JPH0534342A - 白血球分類計数用試料調製方法 - Google Patents
白血球分類計数用試料調製方法Info
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- JPH0534342A JPH0534342A JP3188925A JP18892591A JPH0534342A JP H0534342 A JPH0534342 A JP H0534342A JP 3188925 A JP3188925 A JP 3188925A JP 18892591 A JP18892591 A JP 18892591A JP H0534342 A JPH0534342 A JP H0534342A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 フローサイトメータによって白血球を分類計
数するための血液学的試料を調製する。 【構成】 血液学的試料から、白血球の形態を損なうこ
となく他の血球の影響を除去し、染色に適したｐＨに
し、少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を特異的に染色す
る色素であるアストラゾンイエロー３Ｇと少なくとも好
酸球を特異的に染色する色素であるニュートラルレッド
の少なくとも２種類の色素で染色することによって、測
定用試料を調製する。 【効果】 １つの測定用試料をフローサイトメータで測
定することにより、血液学的試料中の白血球を少なくと
も幼若顆粒球群を含む３つまたは６つの群に分類計数で
きる。
数するための血液学的試料を調製する。 【構成】 血液学的試料から、白血球の形態を損なうこ
となく他の血球の影響を除去し、染色に適したｐＨに
し、少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を特異的に染色す
る色素であるアストラゾンイエロー３Ｇと少なくとも好
酸球を特異的に染色する色素であるニュートラルレッド
の少なくとも２種類の色素で染色することによって、測
定用試料を調製する。 【効果】 １つの測定用試料をフローサイトメータで測
定することにより、血液学的試料中の白血球を少なくと
も幼若顆粒球群を含む３つまたは６つの群に分類計数で
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、臨床検査分野におけ
る血球の分類計数に用いる測定用試料の作製方法に関す
るものであり、さらに詳しくはフローサイトメータを用
いて血球を光学的に測定し、白血球を分類計数するため
の測定用試料の調製方法に関するものである。
る血球の分類計数に用いる測定用試料の作製方法に関す
るものであり、さらに詳しくはフローサイトメータを用
いて血球を光学的に測定し、白血球を分類計数するため
の測定用試料の調製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】通常、健常人の末梢血液は、リンパ球、
単球、好中球、好酸球、好塩基球の５種類の白血球を含
む。
単球、好中球、好酸球、好塩基球の５種類の白血球を含
む。
【０００３】これらの白血球は、各々その機能が異なっ
ており、末梢血液中の白血球を種類別に分類計数するこ
とは、種々の病気を診断するうえで有用である。
ており、末梢血液中の白血球を種類別に分類計数するこ
とは、種々の病気を診断するうえで有用である。
【０００４】一方、白血病などの疾患患者の末梢血液に
は、この５種類以外に、通常骨髄に存在し、末梢血液中
には存在しない幼若顆粒球が出現することが知られてい
る。この幼若顆粒球を検出し、分類計数することは、疾
患を診断するうえで極めて重要である。
は、この５種類以外に、通常骨髄に存在し、末梢血液中
には存在しない幼若顆粒球が出現することが知られてい
る。この幼若顆粒球を検出し、分類計数することは、疾
患を診断するうえで極めて重要である。
【０００５】白血球を分類計数するために、従来よりも
最も良く実施されている方法は、血液像鑑定（用手法、
視算法）と呼ばれる方法である。この方法は、血液をス
ライドグラス上に塗抹し、血球を固定染色した標本を作
製したのち、顕微鏡で観察し、１つ１つの白血球の形態
的特徴や染色度合いから観察者が何れの血球であるかを
判定して、分類計数する方法である。通常の検査室で
は、１００−２００個の白血球を分類計数し白血球全体
の数の中に占める各々の白血球の百分率を分類計数値と
している。
最も良く実施されている方法は、血液像鑑定（用手法、
視算法）と呼ばれる方法である。この方法は、血液をス
ライドグラス上に塗抹し、血球を固定染色した標本を作
製したのち、顕微鏡で観察し、１つ１つの白血球の形態
的特徴や染色度合いから観察者が何れの血球であるかを
判定して、分類計数する方法である。通常の検査室で
は、１００−２００個の白血球を分類計数し白血球全体
の数の中に占める各々の白血球の百分率を分類計数値と
している。
【０００６】この方法は、標本作製操作が煩雑であるこ
と、顕微鏡を用いた分類は熟練を必要とし測定者間の測
定差が少なからずあること、計数する白血球数が少ない
ことにより大きな統計学的誤差があること、さらに、測
定者に大きな負担を強いる方法である等の問題がある。
と、顕微鏡を用いた分類は熟練を必要とし測定者間の測
定差が少なからずあること、計数する白血球数が少ない
ことにより大きな統計学的誤差があること、さらに、測
定者に大きな負担を強いる方法である等の問題がある。
【０００７】この為、多数の白血球を自動的に分類計数
することにより、測定精度を高め、省力化を図る測定方
法が強く求められている。近年、この問題を解決するた
めに、フローシステムを用いた自動化装置が市販されて
いる。
することにより、測定精度を高め、省力化を図る測定方
法が強く求められている。近年、この問題を解決するた
めに、フローシステムを用いた自動化装置が市販されて
いる。
【０００８】これらの自動化装置は、測定原理によって
主に３種類の装置に分けられる。
主に３種類の装置に分けられる。
【０００９】第１の装置は、３系統の溶解剤と３種類の
検出部からなるものであり、第１のステップは、第１の
溶解剤で血液試料中の白血球以外の細胞を溶解し、残っ
た白血球のＲＦ信号及びＤＣ信号を測定し、その信号強
度差によって白血球をリンパ球、単球、顆粒球の３つに
分類する。
検出部からなるものであり、第１のステップは、第１の
溶解剤で血液試料中の白血球以外の細胞を溶解し、残っ
た白血球のＲＦ信号及びＤＣ信号を測定し、その信号強
度差によって白血球をリンパ球、単球、顆粒球の３つに
分類する。
【００１０】ここでＲＦ信号及びＤＣ信号は次のように
説明される。
説明される。
【００１１】微細孔をはさんで設けられた、電極間に直
流（ＤＣ）電流を供給し、粒子が微細孔を通過する際の
インピーダンス変化に基づき発生した信号をＤＣ信号と
いい、電極間に数＋ＭＨＺの高周波（ＲＦ）電流を供給
し、粒子が微細孔を通過する際のインピーダンス変化に
基づき発生した信号をＲＦ信号という。もちろん、両電
流を同時に供給し、ＤＣ信号とＲＦ信号の両方を検出す
ることができる。
流（ＤＣ）電流を供給し、粒子が微細孔を通過する際の
インピーダンス変化に基づき発生した信号をＤＣ信号と
いい、電極間に数＋ＭＨＺの高周波（ＲＦ）電流を供給
し、粒子が微細孔を通過する際のインピーダンス変化に
基づき発生した信号をＲＦ信号という。もちろん、両電
流を同時に供給し、ＤＣ信号とＲＦ信号の両方を検出す
ることができる。
【００１２】第２のステップは、第２の溶解剤で血液試
料中の好酸球以外の細胞を溶解し、残った細胞のＤＣ信
号を測定し、その信号強度差によって好酸球のみを分類
計数する。
料中の好酸球以外の細胞を溶解し、残った細胞のＤＣ信
号を測定し、その信号強度差によって好酸球のみを分類
計数する。
【００１３】第３のステップは、第３の溶解剤で血液試
料中の好塩基球以外の細胞を溶解し、残った細胞のＤＣ
信号測定し、その信号強度差によって好塩基球のみを分
類計数する。
料中の好塩基球以外の細胞を溶解し、残った細胞のＤＣ
信号測定し、その信号強度差によって好塩基球のみを分
類計数する。
【００１４】最後に第１のステップで求めた顆粒球か
ら、第２のステップで求めた好酸球と第３のステップで
もとめた好塩基球を減ずることにより、好中球を算出す
る方法である。
ら、第２のステップで求めた好酸球と第３のステップで
もとめた好塩基球を減ずることにより、好中球を算出す
る方法である。
【００１５】第２の装置は、１系統の試薬系と１種類の
検出部からなるものであり、特開平１−５０２５３３号
公報に詳細が述べられているように、白血球を損なうこ
と無く白血球以外の血球を溶解する溶解剤で血液試料を
処理した後に、ＲＦ，ＤＣ，散乱光の３つの信号を同時
に測定し、各信号を適当に組み合わせることにより、白
血球を５つに分類計数する方法である。
検出部からなるものであり、特開平１−５０２５３３号
公報に詳細が述べられているように、白血球を損なうこ
と無く白血球以外の血球を溶解する溶解剤で血液試料を
処理した後に、ＲＦ，ＤＣ，散乱光の３つの信号を同時
に測定し、各信号を適当に組み合わせることにより、白
血球を５つに分類計数する方法である。
【００１６】第３の装置は、２系統の試薬系と２種類の
検出部からなる方法であり、先ず、溶解剤の作用によっ
て血液試料中の白血球以外の血球を溶解し、さらに染色
液によって、ペルオキシダーゼ染色を行った後に、各白
血球の吸光度、散乱光信号を測定し、その強度差によっ
て白血球をリンパ球、単球、好中球、好酸球の４つに分
類計数する。次に、もう１系列の好塩基球以外の細胞を
溶解する溶解剤で血液試料を処理したのちに、２種類の
散乱光を測定し、その信号強度差によって好塩基球を分
類計数する方法である。
検出部からなる方法であり、先ず、溶解剤の作用によっ
て血液試料中の白血球以外の血球を溶解し、さらに染色
液によって、ペルオキシダーゼ染色を行った後に、各白
血球の吸光度、散乱光信号を測定し、その強度差によっ
て白血球をリンパ球、単球、好中球、好酸球の４つに分
類計数する。次に、もう１系列の好塩基球以外の細胞を
溶解する溶解剤で血液試料を処理したのちに、２種類の
散乱光を測定し、その信号強度差によって好塩基球を分
類計数する方法である。
【００１７】これらの、自動化のための方法はすべて、
前述の用手法の問題を一応解決しており、特に精度の点
では用手法の精度を遙に上回る結果が得られており、臨
床検査の分野においてはほぼ満足のいく性能を有してい
る。
前述の用手法の問題を一応解決しており、特に精度の点
では用手法の精度を遙に上回る結果が得られており、臨
床検査の分野においてはほぼ満足のいく性能を有してい
る。
【００１８】しかし、これらの方法は全て、幼若顆粒球
のみを特徴的に分類計数する方法を持たないために、幼
若顆粒球の出現している試料においては分類結果が不正
確になる、または、幼若顆粒球の存在そのものを検出で
きないという問題を有している。市販されている装置に
おいては、幼若顆粒球の出現によって生じるスキャッタ
グラムの異常を検出し、アブノーマル、あるいはサスペ
クトフラグ等の警告を発することにより、測定者に用手
法による再検査を促すようになっており、異常の見逃し
を極力減少するよう努力されている。但し、この場合は
検査を再度行う必要があり、省力化の目的が完全に達成
されていないという問題がある。
のみを特徴的に分類計数する方法を持たないために、幼
若顆粒球の出現している試料においては分類結果が不正
確になる、または、幼若顆粒球の存在そのものを検出で
きないという問題を有している。市販されている装置に
おいては、幼若顆粒球の出現によって生じるスキャッタ
グラムの異常を検出し、アブノーマル、あるいはサスペ
クトフラグ等の警告を発することにより、測定者に用手
法による再検査を促すようになっており、異常の見逃し
を極力減少するよう努力されている。但し、この場合は
検査を再度行う必要があり、省力化の目的が完全に達成
されていないという問題がある。
【００１９】一方、これらの方法とは別に、血液学的試
料に蛍光染色を施した測定用試料中の各々白血球の蛍光
あるいは、散乱光をフローサイトメータで測定し、白血
球分類を行う方法が幾つか報告されている。これらのう
ち主なものは、特公昭５９−８５３号公報、特開昭−５
０−２０８２０号公報、特開昭６３−７０１６６号公報
に記載されたものである。
料に蛍光染色を施した測定用試料中の各々白血球の蛍光
あるいは、散乱光をフローサイトメータで測定し、白血
球分類を行う方法が幾つか報告されている。これらのう
ち主なものは、特公昭５９−８５３号公報、特開昭−５
０−２０８２０号公報、特開昭６３−７０１６６号公報
に記載されたものである。
【００２０】我々は、特開昭６３−１３４９５７号（発
明の名称「フローサイトメトリーによる白血球の分類計
数方法」）、特開昭６３−１３４９５８号（発明の名称
「フローサイトメトリーによる白血球の分類方法および
試薬」）の各公報においても上述のフローサイトメータ
を用いた白血球分類法の問題を示している。
明の名称「フローサイトメトリーによる白血球の分類計
数方法」）、特開昭６３−１３４９５８号（発明の名称
「フローサイトメトリーによる白血球の分類方法および
試薬」）の各公報においても上述のフローサイトメータ
を用いた白血球分類法の問題を示している。
【００２１】さて、一般に、図１に示すような市販され
ているフローサイトメータで、適当な方法により血液学
的試料から白血球以外の血球成分の影響を除去した測定
用試料を、測定した場合、図２に示すようなスキャッタ
グラム（散布図）が得られ、主に側方散乱光の強度差に
よって、白血球はリンパ球１′、単球２′、顆粒球３′
からなる３つの副集団に分離され、個々の副集団を容易
に分類計数できることは、既知の事実である。さらに、
前述の蛍光染色法を組み合わせることにより、顆粒球を
好酸球、好塩基球、好中球の副集団に分離することも、
既に可能である。
ているフローサイトメータで、適当な方法により血液学
的試料から白血球以外の血球成分の影響を除去した測定
用試料を、測定した場合、図２に示すようなスキャッタ
グラム（散布図）が得られ、主に側方散乱光の強度差に
よって、白血球はリンパ球１′、単球２′、顆粒球３′
からなる３つの副集団に分離され、個々の副集団を容易
に分類計数できることは、既知の事実である。さらに、
前述の蛍光染色法を組み合わせることにより、顆粒球を
好酸球、好塩基球、好中球の副集団に分離することも、
既に可能である。
【００２２】我々もまた、すでに特開昭６３−１３４９
５８号において、フローサイトメータを用いて白血球を
５つの副集団に分離し、個々の副集団を分類計数するた
めの方法および試薬を開示している。この方法におい
て、アストラゾンイエロー３Ｇは好酸球と好塩基球を特
異的に蛍光染色する。継続的な研究の結果我々は、アス
トラゾンイエロー３Ｇがさらに、幼若顆粒球群をも特異
的に染色し、図３に示すように、好酸球と同程度に特異
的な蛍光を発生せしめることを発見した。なお、１′，
２′，３′，４′，５′はリンパ球、単球、好中球、好
酸球と幼若顆粒球、好塩基球の各群を示している。
５８号において、フローサイトメータを用いて白血球を
５つの副集団に分離し、個々の副集団を分類計数するた
めの方法および試薬を開示している。この方法におい
て、アストラゾンイエロー３Ｇは好酸球と好塩基球を特
異的に蛍光染色する。継続的な研究の結果我々は、アス
トラゾンイエロー３Ｇがさらに、幼若顆粒球群をも特異
的に染色し、図３に示すように、好酸球と同程度に特異
的な蛍光を発生せしめることを発見した。なお、１′，
２′，３′，４′，５′はリンパ球、単球、好中球、好
酸球と幼若顆粒球、好塩基球の各群を示している。
【００２３】しかし、この方法においては、好酸球と幼
若顆粒球とは蛍光強度ならびに、蛍光波長において等価
であり、且つ、側方散乱光信号強度においても等価であ
るがゆえに、幼若顆粒球と好酸球を個々の副集団に分離
することはできなかった。
若顆粒球とは蛍光強度ならびに、蛍光波長において等価
であり、且つ、側方散乱光信号強度においても等価であ
るがゆえに、幼若顆粒球と好酸球を個々の副集団に分離
することはできなかった。
【００２４】さらに、我々は、特開昭６３−１３４９５
７号において、好酸球を特異的に染色する色素ニュート
ラルレッドと、好塩基球を特異的に染色する色素アスト
ラゾンオレンジＧを組み合わせることにより、白血球を
５つに分類する方法を開示している。この方法において
もまた、幼若顆粒球を特異的に染色することはできず好
中球と幼若顆粒球を分画することはできなかった。
７号において、好酸球を特異的に染色する色素ニュート
ラルレッドと、好塩基球を特異的に染色する色素アスト
ラゾンオレンジＧを組み合わせることにより、白血球を
５つに分類する方法を開示している。この方法において
もまた、幼若顆粒球を特異的に染色することはできず好
中球と幼若顆粒球を分画することはできなかった。
【００２５】また、一方、幼若顆粒球を含む全ての白血
球をベイシックオレンジ（Ｂａｓｉｃ Ｏｒａｎｇｅ）
２１で蛍光染色したのちに、蛍光顕微鏡をもちいる用手
法で、白血球分類計数を行う方法が米国特許４，５０
０，５０９号公報に開示されているが、この方法は、前
述した用手法の問題を解決しておらず、自動化測定方法
を提供するものではない。
球をベイシックオレンジ（Ｂａｓｉｃ Ｏｒａｎｇｅ）
２１で蛍光染色したのちに、蛍光顕微鏡をもちいる用手
法で、白血球分類計数を行う方法が米国特許４，５０
０，５０９号公報に開示されているが、この方法は、前
述した用手法の問題を解決しておらず、自動化測定方法
を提供するものではない。
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】前述したように、本発
明は従来の自動化法では実施不可能であった幼若顆粒球
を特徴的に検出し、幼若顆粒球を分類計数すること、な
らびに、幼若顆粒球の分類計数ならびに幼若顆粒球の分
類計数を含む白血球分類計数を行うためのフローサイト
メータ測定用試料の調製方法を提供することを課題とす
る。
明は従来の自動化法では実施不可能であった幼若顆粒球
を特徴的に検出し、幼若顆粒球を分類計数すること、な
らびに、幼若顆粒球の分類計数ならびに幼若顆粒球の分
類計数を含む白血球分類計数を行うためのフローサイト
メータ測定用試料の調製方法を提供することを課題とす
る。
【００２７】
【課題を解決するための手段】上記目的は、好塩基球、
幼若顆粒球を特異的に染色するアストラゾンイエロー３
Ｇと、好酸球を特異的に染色し且つアストラゾンイエロ
ー３Ｇによる好酸球特異染色を抑制するニュートラルレ
ッドを、染色に適したｐＨで白血球に作用させ、好塩基
球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に蛍光染色することに
より実施できる。
幼若顆粒球を特異的に染色するアストラゾンイエロー３
Ｇと、好酸球を特異的に染色し且つアストラゾンイエロ
ー３Ｇによる好酸球特異染色を抑制するニュートラルレ
ッドを、染色に適したｐＨで白血球に作用させ、好塩基
球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に蛍光染色することに
より実施できる。
【００２８】以下の説明は、通常血液学的試料中に存在
する血小板、赤血球を適当な方法で除去した試料の場合
について説明する。
する血小板、赤血球を適当な方法で除去した試料の場合
について説明する。
【００２９】本発明独自の基本的原理は、２つの色素の
作用によって説明される。まず、アストラゾンイエロー
３Ｇのみで試料を染色した場合、アストラゾンイエロー
３Ｇは好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に蛍光染
色する。フローサイトメータで測定し、図４に示すよう
に、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラム、を描くと、白血球は緑蛍光強度あるいは赤蛍光
強度の差によって、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球〔Ｉ
ｍ〕、好酸球〔Ｅｏ〕からなる副集団と、他の白血球
〔Ａ１〕からなる副集団の２つの副集団に分離すること
ができる。あるいは図５に示すように、側方散乱強度と
緑蛍光強度あるいは赤蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムを描くと、白血球は、緑蛍光強度あるいは赤蛍
光強度と側方散乱光強度の差によって好塩基球〔Ｂａ〕
からなる副集団と、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕、好酸球〔Ｅ
ｏ〕からなる副集団と、他の白血球〔Ａ２〕からなる副
集団の３つの副集団に分離できるが、何れにしても幼若
顆粒球のみを分類計数することはできない。
作用によって説明される。まず、アストラゾンイエロー
３Ｇのみで試料を染色した場合、アストラゾンイエロー
３Ｇは好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に蛍光染
色する。フローサイトメータで測定し、図４に示すよう
に、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラム、を描くと、白血球は緑蛍光強度あるいは赤蛍光
強度の差によって、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球〔Ｉ
ｍ〕、好酸球〔Ｅｏ〕からなる副集団と、他の白血球
〔Ａ１〕からなる副集団の２つの副集団に分離すること
ができる。あるいは図５に示すように、側方散乱強度と
緑蛍光強度あるいは赤蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムを描くと、白血球は、緑蛍光強度あるいは赤蛍
光強度と側方散乱光強度の差によって好塩基球〔Ｂａ〕
からなる副集団と、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕、好酸球〔Ｅ
ｏ〕からなる副集団と、他の白血球〔Ａ２〕からなる副
集団の３つの副集団に分離できるが、何れにしても幼若
顆粒球のみを分類計数することはできない。
【００３０】一方ニュートラルレッドのみで試料を染色
した場合、ニュートラルレッドは好酸球のみを特異的に
赤蛍光染色する。フローサイトメータで測定し、図６に
示すような赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムあるいは、図７に示すような側方散乱光強
度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描く
と赤蛍光強度の差によって、好酸球〔Ｅｏ〕からなる副
集団と他の白血球〔Ａ２〕からなる副集団との分離が可
能となるが幼若顆粒球を分離することはできない。
した場合、ニュートラルレッドは好酸球のみを特異的に
赤蛍光染色する。フローサイトメータで測定し、図６に
示すような赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムあるいは、図７に示すような側方散乱光強
度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描く
と赤蛍光強度の差によって、好酸球〔Ｅｏ〕からなる副
集団と他の白血球〔Ａ２〕からなる副集団との分離が可
能となるが幼若顆粒球を分離することはできない。
【００３１】本発明の方法である、アストラゾンイエロ
ー３Ｇとニュートラルレッドの共存下で、試料を蛍光染
色した場合、アストラゾンイエロー３Ｇは好塩基球と幼
若顆粒球のみを特異的に蛍光染色する。アストラゾンイ
エロー３Ｇによる好酸球染色は、ニュートラルレッドの
作用により抑制され、特異的な緑蛍光強度の差を生じな
いが、好酸球はニュートラルレッドによって特異的に赤
蛍光染色される。フローサイトメータで測定し、図８に
示すように、緑蛍光強度と側方散乱光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムを描くと，白血球は、好塩基球〔Ｂ
ａ〕からなる副集団と、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕からなる副
集団とその他の白血球〔Ａ３〕からなる副集団の３つの
副集団に分離される。
ー３Ｇとニュートラルレッドの共存下で、試料を蛍光染
色した場合、アストラゾンイエロー３Ｇは好塩基球と幼
若顆粒球のみを特異的に蛍光染色する。アストラゾンイ
エロー３Ｇによる好酸球染色は、ニュートラルレッドの
作用により抑制され、特異的な緑蛍光強度の差を生じな
いが、好酸球はニュートラルレッドによって特異的に赤
蛍光染色される。フローサイトメータで測定し、図８に
示すように、緑蛍光強度と側方散乱光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムを描くと，白血球は、好塩基球〔Ｂ
ａ〕からなる副集団と、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕からなる副
集団とその他の白血球〔Ａ３〕からなる副集団の３つの
副集団に分離される。
【００３２】また、図９に示すような赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描くと、赤あ
るいは緑蛍光強度の差によって白血球は好塩基球〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕からなる副集団と、好酸球
〔Ｅｏ〕からなる副集団と、その他の血球〔Ａ４〕から
なる副集団の３つの副集団に分離することが可能とな
る。各色素の染色機序は明確となっていないが、恐らく
以下の染色機序によると推定される。まず、個々の白血
球は、以下に示す物質を含有していることは、既知であ
る。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描くと、赤あ
るいは緑蛍光強度の差によって白血球は好塩基球〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕からなる副集団と、好酸球
〔Ｅｏ〕からなる副集団と、その他の血球〔Ａ４〕から
なる副集団の３つの副集団に分離することが可能とな
る。各色素の染色機序は明確となっていないが、恐らく
以下の染色機序によると推定される。まず、個々の白血
球は、以下に示す物質を含有していることは、既知であ
る。
【００３３】１．好塩基球は、好塩基性顆粒中にヘパリ
ン、等の酸性ムコ多糖類を有する。 ２．幼若顆粒球は、１次顆粒中にムコ多糖類を有する。
ン、等の酸性ムコ多糖類を有する。 ２．幼若顆粒球は、１次顆粒中にムコ多糖類を有する。
【００３４】３．好酸球は、好酸性顆粒中に好酸球に特
有の強塩基性物質を有する。
有の強塩基性物質を有する。
【００３５】アストラゾンイエロー３Ｇは１，２項のム
コ多糖類を特異的に染色し、ニュートラルレッドは３項
の強塩基性物質を特異的に染色し、フローサイトメータ
で蛍光強度を測定した場合に、他の血球と分離可能な蛍
光強度の差を生じると推察される。
コ多糖類を特異的に染色し、ニュートラルレッドは３項
の強塩基性物質を特異的に染色し、フローサイトメータ
で蛍光強度を測定した場合に、他の血球と分離可能な蛍
光強度の差を生じると推察される。
【００３６】上述のように、幼若顆粒球、好塩基球、好
酸球は特異的な蛍光によって分離することができるが、
血液試料中のリンパ球、単球、好中球は上記の物質をほ
とんど含まないがゆえに、特異的な染色が行われない。
但し、アストラゾンイエロー３Ｇは、リンパ球、単球、
好中球に含まれる顆粒を非特異的に弱く染色するため
に、これらの白血球も弱い蛍光を発するが、蛍光強度で
これらの白血球を分離することは、困難である。このた
め、これらの白血球を分離するためには、例えば、図１
０にしめすように、赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸と
するスキャッタグラムを描き、ウィンド１〔Ｗ１〕でリ
ンパ球、単球、好中球〔Ｌｙｍ＋Ｍｏｎｏ＋Ｎｅｕｔ〕
のみからなる副集団のデータを取り出し図１１に示すよ
うに、側方散乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度とのスキ
ャッタグラムを描くと、リンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍ
ｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕は、主に側方散乱光強度
差によって、各々、個々の白血球からなる３つの副集団
に分離できる。
酸球は特異的な蛍光によって分離することができるが、
血液試料中のリンパ球、単球、好中球は上記の物質をほ
とんど含まないがゆえに、特異的な染色が行われない。
但し、アストラゾンイエロー３Ｇは、リンパ球、単球、
好中球に含まれる顆粒を非特異的に弱く染色するため
に、これらの白血球も弱い蛍光を発するが、蛍光強度で
これらの白血球を分離することは、困難である。このた
め、これらの白血球を分離するためには、例えば、図１
０にしめすように、赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸と
するスキャッタグラムを描き、ウィンド１〔Ｗ１〕でリ
ンパ球、単球、好中球〔Ｌｙｍ＋Ｍｏｎｏ＋Ｎｅｕｔ〕
のみからなる副集団のデータを取り出し図１１に示すよ
うに、側方散乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度とのスキ
ャッタグラムを描くと、リンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍ
ｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕は、主に側方散乱光強度
差によって、各々、個々の白血球からなる３つの副集団
に分離できる。
【００３７】一般にスキャッタグラム上の個々の副集団
をウィンドと呼ばれる領域で囲むによって取り出す操作
は、ゲーティングとよばれており、一般のフローサイト
メータで用いられる方法である。
をウィンドと呼ばれる領域で囲むによって取り出す操作
は、ゲーティングとよばれており、一般のフローサイト
メータで用いられる方法である。
【００３８】また、分離された個々の白血球副集団をウ
ィンドで囲み、ウィンド内の細胞数を計数することによ
り、個々の白血球の副集団の数を計数することができ
る。
ィンドで囲み、ウィンド内の細胞数を計数することによ
り、個々の白血球の副集団の数を計数することができ
る。
【００３９】例えば、図８の幼若顆粒球〔Ｉｍ〕の副集
団をウィンドで囲みその個数を計数することにより、幼
若顆粒球の数を計数することができる。同様に各々分離
された白血球副集団をウィンドで囲むことにより、その
白血球副集団の数を計数することができる。
団をウィンドで囲みその個数を計数することにより、幼
若顆粒球の数を計数することができる。同様に各々分離
された白血球副集団をウィンドで囲むことにより、その
白血球副集団の数を計数することができる。
【００４０】次に、一般の臨床検査室で測定される血液
学的試料は、末梢血液であり、白血球以外の血球、主
に、赤血球を含んでいる。赤血球が測定試料中に含まれ
る場合、次のような影響がある。
学的試料は、末梢血液であり、白血球以外の血球、主
に、赤血球を含んでいる。赤血球が測定試料中に含まれ
る場合、次のような影響がある。
【００４１】赤血球の影響
通常、白血球の１０００倍程度の個数の赤血球が血液試
料中に存在するが、上述の染色法では染色されず蛍光を
殆ど発しないため、特異的な蛍光を発する幼若顆粒球、
好酸球、好塩基球の分類計数に影響を及ぼすことはな
い。
料中に存在するが、上述の染色法では染色されず蛍光を
殆ど発しないため、特異的な蛍光を発する幼若顆粒球、
好酸球、好塩基球の分類計数に影響を及ぼすことはな
い。
【００４２】しかし、さらに他の特異的な蛍光を発しな
い他の白血球（特にリンパ球）を分類計数する場合は、
問題となる。例えば、前方散乱光強度あるいは、側方散
乱光信号強度で、リンパ球と赤血球を完全に分離するこ
とはできず、正確な白血球分類結果を得ることはできな
い。
い他の白血球（特にリンパ球）を分類計数する場合は、
問題となる。例えば、前方散乱光強度あるいは、側方散
乱光信号強度で、リンパ球と赤血球を完全に分離するこ
とはできず、正確な白血球分類結果を得ることはできな
い。
【００４３】さらに、多量に存在する赤血球は、フロー
サイトメータの検出部において、白血球と同時通過する
ことにより、白血球の散乱光信号強度を不正確にし、散
乱光によるリンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、顆
粒球〔Ｇｒａｎｕｌ〕の分離を困難にする。赤血球の同
時通過がある場合の白血球散乱光強度分布を図１２に示
す。一点鎖線で囲まれた領域〔Ｒ〕は赤血球の分布位置
を示す。赤血球とリンパ球の前方散乱光強度並びに側方
散乱光強度は等しく、分離できないことがわかる。さら
に赤血球の影響を除去した試料を測定したスキャッタグ
ラム図２と比較して、各白血球の側方散乱光強度の分布
がひろがっており、各白血球の副集団の分離が困難とな
る。このため、正確な分類結果を得ためには、血液試料
中の赤血球の影響を除去するための工程が必要となる。
血液試料中の赤血球を除去するために種々の既知の方法
があるが、操作が煩雑である、あるいは白血球の染色を
阻害する等の問題がある。
サイトメータの検出部において、白血球と同時通過する
ことにより、白血球の散乱光信号強度を不正確にし、散
乱光によるリンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、顆
粒球〔Ｇｒａｎｕｌ〕の分離を困難にする。赤血球の同
時通過がある場合の白血球散乱光強度分布を図１２に示
す。一点鎖線で囲まれた領域〔Ｒ〕は赤血球の分布位置
を示す。赤血球とリンパ球の前方散乱光強度並びに側方
散乱光強度は等しく、分離できないことがわかる。さら
に赤血球の影響を除去した試料を測定したスキャッタグ
ラム図２と比較して、各白血球の側方散乱光強度の分布
がひろがっており、各白血球の副集団の分離が困難とな
る。このため、正確な分類結果を得ためには、血液試料
中の赤血球の影響を除去するための工程が必要となる。
血液試料中の赤血球を除去するために種々の既知の方法
があるが、操作が煩雑である、あるいは白血球の染色を
阻害する等の問題がある。
【００４４】白血球染色を行ううえでの問題点は、特開
昭６３−１３４９５７号、特開昭６３−１３４９５８号
各公報に詳細に述べられている。さらに、各公報は白血
球染色を行う上での赤血球の影響を除去するための方法
を開示している。これらの方法は、予期せぬことに本質
的な変更なしに、本発明の方法における蛍光染色法に適
用することが出来る。
昭６３−１３４９５７号、特開昭６３−１３４９５８号
各公報に詳細に述べられている。さらに、各公報は白血
球染色を行う上での赤血球の影響を除去するための方法
を開示している。これらの方法は、予期せぬことに本質
的な変更なしに、本発明の方法における蛍光染色法に適
用することが出来る。
【００４５】以下にその方法について説明する。
【００４６】赤血球の影響を除去するための第１の工程
赤血球のみを断片化する方法を用いて、赤血球の散乱光
強度を低下し、赤血球と白血球との同時通過による白血
球の散乱光への影響を除去すると同時に、断片化した赤
血球と白血球との（特にリンパ球との）分離を可能とす
るための工程である。
強度を低下し、赤血球と白血球との同時通過による白血
球の散乱光への影響を除去すると同時に、断片化した赤
血球と白血球との（特にリンパ球との）分離を可能とす
るための工程である。
【００４７】白血球染色に影響を与えることなく赤血球
を断片化するためには、以下の工程で血液学的試料を処
理する。まず、血液学的試料を酸性の低張条件下におく
ことにより、赤血球は断片される。具体的にはゴースト
化されたのち、断片化される。赤血球の溶解が終了した
時点で、ｐＨ、浸透圧を白血球に損傷を与えない条件に
することにより、白血球に損傷を与えること無く赤血球
を断片化することができる。
を断片化するためには、以下の工程で血液学的試料を処
理する。まず、血液学的試料を酸性の低張条件下におく
ことにより、赤血球は断片される。具体的にはゴースト
化されたのち、断片化される。赤血球の溶解が終了した
時点で、ｐＨ、浸透圧を白血球に損傷を与えない条件に
することにより、白血球に損傷を与えること無く赤血球
を断片化することができる。
【００４８】この結果赤血球散乱光強度は、リンパ球の
１／２〜１／３となり、事実上赤血球と白血球の同時通
過は、無視しうるものとなる。
１／２〜１／３となり、事実上赤血球と白血球の同時通
過は、無視しうるものとなる。
【００４９】この方法を前述の染色法に適用した場合、
白血球の散乱光強度は非常に正確に測定できる。例え
ば、図１３に示すように赤蛍光強度−緑蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムで、好酸球〔Ｅｏ〕以外の白
血球〔Ａ５〕の副集団のデータをウィンド２〔Ｗ２〕に
よって取り出し、図１４に示すように赤蛍光強度あるい
は緑蛍光強度と側方散乱光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムを描くと、他の白血球〔Ａ５〕は、好塩基球
〔Ｂａ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、リ
ンパ球と断片化した赤血球からなる群〔Ａ６〕と、以外
なことに、幼若顆粒球は２つの群〔Ｉｍ１〕、〔Ｉｍ
２〕の６つの副集団に分離された。各白血球の副集団を
ウィンドで囲み計数することにより、６つの白血球の副
集団の分類計数が可能である。
白血球の散乱光強度は非常に正確に測定できる。例え
ば、図１３に示すように赤蛍光強度−緑蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムで、好酸球〔Ｅｏ〕以外の白
血球〔Ａ５〕の副集団のデータをウィンド２〔Ｗ２〕に
よって取り出し、図１４に示すように赤蛍光強度あるい
は緑蛍光強度と側方散乱光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムを描くと、他の白血球〔Ａ５〕は、好塩基球
〔Ｂａ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、リ
ンパ球と断片化した赤血球からなる群〔Ａ６〕と、以外
なことに、幼若顆粒球は２つの群〔Ｉｍ１〕、〔Ｉｍ
２〕の６つの副集団に分離された。各白血球の副集団を
ウィンドで囲み計数することにより、６つの白血球の副
集団の分類計数が可能である。
【００５０】また、図１５に示すように、前方散乱光強
度の差に着目して、ウィンド３〔Ｗ３〕により、断片化
した赤血球と血小板からなる副集団〔Ａ７〕を除去して
白血球のみの副集団〔Ａ８〕のデータのみをとりだした
のち、赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラム図１６を描くと、白血球は好酸球〔Ｅｏ〕とそ
の他の白血球の副集団〔Ａ９〕とに分離される。さらに
副集団〔Ａ９〕を、ウィンド４〔Ｗ４〕によってとりだ
し、図１７に示すように、側方散乱光強度と赤蛍光強度
あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを
描くと、他の白血球の集団〔Ａ９〕はリンパ球〔Ｌｙ
ｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基
球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群
２〔Ｉｍ２〕の６つの副集団に分離される。この場合
は、７つの白血球の副集団の分類計数が可能である。
度の差に着目して、ウィンド３〔Ｗ３〕により、断片化
した赤血球と血小板からなる副集団〔Ａ７〕を除去して
白血球のみの副集団〔Ａ８〕のデータのみをとりだした
のち、赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラム図１６を描くと、白血球は好酸球〔Ｅｏ〕とそ
の他の白血球の副集団〔Ａ９〕とに分離される。さらに
副集団〔Ａ９〕を、ウィンド４〔Ｗ４〕によってとりだ
し、図１７に示すように、側方散乱光強度と赤蛍光強度
あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを
描くと、他の白血球の集団〔Ａ９〕はリンパ球〔Ｌｙ
ｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基
球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群
２〔Ｉｍ２〕の６つの副集団に分離される。この場合
は、７つの白血球の副集団の分類計数が可能である。
【００５１】赤血球の影響を除去するための第２の工程
前述のアストラゾンイエロー３Ｇあるいはニュートラル
レッドで染色されない白血球（特にリンパ球）と赤血球
を分離するために、白血球のみを非特異的に染色するた
めの第３の色素を白血球に作用させ、白血球のみを染色
し、蛍光強度の差によって、赤血球と白血球を分離する
方法である。
レッドで染色されない白血球（特にリンパ球）と赤血球
を分離するために、白血球のみを非特異的に染色するた
めの第３の色素を白血球に作用させ、白血球のみを染色
し、蛍光強度の差によって、赤血球と白血球を分離する
方法である。
【００５２】この目的のために使用される蛍光色素は、
アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドよる特
異染色を阻害せず赤血球に存在せず白血球にのみ存在す
る物質を染色する色素が選ばれる。白血球のみに存在す
る成分は核あるいは、細胞質であり、赤血球には、核あ
るいは細胞質は存在しない。
アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドよる特
異染色を阻害せず赤血球に存在せず白血球にのみ存在す
る物質を染色する色素が選ばれる。白血球のみに存在す
る成分は核あるいは、細胞質であり、赤血球には、核あ
るいは細胞質は存在しない。
【００５３】つまり、この目的のためには、白血球中に
含まれる核あるいは、細胞質あるいは、両方の物質を染
色する色素が選ばれる。この目的に合う好適な色素は以
下の色素である。
含まれる核あるいは、細胞質あるいは、両方の物質を染
色する色素が選ばれる。この目的に合う好適な色素は以
下の色素である。
【００５４】（１） アストラゾンオレンジＲ
（２） アストラバイオレット（ＣＩ Ｎｏ．４８０７
０，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２） （３） ローダミン６Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．４５１６０） （４） ローダミン１９ （５） ローダミンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５１７０，Ｂａ
ｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ１０） （６） ローダミン３ＧＯ（ＣＩ Ｎｏ．４５２１０，
Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ３） （７） ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５０１０） （８） シアノシン （９） ３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４８０
２０，Ｂａｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ ７） これらの色素は、我々が実験において効果を確認した色
素であって、これ以外の色素の使用を否定するものでは
ない。上述した条件を満たしておれば使用可能である。
０，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２） （３） ローダミン６Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．４５１６０） （４） ローダミン１９ （５） ローダミンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５１７０，Ｂａ
ｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ１０） （６） ローダミン３ＧＯ（ＣＩ Ｎｏ．４５２１０，
Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ３） （７） ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５０１０） （８） シアノシン （９） ３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４８０
２０，Ｂａｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ ７） これらの色素は、我々が実験において効果を確認した色
素であって、これ以外の色素の使用を否定するものでは
ない。上述した条件を満たしておれば使用可能である。
【００５５】この方法を前述の染色法と併用した場合、
最終的には、白血球を少なくとも好酸球、幼若顆粒球、
好塩基球、好中球、単球、リンパ球の６つの副集団に分
離でき、個々に分類計数することができる。例えば、図
１８に示すように赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムを描くと、白血球以外の副集団〔Ａ
１０〕，好酸球〔Ｅｏ〕の副集団、好酸球以外の白血球
の副集団〔Ａ１１〕の３つの副集団が発生し、好酸球の
分類計数が可能である。
最終的には、白血球を少なくとも好酸球、幼若顆粒球、
好塩基球、好中球、単球、リンパ球の６つの副集団に分
離でき、個々に分類計数することができる。例えば、図
１８に示すように赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムを描くと、白血球以外の副集団〔Ａ
１０〕，好酸球〔Ｅｏ〕の副集団、好酸球以外の白血球
の副集団〔Ａ１１〕の３つの副集団が発生し、好酸球の
分類計数が可能である。
【００５６】さらに、ウィンド５〔Ｗ５〕によって好酸
球以外の白血球のみの副集団〔Ａ１１〕のデータをとり
だし、図１９に示すように側方散乱光強度と赤あるいは
緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描くと白
血球の副集団〔Ａ１１〕はリンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球
〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂａｓ
ｏ〕、幼若顆粒球群〔Ｉｍ〕の５つの副集団に分離され
個々の白血球を分類計数することができる。
球以外の白血球のみの副集団〔Ａ１１〕のデータをとり
だし、図１９に示すように側方散乱光強度と赤あるいは
緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描くと白
血球の副集団〔Ａ１１〕はリンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球
〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂａｓ
ｏ〕、幼若顆粒球群〔Ｉｍ〕の５つの副集団に分離され
個々の白血球を分類計数することができる。
【００５７】但し、本法では、赤血球の同時通過によっ
て白血球の散乱光強度が若干不正確になる現象を抑制す
ることはできず、幼若顆粒球を２つに分画することは困
難である。
て白血球の散乱光強度が若干不正確になる現象を抑制す
ることはできず、幼若顆粒球を２つに分画することは困
難である。
【００５８】赤血球の影響を除去するための第３の方法
上述した、２つの赤血球を除去する工程は、本質的に変
更することなく同時にあるいは別々に前述の白血球染色
に適用することができる。この場合、リンパ球を含む全
ての白血球は蛍光強度の差によって他の血球と分離可能
であり、且つ白血球の側方散乱光は正確に測定できる。
その結果、図２０に示すように赤蛍光強度と緑蛍光強度
を座標軸とするスキャッタグラムを描くと、白血球以外
の副集団〔Ａ１２〕、好酸球の副集団〔Ｅｏ〕、好酸球
以外の白血球の副集団〔Ａ１３〕の３つの副集団を発生
し、好酸球の分類計数が可能である。
更することなく同時にあるいは別々に前述の白血球染色
に適用することができる。この場合、リンパ球を含む全
ての白血球は蛍光強度の差によって他の血球と分離可能
であり、且つ白血球の側方散乱光は正確に測定できる。
その結果、図２０に示すように赤蛍光強度と緑蛍光強度
を座標軸とするスキャッタグラムを描くと、白血球以外
の副集団〔Ａ１２〕、好酸球の副集団〔Ｅｏ〕、好酸球
以外の白血球の副集団〔Ａ１３〕の３つの副集団を発生
し、好酸球の分類計数が可能である。
【００５９】さらに、副集団〔Ａ１３〕のデータをウィ
ンド６〔Ｗ６〕で取り出し、図２１に示す側方散乱光強
度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグ
ラムを描くとリンパ〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好
中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂａｓｏ〕，幼若顆粒球
群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕の６つの副
集団を発生し、個々の白血球を分類計数することができ
る。
ンド６〔Ｗ６〕で取り出し、図２１に示す側方散乱光強
度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグ
ラムを描くとリンパ〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好
中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂａｓｏ〕，幼若顆粒球
群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕の６つの副
集団を発生し、個々の白血球を分類計数することができ
る。
【００６０】本法において用いられる色素の構造は、以
下に示される。
下に示される。
【００６１】アストラゾンイエロー３Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．
４８，０５５，ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ １
１）
４８，０５５，ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｙｅｌｌｏｗ １
１）
【００６２】
【００６３】ニュートラルレッド（ＣＩ Ｎｏ．５０，
０４０，ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ５）
０４０，ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ５）
【００６４】
【００６５】アストラゾンオレンジＲ（ＣＩ Ｎｏ．４
８，０４０，ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ２２）
８，０４０，ＣＩ Ｂａｓｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ２２）
【００６６】
【００６７】アストラゾンバイオレット（ＣＩ Ｎｏ．
４８，０７０，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２）
４８，０７０，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２）
【００６８】
【００６９】ローダミン６Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．４５，１６
０）
０）
【００７０】
【００７１】ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５，０１０）
【００７２】
【００７３】シアノシン
【００７４】
【００７５】３，３′−ジメチルチオカルボシアニン
アイオダイド
アイオダイド
【００７６】
【００７７】式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−ＣＨ3 ， Ｒ2 ：
−Ｓ− ３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイオダイド 式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−Ｃ2 Ｈ5 ， Ｒ2 ：−Ｓ− ３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン アイオダ
イド 式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−Ｃ3 Ｈ7 ， Ｒ2 ：−Ｏ− ３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン アイオダ
イド 式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−Ｃ6 Ｈ13， Ｒ2 ：−Ｏ− ３，６ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデシルアクリ
ジニウム ブロマイド
−Ｓ− ３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイオダイド 式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−Ｃ2 Ｈ5 ， Ｒ2 ：−Ｓ− ３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン アイオダ
イド 式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−Ｃ3 Ｈ7 ， Ｒ2 ：−Ｏ− ３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン アイオダ
イド 式（ＩＩ）中、Ｒ1 ：−Ｃ6 Ｈ13， Ｒ2 ：−Ｏ− ３，６ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデシルアクリ
ジニウム ブロマイド
【００７８】
【００７９】７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオ
キサジアゾール
キサジアゾール
【００８０】
【００８１】７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジ
アゾール
アゾール
【００８２】
【００８３】アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４
８，０２０，ＢａｓｉｃＶｉｏｌｅｔ ７）
８，０２０，ＢａｓｉｃＶｉｏｌｅｔ ７）
【００８４】
【００８５】まず、本発明でいう血液学的試料とは、動
物特に人の末梢血液あるいは、骨髄穿刺液等の主に血液
細胞からなる生物学的試料であって、好ましくは、抗凝
固剤処理のなされた静脈採血血液である。上記、血液学
的試料から、適当な方法、例えば、密度勾配遠心法など
によって白血球以外の血球を除去した血液学的試料も好
適な試料である。
物特に人の末梢血液あるいは、骨髄穿刺液等の主に血液
細胞からなる生物学的試料であって、好ましくは、抗凝
固剤処理のなされた静脈採血血液である。上記、血液学
的試料から、適当な方法、例えば、密度勾配遠心法など
によって白血球以外の血球を除去した血液学的試料も好
適な試料である。
【００８６】好塩基球、好酸球は、一般の臨床検査室で
行われるロマノフスキー染色を用いた用手法で同定され
る好塩基球、好酸球である。幼若顆粒球とは、用手法に
よって同定される前骨髄球、骨髄球、後骨髄球からなる
群である。また２つの幼若顆粒球群とは、用手法によっ
て１次顆粒（アズール顆粒）の存在が同定される幼若顆
粒球であって、主に前骨髄球からなる幼若顆粒球群１
と、１次顆粒の存在が殆ど同定されない幼若顆粒球であ
って、主に骨髄球と後骨髄球からなる幼若顆粒球群２の
２つをいう。
行われるロマノフスキー染色を用いた用手法で同定され
る好塩基球、好酸球である。幼若顆粒球とは、用手法に
よって同定される前骨髄球、骨髄球、後骨髄球からなる
群である。また２つの幼若顆粒球群とは、用手法によっ
て１次顆粒（アズール顆粒）の存在が同定される幼若顆
粒球であって、主に前骨髄球からなる幼若顆粒球群１
と、１次顆粒の存在が殆ど同定されない幼若顆粒球であ
って、主に骨髄球と後骨髄球からなる幼若顆粒球群２の
２つをいう。
【００８７】フローサイトメータとは、図１に示される
ような、少なくとも赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つ
の光学的情報、さらに好ましくは前方散乱光を含む４つ
の光学的情報を測定できる装置であって、４つの光学的
情報をもちいて、細胞種の解析ができる装置をいう。通
常、市販されているフローサイトメータもしくは、同等
の性能を有するフローサイトメータをいう。フローサイ
トメータについては、後述する。
ような、少なくとも赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つ
の光学的情報、さらに好ましくは前方散乱光を含む４つ
の光学的情報を測定できる装置であって、４つの光学的
情報をもちいて、細胞種の解析ができる装置をいう。通
常、市販されているフローサイトメータもしくは、同等
の性能を有するフローサイトメータをいう。フローサイ
トメータについては、後述する。
【００８８】本発明の好ましい実施形態は、少なくとも
好塩基球，幼若顆粒球を特異的に染色するのに十分な量
のアストラゾンイエロ３Ｇと、好酸球を特異的に染色す
るのに十分な量のニュートラルレッドと血液学的試料中
の好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に染色するの
に適したｐＨにするための緩衝剤とからなる水溶液と血
液学的試料を混合し、少なくとも好塩基球、幼若顆粒
球、好酸球を特異的に蛍光染色する工程である。好塩基
球と幼若顆粒球を特異的に染色するのに十分なアストラ
ゾンイエロー３Ｇの量とは、水溶液中に５０ｍｇ／ｌ以
上の濃度である。上限は実験によって１０００ｍｇ／ｌ
の濃度まで、本発明の効果を得ることができることが確
認されているが、これ以上の濃度で本発明の効果がなく
なることを意味するわけではない。
好塩基球，幼若顆粒球を特異的に染色するのに十分な量
のアストラゾンイエロ３Ｇと、好酸球を特異的に染色す
るのに十分な量のニュートラルレッドと血液学的試料中
の好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に染色するの
に適したｐＨにするための緩衝剤とからなる水溶液と血
液学的試料を混合し、少なくとも好塩基球、幼若顆粒
球、好酸球を特異的に蛍光染色する工程である。好塩基
球と幼若顆粒球を特異的に染色するのに十分なアストラ
ゾンイエロー３Ｇの量とは、水溶液中に５０ｍｇ／ｌ以
上の濃度である。上限は実験によって１０００ｍｇ／ｌ
の濃度まで、本発明の効果を得ることができることが確
認されているが、これ以上の濃度で本発明の効果がなく
なることを意味するわけではない。
【００８９】好酸球を特異的に染色するのに十分なニュ
ートラルレッドの濃度は、水溶液中に１ｍｇ／ｌ以上の
濃度であり、さらに好適には、アストラゾンイエロー３
Ｇの濃度の１／５０〜１／１０の範囲の濃度である。ア
ストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドの染色は
競合反応であり、アストラゾンイエロー３Ｇの濃度に比
べ著しく高い濃度のニュートラルレッドの存在はアスト
ラゾンイエロー３Ｇによる好酸球の染色のみならず好塩
基球、幼若顆粒球の特異的染色をも阻害する。好塩基
球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に染色するのに適した
ｐＨとは、水溶液と血液学的試料との混合物のｐＨが
７．０〜１１．０であり、さらに好適には、７．５〜１
０．０のｐＨである。ｐＨ７．０以下の場合、アストラ
ゾンイエロー３Ｇによる好塩基球、幼若顆粒球の有効な
特異的染色は得難くなる。ｐＨ１１．０以上の場合、白
血球の損傷が大きくなり白血球の形態変化を生じやすく
なる。また同時にアストラゾンイエロー３Ｇの分解反応
により、フローサイトメータでの測定に障害となる沈殿
物を生じる。
ートラルレッドの濃度は、水溶液中に１ｍｇ／ｌ以上の
濃度であり、さらに好適には、アストラゾンイエロー３
Ｇの濃度の１／５０〜１／１０の範囲の濃度である。ア
ストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッドの染色は
競合反応であり、アストラゾンイエロー３Ｇの濃度に比
べ著しく高い濃度のニュートラルレッドの存在はアスト
ラゾンイエロー３Ｇによる好酸球の染色のみならず好塩
基球、幼若顆粒球の特異的染色をも阻害する。好塩基
球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に染色するのに適した
ｐＨとは、水溶液と血液学的試料との混合物のｐＨが
７．０〜１１．０であり、さらに好適には、７．５〜１
０．０のｐＨである。ｐＨ７．０以下の場合、アストラ
ゾンイエロー３Ｇによる好塩基球、幼若顆粒球の有効な
特異的染色は得難くなる。ｐＨ１１．０以上の場合、白
血球の損傷が大きくなり白血球の形態変化を生じやすく
なる。また同時にアストラゾンイエロー３Ｇの分解反応
により、フローサイトメータでの測定に障害となる沈殿
物を生じる。
【００９０】混合物のｐＨを染色するのに適したｐＨに
維持するのに最も好適な方法は、緩衝剤を用いる方法で
ある。本法に用いる緩衝剤の種類は特に制限はなく、ｐ
Ｋａ（酸解離定数）が９．０±２．０付近にある緩衝剤
が好適に用いられる。緩衝剤種の濃度は特に限定されな
いが、通常５〜１００ｍＭ／ｌの濃度が好適に用いられ
る。本法を実施するにあたって緩衝剤の使用は、必須の
条件ではなく、ｐＨを７．５〜１１．０に調製できれ
ば、他の方法でも良い。
維持するのに最も好適な方法は、緩衝剤を用いる方法で
ある。本法に用いる緩衝剤の種類は特に制限はなく、ｐ
Ｋａ（酸解離定数）が９．０±２．０付近にある緩衝剤
が好適に用いられる。緩衝剤種の濃度は特に限定されな
いが、通常５〜１００ｍＭ／ｌの濃度が好適に用いられ
る。本法を実施するにあたって緩衝剤の使用は、必須の
条件ではなく、ｐＨを７．５〜１１．０に調製できれ
ば、他の方法でも良い。
【００９１】血液学的試料と、水溶液の混合体積比は特
に限定されないが、フローサイトメータでの測定におい
て、１：５〜１：２００の混合比率が好適に使用され
る。
に限定されないが、フローサイトメータでの測定におい
て、１：５〜１：２００の混合比率が好適に使用され
る。
【００９２】染色を完了するのに必要な時間は、幾分温
度依存性があるが、室温（１８−２５℃）の場合は、１
０−４０秒程度で完了する。温度が高い場合は幾分短
い、温度が低い場合は幾分長い時間を必要とする。
度依存性があるが、室温（１８−２５℃）の場合は、１
０−４０秒程度で完了する。温度が高い場合は幾分短
い、温度が低い場合は幾分長い時間を必要とする。
【００９３】白血球の損傷を抑制し、少なくともリンパ
球、単球、好中球を散乱光によって分離するために必要
な形態に保持するためには、混合物の浸透圧が１００〜
５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にあることが好適であ
る。さらに好適には、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの
範囲にあることが好ましい。
球、単球、好中球を散乱光によって分離するために必要
な形態に保持するためには、混合物の浸透圧が１００〜
５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にあることが好適であ
る。さらに好適には、２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの
範囲にあることが好ましい。
【００９４】混合物の浸透圧がこの範囲を外れる場合に
は、水溶液に浸透圧補償剤を含むことが好適である。浸
透圧補償剤の種類は、特に限定されないがアルカリ金属
塩あるいは、糖類など、通常生物学的細胞を生理的浸透
圧に保つための物質が好適に使用される。
は、水溶液に浸透圧補償剤を含むことが好適である。浸
透圧補償剤の種類は、特に限定されないがアルカリ金属
塩あるいは、糖類など、通常生物学的細胞を生理的浸透
圧に保つための物質が好適に使用される。
【００９５】以上、本法で作製した測定用試料をフロー
サイトメータで測定した場合、図８，９に示すように、
白血球を少なくとも好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球〔Ｉ
ｍ〕、好酸球〔Ｅｏ〕の３つの副集団に分離することが
でき、個々の白血球の副集団を分類計数することが可能
である。
サイトメータで測定した場合、図８，９に示すように、
白血球を少なくとも好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球〔Ｉ
ｍ〕、好酸球〔Ｅｏ〕の３つの副集団に分離することが
でき、個々の白血球の副集団を分類計数することが可能
である。
【００９６】次に、赤血球の影響を除去する工程が、赤
血球を溶解する第１の工程を含む測定用試料調製方法に
ついて述べる。
血球を溶解する第１の工程を含む測定用試料調製方法に
ついて述べる。
【００９７】まず、血液学的試料と、ｐＨが酸性低張の
第１の水溶液とを混合することにより、赤血球はゴース
ト化され次いで断片化される。
第１の水溶液とを混合することにより、赤血球はゴース
ト化され次いで断片化される。
【００９８】次に、赤血球の溶解が終了したのち白血球
の形態的変化を生じないうちに、酸を中和するための緩
衝剤と、浸透圧を白血球の形態を保持する浸透圧にする
ための浸透圧補償剤からなる第２の水溶液を添加するこ
とによって、赤血球の影響を除去した血液学的試料が調
製できる。
の形態的変化を生じないうちに、酸を中和するための緩
衝剤と、浸透圧を白血球の形態を保持する浸透圧にする
ための浸透圧補償剤からなる第２の水溶液を添加するこ
とによって、赤血球の影響を除去した血液学的試料が調
製できる。
【００９９】酸性低張液で、赤血球のみを断片化する本
工程の詳細な説明は特開昭６３−１３４９５７号、特開
昭６３−１３４９５８に述べられている。
工程の詳細な説明は特開昭６３−１３４９５７号、特開
昭６３−１３４９５８に述べられている。
【０１００】上述した工程により、赤血球の影響を除去
した血液学的試料について、続いて前述のアストラゾン
イエロー３Ｇ、ニュートラルレッドによる蛍光染色を行
うことにより、フローサイトメータ測定用試料が調製で
きる。
した血液学的試料について、続いて前述のアストラゾン
イエロー３Ｇ、ニュートラルレッドによる蛍光染色を行
うことにより、フローサイトメータ測定用試料が調製で
きる。
【０１０１】酸性とは、ｐＨ２．０−５．０が好適であ
り、さらに好適にはｐＨ２．５−４．０である。
り、さらに好適にはｐＨ２．５−４．０である。
【０１０２】第１の工程で用いられる緩衝剤は特に限定
されず、酸解離定数ｐＫａ３．０±２．０の緩衝剤が好
適に使用される。
されず、酸解離定数ｐＫａ３．０±２．０の緩衝剤が好
適に使用される。
【０１０３】緩衝剤の濃度は混合物のｐＨを２．０−
５．０の範囲に維持するのに必要な量であり、好適に
は、５−５０ｍＭ／Ｌの濃度である。
５．０の範囲に維持するのに必要な量であり、好適に
は、５−５０ｍＭ／Ｌの濃度である。
【０１０４】ｐＨが２．０以下になった場合、白血球の
特異的染色は、明らかに妨げられる、またｐＨ５．０以
上では、赤血球を断片化する作用が明らかに妨げられ
る。
特異的染色は、明らかに妨げられる、またｐＨ５．０以
上では、赤血球を断片化する作用が明らかに妨げられ
る。
【０１０５】低張とは、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸
透圧をいい浸透圧が１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上では赤血
球を断片化する作用が明らかに妨げられる。
透圧をいい浸透圧が１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上では赤血
球を断片化する作用が明らかに妨げられる。
【０１０６】赤血球の断片化を完了するのに必要な第一
液と血液学的試料の反応時間は、幾分温度依存性がある
が、室温（１８−２５℃）の場合は、５−２０秒程度で
完了する。
液と血液学的試料の反応時間は、幾分温度依存性がある
が、室温（１８−２５℃）の場合は、５−２０秒程度で
完了する。
【０１０７】温度が高い場合は幾分短い、温度が低い場
合は幾分長い時間を必要とする。
合は幾分長い時間を必要とする。
【０１０８】好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に
蛍光染色する工程と、赤血球を断片化する工程を同時に
行うことは、可能である。
蛍光染色する工程と、赤血球を断片化する工程を同時に
行うことは、可能である。
【０１０９】この場合は、例えば、白血球を特異的に染
色する色素であるアストラゾンイエロー３Ｇとニュート
ラルレッドと酸性に保つための緩衝剤とからなる低張の
第一の水溶液と血液学的試料を混合して、赤血球を断片
化したのちに、酸を中和するための緩衝剤と、ｐＨを染
色に適したｐＨにするための緩衝剤と、浸透圧を白血球
の形態を保持する浸透圧にするための浸透圧補償剤から
なる第２の水溶液を添加することによって実施される。
色する色素であるアストラゾンイエロー３Ｇとニュート
ラルレッドと酸性に保つための緩衝剤とからなる低張の
第一の水溶液と血液学的試料を混合して、赤血球を断片
化したのちに、酸を中和するための緩衝剤と、ｐＨを染
色に適したｐＨにするための緩衝剤と、浸透圧を白血球
の形態を保持する浸透圧にするための浸透圧補償剤から
なる第２の水溶液を添加することによって実施される。
【０１１０】本工程で調製した測定用試料をフローサイ
トメータで測定した場合、例えば図１３、図１４に示す
ように白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好
中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１
〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕の６つの副集団
に分離することができ、個々の白血球を分類計数する事
が出来る。
トメータで測定した場合、例えば図１３、図１４に示す
ように白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好
中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１
〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕の６つの副集団
に分離することができ、個々の白血球を分類計数する事
が出来る。
【０１１１】またこの例では、測定する光学的情報が緑
蛍光、赤蛍光、側方散乱光の３つであるが、さらに前方
散乱光を加えた４つの光学的情報を測定した場合、図１
５〜１７に示すように、白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、リン
パ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕ
ｔ〕、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、
幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕の７つの副集団に分離するこ
とができ、個々の白血球を分類計数する事が出来る。
蛍光、赤蛍光、側方散乱光の３つであるが、さらに前方
散乱光を加えた４つの光学的情報を測定した場合、図１
５〜１７に示すように、白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、リン
パ球〔Ｌｙｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕ
ｔ〕、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、
幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕の７つの副集団に分離するこ
とができ、個々の白血球を分類計数する事が出来る。
【０１１２】次に、赤血球の影響を除去する工程が白血
球のみを染色する工程である第２の工程を含む測定用試
料調製方法について述べる。
球のみを染色する工程である第２の工程を含む測定用試
料調製方法について述べる。
【０１１３】本第２の工程は、アストラゾンイエロー３
Ｇならびにニュートラルレッドで蛍光染色されない白血
球、特にリンパ球を染色し、且つ、アストラゾンイエロ
ー３Ｇならびにニュートラルレッドによる特異染色を阻
害しない色素で染色する工程であって、フローサイトメ
ータでの測定時に蛍光強度の差によって白血球と赤血球
を分離するための方法を提供するための測定用試料調製
法である。
Ｇならびにニュートラルレッドで蛍光染色されない白血
球、特にリンパ球を染色し、且つ、アストラゾンイエロ
ー３Ｇならびにニュートラルレッドによる特異染色を阻
害しない色素で染色する工程であって、フローサイトメ
ータでの測定時に蛍光強度の差によって白血球と赤血球
を分離するための方法を提供するための測定用試料調製
法である。
【０１１４】この工程に使用される色素は、白血球にの
み存在する物質を染色し、且つ赤血球を染色しない色素
が選ばれる。この目的のためには、白血球の核あるいは
細胞質あるいはその両方を染色する色素が選ばれる。
み存在する物質を染色し、且つ赤血球を染色しない色素
が選ばれる。この目的のためには、白血球の核あるいは
細胞質あるいはその両方を染色する色素が選ばれる。
【０１１５】具体的には、以下の色素が実験的にこの目
的に使用可能である事がわかった。 （１） アストラゾンオレンジＲ （２） アストラバイオレット（ＣＩ Ｎｏ．４８０７
０，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２） （３） ローダミン６Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．４５１６０） （４） ローダミン１９ （５） ローダミンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５１７０，Ｂａ
ｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ１０） （６） ローダミン３ＧＯ（ＣＩ Ｎｏ．４５２１０，
Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ３） （７） ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５０１０） （８） シアノシン （９） ３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４８０
２０，Ｂａｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ ７） 好ましい実施形態は、好塩基球と幼若顆粒球を特異的に
蛍光染色する好酸球を特異的に染色するＮｅｕｔｒａｌ
ＲｅｄとｐＨを染色に適したｐＨにする緩衝剤と上記
の色素の群から選ばれた少なくとも１種類の色素とから
なる水溶液と、血液学的試料を混合することによって行
われる。さらに水溶液に浸透圧補償剤をふくむことは、
好適に行われ得る。
的に使用可能である事がわかった。 （１） アストラゾンオレンジＲ （２） アストラバイオレット（ＣＩ Ｎｏ．４８０７
０，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ１２） （３） ローダミン６Ｇ（ＣＩ Ｎｏ．４５１６０） （４） ローダミン１９ （５） ローダミンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５１７０，Ｂａ
ｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ１０） （６） ローダミン３ＧＯ（ＣＩ Ｎｏ．４５２１０，
Ｂａｓｉｃ Ｒｅｄ３） （７） ピロニンＢ（ＣＩ Ｎｏ．４５０１０） （８） シアノシン （９） ３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ（ＣＩ Ｎｏ．４８０
２０，Ｂａｓｉｃ Ｖｉｏｌｅｔ ７） 好ましい実施形態は、好塩基球と幼若顆粒球を特異的に
蛍光染色する好酸球を特異的に染色するＮｅｕｔｒａｌ
ＲｅｄとｐＨを染色に適したｐＨにする緩衝剤と上記
の色素の群から選ばれた少なくとも１種類の色素とから
なる水溶液と、血液学的試料を混合することによって行
われる。さらに水溶液に浸透圧補償剤をふくむことは、
好適に行われ得る。
【０１１６】白血球の少なくとも核あるいは細胞質を染
色する色素の最適濃度は、各々の色素によって異なって
おり、最適な濃度は、実験によって決定される。
色する色素の最適濃度は、各々の色素によって異なって
おり、最適な濃度は、実験によって決定される。
【０１１７】本工程で調製した測定用試料をフローサイ
トメータで測定した場合、図１８，１９に示すように、
白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、リンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球
〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球群〔Ｉｍ〕の６つの副集団に分離で
き、個々の白血球を分類計数する事が出来る。
トメータで測定した場合、図１８，１９に示すように、
白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、リンパ球〔Ｌｙｍ〕、単球
〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基球〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球群〔Ｉｍ〕の６つの副集団に分離で
き、個々の白血球を分類計数する事が出来る。
【０１１８】さらに、この白血球の核あるいは細胞質を
染色する第２の工程は、赤血球を断片化する第１の工程
と、同時に行うことができる。
染色する第２の工程は、赤血球を断片化する第１の工程
と、同時に行うことができる。
【０１１９】この場合は、例えば、白血球を特異的に染
色する色素であるアストラゾンイエロー３Ｇとニュート
ラルレッドとｐＨを酸性に保つための緩衝剤と、上述の
少なくとも１種類の色素とからなる低張の第一の水溶液
と血液学的試料を混合して、赤血球を断片化したのち
に、酸を中和するための緩衝剤と、ｐＨを染色に適した
ｐＨにするための緩衝剤と、浸透圧を白血球の形態を保
持する浸透圧にするための浸透圧補償剤からなる第２の
水溶液を添加することによって実施される。
色する色素であるアストラゾンイエロー３Ｇとニュート
ラルレッドとｐＨを酸性に保つための緩衝剤と、上述の
少なくとも１種類の色素とからなる低張の第一の水溶液
と血液学的試料を混合して、赤血球を断片化したのち
に、酸を中和するための緩衝剤と、ｐＨを染色に適した
ｐＨにするための緩衝剤と、浸透圧を白血球の形態を保
持する浸透圧にするための浸透圧補償剤からなる第２の
水溶液を添加することによって実施される。
【０１２０】本工程で調製した測定用試料をフローサイ
トメータで測定した場合図２０，２１に示すように、赤
蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つの光学的情報を測定す
るだけで、白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、リンパ球〔Ｌｙ
ｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基
球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群1 〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群
２〔Ｉｍ２〕の７つの副集団に分離することができ、個
々の白血球を分類計数する事が出来る。
トメータで測定した場合図２０，２１に示すように、赤
蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つの光学的情報を測定す
るだけで、白血球を好酸球〔Ｅｏ〕、リンパ球〔Ｌｙ
ｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基
球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球群1 〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群
２〔Ｉｍ２〕の７つの副集団に分離することができ、個
々の白血球を分類計数する事が出来る。
【０１２１】
【実施例】以上述べた実施形態は、本発明の好ましい実
施形態の例であって、本発明の実施形態を限定するもの
ではない。
施形態の例であって、本発明の実施形態を限定するもの
ではない。
【０１２２】以下に本発明を実施するために用いられる
フローサイトメータについて説明する。図１は、一般の
フローサイトメータの構成を図示した概略図である。１
は、フローサイトメータの光源を示し、少なくともアス
トラゾンイエロー３Ｇと、ニュートラルレッドで染色さ
れた少なくとも好酸球、好塩基球、幼若顆粒球から、特
異的な蛍光を励起するのに適した波長の光を放出する光
源であり、波長、４００−５２０ｎｍ付近の光を放出す
るアルゴンイオンレーザ、水銀アークランプなどが好適
に用いられる。光源からの光は、レンズ２によって粒子
の流領域２０に扁平円形状に集束され、そこを通過する
細胞等の粒子１３に照射される。このとき、粒子１３か
らは前方に前方散乱光２１、側方に赤蛍光２２、緑蛍光
２３、側方散乱光２４が発せられる。
フローサイトメータについて説明する。図１は、一般の
フローサイトメータの構成を図示した概略図である。１
は、フローサイトメータの光源を示し、少なくともアス
トラゾンイエロー３Ｇと、ニュートラルレッドで染色さ
れた少なくとも好酸球、好塩基球、幼若顆粒球から、特
異的な蛍光を励起するのに適した波長の光を放出する光
源であり、波長、４００−５２０ｎｍ付近の光を放出す
るアルゴンイオンレーザ、水銀アークランプなどが好適
に用いられる。光源からの光は、レンズ２によって粒子
の流領域２０に扁平円形状に集束され、そこを通過する
細胞等の粒子１３に照射される。このとき、粒子１３か
らは前方に前方散乱光２１、側方に赤蛍光２２、緑蛍光
２３、側方散乱光２４が発せられる。
【０１２３】なお、粒子は、ノズル１７から吐出され、
シース液供給口１４から供給されるシース液につつまれ
て、フローセル内でシースフローを形成する。
シース液供給口１４から供給されるシース液につつまれ
て、フローセル内でシースフローを形成する。
【０１２４】前方散乱光２１はビームストーパ−５によ
って直接光が除去され、散乱光が集光レンズ４によって
光検出部６に送られる。側方に発せられた光２２，２
３，２４は集光レンズ３によって集められ、光検出部に
送られる。側方散乱光２４はダイクロイックミラー１０
によって反射され光検出部７におくられる。赤蛍光２２
はダイクロイックミラー１１によって反射され、光検出
部８に送られる。緑蛍光２３はダイクロイックミラー１
１を通過し、光検出部９に送られる。光検出部６，７，
8 ，９に送られた光は、それぞれ電気信号に変換され、
信号処理部１５によって増幅され、解析部１６に送ら
れ、解析される。本発明において前方散乱光とは、検出
部を通過する細胞から光源の放射軸に対して０°に近い
狭い角度で放射された散乱光である。
って直接光が除去され、散乱光が集光レンズ４によって
光検出部６に送られる。側方に発せられた光２２，２
３，２４は集光レンズ３によって集められ、光検出部に
送られる。側方散乱光２４はダイクロイックミラー１０
によって反射され光検出部７におくられる。赤蛍光２２
はダイクロイックミラー１１によって反射され、光検出
部８に送られる。緑蛍光２３はダイクロイックミラー１
１を通過し、光検出部９に送られる。光検出部６，７，
8 ，９に送られた光は、それぞれ電気信号に変換され、
信号処理部１５によって増幅され、解析部１６に送ら
れ、解析される。本発明において前方散乱光とは、検出
部を通過する細胞から光源の放射軸に対して０°に近い
狭い角度で放射された散乱光である。
【０１２５】側方散乱光とは、検出部の細胞から光源の
放射軸に対してほぼ９０°方向に放射された散乱光であ
る。赤蛍光とは検出部の細胞から全方向に放射される蛍
光のうち、波長５６０ｎｍ以上の蛍光をいう。通常のフ
ローサイトメータでは、装置構成の都合上光源の放射軸
にたいしてほぼ０°あるいはほぼ９０°の蛍光が集光さ
れる。
放射軸に対してほぼ９０°方向に放射された散乱光であ
る。赤蛍光とは検出部の細胞から全方向に放射される蛍
光のうち、波長５６０ｎｍ以上の蛍光をいう。通常のフ
ローサイトメータでは、装置構成の都合上光源の放射軸
にたいしてほぼ０°あるいはほぼ９０°の蛍光が集光さ
れる。
【０１２６】緑蛍光とは検出部の細胞から全方向に放射
される蛍光のうち、波長５２０ｎｍ−５６０ｎｍ付近の
蛍光をいう。通常のフローサイトメータでは、装置構成
の都合上光源の放射軸にたいしてほぼ０°あるいはほぼ
９０°の蛍光が集光される。次に具体的な実施例によっ
て、本発明の処理工程について述べる。この実施例に使
用した試薬系は、一般に市販されている試薬級の化学原
料から作製した。なお評価に用いたフローサイトメータ
は、図１に示すような構成のフローサイトメータを使用
した。
される蛍光のうち、波長５２０ｎｍ−５６０ｎｍ付近の
蛍光をいう。通常のフローサイトメータでは、装置構成
の都合上光源の放射軸にたいしてほぼ０°あるいはほぼ
９０°の蛍光が集光される。次に具体的な実施例によっ
て、本発明の処理工程について述べる。この実施例に使
用した試薬系は、一般に市販されている試薬級の化学原
料から作製した。なお評価に用いたフローサイトメータ
は、図１に示すような構成のフローサイトメータを使用
した。
【０１２７】実施例１
本実施例は、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つの光学
的情報を測定することにより、白血球を少なくとも、好
酸球、好塩基球、幼若顆粒球と他の白血球の４つの副集
団に分離するための試料調製例である。
的情報を測定することにより、白血球を少なくとも、好
酸球、好塩基球、幼若顆粒球と他の白血球の４つの副集
団に分離するための試料調製例である。
【０１２８】組成例１
アストラゾンイエロー３Ｇ ３００ｍｇ
ニュートラルレッド ２０ｍｇ
ＴＲＩＳ ３．６ｇ
ＮａＯＨ 適量（ｐＨ９．０となる量）
ＮａＣｌ 適量（浸透圧２８０ｍＯｓｍ／ｋｇとなる量）
精製水 １Ｌ
組成例１の試薬０．９５ｍｌと末梢血液０．０５ｍｌを
混合し、１０秒以上おくことにより、測定用試料が調製
できる。白血球の分類計数はフローサイトメータで個々
の細胞についての赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測定
し、解析することにより、得られる。解析は、例えばま
ず、図２２に示す赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムを描くと、少なくとも好酸球〔Ｅ
ｏ〕とその他の細胞〔Ａ１４〕の２つの副集団を発生す
る。ウィンド11〔Ｗ１１〕によって好酸球のみをデーテ
ィングし計数する。次に好酸球以外の細胞集団のデータ
をウィンド１２によってゲーティングし、図２３に示す
ように側方散乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸と
するスキャッタグラムを描くと白血球は、好塩基球〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕、その他の白血球〔Ａ１５〕
の３つの副集団に分離される。ウィンド１３〔Ｗ１３〕
によって好塩基球を、ウィンド１４〔Ｗ１４〕よって幼
若顆粒球をゲーティングし計数する。
混合し、１０秒以上おくことにより、測定用試料が調製
できる。白血球の分類計数はフローサイトメータで個々
の細胞についての赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測定
し、解析することにより、得られる。解析は、例えばま
ず、図２２に示す赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムを描くと、少なくとも好酸球〔Ｅ
ｏ〕とその他の細胞〔Ａ１４〕の２つの副集団を発生す
る。ウィンド11〔Ｗ１１〕によって好酸球のみをデーテ
ィングし計数する。次に好酸球以外の細胞集団のデータ
をウィンド１２によってゲーティングし、図２３に示す
ように側方散乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸と
するスキャッタグラムを描くと白血球は、好塩基球〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕、その他の白血球〔Ａ１５〕
の３つの副集団に分離される。ウィンド１３〔Ｗ１３〕
によって好塩基球を、ウィンド１４〔Ｗ１４〕よって幼
若顆粒球をゲーティングし計数する。
【０１２９】尚、ウィンドとは、散布図上の特定の領域
をさし、ゲーティングとは、ウィンドによって限定され
た領域のデータのみを取り出す操作をいう。また特定の
領域をウィンドで囲むことにより、ウィンド内のデータ
数を計数することができる。実施例２ 本実施例は、赤血球の影響を除去する第一の工程を含む
試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つ
の光学的情報を測定することにより、白血球を少なくと
も６つの副集団に分離するための例である。
をさし、ゲーティングとは、ウィンドによって限定され
た領域のデータのみを取り出す操作をいう。また特定の
領域をウィンドで囲むことにより、ウィンド内のデータ
数を計数することができる。実施例２ 本実施例は、赤血球の影響を除去する第一の工程を含む
試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つ
の光学的情報を測定することにより、白血球を少なくと
も６つの副集団に分離するための例である。
【０１３０】組成例２
試薬第１液
アストラゾンイエロー３Ｇ ３００ｍｇ
ニュートラルレッド ２０ｍｇ
クエン酸−水塩 ２．１０ｇ（ｐＨ２．６２）
精製水 １Ｌ
試薬第２液
ＴＲＩＳ ３６．３ｇ
ＮａＣｌ ５８．４ｇ
ＮａＯＨ １８．８ｇ
精製水 １ Ｌ
組成例２の試薬第１液０．９０ｍｌと末梢血液０．０５
ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬第２液０．１
０ｍｌを加えさらに１０秒以上おくことにより、測定用
試料が調製できる。白血球の分類計数は、フローサイト
メータで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測
定し、解析することにより、得られる。解析は、まず、
図２４に示す。赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムを描くと白血球は、好酸球〔Ｅｏ〕と
その他の白血球の集団の２つの副集団にわかれる。ウィ
ンド２１〔Ｗ２１〕によって好酸球のみを計数する。次
に好酸球以外の細胞集団〔Ａ１６〕のデータをウィンド
２２〔Ｗ２２〕によってゲーティングし、図２５に示す
ように側方散乱光強度と赤蛍光あるいは、緑蛍光強度を
座標軸とする散布図を描くと、白血球は、単球〔Ｍｏｎ
ｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ
１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕、好塩基球〔Ｂａ〕と
その他の白血球の副集団〔Ａ１７〕に分離される。
ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬第２液０．１
０ｍｌを加えさらに１０秒以上おくことにより、測定用
試料が調製できる。白血球の分類計数は、フローサイト
メータで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測
定し、解析することにより、得られる。解析は、まず、
図２４に示す。赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムを描くと白血球は、好酸球〔Ｅｏ〕と
その他の白血球の集団の２つの副集団にわかれる。ウィ
ンド２１〔Ｗ２１〕によって好酸球のみを計数する。次
に好酸球以外の細胞集団〔Ａ１６〕のデータをウィンド
２２〔Ｗ２２〕によってゲーティングし、図２５に示す
ように側方散乱光強度と赤蛍光あるいは、緑蛍光強度を
座標軸とする散布図を描くと、白血球は、単球〔Ｍｏｎ
ｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ
１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕、好塩基球〔Ｂａ〕と
その他の白血球の副集団〔Ａ１７〕に分離される。
【０１３１】ウィンド２３〔Ｗ２３〕によって好塩基球
を、ウィンド２４〔Ｗ２４〕によって幼若顆粒球群１を
ウィンド２５〔Ｗ２５〕によって幼若顆粒球群２をウィ
ンド２６〔Ｗ２６〕によって単球をウィンド２７〔Ｗ２
７〕によって好中球を分類計数する。
を、ウィンド２４〔Ｗ２４〕によって幼若顆粒球群１を
ウィンド２５〔Ｗ２５〕によって幼若顆粒球群２をウィ
ンド２６〔Ｗ２６〕によって単球をウィンド２７〔Ｗ２
７〕によって好中球を分類計数する。
【０１３２】実施例３
本実施例は、赤血球の影響を除去する第一の工程を含む
試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光、前方
散乱光の４つの光学的情報を測定することにより、白血
球を少なくとも７つの副集団に分離するための例であ
る。実施例２とは前方散乱光も測定する点で異なる。
試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光、前方
散乱光の４つの光学的情報を測定することにより、白血
球を少なくとも７つの副集団に分離するための例であ
る。実施例２とは前方散乱光も測定する点で異なる。
【０１３３】組成例２の試薬第１液０．９０ｍｌと末梢
血液０．０５ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬
第２液０．１０ｍｌを加えさらに１０秒以上経過した後
にフローサイトメータで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、
側方散乱光、前方散乱光の４つの光学的情報を測定し
た。
血液０．０５ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬
第２液０．１０ｍｌを加えさらに１０秒以上経過した後
にフローサイトメータで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、
側方散乱光、前方散乱光の４つの光学的情報を測定し
た。
【０１３４】まず、図２６に示す前方散乱光と側方散乱
光を座標軸とするスキャッタグラムを描き、ウィンド３
１〔Ｗ３１〕によって白血球のみからなる集団〔Ａ１
８〕のデータのみをゲーティングし、全白血球数を得
る。赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラム（図２７）を描き、ウィンド３２〔Ｗ３２〕によ
って好酸球〔Ｅｏ〕のみを分類計数する。次に好酸球以
外の白血球集団〔Ａ１９〕のデータをウィンド３３〔Ｗ
３３〕によってゲーティングし図２８にしめすように側
方散乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするス
キャッタグラムを描くと白血球は、リンパ球〔Ｌｙ
ｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、幼若顆
粒球群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕、好塩
基球〔Ｂａ〕、ウィンド３４〔Ｗ３４〕によって好塩基
球を、ウィンド３５〔Ｗ３５〕によって幼若顆粒球群１
をウィンド３６〔Ｗ３６〕によって幼若顆粒球群２をウ
ィンド３７〔Ｗ３７〕によってリンパ球をウィンド３８
〔Ｗ３８〕によって単球をウィンドゲート３９〔Ｗ３
９〕によって好中球を分類計数する。
光を座標軸とするスキャッタグラムを描き、ウィンド３
１〔Ｗ３１〕によって白血球のみからなる集団〔Ａ１
８〕のデータのみをゲーティングし、全白血球数を得
る。赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラム（図２７）を描き、ウィンド３２〔Ｗ３２〕によ
って好酸球〔Ｅｏ〕のみを分類計数する。次に好酸球以
外の白血球集団〔Ａ１９〕のデータをウィンド３３〔Ｗ
３３〕によってゲーティングし図２８にしめすように側
方散乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするス
キャッタグラムを描くと白血球は、リンパ球〔Ｌｙ
ｍ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、幼若顆
粒球群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕、好塩
基球〔Ｂａ〕、ウィンド３４〔Ｗ３４〕によって好塩基
球を、ウィンド３５〔Ｗ３５〕によって幼若顆粒球群１
をウィンド３６〔Ｗ３６〕によって幼若顆粒球群２をウ
ィンド３７〔Ｗ３７〕によってリンパ球をウィンド３８
〔Ｗ３８〕によって単球をウィンドゲート３９〔Ｗ３
９〕によって好中球を分類計数する。
【０１３５】実施例４
本実施例は、赤血球の影響を除去する第二の工程を含む
試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光、３つ
の光学的情報を測定することにより、白血球を少なくと
も６つの副集団に分離するための例である。
試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光、３つ
の光学的情報を測定することにより、白血球を少なくと
も６つの副集団に分離するための例である。
【０１３６】組成例３
アストラゾンイエロー３Ｇ ３００ｍｇ
ニュートラルレッド ２０ｍｇ
ＡＳＴＲＡＺＯＮＥ ＯＲＡＮＧＥ Ｒ ３００ｍｇ
ＴＲＩＳ ３．６ｇ
ＮａＯＨ 適量（ｐＨ９．０となる量）
ＮａＣｌ 適量（浸透圧２８０ｍＯｓｍ／ｋｇとなる量）
精製水 １ Ｌ
組成例３の試薬０．９５ｍｌと末梢血液０．０５ｍｌを
混合し、１０秒以上おくことにより測定用試料が調製で
きる。白血球分類は、フローサイトメータで個々の細胞
の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測定し、解析すること
によりおこなう。解析は、まず、図２９に示す赤蛍光強
度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描
き、ウィンド４１〔Ｗ４１〕によって好酸球〔Ｅｏ〕の
みを分類計数する。次に好酸球以外の白血球集団〔Ａ２
０〕のデータをウィンド４２〔Ｗ４２〕によって取り出
し、図３０にしめすように側方散乱光強度と赤または緑
蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描き、ウィ
ンド４３〔Ｗ４３〕によって好塩基球を、ウィンド４４
〔Ｗ４４〕によって幼若顆粒球群〔Ｉｍ〕をウィンド４
５〔Ｗ４５〕によってリンパ球〔Ｌｙｍｐｈ〕をウィン
ド４６〔Ｗ４６〕によって単球〔Ｍｏｎｏ〕をウィンド
４７〔Ｗ４７〕によって好中球〔Ｎｅｕｔ〕を分類す
る。
混合し、１０秒以上おくことにより測定用試料が調製で
きる。白血球分類は、フローサイトメータで個々の細胞
の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測定し、解析すること
によりおこなう。解析は、まず、図２９に示す赤蛍光強
度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描
き、ウィンド４１〔Ｗ４１〕によって好酸球〔Ｅｏ〕の
みを分類計数する。次に好酸球以外の白血球集団〔Ａ２
０〕のデータをウィンド４２〔Ｗ４２〕によって取り出
し、図３０にしめすように側方散乱光強度と赤または緑
蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描き、ウィ
ンド４３〔Ｗ４３〕によって好塩基球を、ウィンド４４
〔Ｗ４４〕によって幼若顆粒球群〔Ｉｍ〕をウィンド４
５〔Ｗ４５〕によってリンパ球〔Ｌｙｍｐｈ〕をウィン
ド４６〔Ｗ４６〕によって単球〔Ｍｏｎｏ〕をウィンド
４７〔Ｗ４７〕によって好中球〔Ｎｅｕｔ〕を分類す
る。
【０１３７】実施例５
本実施例は、赤血球の影響を除去する第一の工程と第二
の工程を含む試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方
散乱光、３つの光学的情報を測定することにより、白血
球を少なくとも７つの副集団に分離するための例であ
る。
の工程を含む試料調製例であり、赤蛍光、緑蛍光、側方
散乱光、３つの光学的情報を測定することにより、白血
球を少なくとも７つの副集団に分離するための例であ
る。
【０１３８】組成例４
試薬第１液
アストラゾンイエロー３Ｇ ３００ｍｇ
ニュートラルレッド ２０ｍｇ
ＡＳＴＲＡＺＯＮＥ ＯＲＡＮＧＥ Ｒ ３００ｍｇ
クエン酸−水塩 ２．１０ｇ（ｐＨ２．６２）
精製水 １ Ｌ
試薬第２液
ＴＲＩＳ ３６．３ｇ
ＮａＣｌ ５８．４ｇ
ＮａＯＨ １８．８ｇ
精製水 １ Ｌ
組成例１の試薬第１液０．９０ｍｌと末梢血液０．０５
ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬第２液０．１
０ｍｌを加えさらに１０秒以上おくことにより、測定用
試料が調製できる。白血球の分類計数は、フローサイト
メータで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測
定し、解析をすることにより行う。解析は、まず、図３
１に示す赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムを描き、ウィンド５１〔Ｗ５１〕によって好
酸球〔Ｅｏ〕のみを分類計数する。次に好酸球以外の細
胞集団〔Ａ２１〕のデータをウィンド５２〔Ｗ５２〕に
よって取り出す。次いで図３２にしめすように側方散乱
光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムを描き、ウィンド５３〔Ｗ５３〕によって好塩基
球〔Ｂａ〕を、ウィンド５４〔Ｗ５４〕によって幼若顆
粒球群１〔Ｉｍ１〕をウィンド５５〔Ｗ５５〕によって
幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕をウィンド５６〔Ｗ５６〕に
よってリンパ球〔Ｌｙｍ〕をウィンド５７〔Ｗ５７〕に
よって単球〔Ｍｏｎｏ〕をウィンド５８〔Ｗ５８〕によ
って好中球〔Ｎｅｕｔ〕を分類計数する。
ｍｌを混合し５秒以上経過した後に、試薬第２液０．１
０ｍｌを加えさらに１０秒以上おくことにより、測定用
試料が調製できる。白血球の分類計数は、フローサイト
メータで個々の細胞の赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光を測
定し、解析をすることにより行う。解析は、まず、図３
１に示す赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムを描き、ウィンド５１〔Ｗ５１〕によって好
酸球〔Ｅｏ〕のみを分類計数する。次に好酸球以外の細
胞集団〔Ａ２１〕のデータをウィンド５２〔Ｗ５２〕に
よって取り出す。次いで図３２にしめすように側方散乱
光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムを描き、ウィンド５３〔Ｗ５３〕によって好塩基
球〔Ｂａ〕を、ウィンド５４〔Ｗ５４〕によって幼若顆
粒球群１〔Ｉｍ１〕をウィンド５５〔Ｗ５５〕によって
幼若顆粒球群２〔Ｉｍ２〕をウィンド５６〔Ｗ５６〕に
よってリンパ球〔Ｌｙｍ〕をウィンド５７〔Ｗ５７〕に
よって単球〔Ｍｏｎｏ〕をウィンド５８〔Ｗ５８〕によ
って好中球〔Ｎｅｕｔ〕を分類計数する。
【０１３９】
１．幼若顆粒球をアストラゾンイエロー３Ｇとニュート
ラルレッドで特異的に蛍光染色することによって、幼若
顆粒球を他の白血球と分離することができるフローサイ
トメータ測定用試料の調製方法を提供する。この結果従
来不可能であった幼若顆粒球の分類計数が可能となる。
ラルレッドで特異的に蛍光染色することによって、幼若
顆粒球を他の白血球と分離することができるフローサイ
トメータ測定用試料の調製方法を提供する。この結果従
来不可能であった幼若顆粒球の分類計数が可能となる。
【０１４０】２．さらに、赤血球の影響を除去する工程
を組み合わせた場合、１つの測定用試料を測定するのみ
で、幼若顆粒球の分類計数を含む白血球の分類計数が可
能となる。最も好適な試料調製方法をもちいれば、少な
くとも白血球を７つに分類計数することが可能となる。
を組み合わせた場合、１つの測定用試料を測定するのみ
で、幼若顆粒球の分類計数を含む白血球の分類計数が可
能となる。最も好適な試料調製方法をもちいれば、少な
くとも白血球を７つに分類計数することが可能となる。
【図１】一般に市販され本発明を実施するのに使用され
るフローサイトメータの構成を示した概略図である。
るフローサイトメータの構成を示した概略図である。
【図２】血液学的試料から白血球以外の血球成分の影響
を除去した測定用試料を図１に示すフローサイトメータ
で測定して得られたスキャッタグラムである。
を除去した測定用試料を図１に示すフローサイトメータ
で測定して得られたスキャッタグラムである。
【図３】アストラゾンイエロー３Ｇによる染色で得られ
た、蛍光強度と側方散乱光強度とを座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
た、蛍光強度と側方散乱光強度とを座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
【図４】アストラゾンイエロー３Ｇによる染色で得られ
た、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
た、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
【図５】アストラゾンイエロー３Ｇのみで試料を染色し
て得られた側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムである。
て得られた側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムである。
【図６】ニュートラルレッドのみで試料を染色して得ら
れた赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
れた赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
【図７】ニュートラルレッドのみで試料して染色して得
られた側方散乱光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
られた側方散乱光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
【図８】アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッ
ドの共存下で試料を染色して得られた、緑蛍光強度と側
方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
ドの共存下で試料を染色して得られた、緑蛍光強度と側
方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図９】アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッ
ドの共存下で試料を染色して得られた、赤蛍光強度と緑
蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
ドの共存下で試料を染色して得られた、赤蛍光強度と緑
蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図１０】アストラゾンイエロー３Ｇのみで試料を染色
して得られた、赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムである。
して得られた、赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムである。
【図１１】図１０のウィンド１〔Ｗ１〕で取出したデー
タの側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムである。
タの側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムである。
【図１２】赤血球の同時通過がある場合の、側方散乱光
強度と前方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラム
である。
強度と前方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラム
である。
【図１３】赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
ャッタグラムである。
【図１４】図１３のウィンド２〔Ｗ２〕からのデータの
赤蛍光強度または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
赤蛍光強度または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
【図１５】前方散乱光強度と側方散乱光強度を座標軸と
するスキャッタグラムである。
するスキャッタグラムである。
【図１６】図１５の副集団〔Ａ８〕のデータのみの赤蛍
光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
【図１７】図１６の副集団〔Ａ９〕のデータの側方散乱
光強度と赤蛍光強度あるいは緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムである。
光強度と赤蛍光強度あるいは緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムである。
【図１８】赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
ャッタグラムである。
【図１９】図１８の副集団〔Ａ１１〕のデータの側方散
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
【図２０】赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
ャッタグラムである。
【図２１】図２０の副集団〔Ａ１３〕のデータの側方散
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
【図２２】実施例１で得られた試料の赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２３】実施例１で得られた側方散乱光強度と赤また
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２４】実施例２で得られた試料の赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２５】実施例２で得られた側方散乱光強度と赤また
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２６】実施例３で得られた試料の前方散乱光と側方
散乱光を座標軸とするスキャッタグラムである。
散乱光を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２７】実施例３で得られた試料の赤蛍光強度と緑蛍
光強度のスキャッタグラムである。
光強度のスキャッタグラムである。
【図２８】実施例３において得られた側方散乱光強度と
赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
【図２９】実施例４の試料で得られた赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図３０】図２９の副集団〔Ａ２０〕のデータの側方散
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
【図３１】実施例５の試料で得られた赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図３２】図３１の副集団〔Ａ２１〕のデータの側方散
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
１ 光源
２ レンズ
３ 集光レンズ
４ 集光レンズ
５ ビームストーパー
６〜９ 光検出部
１０〜１１ ダイクロイックミラー
１３ 粒子
１４ シース液供給口
１５ 信号処理部
１６ 解析部
１７ ノズル
１８ フローセル
２０ 粒子の流領域
２１ 前方散乱光
２２ 赤蛍光
２３ 緑蛍光
２４ 側方散乱光
１′ リンパ球
２′ 単球
３′ 顆粒球
３″ 好中球
４′ 好酸球、幼若顆粒球
５′ 好塩基球
〔ＮＲＢＣ〕 赤芽球
〔Ｒ〕 赤血球
〔Ｅｏ〕 好酸球
〔Ｇｒａｎｕｌ〕 顆粒球
〔Ｌｙｍ〕 リンパ球
〔Ｍｏｎｏ〕 単球
〔Ｎｅｕｔ〕 好中球
〔Ｂａ〕 好塩基球
〔Ｉｍ〕 幼若顆粒球
〔Ｉｍ１〕 幼若顆粒球群１
〔Ｉｍ２〕 幼若顆粒球群２
〔Ａ１〕 白血球からなる副集団
〔Ａ２〕 白血球以外の細胞からなる副集団
〔Ａ３〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
副集団 〔Ａ４〕 好酸球、好塩基球、幼若顆粒球以外
の白血球副集団 〔Ａ５〕 好酸球以外の白血球からなる副集団 〔Ａ６〕 リンパ球と断片化した赤血球からな
る副集団 〔Ａ７〕 断片化した赤血球と血小板からなる
副集団 〔Ａ８〕 白血球のみの副集団 〔Ａ９〕 好酸球以外の白血球からなる副集団 〔Ａ１０〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１１〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１２〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１３〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１４〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１５〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
の副集団 〔Ａ１６〕 好酸球以外の細胞集団 〔Ａ１７〕 単球、好中球、幼若顆粒球１、幼若
顆粒球２、好塩基球以外の白血球副集団 〔Ａ１８〕 白血球のみからなる集団 〔Ａ１９〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２０〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２１〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ｗ１〕〜〔Ｗ５８〕 ウィンド１〜５８
副集団 〔Ａ４〕 好酸球、好塩基球、幼若顆粒球以外
の白血球副集団 〔Ａ５〕 好酸球以外の白血球からなる副集団 〔Ａ６〕 リンパ球と断片化した赤血球からな
る副集団 〔Ａ７〕 断片化した赤血球と血小板からなる
副集団 〔Ａ８〕 白血球のみの副集団 〔Ａ９〕 好酸球以外の白血球からなる副集団 〔Ａ１０〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１１〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１２〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１３〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１４〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１５〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
の副集団 〔Ａ１６〕 好酸球以外の細胞集団 〔Ａ１７〕 単球、好中球、幼若顆粒球１、幼若
顆粒球２、好塩基球以外の白血球副集団 〔Ａ１８〕 白血球のみからなる集団 〔Ａ１９〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２０〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２１〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ｗ１〕〜〔Ｗ５８〕 ウィンド１〜５８
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年６月１１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】本発明独自の基本的原理は、２つの色素の
作用によって説明される。まず、アストラゾンイエロー
３Ｇのみで試料を染色した場合、アストラゾンイエロー
３Ｇは好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に蛍光染
色する。フローサイトメータで測定し、図４に示すよう
に、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラム、を描くと、白血球は緑蛍光強度あるいは赤蛍光
強度の差によって、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球〔Ｉ
ｍ〕、好酸球〔Ｅｏ〕からなる副集団と、他の白血球
〔Ａ１〕からなる副集団の２つの副集団に分離すること
ができる。あるいは図５に示すように、側方散乱強度と
緑蛍光強度あるいは赤蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムを描くと、白血球は、緑蛍光強度あるいは赤蛍
光強度と側方散乱光強度の差によって好塩基球〔Ｂａ〕
からなる副集団と、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕、好酸球〔Ｅ
ｏ〕からなる副集団と、好酸球以外の白血球〔Ａ１〕か
らなる副集団の３つの副集団に分離できるが、何れにし
ても幼若顆粒球のみを分類計数することはできない。
作用によって説明される。まず、アストラゾンイエロー
３Ｇのみで試料を染色した場合、アストラゾンイエロー
３Ｇは好塩基球、幼若顆粒球、好酸球を特異的に蛍光染
色する。フローサイトメータで測定し、図４に示すよう
に、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラム、を描くと、白血球は緑蛍光強度あるいは赤蛍光
強度の差によって、好塩基球〔Ｂａ〕、幼若顆粒球〔Ｉ
ｍ〕、好酸球〔Ｅｏ〕からなる副集団と、他の白血球
〔Ａ１〕からなる副集団の２つの副集団に分離すること
ができる。あるいは図５に示すように、側方散乱強度と
緑蛍光強度あるいは赤蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムを描くと、白血球は、緑蛍光強度あるいは赤蛍
光強度と側方散乱光強度の差によって好塩基球〔Ｂａ〕
からなる副集団と、幼若顆粒球〔Ｉｍ〕、好酸球〔Ｅ
ｏ〕からなる副集団と、好酸球以外の白血球〔Ａ１〕か
らなる副集団の３つの副集団に分離できるが、何れにし
ても幼若顆粒球のみを分類計数することはできない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４９】この方法を前述の染色法に適用した場合、
白血球の散乱光強度は非常に正確に測定できる。例え
ば、図１３に示すように赤蛍光強度−緑蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムで、好酸球〔Ｅｏ〕以外の血
球〔Ａ５〕の副集団のデータをウィンド２〔Ｗ２〕によ
って取り出し、図１４に示すように赤蛍光強度あるいは
緑蛍光強度と側方散乱光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムを描くと、他の血球〔Ａ５〕は、好塩基球〔Ｂ
ａ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、リンパ
球と白血球以外の血球からなる群〔Ａ６〕と、以外なこ
とに、幼若顆粒球は２つの群〔Ｉｍ１〕、〔Ｉｍ２〕の
６つの副集団に分離された。各白血球の副集団をウィン
ドで囲み計数することにより、６つの白血球の副集団の
分類計数が可能である。
白血球の散乱光強度は非常に正確に測定できる。例え
ば、図１３に示すように赤蛍光強度−緑蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムで、好酸球〔Ｅｏ〕以外の血
球〔Ａ５〕の副集団のデータをウィンド２〔Ｗ２〕によ
って取り出し、図１４に示すように赤蛍光強度あるいは
緑蛍光強度と側方散乱光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムを描くと、他の血球〔Ａ５〕は、好塩基球〔Ｂ
ａ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、単球〔Ｍｏｎｏ〕、リンパ
球と白血球以外の血球からなる群〔Ａ６〕と、以外なこ
とに、幼若顆粒球は２つの群〔Ｉｍ１〕、〔Ｉｍ２〕の
６つの副集団に分離された。各白血球の副集団をウィン
ドで囲み計数することにより、６つの白血球の副集団の
分類計数が可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５０】また、図１５に示すように、前方散乱光強
度の差に着目して、ウィンド３〔Ｗ３〕により、白血球
以外の血球からなる副集団〔Ａ７〕を除去して白血球の
みの副集団〔Ａ８〕のデータのみをとりだしたのち、赤
蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラム
図１６を描くと、白血球は好酸球〔Ｅｏ〕とその他の白
血球の副集団〔Ａ９〕とに分離される。さらに副集団
〔Ａ９〕を、ウィンド４〔Ｗ４〕によってとりだし、図
１７に示すように、側方散乱光強度と赤蛍光強度あるい
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描く
と、他の白血球の集団〔Ａ９〕はリンパ球〔Ｌｙｍ〕、
単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基部〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉ
ｍ２〕の６つの副集団に分離される。この場合は、７つ
の白血球の副集団の分類計数が可能である。
度の差に着目して、ウィンド３〔Ｗ３〕により、白血球
以外の血球からなる副集団〔Ａ７〕を除去して白血球の
みの副集団〔Ａ８〕のデータのみをとりだしたのち、赤
蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラム
図１６を描くと、白血球は好酸球〔Ｅｏ〕とその他の白
血球の副集団〔Ａ９〕とに分離される。さらに副集団
〔Ａ９〕を、ウィンド４〔Ｗ４〕によってとりだし、図
１７に示すように、側方散乱光強度と赤蛍光強度あるい
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムを描く
と、他の白血球の集団〔Ａ９〕はリンパ球〔Ｌｙｍ〕、
単球〔Ｍｏｎｏ〕、好中球〔Ｎｅｕｔ〕、好塩基部〔Ｂ
ａ〕、幼若顆粒球群１〔Ｉｍ１〕、幼若顆粒球群２〔Ｉ
ｍ２〕の６つの副集団に分離される。この場合は、７つ
の白血球の副集団の分類計数が可能である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６４】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２７】実施例１
本実施例は、赤蛍光、緑蛍光、側方散乱光の３つの光学
的情報を測定することにより、白血球を少なくとも、好
酸球、好塩基球、幼若顆粒球の３つの副集団に分離する
ための試料調製例である。
的情報を測定することにより、白血球を少なくとも、好
酸球、好塩基球、幼若顆粒球の３つの副集団に分離する
ための試料調製例である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４０】２．さらに、赤血球の影響を除去する工程
を組み合わせた場合、１つの測定用試料を測定するのみ
で、幼若顆粒球の分類計数を含む白血球の分類計数が可
能となる。最も好適な試料調製方法をもちいれば、少な
くとも白血球を７つに分類計数することが可能となる。
を組み合わせた場合、１つの測定用試料を測定するのみ
で、幼若顆粒球の分類計数を含む白血球の分類計数が可
能となる。最も好適な試料調製方法をもちいれば、少な
くとも白血球を７つに分類計数することが可能となる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】一般に市販され本発明を実施するのに使用され
るフローサイトメータの構成を示した概略図である。
るフローサイトメータの構成を示した概略図である。
【図２】血液学的試料から白血球以外の血球成分の影響
を除去した測定用試料を図１に示すフローサイトメータ
で測定して得られたスキャッタグラムである。
を除去した測定用試料を図１に示すフローサイトメータ
で測定して得られたスキャッタグラムである。
【図３】アストラゾンイエロー３Ｇによる染色で得られ
た、蛍光強度と側方散乱光強度とを座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
た、蛍光強度と側方散乱光強度とを座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
【図４】アストラゾンイエロー３Ｇによる染色で得られ
た、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
た、緑蛍光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
【図５】アストラゾンイエロー３Ｇのみで試料を染色し
て得られた側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムである。
て得られた側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標
軸とするスキャッタグラムである。
【図６】ニュートラルレッドのみで試料を染色して得ら
れた赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
れた赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
【図７】ニュートラルレッドのみで試料して染色して得
られた側方散乱光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
られた側方散乱光強度と赤蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
【図８】アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッ
ドの共存下で試料を染色して得られた、緑蛍光強度と側
方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
ドの共存下で試料を染色して得られた、緑蛍光強度と側
方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図９】アストラゾンイエロー３Ｇとニュートラルレッ
ドの共存下で試料を染色して得られた、赤蛍光強度と緑
蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
ドの共存下で試料を染色して得られた、赤蛍光強度と緑
蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図１０】アストラゾンイエロー３Ｇおよびニュートラ
ルレッドで試料を染色して得られた、赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
ルレッドで試料を染色して得られた、赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図１１】図１０のウィンド１〔Ｗ１〕で取出したデー
タの側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムである。
タの側方散乱光強度と緑または赤蛍光強度を座標軸とす
るスキャッタグラムである。
【図１２】赤血球の同時通過がある場合の、側方散乱光
強度と前方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラム
である。
強度と前方散乱光強度を座標軸とするスキャッタグラム
である。
【図１３】赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
ャッタグラムである。
【図１４】図１３のウィンド２〔Ｗ２〕からのデータの
赤蛍光強度または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
赤蛍光強度または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタ
グラムである。
【図１５】前方散乱光強度と側方散乱光強度を座標軸と
するスキャッタグラムである。
するスキャッタグラムである。
【図１６】図１５の副集団〔Ａ８〕のデータのみの赤蛍
光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
【図１７】図１６の副集団〔Ａ９〕のデータの側方散乱
光強度と赤蛍光強度あるいは緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムである。
光強度と赤蛍光強度あるいは緑蛍光強度を座標軸とする
スキャッタグラムである。
【図１８】赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
ャッタグラムである。
【図１９】図１８の副集団〔Ａ１１〕のデータの側方散
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
【図２０】赤蛍光強度と緑蛍光強度を座標軸とするスキ
ャッタグラムである。
ャッタグラムである。
【図２１】図２０の副集団〔Ａ１３〕のデータの側方散
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
乱光強度と赤あるいは緑蛍光強度を座標軸とするスキャ
ッタグラムである。
【図２２】実施例１で得られた試料の赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２３】実施例１で得られた側方散乱光強度と赤また
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２４】実施例２で得られた試料の赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２５】実施例２で得られた側方散乱光強度と赤また
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
は緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２６】実施例３で得られた試料の前方散乱光と側方
散乱光を座標軸とするスキャッタグラムである。
散乱光を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図２７】実施例３で得られた試料の赤蛍光強度と緑蛍
光強度のスキャッタグラムである。
光強度のスキャッタグラムである。
【図２８】実施例３において得られた側方散乱光強度と
赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッタグラムで
ある。
【図２９】実施例４の試料で得られた赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図３０】図２９の副集団〔Ａ２０〕のデータの側方散
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
【図３１】実施例５の試料で得られた赤蛍光強度と緑蛍
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
光強度を座標軸とするスキャッタグラムである。
【図３２】図３１の副集団〔Ａ２１〕のデータの側方散
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
乱光強度と赤または緑蛍光強度を座標軸とするスキャッ
タグラムである。
【符号の説明】
１ 光源
２ レンズ
３ 集光レンズ
４ 集光レンズ
５ ビームストーパー
６〜９ 光検出部
１０〜１１ ダイクロイックミラー
１３ 粒子
１４ シース液供給口
１５ 信号処理部
１６ 解析部
１７ ノズル
１８ フローセル
２０ 粒子の流領域
２１ 前方散乱光
２２ 赤蛍光
２３ 緑蛍光
２４ 側方散乱光
１′ リンパ球
２′ 単球
３′ 顆粒球
３″ 好中球
４′ 好酸球、幼若顆粒球
５′ 好塩基球
〔ＮＲＢＣ〕 赤芽球
〔Ｒ〕 赤血球
〔Ｅｏ〕 好酸球
〔Ｇｒａｎｕｌ〕 顆粒球
〔Ｌｙｍ〕 リンパ球
〔Ｍｏｎｏ〕 単球
〔Ｎｅｕｔ〕 好中球
〔Ｂａ〕 好塩基球
〔Ｉｍ〕 幼若顆粒球
〔Ｉｍ１〕 幼若顆粒球群１
〔Ｉｍ２〕 幼若顆粒球群２
〔Ａ１〕 好塩基球、好酸球および幼若顆粒球
以外の白血球からなる副集団 〔Ａ２〕 好酸球以外の細胞からなる副集団 〔Ａ３〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
副集団 〔Ａ４〕 好酸球、好塩基球、幼若顆粒球以外
の白血球副集団 〔Ａ５〕 好酸球以外の血球からなる副集団 〔Ａ６〕 白血球以外の血球からなる副集団 〔Ａ７〕 白血球以外の血球からなる副集団 〔Ａ８〕 白血球のみの副集団 〔Ａ９〕 好酸球以外の白血球からなる副集団 〔Ａ１０〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１１〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１２〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１３〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１４〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１５〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
の副集団 〔Ａ１６〕 好酸球以外の細胞集団 〔Ａ１７〕 単球、好中球、幼若顆粒球１、幼若
顆粒球２、好塩基球以外の白血球副集団 〔Ａ１８〕 白血球のみからなる集団 〔Ａ１９〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２０〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２１〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ｗ１〕〜〔Ｗ５８〕 ウィンド１〜５８
以外の白血球からなる副集団 〔Ａ２〕 好酸球以外の細胞からなる副集団 〔Ａ３〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
副集団 〔Ａ４〕 好酸球、好塩基球、幼若顆粒球以外
の白血球副集団 〔Ａ５〕 好酸球以外の血球からなる副集団 〔Ａ６〕 白血球以外の血球からなる副集団 〔Ａ７〕 白血球以外の血球からなる副集団 〔Ａ８〕 白血球のみの副集団 〔Ａ９〕 好酸球以外の白血球からなる副集団 〔Ａ１０〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１１〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１２〕 白血球以外の副集団 〔Ａ１３〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１４〕 好酸球以外の白血球の副集団 〔Ａ１５〕 好塩基球，幼若顆粒球以外の白血球
の副集団 〔Ａ１６〕 好酸球以外の細胞集団 〔Ａ１７〕 単球、好中球、幼若顆粒球１、幼若
顆粒球２、好塩基球以外の白血球副集団 〔Ａ１８〕 白血球のみからなる集団 〔Ａ１９〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２０〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ａ２１〕 好酸球以外の白血球集団 〔Ｗ１〕〜〔Ｗ５８〕 ウィンド１〜５８
Claims (7)
- 【請求項１】 １つの測定用試料をフローサイトメータ
で測定することにより、血液学的試料中の白血球を幼若
顆粒球群を含む３つの群に分類計数するための測定用試
料を調製する方法であって、以下の工程からなる方法： （１）血液学的試料のｐＨを、染色に適したｐＨに調整
する工程；および （２）血液学的試料に含まれる白血球を、 ｉ）少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を染色する色素で
あるアストラゾンイエロー３Ｇと ｉｉ）少なくとも好酸球を染色する色素であるニュート
ラルレッド の少なくとも２種類の色素で染色する工程。 - 【請求項２】 １つの測定用試料をフローサイトメータ
で測定することにより、血液学的試料中の白血球を幼若
顆粒球からなる群を含む６つの群に分類計数するための
測定用試料を調製する方法であって、以下の工程からな
る方法： （１）血液学的試料から白血球の形態を損なうこと無し
に、他の血球の影響を除去する工程； （２）血液学的試料のｐＨを、染色に適したｐＨに調整
する工程；および （３）血液学的試料に含まれる白血球を、 ｉ）少なくとも好塩基球と幼若顆粒球を染色する色素で
あるアストラゾンイエロー３Ｇと ｉｉ）少なくとも好酸球を染色する色素であるニュート
ラルレッド の少なくとも２種類の色素で染色することからなる工
程。 - 【請求項３】 血液学的試料から白血球の形態を損なう
こと無しに、他の血球の影響を除去する工程が赤血球を
断片化する工程であって、 （１）溶液のｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる
低浸透圧の第１の水性溶液と血液学的試料を混合するこ
とにより、血液学的試料中の赤血球を断片化し； （２）（１）の溶液に、白血球の形態を損なうこと無し
に保つための浸透圧補償剤と、第１の水性溶液中の酸を
中和するための緩衝剤からなる第２の溶液を、添加する
こと からなる、血液学的試料中の白血球を単球、好中球、好
酸球、好塩基球、幼若顆粒球群１、幼若顆粒球群２の６
つの群に分類計数する請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 血液学的試料から白血球の形態を損なう
こと無しに、他の血球の影響を除去る工程が、フローサ
イトメータを用いた測定時に蛍光強度の差によって白血
球と他の血球を分離するために、血液学的試料中の白血
球を、少なくとも白血球の細胞質あるいは核を染色する
少なくとも１種類の色素で染色する工程からなる、血液
学的試料中の白血球をリンパ球、単球、好中球、好酸
球、好塩基球、幼若顆粒球群の６つの群に分類計数する
ための請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 少なくとも白血球の細胞質あるいは核を
染色するための色素が （１） アストラゾンオレンジＲ （２） アストラバイオレット （３） ローダミン６Ｇ （４） ローダミン１９ （５） ローダミンＢ （６） ローダミン３ＧＯ （７） ピロニンＢ （８） シアノシン （９） ３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ からなる群の中から選ばれた少なくとも１種類の色素で
ある請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 血液学的試料から白血球の形態を損なう
こと無しに、他の血球の影響を除去する工程が、 （１）溶液のｐＨを酸性域に保つための緩衝剤からなる
低浸透圧の第１の水性溶液と血液学的試料を混合するこ
とにより、血液学的試料中の赤血球を断片化し； （２）（１）の溶液に、白血球の形態を損なうこと無し
に保つための浸透圧補償剤と、第１の水性溶液中の酸を
中和するための緩衝剤からなる第２の溶液を、添加し； （３）フローサイトメータを用いた測定時に蛍光強度の
差によって白血球と他の血球を分離するために、血液学
的試料中の白血球を、少なくとも白血球の細胞質あるい
は核を染色する少なくとも１種類の色素で、染色するこ
と からなる、血液学的試料中の白血球を少なくとも、リン
パ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、幼若顆粒球群
１、幼若顆粒球群２の７つの群に分類計数するための請
求項２記載の方法。 - 【請求項７】 少なくとも白血球の細胞質あるいは核を
染色するための色素が （１） アストラゾンオレンジＲ （２） アストラバイオレット （３） ローダミン６Ｇ （４） ローダミン１９ （５） ローダミンＢ （６） ローダミン３ＧＯ （７） ピロニンＢ （８） シアノシン （９） ３，３′−ジメチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１０）３，３′−ジエチルチオカルボシアニン アイ
オダイド （１１）３，３′−ジプロピルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１２）３，３′−ジヘキシルオキサカルボシアニン
アイオダイド （１３）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ドデ
シルアクリジニウム プロマイド （１４）７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンゾオキサ
ジアゾール （１５）７−フルオロ−４−ニトロベンゾオキサジアゾ
ール （１６）アストラゾンレッド６Ｂ からなる群の中から選ばれた少なくとも１種類の色素で
ある請求項６記載の方法。
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