JPS60159652A - 免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は免疫分析用試薬に関し、更に詳しくは、試料中
に存在する特定の抗原又は抗体を定量分析するための免
疫分析用試薬に関する。

［発明の技術的背景とその問題点］ ４ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の腫瘍
マーカーが見出されるようになった。例えばα−フェト
プロティン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、塩
基性フェトプロティン（ＲＦＰ）および膵ガン胎児性抗
原（ＰＯＡ）などがその代表例として挙げることができ
る。これらの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、非常
に低い（例えば、ＡＦＰの場合：ｌＯｎｇ／ｍ）以下）
。一方、腫瘍患者の場合には正常人の１０倍程度の値を
示すことが多い。いずれにしても、腫瘍マーカーの分析
定量には、非常に高い検出感度が要求される。

この要求を満たすために、従来は、放射性物質で標識化
した抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（ＲＩ　
Ａ）が開発された。しかしながら、Ｒ１，Ａは取扱いが
面倒で廃棄処理も問題にな−る。

そこで、放射性物質の代りに酵素や蛍光物質など種々の
物質で標識化した抗原あるいは抗体を使用する免疫分析
法が提案されたが、これらにおいても遊離抗体と結合抗
体を何らかの方法で分離しなければならないという欠点
を有していた。また、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ　Ａ、Ｆ、　
Ｖａｒｇａｓ、　Ｍ、Ｇ、ａｎｄ　ｋｌａｓｓｃ：、Ｓ
。

（１９７Ｂ）　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２２．１８９９
に発表されたＥＭＩＴ法は、分離工程の不要な均一系で
測定できる画期的な手法であるが、原理的に高分子量の
タンパク質抗原あるいは抗体には適用できない。

ところで、Ｈａｘｂｙ、　Ｊ、Ａ、　Ｋ１ｎ５ｋｙ、　
Ｃ，Ｂ、　ａｎｄＫｉｎｓｋｙ　Ｓ、Ｃ，（１９８Ｂ）
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｆｉｌ　３００で、脂
溶性の抗原を膜内に取り込みグルコースを封入したリポ
ソームを調製し、抗原抗体反応によるリポソームの破壊
に伴うグルコースの流出量を測定することにより、抗体
の定量を行う手法が発表された。　１．− ゛　また、本発明者らは、先の昭和５８年１１月３０日
付の特許出願明細書に記載の通り、親水性の抗原又は抗
体をリポソームに担持せしめた免疫分析用試薬を開発し
、均一系で抗原又は抗体を短時間で簡便に定量すること
に成功した。

しかしながら、リポソームに直接、抗原又は抗体を担持
したこれらの免疫分析用試薬は、抗原−抗体特異反応性
の故に、各測定項目に応じて、１種類のリポソームは１
種類の被検物質のみにしか適用できず、各被検物質に対
応する抗原又は抗体を感作したリポソームを調製しなけ
ればならないという不都合さがあった。このため、免疫
分析用試薬の生産性、汎用性及び実用性が低いという問
題を有していた。

［発明の目的］ 本発明は、抗原又は抗体を担持した、補体活性なマイク
ロカプセル内に標識物質が封入された免疫分析用試薬に
おいて、免疫分析用試薬の生産性、汎用性及び実用性を
向上せしめることを目的とする。

［発明の概要］ 本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た結果、補体活性なマイクロカプセルに直接、抗原゛又
は抗体（第１抗体）を担持せしめることなく、第１抗体
に対する抗体（第２抗体）を該マイクロカブキル上に固
定せしめると、種々の被検物質を同じマイクロカプセル
によって免疫分析することができ、免疫分析用試薬の生
産性、汎用性及び実用性が向上することを見い出し、本
発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の免疫分析用試薬は、少なくとも一部
が脂質膜から成るマイクロカプセルと；該マイクロカプ
セル上に固定された、第１抗体に対する第２抗体と；該
マイクロカプセル内に封入された標識物質から成ること
を特徴とする。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本分析方法による定量が可能な被検物質は、腫瘍マーカ
ー（前述のＡＦＰ、ＲＦＰ、ＣＥＡ、ＰＯＡ及びフェリ
チン等）、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及
びＩｇＭ等）、ホルモン（インシュリン、Ｔ　３．　Ｔ
　４及びＨＣＧ）及び薬物等の広範囲に亘る。

本発明の免疫分析用試薬におけるマイクロカプセルとは
補体活性を示すものであればいかなるものでもよく、補
体活性を示すためには、マイクロカプセル膜の少な゛く
とも一部が脂質膜から成る必要がある。このようなカイ
クロカプセルとしては、例えば、リポソーム、赤血球ゴ
ースト膜等が挙げられ、特にリン脂質又は糖脂質とコレ
ステロールから構成されるリポソームが好ましい。例え
ば、リン脂質とコレステロールからリポソームを合成す
る場合は、こららの比がｌ：１前後にあるとき、安定な
リポソームが得られ易い。またリン脂質中の脂肪酸残基
は、炭素原子数が１２〜１８であることが好ましく、更
には偶数であることがより好ましい。

マイクロカプセル上に固定される第２抗体とは、前記被
検物質に対する抗体（第１抗体）の抗体（例えば、抗原
を免疫する動物がウサギの場合にはヤギか６ら得られる
抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体）を言う。

これら第２抗体は、酵素の固定化に用いられている種々
の共有結合法によって、マイクロカプセル上に固定化さ
れる。しかしながら、グルタルアルデヒドのような強力
な架橋剤による固定法は。

第２抗体の活性を著しく低下せしめるので望ましくない
。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。かかる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により蛍光は示さないが、低濃度（ｌＯ−３
Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシルフルオ
レセインのよな蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフェリンのような発光
性化合物；口丁視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を
有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用
により分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもた
らすグルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラ
ペンチルアンモニウムのよな比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジ
カル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。

以上に説明した本発明の免疫分析用試薬は、例えば、次
の如き方法で製造される。まず、所望の脂質とＮ−スク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）フチレート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシ
ンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート
（ＳＭＰＡ）等の架橋剤（これを用いた場合を架橋法と
いう）とを溶媒中で反応せしめ（架橋剤の代わりに脂質
の活性化剤例えば、シアノーゲンプロミド（ＣＮＢｒ）
、シアヌリッククロリド（ＣＣ）、エビクロロヒドリン
（ＥＨ）　、ｏ−ブロモアセチル−Ｎ−ヒドロオキシス
クシンイミド等を用いてもよく、こρ方法を活性脂質法
という）、リポソーム上に固定化される第２抗体と結合
し得る官能基を脂質分子に導入する。次いで、得られた
官能性脂質とコレステロール及び必要であれば他の脂質
とをフラスコに入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒
を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成
されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密
栓をして振とうし、感作リポソームの懸濁液を得る。

一方、リポソームに固定化すべき第２抗体と架橋剤とを
緩衝液中で反応させて架橋基を導入し、しかる後、必要
であれば、該架橋基を還元する試薬（例えばジチオトレ
イトール、ＤＴＴ）と更に反応させて、修飾第２抗体を
得る。なお、前記工程で脂質をその活性化剤で処理した
場合は、本工程は不要である。

最後に、感作リポソームと修飾第２抗体（活性脂質法を
用いた場合は、未修飾の第２抗体）とを緩衝液中で反応
せしめることにより、本発明の免疫分析用試薬が得られ
る。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、表面に固
定化された第２抗体を担持したマイクロカプセルとして
得られる。

なお、本発明の免疫分析用試薬は、まず脂質と第２抗体
とを、架橋剤又は脂質の活性化剤を用いて結合せしめ、
次いで得られた結合体を界面活性剤とともに水中に加え
てミセルを形成させ、しかる後、透析あるいはゲル口過
等を用いて界面活性剤を除去することにより製造するこ
とも可能である。

次に、添付図面の第１図を参照しながら、本発明の試薬
を用いた分析方法を説明する。

第１図は本発明の試薬を用いた免疫分析法の原理を示す
模式図である。

まず、第２抗体１２を相持し、標識物質１３が内部に封
入されたマイクロカプセル１１から成る本発明の免疫分
析用試薬１０と、十分量の第１抗体１４と、被検査物質
である抗原１５を適当な緩衝液（例えば、ゼラチン−ベ
ロナール緩衝液）中で混合し、第１図の矢印ａで示され
る抗原−抗体結合反応を起こさせて、抗原−第１抗体−
第２抗体感作マイクロカプセル１６を得る。次に、これ
に適当な緩衝液で希釈した十分量の補体１７を加える。

すると、矢印すで示される反応に従って、抗原１５量、
すなわち、抗原−（第１）抗体反応量に応じ、マイクロ
カプセル１１は補体１７の作用によって破壊し、マイク
ロカプセルｌｌ内から標識物質１３が放出される。次い
で、この標識物質１３に応じた分析方法（例えば、標識
物質１３が蛍光物質であれば、蛍光分析法）により定量
を行い、例えば、予め作成した検量線により、試料中の
被検物質１５の量を測定することができる。

定量操作において使用する補体１７は、格別限定されな
いが、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウ
サギ、マウス、ヒＩ・等の血清を使用してもよい。

［発明の効果］ 本発明の免疫分析用試薬は第２抗体がマイクロカプセル
上に担持されているので、従来の試薬に比べて、被検物
質の適用範囲が広く、多項目同時測定に適し、自動分析
化が容易である。また、各測定項目によって異なったマ
イクロカプセルを使用する必要もないので、免疫分析用
試薬の生産性が高く、しかも分析費用も安価である。

［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

（Ａ）試薬及び感作リポソームの調製 （１）試薬 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コ
レステロール、ジパルミトイルフォスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＰＰＥ）及びジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）はシグマ社製のものを用いた。Ｎ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）及びセファデックスＧ−２５フアインはファルマシ
ア社より購入した。他の試薬は市販品（特級）を精製せ
ず使用した。なお、水はイオン交換水を用いた。

（２）感作リポソームの調製 ａ）ＤＰＰＥ−ジチオピリジネート（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ
）の調製 試験管にｌｏｍＭ　ＤＰＰＥ（クロロホルム溶液）５ｍ
ｊｊと５０　ｍ　ｇ　（７）　Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐを加え、
窒素カスで置換した後、密栓して室温で２時間反応させ
た。（触媒として５０終文のトリエチルアミンを添加し
た）。反応後、５倍量の生理食塩水で３回抽出し、残っ
たクロロホルム相を減圧乾燥し、最後に５　ｍ　ｌのク
ロロホルムを加え、密栓試験管中、＝２０°Ｃで保存し
た。

ｂ）リポソームの調製 使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（２／１）　に溶解した。まず、５ｍＭ　
ＤＰＰＣ（２００ｇｌ）、１０ｍＭ　コレステロール（
１００ｇｌ）及び１ｍＭ　ＤＰＰＥ−ＤＴＰ　（６０ｐ
−１＞を１０ｍＭのクロロホルムを加えて良く混合した
。水浴中（約５０℃）でロータリーエバポレーターによ
り溶媒を除去した。

再び２　ｍ　ｌのクロロホルムな鰯加し、十分攪拌後、
再度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた
。この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形
成された。フラスコをデシケータ−中に移し真空ポンプ
で約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、１０
０ＩＬＲの０．２Ｍカルボキシルフルオレセイン（イー
ストマン・コダック社Ｗ。

ＰＨ７，４）を添加１７、フラスコ内部を窒素で置換し
た後に密栓して、６０°Ｃ程度の水浴中に約１分間浸漬
した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、壁面の脂
質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうし
た。この操作により、リポソーム懸濁液が調製された。

ゼラチン−ベロナール緩衝液（０，１ｍＭＭｇＣ１２及
び０．０３ｍＭ　Ｃａｃｌｔ含有；以下、ＧＶＢ２＋と
略記）を少量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チ
ューブに移した。４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠
心し、遊離のカルボキシルフルオレセインを除去した。

上清か透明になるまでＧＶＢ２＋を用いてこの操作を繰
り返した。最後に２ｍｌのＧＶＢ２＋及び５ＪＬＪｌ（
７）１０％ＮａＮ３を加え、Ｖｏｒｔｅｘ　ミキサーで
懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に保存した。

Ｃ）抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）の修飾５ｍｇの抗つサ
ギＩｇＧ抗体（ヤギ） （マイルズ社製）を２ｍｌの０．ＯＩＭＨＥＰＥＳ緩衝
液（ｐＨ７，４５，０，８５％ＮａＣＪｌ含有）に溶解
し、窒素で置換した後、１０＃ＬＪｌ（７）１０ｍＭ　
５ＰＤＰ　（−１−タノール溶液）を加え、十分攪拌し
てそのまま室温で３０分間反応させた。反応後、反応液
を予め生理食塩水で飽和させたセファデックスＧ−２５
フアインのゲルを充填したカラム（ゲル体積：約１５ｍ
文）に展開し、 ０．１Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ）１４．５，０．８５％Ｎ　ａ
ｃｌ含有）で溶出させた。最初のピークフラクション（
約−２ｍ　ｌ　）に更に２　ｍ　ｌの酢酸緩衝液を加え
、窒素置換後、ジチオトレイトール（約３０　ｍ　ｇ　
）を添加した。十分に攪拌して２０分間室温で反応させ
た０反応後、予め０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液で飽和
させたセファデックスＧ−２５フアインのゲルを充填し
であるカラム（ゲル体積：約３０ｍ文）に反応液を展開
し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。最初のピークフラク
ション（約２ｍｊＬ）を集め、窒素置換後、使用するま
で冷蔵庫に保存した。

ｄ）抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）感作リポソームの調製 前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と等量□の
修飾抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）溶液を混合し、窒素置
換後密栓して室温でゆっくり振とうしながらｌ晩反応さ
せた。

ＨＥＰＥＳ緩衝液、次いでＧＶＢ２＋で洗浄した、未反
応の抗体を除去した。反応に用いたリポソーム懸濁液の
量に相当するＧＶＢ２＋及び５＃Ｌ見の１０％ＮａＮ３
を最後に添加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵
庫に保存した。

（３）抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）感作リポソームを用
いたヒトＩｇＧの測定 タンク社製のＵ型プレート（９６穴）に適当量のＧＶＢ
２＋で希釈したヒトＩｇＧを２５ｐ−１ずつ注入した。

次いで、上記感作リポソーム懸濁液をＧＶＢＺ＋で１０
０倍に希釈し、５延文ずつ各ウェル（Ｗｅｌｌ）に分注
した。更に、約２ｐ−ｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ抗体をｌ
Ｏｇｕずつ各ウェル（Ｗｅｌｌ）に添加し、最後に、適
当にＧＶＢＺ＋で希釈した補体（モルモット由来）を２
５ｗ文ずつ添加した。反応は３７°Ｃ高温度下で１．５
時間行った。反応後、各−ｅｌｌにｉｏｏル見のｏ、ｏ
ｔＭ　ＥＤＴＡ−ベロナール溶液を加えて反応を停止し
、プレート用蛍光分光光度計（コロナ電子社製、ＭＴＰ
−１２Ｆ）で各Ｗｅｌｌノ蛍光を測定した（　Ｅ　ｘ　
：　４９０　ｎ　ｍ　、　Ｅ　ｍ　：５２０ｎｍ）。な
お、測定値は、抗体の代わりにｌＯ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
　−１００を２５延見添加したＷｅｌｌの蛍光と、抗体
の代わりに２５ＪＬＩのＧＶＢ２＋を添加したものの差
を１００％とした相対値で表示した。４００倍希釈の補
体を用いた場合の結果を第２図に示した。

実施例１で調製した抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）感作リ
ポソームと抗ヒトＩｇＧ抗体（ウサギ）［丸善石油より
購入］を用いてヒトＡＦＰ（日本バイオテスト研究所よ
り購入）を測定した。操作方法は実施例１に示した通り
である。

８００倍希釈の補体（モルモット血清）を使用した場合
、１０〜２００　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌの範囲内でヒトＡ
ＦＰが定量できることが判明した。

抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）感作リポソームと抗ヒ）−
フェリチン抗体（ウサギ）を用いてヒト・フェリチン（
シグマ社より購入）を測定した。

操作法は実施例１と同様である。４゛００倍希釈の補体
（モルモット血清）を使用した場合、５〜５００ｎｇ／
ｍＪｌの範囲内でヒト・フェリチンが測定可能であった
。

実施例１で調製した抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）感作リ
ポソームを冷蔵庫（４℃）中で保存し、定期的にヒトＩ
ｇＧを測定したところ、６ケ月後も測定感度の低下は全
く認められず、当該リポソームが少なくとも６ケ月以上
安定であることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬を用いた免疫分析法の原理を示す
模式図である。 第２図は抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）感作リポソームを
用いてヒ）ＩｇＧ抗体の測定を行った場合における。ヒ
トＩｇＧ抗体の希釈倍率と相対蛍光強度との相関図であ
る。 ｌＯ・・・本発明の免疫分析用試薬 ｌｌ・・・マイクロカプセル １２・・・第１抗体 １３・・・標識物質 １４・・・第２抗体 １５・・・抗原（被検物質） １６・・・抗原−第１抗体−第２抗体感作マイクロカプ
セル １７・・・補体

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （］）少なくとも一部が脂質膜から成るマイクロカプセ
   ルと；該マイクロカプセル上に固定された、第１抗体に
   対する第２抗体と；該マイクロカプセル内に封入された
   親水性の標識物質から成ることを特徴とする免疫分析用
   試薬。 （２）第２抗体がマイクロカプセル−ヒに共有結合によ
   って固定されている特許請求の範囲第１項記載の免疫分
   析用試薬。 （３）標識物質が蛍光性化合物、発光性化合物、吸光性
   化合物、糖類、イオン性化合物、補酵素類及びラジカル
   化合物の群から選ばれる少なくとも１種の化合物である
   特許請求の範囲第１項記載の免疫分析用試薬。 （４）マイクロカプセルがリポソームである特許請求の
   範囲第１項記載の免疫分析用試薬。