verteilung zeigt die relative Stärke des durch das Gleichstromverfahren bestimmten Signals und die vertikale Achse zeigt die relative Stärke des durch das HF-Verfahren bestimmten Signals. Die einzelnen in Fig. 6 gezeigten Flecken entsprechen den einzelnen Zellen, die jeweils ein Gleichstromsignal und ein HF-Signal ergaben.
Die Bezeichnungen a-d in Fig. 6 haben folgende Bedeutung:
a: Granulozyten; b: Monozyten; c: Lymphozyten; d: Erythrozyten-Geister.
In den übrigen Figuren sind die vertikalen und horizontalen Achsen sowie die Symbole auf die gleiche Weise wie in Fig. 6 definiert.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse, die unmittelbar nach der Blutentnahme erhalten wurden. In dieser Figur überlappt sich die Verteilung der Erythrozyten-Geister d und der Lymphozyten c partiell. Ferner ergeben die Verteilungen der Granulozyten a, der Monozyten b und der Lymphozyten c keine gute Trennung (unzureichende Trennung)
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse, die bei Bestimmung einer Blutprobe 24 Stunden nach der Entnahme unter Verwendung des gleichen Reagenz wie in Fig. 6 erhalten wurden. Bei der Verteilung der drei Leukozytenarten ergibt sich, daß diese schlechter voneinander getrennt sind.

Vergleichsbeipiel 2

Die Ergebnisse, die bei Bestimmung unmittelbar nach der Blutentnahme unter Verwendung eines Reagenz, das nur die erste Lösung des vorliegenden Kits enthielt, erhalten wurden, sind in Fig. 1 angegeben. Der pH-Wert der Lösung betrug 2,0. Ihre Osmolarität betrug 80 mOsm/kg. Als nicht-ionogenes Tensid auf Polyoxyethylenbasis wurden 1,5 giliter Emulsit 9 [C&sub9;H19 -O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub3;&sub0; &sub5;&sub0;-H; Produkt der Fa. Daiichi Kogyo Seiyaku Kabushiki Kaisha] verwendet. Die Verteilung der Erythrozyten-Geister d und die der Lymphozyten c ergibt eine klare Trennung ohne überlappung Die Verteilung von Granulozyten a und Monozyten c ergibt eine gute Trennung.

Vergleichsbeispiel 3

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse, die bei Bestimmung 24 Stunden nach der Blutentnahme unter Verwendung der gleichen Lösung wie in Fig. 1 erhalten wurden. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, ergibt die Verteilung der drei Leukozytenarten und die Verteilung der Erythrozyten-Geister eine gute Trennung.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse, die bei Bestimmung der gleichen Blutprobe wie in Fig. 1 unter Verwendung von Actinol L1O als nicht-ionogenes Tensid auf Polyoxyethylenbasis [C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub5;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub1;&sub0;-H; Produkt der Fa. Matsumoto Yushi Seiyaku Kabushiki Kaisha] anstelle von Emulsit 9 erhalten wurden. Gemäß Fig. 8 war eine Klassifizierung und Zählung von Leukozyten unmöglich, da nicht nur Erythrozyten sondern auch Leukozyten zerstört oder erheblich kontrahiert waren. Bekanntlich ist die hämolytische Aktivität von Polyoxyethylen um so stärker, je kleiner die Additionsmolzahl ist. Actinol L10, worin n den Wert 10 hat, zerstört oder kontrahiert nicht nur Erythrozyten, sondern auch Leukozyten.
Dagegen wird die hämolytische Aktivität schwächer oder verschwindet ganz, wenn die Additionsmolzahl (n) des als Tensid verwendeten Polyoxyethylens größer wird. Ein Tensid mit großem n zeigt eine so schwache härnolytische Aktivität, daß die Schädigung von Leukozyten erheblich verringert wird. Daher ermöglicht es die Verwendung eines derartigen Tensids, Leukozyten selbst im Blut, dessen Entnahme längere Zeit zurückliegt, zu klassifizieren und zu zählen. Ist andererseits die hämolytische Aktivität des Tensids zu schwach, so lassen sich Erythrozyten-Geister nicht in ausreichendem Maße verringern, so daß die Geister nicht gut von Lymphozyten unterschieden werden können.
Überraschenderweise haben die Erfinder festgestellt, daß Erythrozyten-Geister in ausreichendem Maße verringert werden können, ohne daß eine unerwünschte Schädigung von Leukozyten hervorgerufen wird, indem man ein nicht-ionogenes Tensid verwendet, dessen Additionsmolzahl des Polyoxyethylens 20-100 beträgt.
Außerdem haben die Erfinder festgestellt, daß das Tensid die Leukozytenmembranen schützt und in einem zweidimensionalen Verteilungsdiagramm eine klare Trennung von drei Gruppen von Leukozyten liefern kann: Granulozyten a; Monozyten b; und Lymphozyten c.
Ein Beispiel für eine derartige Schutzwirkung ist nachstehend aufgeführt:
Bei Durchführung der Hämolyse in einer sauren und hypoosmotischen Lösung werden Leukozyten innerhalb von etwa 5 Minuten geschädigt und kontrahiert. Wenn jedoch die Lösung mit einem nicht-ionogenen Tensid, bei dem die Additionsmolzahl von Polyoxyethylen 20-100 beträgt, zersetzt wird, kommt es selbst nach 20 Minuten zu keiner Kontraktion der Leukozyten.
Nachstehend werden die erfindungsgemäß bereitgestellten Kits aus zwei Lösungen näher beschrieben.
Die erste Lösung im vorstehend beschriebenen zweiteiligen Kit, wird mit Blut umgesetzt, um Erythrozyten unter sauren und hypoosmotischen Bedingungen zu hämolysieren, wobei Leukozyten geschützt sind. Die zweite Lösung, die einen Puffer und ein Mittel zur Einstellung der Osmolarität enthält, wird der die erste Lösung und das Blut enthaltenden Reaktionslösung zugesetzt, wodurch der pH-Wert und die Osmolarität des erhaltenen Gemisches auf einen Neutralbereich (pH-Wert 5,0-12,0) und eine hohe Osmolarität (150-2000 mOsm/kg) eingestellt werden. Somit bewirkt die zweite Lösung die Einstellung des pH-Werts und der Osmolarität der Reaktionslösung Durch Zugabe der zweiten Lösung wird die Auftrennung der Gruppen von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten stärker verbessert, wobei die Analyse einer zweidimensionalen Verteilung mittels eines Computers zur Fraktionierung der Verteilung in die einzelnen Gruppen erleichtert wird.
Die Trennung der Gruppen kann weiter verbessert werden, indem man ein nicht-ionogenes Tensid auf Polyoxyethylenbasis und ein Solubilisierungsmittel gemäß früheren Angaben einverleibt.

Beispiel 1

Nachstehend wird die Verwendung eines Kits aus zwei Lösungen erläutert.

Herstellung der ersten Lösung

1 Liter einer auf einem pH-Wert von 2,0 gehaltenen und mit Kaliumchlorid auf 80 mOsm/kg eingestellten Salzsäure- Pufferlösung wurde mit 1,5 g Emulsit 9 versetzt.

Herstellung der zweiten Lösung

2 Liter Puffer aus primärem Natriumphosphat/sekundärem Natriumphosphat wurden zu 100 g Formalin gegeben. Nachdem die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 und auf eine Osmolarität von 1100 mOsm/kg eingestellt worden war, wurden 2,5 g β- Phenethylalkohol als Konservierungsmittel, 10 g Triethanolamin als Antioxidationsmittel und 0,025 g Emulgen 420 [CH&sub3; (CH&sub2;)&sub7;CH=CH(CH&sub2;)&sub8;-O-(CH&sub2;CH&sub2;)&sub1;&sub3;H; nicht-ionogenes Tensid auf Polyoxyethylenbasis der Fa. Kao Kabushiki Kaisha] als Mittel zur Bildung von Erythrozyten-Geistern zu der Lösung gegeben.

Reaktionsbedingungen

5 ml der ersten Lösung wurden mit 60 µl Blut versetzt. Das Gemisch wurde 30 Sekunden bei 33ºC umgesetzt.
Anschließend wurde das Gemisch mit der zweiten Lösung versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 30 Sekunden bei 33ºC umgesetzt.
Die zweidimensionale Verteilung des Bluts durch die vorstehende zweistufige Reaktion unmittelbar nach der Blutentnahme ist in Fig. 3 dargestellt. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, waren die Erythrozyten-Geister in ausreichendem Maße kontrahiert und die Granulozyten a, die Monozyten b und die Lymphozyten c gut getrennt. Das Symbol g bedeutet ein Blutplättchenaggregat.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse, die bei der Bestimmung auf die gleiche Weise wie in Fig. 3 bei der gleichen Blutprobe wie in Fig. 3 erhalten wurden, mit der Ausnahme, daß nach der Blutentnahme 24 Stunden verstrichen waren. Wie aus Fig. 4 klar ersichtlich ist, wurde auch bei Bestimmung 24 Stunden nach der Blutentnahme im wesentlichen die gleiche zweidimensionale Verteilung wie in Fig. 3 erhalten. Dies zeigt, daß das erfindungsgemäße Kit eine stabile Blutbestimmung auch lange Zeit nach der Blutentnahme ermöglicht. Dies ist auf die Stabilisierung von Leukozyten mit dem erfindungsgemäßen Kit zurückzuführen.
Leukozyten wurden in drei Fraktionen klassifiziert und, gemäß den Angaben in PCT/JP88/00514 wurde eine Probe zur Bestimmung von Eosinophilen und eine Probe zur Bestimmung von Basophilen zur Messung der Zahl der Eosinophilen und der Basophilen hergestellt. Durch die Vorgehensweise ließen sich die Leukozyten in fünf Typen klassifizieren, d. h. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile. Die Zellen der einzelnen Typen konnten ausgezählt werden, so daß man die Gesamtanzahl der Zellen der einzelnen Typen von Leukozyten sowie die entsprechenden Verhältnisse erhielt. Die Korrelationskoeffizienten für die Verhältnisse von fünf Typen von Leukozyten, die durch einen Vergleich der Ergebnisse von 20 nach dem vorstehenden Verfahren bestimmten Blutproben mit den Ergebnissen der Messung von 200 Zellen für die einzelnen Proben durch das visuelle Zählverfahren erhalten wurden, sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Lymphozyten Monozyten Neutrophile Eosinophile Basophile
Auf die gleiche Weise wurde Blut eines Patienten mit akuter myelozytischer Leukämie (AML) bestimmt. Die Ergebnisse einer zweidimensionalen Verteilung sind in Fig. 5 dargestellt. Die Symbole e und f bedeuten Leukämiezellen bzw. kemhaltige Erythrozyten. In Fig. 5 treten abnormale Zellen, wie Leukämiezellen, an Stellen auf, bei denen in den Figg. 3 und 4 keine Zellen vorhanden sind. Somit lassen sich erfindungsgemäß nicht nur normale Zellen, sondern auch abnormale Zellen erfassen.
Mit dem erfindungsgemäßen Kit und unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Erythrozyten unter Verwendung eines zytolytischen Mittels mit einer stabilen hämolytischen Aktivität hämolysieren; Leukozyten innerhalb von kurzer Zeit stabilisieren; und Erythrozyten-Geister und Lymphozyten klar unterscheiden. Eine Kombination des Gleichstromverfahrens und des HF-Verfahrens ermöglicht eine Klassifizierung von Leukozyten in fünf Typen von normalen Leukozyten und abnormalen Zellen. Genaue Klassifizierungswerte lassen sich an Blut, das lange Zeit nach der Entnahme getestet wird, erhalten.

Claims

1. Kit zur Klassifizierung und Zählung von Leukozyten unter Lysis von Erythrozyten und Einwirkung aufleukozyten, umfassend folgende Bestandteile:

(i) eine erste Lösung mit einem pH-Wert von 1,5-5,0 und einer Osmolarität von 10-120 mmol/kg (10-120 mOsm/kg) und mit einem Gehalt an einem nicht-ionogenen Tensid auf Polyoxyethylenbasis der allgemeinen Formel

R&sub1;-R&sub2;- (CH&sub2;CH&sub2;O)n-H

in der R&sub1; einen Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 12-22 Kohlenstoffatomen bedeutet; R&sub2; die Bedeutungen -O-, oder -COO- hat; und n eine ganze Zahl von 20-100 ist; oder der Formel C&sub9;H&sub1;&sub9; O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub3;&sub0; &sub5;&sub0;-H; und

(ii) eine zweite Lösung mit einem Gehalt an einem Puffer und einem Mittel zur Einstellung der Osmolarität, das nach Zugabe zur ersten Lösung zu einem Gemisch mit einem pH-Wert von 5,0- 12,0 und einer Osmolarität von 150-2000 mmol/kg (150-2000 -mOsm/kg) führt.

2. Kit nach Anspruch 1, wobei die zweite Lösung zusätzlich ein nicht-ionogenes Tensid auf Polyoxyethylenbasis der folgenden allgemeinen Formel enthält:

R&sub1;-R&sub2;- (CH&sub2;CH&sub2;O)n-H in der R&sub1; einen Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest mit 12-22 Kohlenstoffatomen bedeutet; R&sub2; die Bedeutung -O-, oder -COO- hat; und n eine ganze Zahl von 20-100 ist.

3. Kit nach Anspruch 1, wobei die zweite Lösung mindestens ein Solubilisierungsmittel enthält, das aus folgenden fünf Untergruppen ausgewählt ist:

Untergruppe 1 (Harnstoffverbindungen):

Harnstoff

Thioharnstoff

1,1-Dimethylharnstoff

Ethylenharnstoff

Met hylurethan

1,3-Dimethylharnstoff

Urethan(H&sub2;NCOOC&sub2;H&sub5;)

Untergruppe 2:

N-Octyl-β-D-glucosid

CHAPS (3-[(3-Chloramidopropyl)-dimethylammonio]-1- propansulfonat)

CHAPSO (3-[(3-Chloramidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansulfonat)

MEGA 8,9,10 (Octanoyl-, Nonanoyl- oder Decanoyl-N- methylglucamid)

Saccharosemonocaprat

N-Formylmethylleucylalanin

Untergruppe 3 (Guanidine):

Guanidinthiocyanat

Guanylguanidin

Guanidinhydrochlorid

Guanidinrhodanat

Guanidinnitrat

1,1,3,3-Tetraguanidin

Guanidincarbonat

Guanidinphosphat

Guanidinsulfat

Untergruppe 4 (Cholsäuren):

Natriumdesoxycholat

Taurocholsäure

Cholsäure

Untergruppe 5 (halogensubstituierte Essigsäuren):

Natriumtrichloracetat

Natriumtribromacetat

Natriumdichloracetat

Natriumdibromacetat

Natriummonochloracetat

Natriummonobromacetat.

4. Verfahren zur Klassifizierung von Leukozyten in mindestens drei Typen, d. h. Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten unter Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und unter Anwendung eines speziellen Analyseverfahrens, das unter HE- Verfahren und Gleichstrornverfahren ausgewählt ist.

5. Verfahren zum Erfassen von abnormalen Zellen unter Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und unter Anwendung eines speziellen Analysenverfahrens, das unter HE- Verfahren und Gleichstromverfahren ausgewählt ist.