JP2000329762A - 白血球測定用試薬及び白血球測定用試料調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 浸透圧補償剤による浸透圧調整による白血球
の分画性能の向上、特に、リンパ球と単球の分画性能の
向上を目的とした白血球測定用試料を調製するための試
薬および白血球測定試料の調製方法を提供する。 【解決手段】 上記の白血球測定用試薬は、（ａ）ｐＨ
を酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張な溶液から
なる赤血球溶血剤；および（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中
和するための緩衝剤と、溶液を白血球の分画性能を向上
させるための最終浸透圧が約４００〜約５００ｍＯｓｍ
／ｋｇである浸透圧補償剤とからなる溶液である。ま
た、白血球測定用試料調製方法は上記試薬を使用するも
のであって、（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を
含有する低張な溶液からなる赤血球溶血剤に、抗凝固処
理を施した新鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工
程；および（ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩
衝剤と、溶液を白血球の分画性能を向上させるための最
終浸透圧が約４００〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである浸
透圧補償剤とからなる溶液で処理された血液試料を加え
る工程からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査分野にお
いて、赤血球を除去した白血球測定用試料を調製するた
めの試薬および白血球測定試料の調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査分野おける血液検査において、
血液中の白血球を種類別に計数することは一般的に良く
行われており、白血球を分類をすることよって、病気の
診断に貢献することができることが知られている。白血
球を分類する方法には、光源と、試料中の細胞が細い流
路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せられ
た光を検出する測光部と、検出信号の強度によっては散
乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって白血球を
分類しようとしたものである。この方法では、血球を染
色し、染色された血球を光で照射し、そのとき血球から
発する蛍光および場合によっては散乱光を一緒に検出
し、検出信号の強度によって血球を分類しようとするも
のである。

【０００３】この方法に属する第１の方法としては、特
公平７−２３８９０があり、ｐＨを酸性域に保つための
緩衝剤を含有する低張な溶液からなる赤血球溶血剤と、
上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と溶液を白血
球の形態を保持する浸透圧に調整する浸透圧補償剤とか
らなる溶液からなり、赤血球を除去した白血球測定用試
料を調製するための試薬および白血球測定試料の調製方
法である。この方法によれば、酸性低張処理により赤血
球−白血球の同時通過が無視できるところまで赤血球が
ゴースト化され、白血球の分画性能が向上している。

【０００４】第２の方法としては、特公平７−２６９５
５があり、酸性溶解試薬により全血試料を非赤血球画分
と赤血球画分から効果的に区別し、さらに抑制剤により
溶解活性を著しく低下させると同時に中和し、特異的な
インディケータ標識結合物質との免疫化学的相互作用に
より非赤血球画分をさらに副集団に分ける方法である。
この方法によれば、非赤血球画分を自然な生理的状態に
維持しながら赤血球画分の迅速で完全な溶血を達成する
ことができる。

【０００５】しかしながら、上記の２つの方法おいて、
浸透圧補償剤（抑制剤）による浸透圧調整による白血球
の分画性能の向上については全く開示されていない。特
に、リンパ球と単球の分画性能の向上について触れられ
ていない。

【０００６】また、ＨＩＶ感染者のＡＩＤＳ発症のモニ
タリング、ＨＩＶ感染者の症状の確認と治療（発症を遅
らせる）のサポートに、リンパ球サブセットであるＣＤ
４カウント、ＣＤ４／ＣＤ８の比率のモニタリングが有
効でことが知られている。しかしながら、リンパ球に赤
血球ゴースト成分、単球が混入すると、ＣＤ４カウン
ト、ＣＤ４／ＣＤ８の比率を正確に求めることができな
いことがわかっている。そのため、赤血球ゴースト成分
に加えて、リンパ球と単球の分画精度の向上が望まれて
いる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記事情に鑑
みてなされたもので、浸透圧補償剤による浸透圧調整に
よる白血球の分画性能の向上、特に、リンパ球と単球の
分画性能の向上を目的とした白血球測定用試料を調製す
るための試薬および白血球測定試料の調製方法を課題と
する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決するためにｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有
する低張な溶液からなる赤血球溶血剤による溶血処理後
に、上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と浸透圧
に調整する浸透圧補償剤とからなる溶液の浸透圧と白血
球の分画性能につてい種々の検討を加え、下記の知見を
得ることにより本発明を完成した。すなわち、浸透圧補
償剤による最終浸透圧が約４００〜約５００ｍＯｓｍ／
ｋｇの範囲にあるとき、白血球集団の集合能が上がり、
白血球（リンパ球、単球、顆粒球）の分画性能が向上
し、特にリンパ球と単球の分離が特に向上することを見
い出した。つまり、本発明は白血球測定用試薬は、
（ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張
な溶液からなる赤血球溶血剤；および（ｂ）上記緩衝剤
中の酸を中和するための緩衝剤と、溶液を白血球の分画
性能を向上させるための最終浸透圧が約４００〜約５０
０ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧補償剤とからなる溶液で
ある。

【０００９】また、本発明の白血球測定用試料調製方法
は上記試薬を使用するものであって、（ａ）ｐＨを酸性
域に保つための緩衝剤を含有する低張な溶液からなる赤
血球溶血剤に、抗凝固処理を施した新鮮な血液を加え
て、赤血球を溶血させる工程；および（ｂ）上記緩衝剤
中の酸を中和するための緩衝剤と、溶液を白血球の分画
性能を向上させるための最終浸透圧が約４００〜約５０
０ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧補償剤とからなる溶液で
処理された血液試料を加える工程からなる。

【００１０】

【実施の形態】ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有
する低張な溶液からなる赤血球溶血剤（第１液）とは、
特公平７−２３８９０に開示されたものが使用できる。
ｐＫａ３．５±１．５ならばいずれの緩衝剤でも使用可
能でり、例えばマレイン酸、マロン酸、フタル酸、ジグ
リコール酸、サリチル酸、フマル酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸などである。緩衝剤の濃度は、第１液の浸
透圧を低くすることが望ましい。本発明の目的には５０
ｍＭ以下が望ましく、さらに、好適には、５〜３０ｍＭ
が望ましい。

【００１１】また、赤血球溶血剤の浸透圧は低いほど赤
血球の溶血が速やかに行われる。本発明の目的には０〜
１００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、特に、０〜５０ｍＯｓｍ
／ｋｇであることが好ましい。

【００１２】赤血球溶血剤中の酸を中和するための緩衝
剤と、溶液を白血球の分画性能を向上させるための最終
浸透圧が約４００〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透
圧補償剤とからなる溶液（第２液）とは、ｐＫａ７．０
〜９．５の緩衝剤であれば、いずれの緩衝剤でも使用可
能である。例えば、リン酸、トリス、トライシン、ビシ
ン、２−アミノ−メチル−１，３−プロパンジオール、
タウリン、ホウ酸、セリンなどである。

【００１３】また、最終浸透圧は白血球分画性能に影響
し、約４００〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、特に約
４００ｍＯｓｍ／ｋｇが望ましい。浸透圧補償剤は、塩
類が使用できる。例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等の塩類が
使用可能である。ここで、最終浸透圧とは第１液と血液
を混合した後に、第２液を添加したときの浸透圧であ
る。

【００１４】調製した試料を測定するには、例えば図１
に示すような構造のフローサイトメータ（例えば、ＦＡ
ＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社）が使用でき、
特に改良の必要がない。光源は、使用する蛍光色素波長
に合わせて適宜選択することができる。

【００１５】本発明を以下の実施例によって説明する
が、本発明の範囲はこれに限定されない。

【００１６】

【実施例】第１液：１種類、第２液：８種類についての
組み合わせにおいて、健常人から採取した血液を用い
て、第１液と混合した後に、第２液を添加し、最終浸透
圧が白血球分画に与える影響を確認した。具体的には血
液５０μＬに対して、第１液５００μＬを添加し、３０
秒間室温で放置した後、第２液を１０００μＬ添加して
混合し、５分間室温で放置した。最終的に調製されたサ
ンプルは、一般的に使用されるフローサイトメータで測
定し、前方散乱強度、側方散乱強度によるスキャッタグ
ラム（２次元分布図）を得た。このようにして得られた
スキャタグラムを図２〜図５に示した。図中、Ｌｙｍｐ
はリンパ球、Ｍｏｎｏは単球、Ｇｒａｎは顆粒球を示
す。

【００１７】 第１液、第２液の組成は以下の通りである。 第１液 １０ｍＭクエン酸−リン酸２ナトリウム緩衝剤 ｐＨ３．０、浸透圧６２ｍＯｓｍ／ｋｇ 第２液 ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤 ｐＨ７．７ 上記緩衝剤に塩化ナトリウム（浸透圧補償剤）を加え
て、最終浸透圧が１００、２００、３００、４００、５
００、６００、７００、８００ｍＯｓｍ／ｋｇになるよ
うな８種類の溶液

【００１８】図２〜５に示したスキャッタグラムに示し
たように、従来例の最終浸透圧（２００ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ）と比較例の最終浸透圧（８００ｍＯｓｍ／ｋｇ）に
比べて、最終浸透圧が４００、５００ｍＯｓｍ／ｋｇと
き、白血球集団の集合能が上がり、白血球（リンパ球、
単球、顆粒球）の分画性能が向上し、特にリンパ球と単
球の分離が向上していることがわかる。

【００１９】次に、リンパ球と単球の集合能を測る物差
しとして、リンパ球と単球の集団（ゲートで囲まれた領
域）のそれぞれの前方散乱光強度と側方散乱光強度のヒ
ストグラムの標準偏差を求め、図６〜９のグラフに示し
た。図６〜９に示されたように、最終浸透圧４００、５
００ｍＯｓｍ／ｋｇときにリンパ球と単球のそれぞれの
側方散乱光と前方散乱光のヒストグラムの標準偏差が小
さくなり、リンパ球と単球の集合能が上がっていること
がわかる。

【００２０】

【発明の効果】本発明は、次のような効果を奏する。本
発明は、抗凝固剤処理を施した血液にｐＨを酸性域に保
つための緩衝剤を含有する低張な溶液からなる赤血球溶
血剤による溶血処理後に、上記緩衝剤中の酸を中和する
ための緩衝剤と浸透圧を調整する浸透圧補償剤とからな
る溶液を添加し、最終浸透圧を約４００〜約５００ｍＯ
ｓｍ／ｋｇに保つことにより、白血球の分画性能が向上
し、特にリンパ球と単球の分離が向上し、より正確な白
血球分類ができるようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に使用できるフローサイトメータの概略
図である。

【図２】従来例（最終浸透圧：２００ｍＯｓｍ／ｋｇ）
のスキャッタグラムを示した図である。

【図３】本発明（最終浸透圧：４００ｍＯｓｍ／ｋｇ）
のスキャッタグラムを示した図である。

【図４】本発明（最終浸透圧：５００ｍＯｓｍ／ｋｇ）
のスキャッタグラムで示した図ある。

【図５】比較例（最終浸透圧：７００ｍＯｓｍ／ｋｇ）
のスキャッタグラムで示した図である。

【図６】リンパ球の前方散乱強度ヒストグラムの標準偏
差を示した図である。

【図７】リンパ球の側方散乱強度ヒストグラムの標準偏
差を示した図である。

【図８】単球の前方散乱強度ヒストグラムの標準偏差を
示した図である。

【図９】単球の側方散乱強度ヒストグラムの標準偏差を
示した図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（ａ）および（ｂ）からなる白血球
   測定用試薬。 （ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張
   な溶液からなる赤血球溶血剤； （ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
   液を白血球の分画性能を向上させるための最終浸透圧が
   約４００〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧補償剤
   とからなる溶液。
2. 【請求項２】 下記（ａ）および（ｂ）の工程からなる
   ことを特徴とする白血球測定用試料調製方法。 （ａ）ｐＨを酸性域に保つための緩衝剤を含有する低張
   な溶液からなる赤血球溶血剤に、抗凝固処理を施した新
   鮮な血液を加えて、赤血球を溶血させる工程； （ｂ）上記緩衝剤中の酸を中和するための緩衝剤と、溶
   液を白血球の分画性能を向上させるための最終浸透圧が
   約４００〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである浸透圧補償剤
   とからなる溶液で処理された血液試料を加える工程。