DE3854983T2 - System zur isolierung und identifizierung von leukozyten - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Diese Erfindung bezieht sich auf wäßrige, lytische Reagenzsysteme und ihre Verwendung beim Auftrennen von Voliblutproben.
Beschreibung des Standes der Technik
• Die Trennung von komplexen, biologischen Fluids (z.B. Vollblut) in ihre verschiedenen wesentlichen Elemente vor der Untersuchung und der Analyse ihrer Bestandteile ist allgemein wünschenswert und oft ein wesentliches Erfordernis von zahlreichen eingesetzten, analytischen Protokollen und/oder in derartigen Studien und Analysen verwendeten Instrumentierungen. Wo eine derartige Studie oder Analyse der fluiden Fraktion der Probe von primärem Interesse ist, wird die zelluläre Fraktion von der Probe ohne Rücksicht auf die Aufrechterhaltung der Zellebensfähigkeit oder der Unversehrtheit der Membran abgetrennt. Im Gegensatz dazu erfordert dort, wo die Zellfraktion selbst von primärem Interesse für den Forscher oder den Mediziner ist, die Auftrennung der Vollblutprobe in ihre verschiedenen zellulären Komponenten, daß die Probenbehandlungs/Verarbeitungstechniken entsprechend angepaßt werden. Die traditionellen Verfahren zum Trennen von Vollblutproben in ihre verschiedenen zellulären Komponenten ist durch Zentrifugieren. Obwohl dieses Verfahren effizient ist, ist es arbeitsintensiv, relativ ineffizient und erfordert eine physikalische Handhabung der zelluläre Fraktion der Probe.
• Wo eine derartige Trennung/Auftrennung der zellulären Fraktion der Probe mit chemischen Mitteln versucht wird, waren die Ergebnisse aus einer Mehrzahl von Gründen weniger als vollständig zufriedenstellend. Genauer ist die Vitalität und Lebensfähigkeit einer Zellpopulation invivo oder invitro von dem Aufrechterhalten einer präzisen physiologischen Umgebung abhängig, welche mit der Aufrechterhaltung der physikalischen Zellstruktur und des chemischen Gleichgewichts in der Zelle übereinstimmt. Dieses Gleichgewicht wird durch die Permeabilität und Transportcharakteristika der Zellmembran gesteuert. Eine Veränderung in der phyisologischen Umgebung wird demgegenüber eine Reaktion oder Änderung in der Zellmembran bewirken. Die Membranreaktion ist von "defensiver" Art, d.h. die physiologische Reaktion der Membran ist so berechnet, daß das chemische Gleichgewicht in der Zelle und folglich ihre fortgesetzte und ununterbrochene Vitalität aufrechterhalten wird.
• Es ist vollständig anerkannt, daß eine solche Änderung in der idealen physiologischen Umgebung der Zelle nur innerhalb von Grenzen toleriert werden kann und daß, wenn derartige Grenzen überschritten werden, eine permanente Schädigung an der Zelle auftreten kann. Wie dies weiter in der Technik erkannt wird, können derartige Änderungen in der Umgebung (z.B. Toxizität des Verdünnungsmediums - selbst mit destilliertem Wasser) eine Hämolyse der Zellen beeinflussen.
• Der Grad der widerstandsfähigkeit von verschiedenen Zellpopulationen in Vollblut gegenüber Veränderungen in ihrer physiologischen Umgebung wurde extensiv studiert und dokumentiert. Die Effekte der Veränderung in verschiedenen Aspekten der physiologischen Umgebung der zellulären Fräktion von Vollblut sind sowohl fein als auch dramatisch und können durch Nahrungsmetaboliten und/oder Fremdsubstanzen beeinflußt werden. Diese Studien umfassen das Aufzeichnen der Reaktion von zellulären Präparaten gegenüber verschiedenen Wirkstoffen, Da Costa, A.J. et al, Transfusion, (1973), 13, 305; gegenüber Nahrungsunausgeglichenheit, Kobayashi, T. et al, Journal of Biochemistry (1983) 93, 675; und gegenüber Änderungen im pH, Rother, U. et al. Z. Immunologie Forschungsgemeinschaft (1978) 155, 118, und Schettini, F. et al, Acta Paediat. Scand. (1971), 60, 17.
• In jedem der obengenannten Artikel bewirkte ein Medikament, Nahrungsmetabolit oder eine Änderung im pH eine signifikante veränderung in der physiologischen Umgebung des Blutes bis zu dem Grad, wo die Hämolyse von roten Blutzellen vollzogen war.
• Genauer berichtet der oben zitierte Artikel von Rother die Serumaktivierung durch Ansäuern (pH 6,4) mit Chlorwasser stoff säure, welche unsensibilisierte Erythrocyten in der Gegenwart von EDTA auflöste. Der Artikel vergleicht den Effekt eines derartigen Ansäuerns mit der "abgeleiteten Zerfall"-Aktivität, welche nach der Serumäktivierung mit Insulin beobachtet wurde. Eine unabhängige und nicht in Zusammenhang stehende Studie von Schettini und seinen Mitarbeitern schloß, daß rote Blutzellen von Säuglingen und Kleinkindern empfindlicher gegen saure Hämolyse waren als rote Blutzellen von älteren Individuen.
• Bis zur Gegenwart ist keine chemische Behandlung verfügbar, um schnell und effizient eine Vollblutprobe in lebensfähige Zellfraktionen auf zutrennen. Wo eine oder mehrere chemische Behandlungen der Vollblutprobe verwendet werden (wie bei der Herstellung oder Vorbehandlung von Vollblut für die Duchführung von Unterscheidungen von weißen Blutzellen) war der wichtigste Punkt einer derartigen Behandlung das Verändern der Probe, um die Unterscheidung ihrer Zellkomponenten voneinander, basierend auf einer Isolation/Analyse von (i) den Zellbruchstücken (Z.B. Zellkernen), welche nach einer derartigen Behandlung zurückbleiben; (ii) dem Fixieren der Zellen durch derartige chemische Behandlungen; oder (iii) die relativ schwierige Modifikation von derartigen Zellen, welche gegebenenfalls in ihrer abschließenden Disintegration resultiert. Derartige relativ harte und zerstörende, chemische Behandlungen von Vollblutproben wurden jedoch erfolgreich angewandt, wo sie mit relativ hoch entwickelten Instrumentierungen kombiniert wurden. Genauer wurde die Fähigkeit zum Verändern der physiologischen Umgebung einer Zellpopulation in vitro verwendet, um in der Messung von bestimmten Zellparametern voranzuschreiten und um die individuellen Populationen zu quantifizieren. Die ausgeprägte Reaktion von jeder individuellen Zellpopulation gegenüber einer Veränderung in ihrer physiologischen Umgebung hatte spezielle Vorteile in der Identifizierung der individuellen Leukozyten-Subpopulationen von Zellen des Gesamtblutes. Die Leukozytenpopulation von Blut wurde zuvor in zwei Hauptfraktionen klassifiziert; die Lymphoid- und die Myeloidfraktion. Die Lymphoidfraktion besteht aus Lymphozyten (B- und T-Zellen). Die Myeloidfraktion besteht aus Monozyten und Granulozyten (Neutrophilen, Basophilen und Eosinophilen). Eine akzeptierte Technik für die Modifikation der physiologischen Umgebung der Zellpopulation von Vollblut war durch den Zusatz von bestimmten, sogenannten "lytischen Reagenzien" zu einer Blutprobe. Die Entwicklung von bestimmten lytischen Reagenzien und lytischen Reagenzsystemen hat den Mediziner mit der Fähigkeit versehen, effizient die weiße Blutzellenpopulation (in der Folge "Leukozyten") von der roten Blutzellenpopulation von Vollblut zu isolieren. Die relative Konzentration von Leukozyten in der Blutprobe und das massive morphologische Auftreten von bestimmten Klassen dieser Zellen können klinisch signifikant sein.
• Diese Fähigkeit, die Leukozytenpopulation weiter zu differenzieren, stellt ein unbezahlbares diagnostisches Instrument in der Studie und Behandlung von verschiedenen Erkrankungen zur Verfügung. Wie weiters festgestellt wird, ist je größer die Zahl der Subpopulationen von Leukozyten ist, welche indentifizierbar sind, desto genauer und zuverlässiger die Identifikation von jeder der derartigen Subpopulationen.
• Eine Auzahl von Literaturstellen sind in der jüngsten Patentliteratur aufgetaucht, welche verschiedene Reagenzsysteme und Techniken für die Erhöhung der Fähigkeit automatisierter Instrumentierungen zur Durchführung von weißen Blutzellendifferenzierungen offenbaren. Die folgenden Literaturstellen sind für die auf diesem Gebiet bedeutende Patentliteratur repräsentativ: US-Patente 3 874 852; 4 286 963; 4 346 018; 4 485 175; 4 520 274; 4 529 704 und US-Anmeldungen Ser.Nr. 615 961 (entspricht der internationalen Anmeldung PCT/US85/ 00954, veröffentlicht am 19. Dezember 1985); und Ser.Nr. 615 966 (entspricht der internationalen Anmeldung PCT/US85/ 00868, veröffentlicht am 19. Dezember 1985), auf welche alle in ihrer Gesamtheit Bezug genommen wird.
• US-Patent 3 874 852 (für Hamill) beschreibt ein Reagenzsystem und ein Verfahren, welches in der Durchführung von Leukozyten- und Hämoglobinbestimmungen von Vollblut verwend bar ist. Dieses Reagenzsystem umfaßt eine im wesentlichen Eisencyanid-freie, wäßrige Lösung von quaternärem Ammoniumsalz und Cyanidionen. Dieses Reagenzsystem ist effizient, um sowohl rote Blutzellen als auch Blättchenzellen in Vollblut zu stromatolysieren und in der Umwandlung von dem freien Hämoglobin in ein chromagen. Dieses System ist als effizient für Leukozyten- und Hämoglobinbestimmungen mit diagnostischer Genauigkeit bezeichnet. Das in diesem System erhältliche Leukozyten-Populationsprofil ist jedoch auf eine Gesamtzählung der weißen Zellen beschränkt, ohne weitere Differenzierung dieser zellulären Fraktion in diskrete Subpopulationen.
• US-Patent 4 286 963 (für Ledis, et al) beschreibt ein lytisches Verdünnungsmittel und ein Verfahren zum Erreichen einer schnellen Lyse von roten Blutzellen im Vollblut. Dieses Verdünnungsmittel beschleunigt die Fähigkeit einer automatisierten Instrumentierung, um unterscheidende Bestimmungen von Lymphoid- und Myeloid-Subpopulationen von Leukozyten in der quantitativen Bestimmung von Hämoglobin durchzuführen. Das lytische Verdünnungsmittel, welches von Ledis beschrieben ist, ist aus einer Mischung von zumindest einem quaternären Ammoniumsalz und einem kurzkettigen, Aryl-substituierten Alkanol in gepuffertem, wäßrigen Medium (pH 3,5 - 5,0) zusammengesetzt. Das lytische Verdünnungsmittel dieses Ledis-Patentes ist jedoch in seiner Fähigkeit einer Durchführung einer Auftrennung der Leukozytenpopulation auf die zwei (2) Hauptsubpopulationen, nämlich die Lymphoid- und Myeloidfraktionen, beschränkt
• US-Patent 4 346 018 (für Carter, et al.) beschreibt ein Blutverdünnungsmittel für mehrere Zwecke und ein Verfahren zur Verwendung dieses Verdünnungsmittels in Kombination mit einem schwach lösenden Reagenzsystem für die Durchführung der Hämoglobinbestimmung und die Differenzierung von Lymphozyten in die Lymphoid- und Myeloid-Subpopulationen. Dieses Verdünnungsmittel umfaßt unter anderen Bestandteilen N-(2- Acetamido)iminodiessigsäure (ADA) als ein Blutstabilisierungsmittel. Das lösende Agens umfaßt eine wäßrige Lösung aus zumindest einem quaternären Ammoniumsalz. Das Verdünnungsmittel/lytische Reagenz dieses Carter-Patentes ist jedoch in seiner Fähigkeit einer Durchführung einer Auftrennung der Leukozytenpopulation auf die zwei (2) prinzipiellen Subpopulationen, nämlich die Lymphoid- und Myeloidfraktionen, beschränkt. Zusätzlich wurde gefunden, daß ADA die Größenverteilung, Zellform und am bedeutendsten den hohen Grad der Zellverteilung von Erythrozyten und Blättchen in einem Ausmaß, welches zuvor mit anderen Verbindungen noch nicht beobachtet wurde, zu stabilisieren hilft.
• US-Patent 4 485 175 (für Ledis et al) beschreibt ein Reagenzsystem und ein Verfahren zur Durchführung von unterscheidenden Bestimmungen von Leukozyten in drei (3) Subpopulationen unter Verwendung einer automatisierten Zellzähleinrichtung. Dieses Reagenzsystem umfaßt ein Blutverdünnungsund ein Auflösungsmittel. Das Auflösungsmittel (umfassend eine wäßrige Mischung aus quaternären Ammoniumsalzen) bewirkt, wenn es zu der verdünnten Blutprobe unter milden Bedingungen und Konzentrationen und in einer relativ langsamen Rate zugesetzt wird, unerwartete Volumsmodifikationen für die verschiedenen Leukozyten- Subpopulationen. Die Entdekkung, welche das Erreichen des Grades der Differenzierung der Leukozytenpopulation von Ledis et al. ermöglichte, basiert auf der Beobachtung der relativ größeren Empfindlichkeit der Granulozyten-Subpopulation gegenüber lytischen Agentien. Durch Steuern der Rate des Aussetzens der Lymphozytenpopulation an lytische Agentien wird die Granulozyten- Subpopulation besser konserviert. Das Reagenzsystem von diesem Patent von Ledis et al. ist jedoch in seiner Fähigkeit einer Durchführung der Differenzierung der Leukozytenpopulation auf drei (3) Subpopulationen, namlich Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten, beschränkt.
• Obwohl alle oben genannten lytischen Agentien und Reagenz systeme die Differenzierung der Leukozytenfraktion einer Blutprobe (in einem größeren oder kleineren Ausmaß) erleichtern, leidet jedes an einem gemeinsamen Mangel, nämlich der Unfähigkeit, eine derartige Differenzierung ohne nachteiliges Verändern des chemischen Gleichgewichtes der Zellen, welche einer derartigen Behandlung unterworfen werden, durchzuführen. Wo eine derartige Änderung in dem chemischen Gleichgewicht induziert wird, kann die Wirkung auf die Zellpopulation von relativ kleineren Veränderungen (d.h. Quellen) bis zum Auflösen reichen. Dramatische chemische Veränderungen in der physiologischen Umgebung der Leukozytenpopulation ändern auch die immunochemische Antwort der Leukozyten-Oberflächenmarker. Die Behandlung von Leukozyten mit derartigen traditionellen lytischen Agenssystemen ist daher mit der weiteren immunochemischen Untersuchung dieser Leukozyten inhärent unverträglich.
• Die CA-A-1087966 offenbart ein Reagenz, welches aus einer hypotonischen Lösung, umfassend eine Säure, welche Erythrozyten in Blutproben zu zerstören hilft, gebildet ist. Genauer beschreibt die CA-A-1087966 das Visualisieren von Basophilen durch direktes Vermischen der Blutprobe mit einem hypotonischen, wäßrigen Reagenz, enthaltend ein Metachromat- Agens, ein Fixierungsmittel für Leukozyten und Basophilen und eine Säure, welche geeignet ist, zu der Zerstörung der Erythrozyten, welche zumindest teilweise durch in dem Reagenz enthaltenes Wasser bewirkt wird, beizutragen. Die Menge der Säure ist 50, daß der End-pH der Probe/Reagenz zwischen 3 und 5 liegt. Die Basophilen werden gefärbt und dann durch mikroskopische Überprüfung identifiziert.
Zusammenfassung der Erfindung
• Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein neues wäßriges, lytisches Reagenzsystem für die selektive, chemische Behandlung von Vollblut geeignet. Das neue System umfaßt Saponin und ein lytisches Reagenz, ausgewählt aus Carbonsäuren der Formel RCOOH, Sulfonsäuren der Formel R'SO&sub3;H und Phenolen, welche durch 1 bis 3 elektronenziehende Gruppen ringsubstituiert sind, wobei R H oder ein aliphatischer C&sub1;&submin;&sub3; Kohlenwasserstoffrest ist, welcher gegebenenfalls durch eine oder mehrere Carbonyl- und/oder Hydroxy-Gruppen substituiert ist, und R' OH, ein aliphatischer C&sub1;&submin;&sub3; Kohlenwasserstoffrest oder Aryl ist.
• Das neue System kann zum schnellen und effizienten Auftrennen einer Vollblutprobe in eine im wesentlichen intakte Leukozytenfraktion und eine gelöste Erythrozytenfraktion verwendet werden. Es kann für die differenzierende Bestimmung von Leukozyten-Subpopulationen von Vollblut verwendet werden. Dies kann durch (a) Messen der physikalischen und/ oder optischen Eigenschaften von derartigen Subpopulationen und/oder (b) Beobachten der immunochemischen Antwort oder Wechselwirkung derartiger Subpopulationen mit Immunoreagenzien (z.B. Antiserum), welche für einen oder mehrere Oberflächenmarker auf jede von derartigen Zellsubpopulationen spezifisch sind, durchgeführt werden.
• Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfaßt ein Kit das wäßrige, lytische Reagenzsystem und als ein Quench eine alkalische, wäßrige Salzlösung. Die primären Funktionen des Quench sind, die Aktivität des lytischen Reagenz zu verzögern und das ionische Gleichgewicht der Probe nach ihrer Behandlung mit dem lytischen Reagenz wiederherzustellen.
• Das lytische Reagenzsystem und das Verfahren gemäß dieser Erfindung haben als allgemein dargelegte Ziele die selektive Hämolyse der Erythrozytenpopulation einer Vollblutprobe, wobei die nachfolgende Isolation, Identifizierung und/oder Analyse von einer oder mehreren der Leukozyten-Subpopulationen derselben Probe erleichtert wird, basierend auf einem oder mehreren der physikalischen, physiologischen und/oder immunochemischen Charakteristika, welche für die interessierende Subpopulation indikativ sind. Wenn die geeignete Konzentration des lytischen Reagenz zu einer Vollblutprobe zugesetzt wird, ist ihre Dissoziation effizient, um die Probe anzusäuern (pH 2,6 bis 4,0), während die Osmolarität der Probe unter 100 mOs gehalten wird.
Beschreibung der Erfindung
• Wenn das lytische Reagenz eine Carbonsäure ist, ist es vorzugsweise aus Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure, Succinsäure, Milchsäure und deren Mischungen ausgewählt.
• Wenn das lytische Reagenz eine Sulphonsäure ist, ist es vorzugsweise aus Schwefelsäure, Methansulphonsäure, Ethansulphonsäure, Benzolsulphonsäure, p-Toluolsulphonsäure, m- Nitrobenzolsulphonsäure und deren Mischungen ausgewählt.
• Wenn das lytische Reagenz ein substituiertes Phenol ist, ist es vorzugsweise aus p-Nitrophenol, m-Nitrophenol, o-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Chlorphenol, p-Cyanophenol, 1- Chlor-2,4-dinitrophenol und deren Mischungen ausgewählt.
• Die zuvor genannten sind repräsentativ für die Klassen von Materialien, welche als lytische Reagenzien in Ubereinstimmung mit den Zielen dieser Erfindung verwendet werden können. Es wird angenommen, daß die relativ schwachen Säuren sowohl als eine undisoziierte Verbindung als auch in dem dissoziierten Zustand in der Probe vorliegen. Starke Säuren sind selbstverständlich im wesentlichen vollständig in der Probe dissoziiert. Bestimmte undissoziierte Säuren und die Gegenionen der dissozuerten Säuren können offensichtlich den Grad der Differenzierung der Leukozytenfraktion in Abhängigkeit von ihrer relativen Konzentration in der Probe und die physiologische Erkennung (sofern vorhanden) der Säure und/oder ihres Gegenions durch die interessierenden Zellanalyte beeinflussen. Beispielsweise ist Phosphorsäure selbst in dem geeigneten pH im allgemeinen nicht akzeptabel, um eine Differenzierung der Leukozyten in fünf Subpopulationen zu erreichen. Es wird angenommen, daß die Gegenionenkompatibilität (Phosphation) unakzeptabel ist und daher die Differenzierung der Leukozytenpopulation eindeutig schwieriger ist.
• Das lytische System der Erfindung enthält vorzugsweise 0,01 bis 0,1 %, bevorzugter 0,05 bis 0,5 %, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,25 % (v/v), des lytischen Reagenz, z.B. in deionisiertem Wasser. Eine zur (Differenzierung wirksame Menge) wird verwendet, d.h. eine Konzentration des lytischen Reagenz, welche nicht nur zum Auflösen der roten Blutzellen effizient ist, sondern auch feine Änderungen in der Leukozyten-Zellfraktion bewirkt, um die darauffolgende Isolierung, Identifizierung und/oder Analyse dieser Leukozyten- Zellfraktion zu erleichtern; umfassend die Fähigkeit der Instrumentierung, eine Differentialanalyse und Identifizierung von wenigstens fünf Subpopulationen von Leukozyten durchzuführen.
• Das bevorzugte lytische Reagenz ist Ameisensäure und/oder Essigsäure, z.B. in einer Mischung, in welcher Ameisensäure der hauptsächliche, funktionelle Bestandteil ist und die Essigsäure in einer geringeren Menge vorhanden ist. Die Konzentration der Essigsäure kann 0,05 bis 0,1 % (v/v) sein. Die bevorzugte Konzentration von Ameisensäure ist 0,10 bis etwa 0,25 % (v/v). Die Konzentration eines derartigen bevorzugten, lytischen Reagenz, welches als die zuvor genannten Kriterien erfüllend bestimmt wurde, ist von 9 bis 20 µl Ameisensäure pro ml Vollblut. Die feine Modifikation der Leukozytenfraktion durch das lytische Reagenz wird dann erreicht, während die immunochemische Antwort auf die Oberflächenmarker jeder der fünf Zell-Subpopulationen von Leukozyten konserviert wird. Wie zuvor ausgeführt, ist es das erste Ziel dieser Behandlung der Vollbutprobe mit dem lytischen Reagenz, daß ein derartiges Reagenz die Stromatolyse der Erythrozyten-Zellfraktion effizient vervollständigt, während es die Leukozytenfraktion in ihrem im wesentlichen nativen Zustand konserviert.
• Das Reagenzsystem enthält Saponin zusätzlich zu dem lytischen Reagenz. Der Ausdruck (Saponin) soll sich auf eine kommerzielle Qualität von Quillajasaponinpulver beziehen. Der Zusatz von Saponin ist insbesondere geeignet, wenn ein Mediziner bestimmte Parameter der Leukozyten-Subpopulation mit anderen als durch photooptische oder immunochemische Techniken beobachtet. Der Zusatz von geeigneten Mengen von Saponin zu dem lytischen Reagenzsystem ist wirksam in seiner Fähigkeit, die Größe von roten Zellfragmenten zu verringern, um ihre Wechselwirkung in der Bestimmung von bestimmten Leukozyten-Parametern durch Messen der elektrischen Opazität und/oder des Coulter-Volumens unter Verwendung der in den US-Patenten 2 656 508 und 3 502 974 von Coulter (welche hier als Bezug in ihrer Gesamtheit enthalten sind) beschrieben sind, zu verhindern. Der bevorzugte Konzentrationsbereich von Saponin, welcher als effizient für die Reduktion von roten Zellfragmenten bestimmt wurde, ist von etwa 0,006 bis etwa 0,012 g/ml Vollblut. Kurz gesagt, umfaßt die Technik die Messung des Zellvolumens unter Verwendung von Radiofrequenzstrom (RF) und DC-Feldanregung. Indem ein Teilchenmeßfeld mit sowohl einer Niederfrequenz- oder einer Gleichstrom- (DC) als auch Radiofrequenz- (RF) Stromanregungen gebildet wird, können zwei oder mehr untereinander verbundene Ausgangssignale vom Durchgang eines einzigen Teilchens (d.h. Leukozyt) durch ein elektrisches Feld abgeleitet werden. Der von diesem Ausgabesignal abgeleitete Wert ist als (relative Opazität) bezeichnet, welche für jede Subpopulation von Leukozyten einzigartig ist. Der Zusatz von Saponin zu dem lytischen Reagenz reduziert die Größe der roten Blutfragmente bis zu einem Punkt, wo sie nicht miteinander wechselwirken oder selbst die Ableitung eines Ausgabesignals, welches für eine Spezies von Leukozyten indikativ ist, bewirken.
• Wo die Zelldifferenzierung auf Lichtstreuungsmessungen basiert (unter Verwendung der Techniken, welche im US-patent 3 989 381 von Fulwyler und/oder US-Patent 4 038 556 von Auer, et al beschrieben sind, welche hier in ihrer Gesamtheit als Bezug enthalten sind), wechselwirken die roten Zellfragmente nicht oder beeinflussen die photometrische Differenzierung der verschiedenen Subpopulationen von Leukozyten nicht nachteilig. Folglich ist der Zusatz von Saponin zu dem lytischen Reagenzsystem unnotwendig, wo eine derartige Differenzierung auf einer photometrischen Analyse beruht.
• Das Ausmaß der Zeit des Aussetzens der Blutprobe an das lytische Reagenzsystem ist für das Unterscheidungsverfahren gemäß dieser Erfindung kritisch. Dieser Aussetzungszeitraum, wie er in den folgenden Beispielen geoffenbart ist, sollte 10 (zehn) Sekunden nicht übersteigen und erfordert besonders bevorzugt nur etwa 6 (sechs) Sekunden oder weniger. Beide dieser Aussetzungszeiten sind für Raumtemperatur (etwa 18 bis 28 ºC) spezifiziert. In jedem Fall ist die Wirkung des lytischen Reagenz durch einfachen Zusatz von geeigneten Konzentrationen von Salzen zu der Probe gequencht, um die Zellen in ihre native physiologische Umgebung zurückzuführen. Das Quench verzögert weiters effizient die Aktivität des lytischen Reagenz auf die Leukozyten ohne Erfordernis eines Zusatzes von Fixierungsmitteln. Das Quench für das lytische Reagenz ist eine wesentliche Vervollständigung für das lytische Reagenzsystem, wo die darauffolgende Analyse der Leukozytenfraktion eine Verlangsamung der Aktivität des lytischen Reagenz erfordert. Die Leukozyten werden durch dieses Quench durch Steuern des pH innerhalb eines ziemlich engen Bereiches (pH ungefähr 6,00 bis 7,25) und der Osmolarität (ungefähr 300 bis 330 Milliosmol) stabilisiert. Das Quench kann auch formuliert sein, um die Leitfähigkeit eines gewählten (Scheide)-Fluids anzupassen, welches in einem Analysensystem mit einer fokussierten Durchflußblende verwendet wird. Die Zusammensetzung und das Volumen des Quench sind eingestellt, um die optimale Trennung der 5 (fünf) Hauptleukozyten-Subklassen zur Verfügung zu stellen, wenn sie in Übereinstimmung mit den Techniken (RF-Frequenzstrom in Kombination mit DC-Feldanregung), beschrieben in dem US- Patent 3 502 974 von Coulter et al. (welches zuvor durch Bezug aufgenommen wurde), analysiert werden. Die Leukozytenfraktion der Probe, welche in der obigen Weise behandelt wurde, kann leicht in zumindest fünf (5) Subpopulationen durch einen Hämatologieanalysierer unterteilt werden, welcher für Mehr-Parameter-Teilchen (Zellen) Messungen fähig ist und durch immunochemische Wechselwirkung mit Antiserum (d.h. Antikörper, Bindungsproteinen, usw.), welche für einen oder mehrere Oberflächenmarker auf den Zellen von jeder derartigen Zellsubpopulation spezifisch sind.
• In dem Verfahren gemäß der Erfindung ist das Ansäuern der Probe notwendig, um die gewünschte Lyse der Erythrozyten durchzuführen. Wo jedoch der pH dieser Probe von dem bevorzugten Bereich von 2,6 bis 4,0 abweicht, ist die Fähigkeit, die Leukozytenfraktion in fünf bestimmte Subpopulationen zu unterscheiden, offensichtlich beeinträchtigt. Eine effiziente Differenzierung wird auch verhindert, wo die Osmolarität der gelösten Probe nicht unter 100 mOs gehalten wird.
• Das lytische Reagenzsystem enthält sehr geringe Mengen an Saponin (vorzugsweise wenigstens etwa 0,05 bis etwa 0,2 Gew.-%) zusätzlich zu dem lytischen Reagenz. Wie dies vollständig gewürdigt wird, ist die Effizienz von Saponin als ein lytisches Reagenz stark konzentrationsabhängig. Wenn Saponin in niedrigen Konzentrationen verwendet wird, ist es allgemein für diesen Zweck unwirksam. Wo Saponin als ein lytisches Reagenz verwendet wird, sollte es in Konzentrationen von wenigstens 2 Gew.-% oder mehr vorhanden sein, um im wesentlichen vollständig die Stromatolyse der roten Blutzellen zu bewirken. Leider kann das Saponin, wo es in einer lytisch effizienten Konzentration vorhanden ist, auch eine Lyse der weißen Blutzellen bewirken. Folglich müssen jegliche Änderungen, welche in der weißen Blutzellenpopulation unter Verwendung von Saponin als das lytische Agens induziert werden, und ihre darauffolgende Differenzierung durch automatisierte Instrumentierung auf jeglichen feststellbaren und unterscheidbaren Charakteristika ihrer entsprechenden Zellkerne basieren. Ihre Gegenwart in dem lytischen Reagenz system gemäß dieser Erfindung ist jedoch wünschenswert, wo der Mediziner mit sogenannten "Geistern" (intakte rote Zellmembranen) befaßt ist, welche mit Unterscheidungsmessungen, basierend auf Unterschieden in physikalischen und/oder elektrischen Eigenschaften, wechselwirken.
• Das lytische Reagenzsystem kann auch andere traditionelle Additive enthalten, bis zu dem Ausmaß, daß ihr Vorhandensein nicht in anderer Weise mit den primär funktionellen Komponenten des Systems (d.h. antimikrobielle Konservierungsmittel, wie Natriumomadin) inkompatibel ist.
• Das lytische Reagenzsystem dieser Erfindung kann mit einer Vollblutprobe durch einfachen händischen oder automatischen Zusatz kombiniert werden, das lytische Ragenz und die Probe werden kurz wechselwirken gelassen und die Wirkung des lytischen Reagenz wird durch Zusatz eines geeigneten Quench wesentlich verzögert. Das in dieser Umgebung effiziente Quench muß daher fähig sein, die lytische Aktivität des lytischen Reagenz unmittelbar nach seinem Zusatz zu der wäßrigen Mischung, welche in der Blutprobe und dem lytischen Reagenz enthalten ist, zu verzögern. Die präzise Formulierung des Quench kann in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des lytischen Reagenzsystems und des in einem Analysensystem mit fokussierter Durchflußblende verwendeten Scheidefluids variieren. Das Quench ist typischerweise eine wäßrige Lösung, enthaltend lösliche Salze, welche sowohl effizient sind, um die lytische Aktivität des lytischen Reagenz wesentlich zu verzögern und/oder im wesentlichen zu neutralisieren als auch das Ionengleichgewicht der Probe wiederherzustellen. Diese Wiederherstellung des Ionengleichgewichts wird die Langlebigkeit der überlebenden Zellen erhöhen und eine nachfolgende Analyse auf einer Einrichtung, welche es erfordert, daß die Probe elektrisch leitfähig ist (Elektrolyten enthält), beispielsweise einem Coulter Counter Vollblutanalysierer, erlauben.
• Ein Quench, welches zur Verwendung gemeinsam mit einer lytischen Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung geeignet ist, kann und wird üblicherweise jede Kombination von wenigstens zwei der folgenden vier Bestandteile enthalten: Natriumchlorid, Natriumsulfat, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat; und zusätzlich Natriumazid als ein Konservierungsmittel. Die Effizienz des Quench über das lytische Reagenz in der Beschreibung dieser Erfindung ist durch seine Fähigkeit bestimmt, die lytische Aktivität der Carboxyl- und nichtflüchtigen Mineralsäuren, welche zur Verwendung in dem lytischen Reagenzsystem ausgewählt wurden, schnell zu reduzieren. Wie oben festgehalten, kann das Verfahren und die Einrichtung, welche in der Unterscheidung der Leukozyten- Subpopulation verwendet werden, auch bestimmte Bedingungen (d.h. Leitfähigkeit, pH, usw.) für die präzise Formulierung des Quench stellen. Genauer können, wenn eine derartige Differenzierung in einem Analysensystem mit fokussierter Durchflußblende durchgeführt wird, die Zusammensetzung und das Volumen des Quench für die optimale Trennung (Differen zierung) der fünf (5) Leukozyten-Subklassen voneinander kritisch sein. In dieser Type des Analysensystems muß das ionische Gleichgewicht des Quench auch eingestellt werden, um eine zufriedenstellende Leitfähigkeitsanpassung der gelösten Blutprobe an das Scheidefluid zu erreichen. In der bevorzugten Quenchformulierung sollten die hauptsächliche, ionische Spezies und ihr relatives Verhältnis in der lysierten, gequenchten Blutprobe im wesentlichen dieselben wie die hauptsächliche, ionische Spezies und ihr relatives Verhältnis in dem Scheidefluid. Die relative Konzentration und die funktionellen Komponenten des Quench, welches in Übereinstimmung mit dem lytischen Reagenzsystem dieser Erfindung zu verwenden ist, wird von etwa 1 bis etwa 3 % (w/v) Natriumchlorid, etwa 0,25 bis etwa 0,8 % (w/v) Natriumcarbonat oder bicarbonat und etwa 2 bis etwa 4 % (w/v) Natriumsulfat liegen. Die präzisen relativen Mengen der Bestandteile des optimalen Quench werden allgemein empirisch bestimmt; die Ziele einer derartigen Einstellung sind es, den pH-Wert der lysierten Blutprobe in dem Bereich von etwa 6.0 bis etwa 715 und eine Endosmolarität der stabilisierten, lysierten Blutprobe in dem Bereich von etwa 300 bis 330 mOs zu erreichen. Es wurde zuvor in einem fokussierten Durchflußblendensystem beobachtet, daß ein optimales Klustern der Leukozyten- Sunklassen durch Einstellen der Osmolarität in der Endblutprobe auf etwa 310 mOs erreicht wird. Die im wesentlichen vollständige Neutralisierung der Azidität der gelösten Probe mit einem alkalischen Quench kann für ein Analysensystem mit fokussierter Durchflußblende kritisch sein. Komponenten der Probe (d.h. Fibrin und Blättchen) sind pH- empfindlich und können Aggregate unter sauren Bedingungen bilden, welche potentiell mit einer Differenzierungsanalyse (d.h. Rauschen) wechselwirken oder physikalisch die Blende eines fokussierten Durchflußblendensystems blockieren.
• Es ist weder geplant noch beabsichtigt, daß das Quench auch notwendigerweise das Saponin inhibiert oder neutralisiert.
• Die Gründe hiefür sind sehr einfach, da das Saponin in den beabsichtigten Konzentrationen (etwa 0,2 Gew.-%) als lytisches Reagenz relativ unwirksam ist. Falls das Quench auch die Saponinaktivität nach ihrem Zusatz zu der Probe inhi bieren sollte, wird eine geeignete Klärung der Probe (Zerstörung der intakten roten Blutzellenmembranen) nicht stattfinden. Daher wird angenommen, daß sich die Aktivität des Saponins etwa 5 bis 15 s nach dem Quenchen der Aktivität des lytischen Reagenz fortsetzt. Es kann unter bestimmten Umständen geeignet sein, ein unabhängiges Quenchagens für das Saponin zur Verfügung zu stellen; in den gegenwärtig beabsichtigten Konzentrationen (weniger als 0,1 %) würde jedoch nichts erforderlich sein, um dieses oder weitere Ziele der Erfindung zu erreichen. Die Geeignetheit des Quenchagens basiert selbstverständlich auf bestimmten Annahmen, welche sich auf die Empfindlichkeit der Zellen der Probe (interessierende Analyten) auf das lytische Reagenz und auf den Kontaktzeitraum des lytischen Reagenz und dieser Zellanalyten vor der Analyse beziehen. Wie oben festgehalten, verzögert das Quench die lytische Wirksamkeit, jedoch eliminiert es seinen Effekt auf die Leukozytenfraktion der Probe nicht vollständig. Wenn daher ein wesentlicher Zeitraum zwischen dem Zusatz des Quench und der Analyse der Probe verstreichen gelassen wird, kann es wünschenswert sein, die Leukozytenfraktion zu fixieren, um die charakteristische Größe und Form der interessierenden Zellanalyten zu konservieren.
• In den bevorzugten Ausbildungen dieser Erfindung müssen die Dauer des effektiven Kontaktes des lytischen Reagenz und der Blutprobe (von der Zeit, wo die beiden kombiniert werden, bis zu der Zeit, wo das Quench zugesetzt wird) weniger als zehn (10) Sekunden und besonders bevorzugt 6 s oder weniger betragen. Das Intervall des reaktiven Kontaktes des lytischen Reagenz und der Blutprobe, wie oben ausgeführt, nimmt an, daß ein derartiger reaktiver Kontakt bei Raumtemperatur (etwa 18 bis 28 ºC) stattfindet. Selbstverständlich würde, wenn die Temperatur über diesem Niveau liegt, die Dauer des reaktiven Kontaktes etwas geringer sein und umgekehrt variieren; und wenn die Temperatur niedriger als dieses Niveau ist, würde die Dauer des reaktiven Kontaktes etwas länger sein. Es ist sowohl kritisch als auch essentiell für die erfolgreiche Leistung des differenzierenden Verfahrens gemäß dieser Erfindung, daß die Kinetik der Wechselwirkung des lytischen Reagenz mit sowohl der getöteten Zellpopulation (rote Blutzellen) als auch der gewünschten Zellfraktion (Leukozyten) vorsichtig und präzise kontrolliert werden kann. Der Mechanismus, mit welchem das lytische Reagenz mit beiden Zellfraktionen reagiert, ist nicht genau bekannt, nur der manifestierte Effekt einer derartigen Wechselwirkung. Es ist daher jenseits des Rahmens dieser Diskussion zu spekulieren, wie diese Verbesserungen in der Differenzierungsanalyse erreicht werden und es wird daher hier kein Versuch gemacht, einen derartigen Mechanismus zu erklären oder später zu beanspruchen.
• Durch Begrenzen des Aussetzens dieser beiden Zellfraktionen an lytische Reagenzien wird die Stromatolyse der Erythrozyten effektiv und effizient durchgeführt, während zusätzliche feine Veränderungen in den Leukozyten durch das Quench induziert werden, um ihre effektive Unterscheidung zu ermöglichen. Beide dieser Ereignisse treten im wesentlichen gleichzeitig auf, während die native, immunochemische Reaktivität der unterschiedenen Leukozytenfraktionen aufrecht erhalten wird.
• Wie oben festgehalten, ist die Dauer des Kontaktes des lytischen Reagenz mit dem Blut ausreichend, um eine selektive, zerstörende Antwort der getöteten Zellfraktion zu bewirken, während zur gleichen Zeit eine unterscheidende Antwort in der Leukozytenfraktion ausgeführt wird, wobei derartige Änderungen unerwartet die physikalische Differenzierung von wenigstens fünf (5) Zellsubpopulationen von Leukozyten voneinander ermöglichen. Das lytische Reagenz, in scharfem Kontrast zu den mehr traditionellen Typen von Lösungen (d.h. Saponin, quaternäre Ammoniumsalze), beeinflußt die native, immunochemische Antwort der Oberflächenmarker von jeder der Zellen in den Leukozyten-Subpopulationen nicht nachteilig. Diese Qualität wird in bezug auf die lytischen Reagenzien dieser Erfindung als einzigartig angenommen.
• Blutproben, welche dem oben genannten, lytischen Reagenz-System ausgesetzt wurden, können verschiedenen Messungen auf für diese Zwecke entwickelten Instrumentierungen unterworfen werden. Derartige Unterscheidungen können auf einer Vorrichtung unter Verwendung einer Technologie der Type, welche in den US-Patenten 3 549 994 (welches hier in seiner Gesamtheit als Bezug enthalten ist), 3 502 974 und 3 989 381 beschrieben ist, durchgeführt werden. Merkmale dieser Erfindungen, welche in den oben genannten Patenten beschrieben sind, können in kommerziell praktikable Instrumentierungen eingebaut werden. Kurz gesagt, wird die Blutprobe zuerst durch Mischen mit dem lytischen Reagenzsystem unter Verwendung einer automatisierten Pipettiereinrichtung behandelt. Die lytische Wirkung des lytischen Reagenz auf die abzutötende Zellpopulation (rote Blutzellen) muß sowohl schnell als auch effizient sein. Ein Quench wird dann mit analogen Pipettiereinrichtungen zugesetzt, um die Aktivität des lytischen Reagenz auf die überlebende Zellfraktion (Leukozyten) wesentlich zu verlangsamen. Die die Leukozytenfraktion enthaltende Probe wird dann einem Zählen von jeder der individuellen Zellsubpopulationen und/oder Histogrammen und/ oder Streuungsdiagrammen von den auf diese Art und Weise gesammelten Daten unterworfen.
• Das in der Durchführung von Coulter-Volumsmessungen beinhaltete Prinzip ist dem Fachmann als das "Coulter-Prinzip" gut bekannt. Kurz gesagt, umfaßt die Arbeitsweise der Instrumentierung unter Verwendung des Coulter-Prinzips die Messung der Änderung in der Impedanz, welche durch den Durchgang von individuellen Zellen durch einen Sensor bewirkt wird, welcher so ausgebildet ist, um einen Spannungsabfall, welcher durch die Anwesenheit der Zelle bewirkt wird, zu detektieren. Die in diesem Prinzip verwendete Instrumentierung umfaßt zwei Fuidkessel oder -kammern, welche jeweils eine leitfähige Elektrolytlösung enthalten. Zumindest zwei Elektroden, welche entgegengesetzte Polaritäten aufweisen, sind in die Elektrolytlösung eingetaucht, wobei jede Fluidkammer eine der Elektroden darin angeordnet enthält. Eine Probe der Elektrolytlösung, welche darin suspendiert die Blutzellen enthält, wird durch einen verengten Fluidweg oder eine Öffnung, welche zwischen den zwei Fluidkammern zwischengelagert ist, geleitet. Obwohl der verengte Durchgang verschiedene Formen aufweisen kann, definiert jeder derartige Weg in jeder Vorrichtung eine Meßzone, worin die Gegenwart oder Abwesenheit eines Teilchens zu einer detektierbaren Änderung in den elektrischen Charakteristika des Weges führt. Beispielsweise gehen relativ schlecht leitfähige Blutzellen durch diesen Weg, verlagern ein Volumen der Elektrolytlösung, welches gleich dem Zellvolumen ist, bewirken einen Spannungsabfall durch Erhöhen der Wegimpedanz. Die Widerstandspulse, welche durch die Abfälle in der Spannung definiert sind, werden für das Teilchenzählen und die Teilchenvolumsbestimmung verwendet. Das Coulter-Prinzip ist genauer in dem US-Patent 2 656 508 beschrieben. Diese Technik zum Messen und Identifizieren von spezifischen Zellpopulationen kann durch eine Kombination der Coulter- Prinzip-Messung mit Radiofrequenzanregung der Zellen in der Meßzone beschleunigt werden. Kurz gesagt, arbeitet diese Radiofrequenzbeschleunigung nach dem Prinzip, daß ein sich durch die Meßzone eines Hämatologie-Analysierers bewegendes Teilchen eine Phasenverschiebung in der Radiofrequenz (RF)- Energie in der Meßzone bewirken wird. Diese Verschiebung in der Phase kann mit physikalischen und Zusammensetzungscharakteristika der Zellpopulation korreliert werden. Diese Technik für die RF-Unterscheidung von Zellen ist genauer in dem US-Patent 3 502 974 bschrieben. Eine Unterscheidung der weißen Zellen kann auch erreicht werden, indem optische Meßprinzipien der Flußzytometrie verwendet werden, wie dies in dem US-Patent 3 380 584 beschrieben ist (welches hier in seiner Gesamtheit als Bezug enthalten ist).
• Das lytische Reagenzsystem dieser Erfindung ist wirksam, um feine Änderungen in der Leukozytenzellfraktion zu induzieren, um die Unterscheidung von fünf (5) bestimmten Subpopulationen von Leukozyten auf einer automatisierten Zellzähleinrichtung, siehe beispielsweise US 4 412 004 (für Ornstein, et al., welches hier in seiner Gesamtheit als Bezug enthalten ist), zu beschleunigen. Diese fünf (5) bestimmten Subpopulationen umfassen, wie zuvor angeführt: Lymphozyten, Monozyten und drei Spezies von Granulozyten (Eosinophilen, Basophilen und Neutrophilen). Jede dieser Subpopulationen von Leukozyten hat bestimmte Oberflächenmarker. In bestimmten Krankheitszuständen werden diese Oberflächenmarker auf einer oder mehreren dieser Subpopulationen eine einzigartige immunochemische Antwort geben und daher die Diagnose oder Bestätigung einer Krankheit in einem frühen Stadium ihrer Entwicklung möglich machen. Die Detektion dieser bestimmten Oberflächenmarker auf einer oder mehreren dieser Supopulationen von Leukozyten wird daher von der Fähigkeit, diese Zellen, welche charakteristische Krankheitszustands-Oberflächenmarker aufweisen, effizient physikalisch von den nicht wirkenden Zellen abzutrennen, abhängen und die relative Konzentration der wirkenden Zellen in der Probe wird analysiert.
• Die anfänglichen lytischen Bedingungen, welche durch diese Erfindung beabsichtigt sind, erlauben eine Erstreckung der Langlebigkeit der Zellpopulationen, welche überleben und welche voneinander unterschieden werden sollen. Meistens wird angenommen, daß die Zell-Langlebigkeit für wenigstens zweiundsiebzig (72) Stunden für bestimmte Arten von immunochemischen Analysen geeignet wäre. In bestimmten Anwendungen dieses Unterscheidungsverfahrens kann es sowohl notwendig als auch geeignet sein, eine oder mehrere dieser Subpopulationen in vitro für mehrere Stunden oder möglicherweise selbst einige Tage zu belassen. Um eine derartig erhöhte Stabilität zu erreichen, ist es ratsam, die Leukozyten von der Fluidfraktion, enthaltend die lytische Reagenz/Quenchmischung, abzutrennen und danach derartige Zellen in einem physiologischen Medium neuerlich zu suspendieren.
• Die folgenden Beispiele erläutern diese Erfindung. Die Ausrüstung und die Techniken, welche in der Herstellung und Auswertung des lytischen Reagenzsystems verwendet werden, sind Standard oder wurden zuvor beschrieben. Teile und Prozentsätze, welche in derartigen Beispielen auftreten, sind Gewichtsteile oder -prozente, außer es ist etwas anderes angeführt.
Beispiel 1
• Ein lytisches Reagenzsystem wurde aus für Reagenzien geeigneten Chemikalien hergestellt. Eine 0,12 % (v/v) Ameisensäurelösung wurde zuerst durch Kombinieren von 1,3 ml 90- %iger Ameisensäure und 989 ml deionisiertem Wasser hergestellt. 0,05 % (w/v) Saponinpulver wurden zugesetzt.
• Eine 50 µl Vollblutprobe (K&sub3; EDTA) und 600 µl des lytischen Reagenzsystems wurden vorsichtig miteinander durch Verquirlen für 5 s bei Raumtemperatur (etwa 20 ºC) vermischt. Die lytische Wirkung der Ameisensäure wurde nach 6 s durch den Zusatz von 265 µl einer wäßrigen Lösung, enthaltend 0,60 % Natriumcarbonat und 3,00 % Natriumchlorid, gequencht.
• Der Zusatz von Saponin zu der lytischen Zusammensetzung eliminiert effizient die Wechselwirkung des roten Zellabfalls von den Coulter-Volumsmessungen. Die Effizienz des Saponins ist stark temperaturabhängig. Die im wesentlichen vollständige Eliminierung der Wechselwirkung von rotem Zellabfall erfordert zusätzliche 10 s (bei Raumtemperatur, ungefähr 18 bis 28 ºC) nach der Vervollständigung der Lyse der roten Zellfraktion der Probe. Wenn die Probe bei einer niedrigeren Temperatur (unter 18 ºC) gehalten wird, wird eine etwas längere Zeitdauer nötig, um die Wechselwirkung von den roten Zellabfällen durch das Saponin effizient zu eliminieren.
• Die Probe wurde adäquat gequencht und war für die differenzierende Analyse durch Flußzytometrie-Techniken innerhalb von 10 bis 20 s nach dem Zusatz des Quench fertig. Die in einer derartigen unterscheidenen Analyse verwendete Ausrüstung war mit einem Helium/Neon-Laser und Silizium-Dioden- Detektoren für Messungen der Lichtstreuung ausgestattet. Die Leukozyten wurden beobachtet und ihre individuellen Parameter durch optische Parameteranalyse, d.h. Messung der Lichtextinktion (Nullwinkelstreuung), und jedem von mehreren Winkelbereichen der Lichtstreuung bestimmt. Die Leukozyten in der Probe wurden auch durch Messung von DC- und RF- Volumina unter Verwendung einer Isoton II Scheideflüssig keit beobachtet und das resultierende Streuungsdiagramm ist in Fig. 1 gezeigt. Vier bestimmte Subpopulationen von Leukozyten wurden identifiziert und in der simultan erhaltenen Lichtstreuung gegen das DC-Streuungsdiagramm von Fig. 2 quantifiziert. Eine fünfte Subpopulation von Leukozyten (Basophilen) wird durch Bildung eines "gattergesteuerten", sekundären Streuungsdiagramms isoliert. Diese Basophilenpopulation ist in dem in Fig. 3 dargestellten Streuungsdiagramm gezeigt.
Beispiel 2
• Die Verfahren von Beispiel 1 wurden unter Verwendung derselben Ameisensäure/Saponin-Reagenzzusammensetzung wiederholt. Die lytische Aktivität der Ameisensäure wurde mit einem Quench, enthaltend 3,13 % (w/v) Natriumsulfat (wasserfrei), 1,45 % (w/v) Natriumchlorid und 0,60 % (w/v) Natriumcarbonat (wasserfrei) gestoppt. Die Probe wurde mit elektrooptischen Techniken auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise analysiert und das resultierende Streuungsdiagramm war analog zu jenen der Fig. 1, 2 und 3. Das Scheidefluid war jedoch in Isoton III Verdünnungsmittel geändert.
Beispiel 3
• Die Verfahren von Beispiel 2 wurden wiederholt, mit der Ausnahme der Verwendung einer konzentrierten, gelösten-gequenchten Blutprobe für einen schnelleren Datenerhalt. Das lytische Reagenz enthielt 0,15 (v/v) Ameisensäure und 0,10 % (w/v) Saponinpulver. Die lytische Aktivität der Ameisensäure wurde durch einen Quench, enthaltend 2,67 % (w/v) Natriumsulfat (wasserfrei), 1,24 % (w/v) Natriumchlorid und 0,56 % (wiv) Natriumcarbonat (wasserfrei), gestoppt.
• Diese Unterscheidungsanalyse wurde durch den Zusatz von 50 µl Vollblut in ein Glaskulturröhrchen, enthaltend 300 µl Lösereagenz, durchgeführt. Die Probe und die Lyse wurden durch Quirlen der Bestandteile in dem Röhrchen für etwa 6 5 vermischt und die lytische Aktivität der Ameisensäure wurde durch Zusatz von 165 µl des obengenannten Quench gestoppt. Die Probe wurde dann einer elektrooptischen Messung in der in Beispiel 1 beschriebenen Art unterworfen und die resultierende Unterscheidungsanalyse war mit jener von Beispiel 1 vergleichbar (wie dies in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt ist).

Claims (15)

1. Wäßriges, lytisches Reagenzsystem, welches für die selektive chemische Behandlung von Vollblut geeignet ist, wobei das System Saponin und ein lytisches Reagenz ausgewählt aus Carbonsäuren der Formel RCOOH, Sulfonsäuren der Formel R'SO&sub3;H und Phenolen, welche durch 1 bis 3 elektronen-ziehende Gruppen ringsubstituiert sind, umfaßt, wobei R H oder ein aliphatischer C&sub1;&submin;&sub3; Kohlenwasserstoffrest ist, welcher gegebenenfalls durch eine oder mehrere Carbonyl- und/oder Hydroxy-Gruppen substituiert ist, und R' OH, ein aliphatischer C&sub1;&submin;&sub3; Kohlenwasserstoffrest oder Aryl ist.

2. System nach Anspruch 1, worin das lytische Reagenz gewählt ist aus Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure, Succinsäure, Milchsäure und deren Gemischen.

3. System nach Anspruch 1, worin das lytische Reagenz gewählt ist aus Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure Benzolsulfonsäure, p-Toluolsäure, m-Nitrobenzolsulfonsäure und deren Gemischen.

4. System nach Anspruch 1, worin das lytische Reagenz gewählt ist aus p-Nitrophenol, m-Nitrophenol, o-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Chlorphenol, p-Cyanophenol, 1-Chlor- 2,4-dinitrophenol und deren Gemischen.

5. System nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches 0,01 bis 1,0 Vol.-% des lytischen Reagenz enthält.

6. System nach Anspruch 5, welches 0,05 bis 0,5 Vol.-% des lytischen Reagenz enthält.

7. System nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches 0,05 bis 0,20 Vol.-% Saponin enthält.

8. Kit, umfassend das System nach einem der vorangehenden Ansprüche und als Quench eine alkalische, wäßrige Salzlösung.

9. Verfahren zum Auftrennen einer Vollblutprobe, welche das Kontaktieren der Blutprobe mit dem System nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, welches derart durchgeführt wird, daß der pH der Vollblutprobe von seinem physiologischen Wert auf 2,6 bis 4,0 herabgesetzt wird, während die Osmolarität auf weniger als 100 mOs gehalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, welches ein Kontaktieren des lytischen Reagenz und der Probe für bis zu Sekunden bei einer Temperatur von 18 bis 28 ºC umfaßt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches zusätzlich Quenchen der lytischen Aktivität umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Quenchen ein Zusetzen einer alkalischen, wäßrigen Salzlösung umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, bei dem das Quenchen die lysierte Probe bei einem pH von 6 bis 7,5 und einer Osmolarität von 300 bis 330 mOs stabilisiert.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, welches zusätzlich eine Untersuchung unter Verwendung von Apparaturen umfaßt, welche Mittel für eine Differentialanalyse von wenigstens fünf Leukozytenpopulationen aufweisen.