JP2619900B2

JP2619900B2 - 血液中の白血球およびヘモグロビンの測定用試薬および方法

Info

Publication number: JP2619900B2
Application number: JP63016735A
Authority: JP
Inventors: 行雄浜口; 幸夫辻野
Original assignee: 東亜医用電子株式会社
Priority date: 1988-01-27
Filing date: 1988-01-27
Publication date: 1997-06-11
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: US5116539A; EP0325710A2; DE3853671T2; DE3853671D1; EP0325710B1; EP0325710A3; JPH01191057A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、血液試料中の白血球およびヘモグロビンを
測定するための試薬に関するものである。

（従来の技術）血液試料中の白血球数およびヘモグロビンを測定する
ことは、白血病や貧血症等の臨床診断にとって極めて重
要である。白血球のうち好酸球を測定することはアレル
ギー疾患の診断にとって重要である。

白血球数の測定においては、顕微鏡観察による視算法
が基準の方法になっている。しかし、視算法において
は、特に好酸球の測定の場合、血液を希釈液（赤血球を
溶血させ、好酸球顆粒のみを染める酸性色素を含む液で
あり、ヒンケルマン（Hinkelman）液、ランドルフ（Ran
dolh）液などがある）で希釈し、計算板上の好酸球を一
個一個数える必要がある。そのため、非常に手間と時間
が必要である。

ところで、血液試料中の白血球数の測定においては、
自動血液分析装置による方法も広く行われている。自動
血液分析装置による白血球数の測定は、赤血球溶解剤を
添加することにより血液試料中の赤血球を溶解させ、主
として白血球のみが残った白血球測定用試料を作製する
ことによって行われる。白血球測定用試料は、自動血液
分析装置内の検出部に設けられた細い通路または細孔を
通過させられる。このとき、一個一個の白血球に対応し
て検出部で発生される電気的または光学的信号を検出す
ることにより白血球数がカウント（計数）される。

また、近年では、得られる信号の強度の差によって白
血球をさらに顆粒球、単球、リンパ球などのクラスに分
類し、カウントする装置も実現されている。さらに、顆
粒球を好中球、好酸球、好塩基球に分類して、計数する
装置も実用化されている。この装置を用いれば、上記の
視算法よりも遥かに簡便に好酸球を測定することができ
る。

一方、ヘモグロビンの測定においては、血液中のヘモ
グロビンを、フェリシアン化カリウムおよびイアンを含
有する溶解試薬の作用によりシアンメトヘモグロビン
（HiCN）に転化させ、特定波長の吸光度を測定する方法
（シアンメトヘモグロビン法）が一般的に行われてい
る。自動血液分析装置においても、上記白血球測定用試
料がヘモグロビン測定用試料としても、そのまま利用で
きることによりシアンメトヘモグロビン法または、それ
に準じた方法が採用されている。

ところが、シアンメトヘモグロビン法においては毒物
であるシアンを用いているため、試薬の取扱に危険が伴
う。また、測定後の廃液は、次亜塩素酸ナトリウムなど
を用いてシアンを分解した後に廃棄する必要があり、廃
液処理に煩わしさがある。

そのため、血液中のヘモグロビンをオキシヘモグロビ
ン（HbO₂）に転化させ、特定波長の吸光度を測定する方
法（オキシヘモグロビン法）も行われるようになってき
ている。オキシヘモグロビン法においては、シアンを使
用しないため、試薬の取扱に危険もなく、廃液処理に煩
わしさもない。

（発明が解決しようとする課題）ところが、従来のオキシヘモグロビン法においては、
溶解試薬の作用により赤血球を溶血するのみならず白血
球をも極めて縮小化する。これは、吸光度を測定する上
では、白血球による散乱光の影響を受けなくなるので好
ましいが、同試薬を用いて白血球を測定すること自体は
不可能になる。

このため、オキシヘモグロビン法を採用した自動血液
分析装置においては、ヘモグロビン測定用試料および白
血球測定用試料を別々に作製し、それぞれヘモグロビン
測定用検出部および白血球測定用検出部において測定す
るようにしていた。

しかし、検出部が別々に必要になる上に、測定用試料
を作製するための流体系も二系列必要となる等のため、
装置が複雑となりコスト高になる。

なお、自動血液分析装置が好酸球測定用の検出部を持
つ場合には、同検出部でオキシヘモグロビン法によりヘ
モグロビンの測定が可能になれば、ヘモグロビン測定用
の検出部を別個に設ける必要が無くなり、装置構成が簡
単化できる。白血球数は、従来通り白血球測定用検出部
で測定すれば良い。

ところが、白血球を分類して好酸球等を分類するため
の検出部を備える自動血液分析装置においても、従来
は、白血球分類用試料（もしくは好酸球測定用試料）を
用いてヘモグロビンを測定することは不可能であった。

そこで、オキシヘモグロビン法を採用しながらも、同
測定用試料において白血球もしくはその中の好酸球も同
時に測定できるようにするための試薬が求められてい
た。

さらに、同試薬の使用によって白血球が他の顆粒球、
単球、リンパ球に分類され、計数できるようになれば、
さらに有用である。

（課題を解決するための手段）上記課題を克服するために、本発明は以下の成分
（ａ）および（ｂ）を含有する水溶性混合物である血液
中の白血球数およびヘモグロビンの測定用試薬を提供す
る：（ａ）一般式 R₁−R₂−（CH₂CH₂O）_ｎ−Ｈ（ここで、R₁は炭素数６〜24のアルキルまたはアルケニ
ルまたはアルキニル基;R₂は−Ｏ−，または−COO−;nは６〜50の整数）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤お
よび（ｂ）水溶液のpHを３〜11にする緩衝剤この試薬を白血球のうち特に好酸球を測定するのに使
用する場合、緩衝剤のpHは５〜11である。

また、この試薬をリンパ球と他の白血球とにあるいは
リンパ球および単球と他の白血球とに分類するのに使用
する場合は、ｎは10〜30の整数であり、R₁は炭素数10〜
20のアルキル、アルケニルまたはアルキニルである。

（作用）本発明の試薬を血液に添加すると、血液中の赤血球は
瞬時に溶血されヘモグロビンは、直ちにオキシヘモグロ
ビンに転化しヘモグロビンの測定が可能となる。また、
赤血球が溶血した後の赤血球ゴーストや、血小板は自動
血液分析装置において白血球とは完全に識別できる程度
にまで極小化される。

一方、血液の白血球は、上記試薬の添加後その大きさ
が徐々に縮小されるものの、所定時間中は自動血液分析
装置によって完全に検出できる程度の大きさに残ってい
る。したがって、その時間内に測定すれば、白血球数を
カウントすることが出来る。さらに、所定時間後には、
好酸球以外の白血球は全て裸核化され、好酸球のみが裸
核化されずに残るので自動血液分析装置によって好酸球
のみが完全に検出される。

また、ｎが10〜30の整数であり、R₁が炭素数10〜20の
アルキル、アルケニルまたはアルキニルである本発明の
試薬を添加して自動血液分析装置により分析した場合に
は、白血球がリンパ球と他の白血球とに、あるいは、リ
ンパ球と単球と他の白血球とに、検出信号の強度差によ
って安定してクラス分けされる時間がある。その時間内
に測定を完了するようにすれば、白血球の分類・計数が
可能となる。

なお、本発明を試薬により調製される試料のpHが３〜
11であれば、血液中の白血球数の測定および白血球の分
類・計数ならびにヘモグロビンの測定が可能であるが、
より良好に白血球を分類・計数するためには、pHが４〜
９であることが好ましい。好酸球を測定するにはpH5〜1
1である。

（実施例）本発明の試薬の一組成例およびその試薬による測定例
を下記実施例において示す。

実施例１試薬組成 ◎ポリオキシエチレン系界面活性剤 0.4 g C₁₈H₃₅−Ｏ−（CH₂CH₂O）₁₂−Ｈ ◎緩衝剤リン酸水素ナトリウム12水塩 0.28g Na₂HPO₄・12H₂O リン酸２水素カリウム 0.02g KH₂PO₄ ◎浸透圧調整剤塩化ナトリウム 0.37g NaCl ◎防腐剤（２−ピリジルチオ−１−オキシド） 0.02g ナトリウム ◎水 100 ml 上記組成の試薬を用いて血液を250倍に希釈し、pH7.
5、浸透圧160mOsm、液温26℃の条件化で、試薬添加後13
秒から測定を開始し、６秒間白血球を測定した結果を第
１図に示す。

第１図に示す二次元分布図の横軸はDC法で測定したと
きの相対信号強度を表し、縦軸はRF法で測定したときの
相対信号強度を表している。

DC法とは、粒子がこれと導電率を異にする流体媒質中
に懸濁された試料を細い電流通路に通過させ、粒子と流
体媒質との導電率の相違に起因する電流の変化を検出す
る方法である。このDC法においては、検出される信号の
大きさは、ほぼ粒子の体積に比例している。

一方、RF方とは、粒子がこれと誘電率を異にする流体
媒質中に懸濁された試料を流体通路に通過させ、通路の
狭隘部分において通路を挟んで互いに近接し対向して設
けられた対をなす電極の間を粒子が通過する際に粒子と
流体媒質との誘電率の相違に起因する電極間の電気イン
ピーダンス変化を検出する方法である。このRF法におい
ては、検出される信号の大きさは、粒子の大きさ情報に
加えて粒子の構造および粒子を構成する材料の性質によ
る情報をも反映している。

第１図中の各点は、上記DC法およびRF法により測定し
たとき、それぞれのDC信号強度とRF信号強度を示した各
細胞に対応している。

第１図に示されるように、白血球はa,b,cの三つの集
団に分画される。ａは顆粒球、ｂは単球、ｃはリンパ球
の集団である。各集団がそれぞれ顆粒球、単球、リンパ
球であることは、それぞれの白血球種を分離した試料を
測定すること、および視算法との相関試験により確認さ
れた。図中ｄで示される集団は赤血球のゴーストであ
る。また、顆粒球、単球、リンパ球の集団に含まれる細
胞数の総和は、従来の視算法によりカウントされた白血
球数と一致した。

以上の結果より、本発明の試薬により血液中の白血球
数を測定できることおよび白血球中の顆粒球、単球、リ
ンパ球を分類・計数できることが示された。

なお、本実施例では、DC法およびRF法と呼ばれる電気
的検出方法により測定したが、光学的検出方法により測
定することも可能である。また、リンパ球数のみが知り
たいときには、白血球を簡易的にリンパ球とその他の白
血球とに分類すれば良い。

次に、上記組成の試薬により上記白血球の測定を行っ
た試料と同一の試料の吸収曲線を測定した例を第２図に
示す。第２図の横軸は波長を、縦軸は吸光度を表す。吸
収曲線の極大を示す波長（541nm,576nm）および極小を
示す波長（510nm,560nm）は、三輪史郎編：血液検査、
臨床検査技術全書、第３巻、46〜52頁、1976年等の文献
に記載されているオキシヘモグロビンの吸収波長と一致
する。したがって、本発明の試薬の添加により、血液中
のヘモグロビンはオキシヘモグロビンに転化されている
ことが確認された。

なお、本実施例では試薬添加後13秒から白血球の測定
を開始したが、ヘモグロビンの測定は試薬添加直後から
可能である。シアンメトヘモグロビンでは転化に３〜５
分掛かることに比べると格段に短い時間で測定が完了出
来る。また、白血球を分類せずに白血球数のみを測定す
る場合には、液温等の条件を適宜選べば、試薬添加後数
秒目から白血球の測定を開始できる。

実施例２試薬組成 ◎ポリオキシエチレン系界面活性剤 C₁₆H₃₃−Ｏ−（CH₂CH₂O）₁₄−Ｈ 1.3 g C₁₈H₃₅−Ｏ−（CH₂CH₂O）₁₃−Ｈ 0.17g ◎緩衝剤リン酸水素ナトリウム12水塩 4.0 g Na₂HPO₄・12H₂O ◎浸透圧調整剤塩化ナトリウム 0.4 g NaCl ◎防腐剤（２−ピリジルチオ−１−オキシド） 0.02g ナトリウム ◎水 100 ml 上記組成の試薬を用いて血液を250倍に希釈し、pH7.
5、浸透圧160mOsm、液温40℃の条件化で、試薬添加後50
秒から測定を開始し、６秒間好酸球を測定した結果を第
３図に示す。

第３図の横軸は前述のDC法で測定したときの相対信号
強度を表している。縦軸は各DC信号強度を有する細胞の
度数を表している。

第３図中Ａに示される点線は、好酸球と他の細胞とを
分離するための闘値レベルを表すものである。点線Ａの
右方の集団は好酸球であり、この集団に含まれる細胞数
を数えることにより、好酸球数が求められる。点線Ａの
左方の集団は赤血球のゴーストおよび好酸球以外の白血
球が裸核化されたものである。

第４図は、上記の様にして求めた好酸球数と、従来法
である視算法により求めた好酸球数との相関を示した図
である。第４図の横軸（Ｘ軸）は、視算法により一検体
あたり500個の細胞を計数し、そのうち好酸球であると
識別された細胞の比率（％）を表している。縦軸（Ｙ
軸）は、本発明の試薬を用いて上記の様に自動血液分析
装置によって好酸球数を計数し、自動血液分析装置によ
る公知の方法で計数された白血球数に対する上記好酸球
数の比率（％）を求めたものを表している。測定検体数
は105である。相関計数は0.9453、回帰直線はＹ＝0.914
9×1.0651であった。図中の直線は、回帰直線を表す。
上記のように、従来法との相関は良好であり、本発明の
試薬により好酸球が測定できることが確認された。

なお、本実施例では、DC法と呼ばれる電気的検出方法
により測定したが、その他の電気的検出方法あるいは光
学的検出方法により測定することも可能である。

次に、上記組成の試薬により上記好酸球の測定を行っ
た試料と同一の試料の吸収曲線を測定した例も第２図に
示すとおりである。

なお、本実施例では試薬添加後50秒から好酸球の測定
を開始したが、ヘモグロビンの測定は試薬添加直後から
可能である。シアンメトヘモグロビンでは転化に３〜５
分掛かることに比べると格段に短い時間で測定が完了出
来る。また、測定用試料のpHを高くするほど、より速く
好酸球以外の白血球を裸核化させることができ、好酸球
測定開始までの時間もさらに短縮化できる。なお、好酸
球測定開始が可能となる時間は液温によっても変化す
る。

（発明の効果）本発明の試薬によって、血液中の白血球数およびヘモ
グロビンを同一測定用試料によって同時に測定すること
が可能になった。しかも、ヘモグロビンはオキシヘモグ
ロビン法により測定されるので、試薬の取扱や測定後の
廃液の処理に危険や煩わしさがない。

また、本発明の試薬によって、血液中の白血球の分類
・計数およびオキシヘモグロビン法によるヘモグロビン
の測定を同一測定用試料によって同時に行うことが可能
になった。

さらに、本発明の試薬によれば、試薬添加後直ちにヘ
モグロビンの測定が可能となり、添加後数秒ないし十数
秒で白血球の測定が可能となるので、自動血液分析装置
による測定の高速化に貢献できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例における白血球の分類結果を示す二次
元分布図である。第２図は、実施例におけるヘモグロビンの吸収曲線を示
す図である。なお、第１図における符号ａないしｂは次の意味を有す
る。 a:顆粒球 b:単球 c:リンパ球 d:赤血球ゴースト第３図は、実施例における好酸球の測定結果を示す分布
図である。図中Ａは好酸球と他の細胞とを分離するため
の闘値レベルを示す点線である。第４図は、実施例における好酸球の測定結果と従来法
（視算法）による測定結果との相関を示す図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）一般式 R₁−R₂−（CH₂CH₂O）_ｎ−Ｈ（ここで、R₁は炭素数６〜24のアルキル、アルケニルま
たはアルキニル基;R₂は−Ｏ−、または−COO−;nは６〜50の整数）で表されるポリオキ
シエチレン系ノニオン界面活性剤および（ｂ）水溶液のpHを３〜11にする緩衝剤を含有する水溶性混合物である、血液中の白血球数とヘ
モグロビン濃度を同時に測定する試薬。
【請求項２】水溶液のpHを５〜11にする緩衝剤を含有す
る特許請求の範囲第１項の試薬。
【請求項３】ｎが10〜30の整数であって、R₁が炭素数10
〜20のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基である
特許請求の範囲第１項の試薬。
【請求項４】（ａ）一般式 R₁−R₂−（CH₂CH₂O）_ｎ−Ｈ（ここで、R₁は炭素数６〜24のアルキル、アルケニルま
たはアルキニル基;R₂は−Ｏ−、または−COO−;nは６〜50の整数）で表されるポリオキ
シエチレン系ノニオン界面活性剤および（ｂ）水溶液のpHを３〜11にする緩衝剤を含有する水溶性混合物からなる試薬を用いて、血液中
の白血球数とヘモグロビン濃度を同時に測定する方法。
【請求項５】血液試料と前記試薬を接触させ、ヘモグロ
ビンをオキシヘモグロビンへ転化したのち直ちにヘモグ
ロビンを測定し、前記試薬で処理された血液試料を分析
する特許請求の範囲第４項の方法。
【請求項６】白血球を分類および計数する特許請求の範
囲第４項の方法。
【請求項７】ｎが10〜30の整数であり、R₁が炭素数10〜
20のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基である特
許請求の範囲第６項の方法。
【請求項８】（ａ）一般式 R₁−R₂−（CH₂CH₂O）_ｎ−Ｈ（ここで、R₁は炭素数６〜24のアルキル、アルケニルま
たはアルキニル基;R₂は−Ｏ−、または−COO−;nは６〜50の整数）で表されるポリオキ
シエチレン系ノニオン界面活性剤および（ｂ）水溶液のpHを５〜11にする緩衝剤を含有する水溶性混合物である、赤血球を溶解し、好酸
球以外の白血球を裸核化して好酸球を測定する、血液の
好酸球測定用試薬。
【請求項９】（ａ）一般式 R₁−R₂−（CH₂CH₂O）_ｎ−Ｈ（ここで、R₁は炭素数６〜24のアルキル、アルケニルま
たはアルキニル基;R₂は−Ｏ−、または−COO−;nは６〜50の整数）で表されるポリオキ
シエチレン系ノニオン界面活性剤および（ｂ）水溶液のpHを５〜11にする緩衝剤を含有する水溶性混合物からなる試薬を用いて、赤血球
を溶解し、好酸球以外の白血球を裸核化して好酸球を測
定する、血液中の好酸球を測定する方法。