DE3208629A1 - Metachromatisches farbstoffabsorptionsverfahren zur differentiellen bestimmung der entwicklungsstufen von neutrophilen und granulozytischen zellen sowie anderen leukozyten - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung auf zytologischem Gebiet und bezieht sich insbesondere auf ein mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Blutanalyse, bei dem unter Einstrahlung eines normalen weißen Lichts auf ein mikroskopisches Feld eine optische Differenzierung,' Identifizierung, Vergleiche und eine Aufzählung jedes Leukozyten aus einer Serie von Leukozyten, die im normalen und pathologischen menschlichen Blut vorliegen, möglich ist, indem ein einziger reiner Farbstoff ohne Fixiermittel verwendet wird, und das genauer und■schneller ist als das bisher manuell oder mittels eines Leukozytendifferentialzählers automatisch durchgeführte Verfahren.

Die vorliegende Anmeldung stellt eine Weiterbildung des Gegenstands der älteren Patentanmeldung P 31 09 252.7 dar.

Ehrlich machte biologische Elemente bei der mikroskopischen Prüfung und photographischen Beobachtung durch Anfärben mit Farbstoffen (Anilin-Farbstoffe) leichter und einfacher erkennbar, um bestimmte weiße Blutzellen zu identifizieren. Ehrlich war der erste, der feststellte, daß einige Farbstoffe methachromatisch sind, wobei er beobachtete, daß das Anfärben der Zelle oder von Bestandteilen, wie die Granula von Leukozyten, dazu führt, daß die Zelle eine andere Farbe annimmt als die Farbe des Farbstoffs oder die Farbe, die aufgrund des Farbstoffs zu erwarten ist. Beispielsweise wurde bei basophilen Zellen festgestellt, daß sie eine andere Farbe als die des Farbstoffs annehmen. Über andere histologische Proben als Blutzellen wird gleichfalls berichtet, daß sie in einer Vielzahl identifizierbarer unterschiedlicher Farben mit Farbstoff anfärbbar sind.

Ein Überblick des Standes der Technik zeigt, daß es fast weltweit Praxis ist, vor dem Anfärben (bei dem gegenwärtig ein Gemisch aus einer Vielzahl chemisch unterschiedlicher Farbstoffe verwendet wird) ein Fixierverfahren durchzuführen, das eine Behandlung bis zu einer halben Stunde erfordern kann, bevor die biologische Probe dem Farbstoff ausgesetzt wird. Fixiermittel sind im allgemeinen Konservierungsmittel und Denaturierungsmxttel, die die Empfindlichkeit der Farbstoffabsorption häufig beeinträchtigen. Beispielsweise enthalten Fixiermittel Formaldehyd sowohl als Flüssigkeit als auch als Dampf, absolute Alkohole (Methylalkohol, Picroformal usw.)· Sehr häufig werden lebende Zellen nicht angefärbt, wenn Vitalfarbstoffe verwendet werden, wobei sich Fixiermittel als wesentlich erwiesen haben, um Proben anzufärben. In der Zytochemie gibt es eine umfangreiche Literatur über Verfahren, die entwickelt wurden, um ein reproduzierbares Anfärben von Blutzellen zu ermöglichen. Viele wesentliche Zusätze sind normalerweise nicht stabil und zersetzen sich schneJLl, so daß die Zellenidentifizierung schwierig und manchmal unzuverlässig ist. Dr. Thomas E. Necheles hat in bezug auf die Leukozytenanalyse festgestellt, daß dieses "System sich in 50 Jahren wenig oder gar nicht geändert hat".

Das Anfärben mit Farbstoff stellt jedoch ein Mittel zur Unterscheidung sonst nicht unterscheidbarer Details durch Übertragung einer Farbreaktion auf die Zellen und deren anfärbbare Teile dar, und zwar metabolisch, funktionell oder pathologisch.

In den Krankenhäusern der USA begann die Leukozytenzählung in den frühen 1900er Jahren, wobei die Zählung als Anhaltspunkt dafür dient, ob beispielsweise eine Notoperation notwendig ist oder nicht. Allein in den USA werden täglich mehr als eine halbe Million Differentialzäh-

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lungen durchgeführt, die ineisten nach manuellen Verfahren. Es ist wichtig, daß die Gesamtzählung der weißen Zellen und die Differentialzellenzählung ohne Verzögerungen durchgeführt und mitgeteilt wird. Die Zeitdauer ist von wesentlicher Bedeutung, so daß ein Bedürfnis besteht, die erforderliche Analyse schneller vorliegen zu haben.

Durch die Bedeutung der Leukozytenzählung, die sich etabliert hatte, entwickelte sich der Wunsch nach einer schnellen Blutanalyse, so daß die etwa zu Beginn der 1950er Jahre durch Arbeiten von Mellors und Papanicolaou (1952) eingeleitete Entwicklung automatischer Differentialleukozytenzähleinrichtungen 1980 zu einer Vielzahl von Geräten führte. Die "CYDAK"-Anlage wurde frühzeitig dazu benutzt, um die Ausführbarkeit der Blutzellenklassifizierung zu untersuchen, die die Bedeutung von spezialisierten Anfärbeverfahren aufzeigte, wobei die Merkmale der optischen Intensitätshistogramme jedes Zellenbilds entnommen wurden. Durch das Verfahren wurde festgestellt, daß die Zellen in vier oder fünf Klassen von Leukozyten aufgeteilt werden können, nämlich Neutrophile, Eosinophi-Ie, Lymphozyten und Monocyten. Young veröffentliche Ergebnisse (1969) über eine automatische Klassifizierung von fünf Klassen von Zellen und Bacus dehnte die Differenzierung 1971 aus.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die automatischen Differentialsysteme gegenwärtig auf einem Vielfarbstoffeinsatz beruhen, sowie-auf Farbstoff-Abbausystemen oder indirekten Fluoreszenzmaßnahmen unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen.

Bei dem Anfärben von Blut nach dem Stand der Technik ist festzustellen, daß es die Praxis ist, einen oder mehrere Farbstoffe in Kombination zu verwenden (Romanowski-

Giemsa- und Wright-Anfärbungen). Bei diesen Methoden ist es in der Praxis schwierig, eine Qualitätskontrolle vorzusehen. Diese Methoden erfordern eine Standardisierung bei der Herstellung jedes Farbstoffbestandteils sowie bei dem Verfahren der Probeanfärbung. Bei der Entwicklung von brauchbaren automatischen Leukozytenzählern ist die Reproduzierbarkeit der Anfärbung sogar noch wichtiger für die kontrollierbare Analyse.

Es wird berichtet, daß das "LARC"-Anfärbemittel (das in den kommerziellen automatischen Differentialleukozytenzählern verwendet wird) ein Gemisch von etwa 10 Thiazinfarbstoffcn, Eosin Y und 2,4,5 -Tribromfluorcszein ist (Mogler 1973) (P.N. Marshall). Die gegenwärtigen Anfärbemittel liegen häufig in einer alkoholischen Lösung mit einem Fixiermittel vor, wobei zwei oder mehr Farbstoffe in Kombination eingesetzt werden. Eine genaue Analyse durch Vitalblutanfärbung ist sehr schwierig. Durch die Schwierigkeit, die sich durch eine kontrollierte Oxidation von Methylenblau ergibt, was bei den Romanowski-Farbstoffen beispielsweise wesentlich ist, werden die Schwierigkeiten einer Qualitätskontrolle von zehn einzelnen unterschiedlichen zugegebenen Farbstoffen, die in Kombination eingesetzt werden, sehr groß.

Es ist festgestellt worden, daß die weit verbreitete Standardisierung und die Verwendung einer beschränkten Anzahl von Farbstoffen eine größere Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei zytologischen Studien sicherstellen würde. Wenn Fixiermittel verwendet werden, ist eine ernsthafte Beeinträchtigung durch Artefakte beobachtet worden, was Schwierigkeiten bei der Interpretation und Mißinterpretationen bei der Leukozytendifferenzierung und -aufzählung verursacht. pH-Einstellungen und Schwermetallkationen sollen zytochemische Versuche daran hindern, in

der erwarteten Weise zu arbeiten. Es wurde festgestellt, daß einige Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe, eine nichtspezifische Ausfällung um die Zellen zeigen. Andere degenerative Veränderungen der fixierten Blutprobe sind Vakuole, Kleeblattbildung der Kerne, Verzerrung der Zellenform sowie Verschmierung und Störung eines idealen Anfärbens. Die Bedeutung der Durchführung von Differentialzählungen an fast lebenden Zellen in der kürzest möglichen Zeit, um optimal brauchbare und verwertbare Blutzellenanalysen zu erhalten, ist erkannt worden. Alkoholische Farbstofflösungen beeinträchtigen das supravitale Anfärben. Soweit bekannt, zeigen frisch zubereitete wasserlösliche Anfärbemittel den geringsten denaturierenden Effekt auf das supravitale Blut bei der Untersuchung.

Andere Farbstoffe sind für die Blutzellen mehr oder weniger toxisch, jedoch sind es einige mehr als andere. Es ist wesentlich, daß die Zellen bei der Untersuchung so lange wie möglich am Leben bleiben. Die Schnelligkeit des Anfärbens verkürzt offenbar die Einwirkungszeit, so daß die Möglichkeit größer ist, die Leukozyten zu untersuchen, bevor sie ihre Vitalität verloren haben. Es besteht ein Bedürfnis nach einer automatischen Differen-. tialleukozytenzählung innerhalb weniger Minuten.

Studien und ein überblick des Standes der Technik zur Durchführung von mikroskopischen Blutanalysen und Krankheitsdiagnosen haben gezeigt, daß es für den Pathologen nicht unüblich ist, den Farbstoff und die Blutprobe auf Körpertemperatur (37⁰C) vor dem Kontakt zu erwärmen.

Dr. Sabin hatte eine "Wärmebox", um eine Temperaturkontrolle sicherzustellen.

Es ist auch festgestellt worden, daß einige nach dem Stand der Technik verwendete Farbstoffe sehr temperaturempfindlich sind. In der Literatur wird berichtet, daß

Kresylecht-Violett kein brauchbares Anfärbemittel oberhalb 30⁰C ist. Es ist für den Zweck der hier beschriebenen Methode als wesentlich anzusehen, daß der Farbstoff in der Lage ist, Leukozyten bei einer Temperatur von 37⁰C anzufärben, wobei keine Schwierigkeiten bei den ausgewählten Farbstoffen bei Temperaturen bis etwa 4 0⁰C beobachtet werden.

In der älteren Patentanmeldung wird eine verhältnismäßig kleine Zahl von Farbstoffen beschrieben, die sich zur Identifizierung einer oder mehrerer Leukozytenarten eignen. Die Identifizierung und Differenzierung bezieht sich speziell auf polymorphkernige Leukozyten (neutrophi-Ie), basophile Leukozyten, Lymphozyten allgemein und Monozyten. Eine zu beobachtende Gemeinsamkeit bestand darin, daß die Farbstoffe, die sich für die Zwecke der älteren Anmeldung als geeignet erwiesen, eine andere metachromatische Färbung erzeugten als die anderen der vorstehend angegebenen Gruppe.

Die ungewöhnlichen Eigenschaften des Farbstoffs Basischorange 21 (CI #48035 und Spektralkurve 7) wurden bei eosinophilen und basophilen Zellen sowie bei Monozyten festgestellt, wurden jedoch ursprünglich übersehen, da die B-Zellen in geringer Zahl vorliegen. Nach der älteren Anmeldung wurde ursprünglich die Beobachtung gemacht, daß die optische Differenzierung zwischen ausgereiften und unausgereiften neutrophilen Zellen dadurch möglich erscheint, daß die ausgereiften Körnchen (oder Granulat) sich im Farbton von den unausgereiften Körnchen unterschieden, die vergleichsweise stark rot und orange waren. Da diese Gruppe, die Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten und Bänder einschließt, nicht immer in sämtlichen Blutproben oder in einer merklichen Anzahl vorhanden ist, wie dies häufig bei T-Lymphozyten

(oder T-Zellen) und B-Lymphozyten (oder B-Zellen) der Fall ist, wurden sie nicht aufgrund einer metachromatischen und differenzierten Anfärbung durch Basischorange 21 spezifisch identifiziert.
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Im Nachgang zu den Arbeiten, die die Grundlage der älteren Anmeldung bilden, zeigte die weitere Forschung in bezug auf den Einsatz dieses einzigartigen Farbstoffs bei Untersuchungen ähnlicher Blutspender, daß es bei Verwendung dieses ausgewählten basischen kationischen Farbstoffs der Methin-, Polymethin- und Chinolin-Klasse in reproduzierbarer Weise möglich war, durch metachromatische Reaktion bestimmte Lymphozyten zu unterscheiden- Es ist weiterhin möglich, wenigstens zehn erkannte Granulozyten und Lymphozytenzellen zu identifizieren, die nach den Kenntnissen der medizinischen Wissenschaft von lebenswichtiger Bedeutung sind.

Da diese Differenzierung außerdem sofort erfolgt, braucht keine verwickelte Biochemie oder eine langwierige Vorbehandlung der Blutproben zu erfolgen. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der Farbstoff eine minimale Toxizität aufweist.

Es wurden mikrospektrophotometrische Messungen mit einer Blende durchgeführt, die klein genug war, um die Farbe der Körnchen der supravital angefärbten granulozytischen Zellen der Leukozyten zu messen. Da keine anderen Teile der Zelle die Messung irgendwie beeinträchtigten, wurde festgestellt, daß Extinktionskoeffizienten der Farben der verschiedenen Leukozytenarten auftraten, die sich beträchtlich unterschieden und oftmals Unterschiede in der Färbung, dem Wert oder dem Farbton von etwa 50 nm aufwiesen. Diese stellen erkennbare Maxima, die mit vielen Zellen übereinstimmen, dar. Es ist darauf hinzuwei-

sen, daß Unterschiede von etwa 5 nm bei mikrospektrophotometrischen Messungen erkennbar sind, wenn diese Unterschiede übereinstimmen und reproduzierbar sind.

Zu den unausgereiften Granulozytenzellen, die sofort identifiziert und voneinander unterschieden werden können, gehören Myeloblasten und Zellen der Myeloidreihe, nämlich Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten. Es wird allgemein angenommen, daß dieselben die Vorläufer der polymorphkernigen Leukozyten oder neutrophilen Zellen sind, die gleichfalls metachromatisch angefärbt werden, so daß sie bei den supravitalen Blutanalysen, die durch die hierin beschriebenen Fortschritte möglich gemacht worden sind, schnell und leicht unterschieden, identifiziert und aufgezählt werden.

Wie in der älteren Anmeldung beschrieben ist, ist es ferner zweckmäßig, gleichzeitig neutrophile, eosinophile und basophile Zellen, Lymphozyten und Monozyten voneinander und von den' vorstehenden Vorläufern zu unterscheiden, falls sie alle in einer bestimmten Blutprobe bei mikrospektrophotometrischen Analysen vorliegen sollten.

Darüber hinaus wurde festgestellt, daß dieser einzigartige Farbstoff zu einem optisch unterschiedlichen Farbmuster führt, ferner zu einer unterschiedlichen Dichte der' Farbe jeder Granula in der Lymphozytengruppe. Durch diese Eigenschaft der Leukozytenzelle kann also eine einzigartige Trennung durch optische Differenzierung von anderen unausgereiften vorstehend genannten Zellen erfolgen. Die Differenzierungen der Farbe, der Farbanordnung und der Farbdichte treten darüber hinaus in einer solchen Größenordnung auf, daß die vorstehend im einzelnen genannten Zellen von einer kompetenten Bedienungsperson vorgenommen werden können. Auch hat es den Anschein, daß

auf dieser Grundlage eine automatische Differentialzähleinrichtung sich entwickeln läßt, was durch die Unterschiede aufgrund der Gegenwart oder Abwesenheit der Farbe und der physikalischen Muster, die in dem Kern vorliegen und durch die relative Anzahl, Größe, Anordnung oder Muster sowie den Farbton, den Wert und die Färbung und die Farbdichte aufgrund der Anzahl der Körnchen in dem Zytoplasma erleichtert wird.

Fast unglaublich, wie jedoch durch die bisherige Grundlagenforschung demonstriert wurde, ist ferner die Möglichkeit, B-Lymphozyten oder B-Zellen von T-Lymphozyten oder T-Zellen zu unterscheiden. Es ist wiederum möglich, jede dieser wichtigen Lymphozyten spiegelbildlich qualitativ und quantitativ durch Verwendung des gleichen Farbstoffs mit der gleichen supravitalen, fxxxermittelfreien Analyse zu identifizieren, sowie die T-Zellen und B-Zellen von jeder der vorstehenden getrennten,unausgereifte und ausgereifte Zellen aufweisenden Gruppen zu unterscheiden und aufzuzählen.

Wie in der älteren Anmeldung beschrieben ist, reagieren Monozyten ebenfalls metachromatisch und sind entsprechend identifizier- und zählbar, ohne in Konflikt mit den vorstehend beschriebenen mikroskopischen Analysen der Lymphozyten zu geraten.

Auch ist zu erwähnen, daß Blutplättchen, schmale, diskrete, staubähnliche Teilchen, die zur Steuerung der Blutung dienen, aufgrund ihrer orangefarbenen Anfärbung identifiziert und gezählt werden können. Ihre Anzahl ist gleichfalls ein wertvoller Hinweis auf die Blutqualität.

Die weitere Feststellung der Möglichkeit von Basischorange 21 zusätzlich Myeloblasten und Blutzellen der myeloiden

Reihe sowie Gruppen und T-Lymphozyten und B-Lyrnphozyten zu differenzieren, erweitert das ursprüngliche Anwendungsgebiet des Farbstoffs in unerwarteter Weise über die Möglichkeit hinaus, die aus der älteren Anmeldung hervorgeht. Supravitale Blutprobenfraktionen von Flüssigkeiten, die mit gesundem Gewebe oder vermutlich anormalem Gewebe in Verbindung stehen, wie Plasma, Lymphe, Serum usw., die eine oder mehrere der vorstehenden Zellen enthalten, können nach der metachromatischen Anfärbung mikroskopisch untersucht werden, um jede vorstehend angegebene Zellenart zu differenzieren und dadurch Aufzählungen und Vergleichsuntersuchungen durchführen zu können.

Der heutige Stand der Technik in Verbindung mit dem Gegenstand der älteren Anmeldung führt zu einem bisher nicht dagewesenen Fortschritt in der Hämatologie, Zytologie und Immunologie sowie zu der Möglichkeit, auf einem unbegrenzten medizinischen Gebiet Untersuchungen zu planen und durchzuführen. Der Bedarf nach teuren Reagenzien, wertvoller Forschungszeit und einer genaueren Dateneinrichtung hat sich dadurch spürbar verbessert.

Die Kenntnisse der Diagnose von Krankheiten haben einen neuen Horizont jenseits der gegenwärtigen Grenzen erreicht.

, Es sind außerdem nahezu tausend verschiedene bekannte Farbstoffe, von denen einige nicht mehr hergestellt werden und nur durch umfangreiche Forschungsarbeiten in geringen Mengen erhältlich waren, untersucht worden, um Hinweise auf Farbstoffe zu erhalten, die sich für Analysen und für das Studium einer supravitalen Blutprobenfraktion eignen. Versuche mit einer nicht zählbaren Gruppe von Farbstoffen sowohl hinsichtlich der chemischen Struktur wie der chromophoren Gruppenklassifikation sind

gescheitert, da nach der Theorie die Metachromasie sehr selten auftritt, jedoch nicht irgendeiner bekannten Klasse vorbehalten ist. Es ist allerdings festgestellt worden, daß die basische quaternäre kationische chemische Klasse sich von größerem Interesse erwies als jede andere bisher bekannte Gruppe.

Bei den Untersuchungen, die dieser Anmeldung zugrunde liegen, wurden zwanzig (20) Methin- und Polymethin-Farbstoffe von Basischrot-, Basischorange- und Basischviolett-Farben zur Identifizierung von Leukozyten getestet. Von der ersten Gruppe der neun Basischrot-Farben führten nur vier zur sofortigen Anfärbung des Kerns von Monozyten, jedoch zu einer geringfügigen oder keiner Anfärbung der anderen Zellarten. Diese Reihe umfaßt das Basischrot 13 der älteren Anmeldung sowie das danach untersuchte Basischrot 35, 36 und 49. Von den sechs (6) getesteten Basischviolett-Methin- und -Polymethin-Farbstoffen färbten das Basischviolett 7, 15, 16 (die in der älteren Anmeldung beschrieben sind), 39 und 40 gleichfalls sofort und selektiv Monozyten an.

Sechs Basischorange-Polymethin-Farbstoffe wurden einem praktischen Test unterworfen. Basischorange 21 war in dieser Reihe einzigartig, da es nicht nur Monozyten unterschiedlich anfärbte, sondern eine unerwartete Anzahl anderer Leukozyten gleichfalls sofort anfärbte, jedes in einer unterschiedlichen Weise.

Die 20 Polymethin- und Methin-Farbstoffe stellen bezeichnenderweise gegenwärtig weltweit den Bestand an allen erhältlichen sowie kommerziell veralteten Farbstoffen der Methin- und Polymethin-Klasse, soweit dem Stand der Technik der Farbstoffe zu entnehmen, dar. In der älteren Anmeldung wird über die Untersuchung von 18 Carbocyanin-

Farbstoffen berichtet, von denen lediglich einer eine ähnliche metachromatische Anfärbung von Monozyten zeigte. Carbocyanin-, Ohinoid- und Methin- sowie Polymethin-Farbstoffe variieren häufig sehr stark in ihrer chemischen Struktur.

Die genaue und spezielle Untersuchung der Struktur von Basischorange 21 (Colour Index 48035) , die in der US-PS 2 126 852 beschrieben wird, führte zur Untersuchung von Basischorange 22 (Colour Index #48040) . Eine Untersuchung der beiden chemischen Strukturen (wie sie nachstehend angegeben sind) in Verbindung mit den durchgeführten Tests führten zu überraschenden Ergebnissen. Basischorange zeigt praktisch keine Metachromasie, um für die hier angegebenen Zwecke brauchbar zu sein.

CI. 48040 Basischorange

CI. 48035 Basischorange 30

Eine Überprüfung dieser Strukturen ergibt, daß als einziger Unterschied festzustellen ist, daß das Indolylradikal jedes Basischorange, das in der vorstehenden Strukturformel mit B und B wiedergegeben ist, lediglich'durch einen Wechsel der Methylgruppe von der 2-Stellüng·: i£ Basischorange 21 in die 1-Stellung in Basischorange 22 variiert, wobei es in Basischorange 21 an ein Kohlenstoffatom und In Basischorange 22 an ein N gebunden ist. Die ufisubsfcituierte 2-Stellung in Basischorange 22 weist ferner 'eine zusätzliche Phenylgruppe anstelle der so in der Struktur neu angeordneten Methylgruppe auf.

In mehr als drei Forschungsjahren mit einer Vielzahl unterschiedlicher Farbstoffklassen konnte keine Grundlage für die Vorhersehbarkeit der Metachromasie festgestellt werden. Es wurde eine häufigere Metachromasie unter den basischen, kationischen quaternären Farbstoffen festgestellt und relativ häufig unter den Methinen und PoIymethinen. ,

; Nach dem Stand der Technik ist es bei supravitalen Analysen nicht unüblich, daß der Einsatz von ärei fFarbstoffkonzentrationen bei drei Präparationen von Objektträgern in derartigen Analysen erforderlich ist, um dUe ErgebniS-se zu überprüfen. Mit Basischorange 21 sind die Farbunterschiede derart deutlich und die Farben derart außergewöhnlich kräftig, daß man mit einem Farbstoff und einem Objektträger primäre von sekundären Körnchen sofort leicht unterscheiden kann.

Die vorliegenden Erfindung stellt einen Fortschritt auf zytologischem Gebiet dar, da sie einen einzigen basischen quatornären kationischen organischen Farbstoff der Mcthin- und Polymethinreihe angibt, der selektiv durch einen oder mehrere periphere Blutzellenleukozyten absorbiert wird,

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wodurch eine ungewöhnliche Verbesserung der Identifikation und Differenzierung zwischen unausgereiften und ausgereiften Teilen verschiedener Arten der Myeloidreihen und der ausgereiften weißen Blutzellen erreicht wird. Bisher mußten zytochemische Maßnahmen und komplexe Färbemittel zur Differenzierung der Blutzellen verwendet werden, die häufig eine Stunde und mehr an mühsamen Präparationen erforderten, um eine einzige Art bekannter Leukozyten durch mikroskopische Analyse zu differenzie- ' ren und aufzuzählen.

Durch die Erfindung ist es nunmehr möglich, differenziert anzufärben und mit einem einzigen reinen Farbstoff (mit dem andere bei bestimmten Untersuchungen kombiniert sein können) durch einen einfachen wäßrigen Kontakt mit einer peripheren venösen Blutprobe oder Fraktion derselben, einschließlich leukozytenreicher Proben, jede der folgenden Arten oder Typen von Zellvorstufen, weißen Blutzellen,' Plättchen usw. genau und leicht zu identifizieren. Diese Arten umfassen Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder, neutrophile, eosinophile und basophile Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Monozyten. Blutplättchen können gleichfalls identifiziert und gezählt werden, zeigen jedoch keine Metachromasie.

Durch Absorption oder in einigen Fällen durch Nichtabsorption des Farbstoffs wird jede der Leukozytenarten differenziert, indem ein Bild reflektiert wird, das spektral idehtifizierbare unterschiedliche Farben aufweist, wobei andere Farben innerhalb des normalen Lichtspektrums adsorbiert werden, das hauptsächlich den· sichtbaren Lichtbereich einschließt, jedoch Infrarot- und Ultraviolettbereiche nicht ausschließt, welche bei einer automatischen Einrichtung Bedeutung haben, die nicht auf das Ansprechen des menschlichen Auges beschränkt ist. Ein Ansprechen auf

einen fluoreszierenden Farbstoff ist jedoch nicht erforderlich.

Dadurch kann jede einzelne genannte Art von ihren Nachbarn unterschieden werden, wobei jede Art gezählt wird, die gesamte Zahl der vorhandenen Arten bestimmt wird, jede Art hinsichtlich ihrer Morphologie untersucht werden kann und viele Bestimmungen gemacht werden können, die von großem medizinischem Wert sind.

Grundsätzlich absorbiert jede der genannten weißen Blutzellen oder Leukozyten differentiell Licht von dem gleichen reinen metachromatischen Farbstoff, in Abhängigkeit von der Qualität des Farbstoffs, der Art des Leukozyten und der Farbstoffrezeption der Bestandteile der spezifischen, in der analysierten Probenfraktion vorhandenen Zellen.

Wenn keine Fixiermittel vorhanden sind, wird der erfindungsgemäße basische Farbstoff metachromatisch absorbiert, so daß jede einzelne Klasse, Art oder Spezies von Leukozyten, Lymphozyten oder Granulozyten ein charakteristisches Lichtspektrum oder eine Farbe reflektiert, die von jeder anderen in der Probe vorhandenen Klasse, Art oder Spezies von Blasten, Myeloidzellen, Leukozyten oder Granulozyten sich unterscheidet. Die auffallend starke Metachromasie des einzigen erfindungsgemäßen orangen Farbstoffs ist, soweit bekannt einzigartig und bemerkenswert. Jede Spezies der Reihen, die Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder, neutrophile, eosinophile und basophile Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Monozyten umfaßt, absorbiert auf diese.Weise eine einzelne metachromatische Farbe, so daß ein unterschiedliches Lichtspektrum oder eine unterschiedliche Farbe im Bereich des sichtbaren Lichts reflektiert wird. Kombina-

tionen des erfindungsgemäßen Farbstoffs mit anderen Farbstoffen, wie sie in der älteren Anmeldung vorgeschlagen werden, können, wie darin angegeben, bei einigen Leukozytenanalysen nützlich sein.
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Das primäre Bezugssystem zur Identifizierung dieses einzelnen neuen Farbstoffs und der neu identifizierten Farbstoffe der älteren Anmeldung sind deren Spektralkurven.

Diese Erfindung stellt eine Weiterbildung der älteren Patentanmeldung P 31 09 252.7 dar, die auf der Erkenntnis beruht, daß mit einer Gruppe einzigartiger metachromatischer Farbstoffe, die einzeln, jedoch häufig in Kombination verwendet werden, fünf Spezies von weißen Blutzellen, nämlich neutrophile, eosinophile und basophile Zellen,Lymphozyten und Monozyten voneinander, wenn sie in menschlichen Blutproben vorliegen, identifizierbar und unterscheidbar sind.

Die Erfindung stellt eine Weiterbildung durch die Erkenntnis dar, daß der Farbstoff, der als Basischorange 21 (Spektralkurve # 7) bekannt ist, wenn er allein in einem ' wäßrigen Medium bei Anwendung der supravitalen Blutanalysentechnik einer fixiermittelfreien Probe oder Fraktion eingejsetzt wird, die Fähigkeit besitzt, in ungewöhnlicher und

unterscheidbarer metachromatischer Weise die bisher identifizierten Reihen von menschlichen Blutzellen und -plättchen anzufärben.

Diese Identifikation einzelner Spezies gibt ein bemerkenswertes Ausmaß der Differenzierung wieder.

Während die vorstehend genannten Blutzellen bisher durch . komplexe Maßnahmen unterschieden und identifiziert wurden, legt es der Stand der Technik auch nicht andeutungsweise

nahe, daß es möglich ist, jede der vorstehend angegebenen Spezies mit einem einzigen Farbstoff zu identifizieren und zu differenzieren.

Die Identifizierung erfolgt nach dem "Colour Index", nach dem Basischorange 21 durch die "Colour Index"-Zahl 48035 wiedergegeben wird, ferner durch die chemische Struktur sowie die nachstehenden Spektralkurven. Auf die Spektralkurve Nr. 2 (Borrelblau) wird hier erneut hingewiesen, da in der älteren Anmeldung dessen Verwendung in Kombination mit Basischorange 21 für bestimmte Zwecke vorgeschlagen ist. Es ist darauf hinzuweisen, daß die obere Kurve, die im allgemeinen die niedrigeren Maxima und mit größerer Häufigkeit Änderungen der Steigung aufweist, das Ansprechen des ultravioletten Lichts wiedergibt, während die ursprünglichen unteren Kurven, die im allgemeinen weniger und größere Peaks aufweisen, die Kurven für das Ansprechen im sichtbaren Licht darstellen.

Ohne daß dies theoretisch erhärtet ist, ist es bekannt, daß fast alle fremden Zusätze die Tendenz besitzen, proteinhaltige Materialien zu denaturieren. Bisher war die Verwendung von Fixiermitteln bei der Präparierung der Blutproben zur Anfärbung die weltweite Praxis. Die Erfahrung hat gezeigt, daß das Fixieren die Wechselwirkung zwischen der Metachromasie der Zellen und der metachromatischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe stört. Störende Artefakte werden dadurch auf diesem Gebiet über den einfachen Umweg der Verwendung einer supravitalen, fixiermittelfreien Probe beim Einsatz der supravitalen Technik gleichfalls vermieden.

Bei der Durchführung der Erfindung erfolgt das Anfärben ausreichend schnell, so daß bei normaler Bluttemperatur (37⁰C) der Zytologe nicht zu warten braucht oder sich auf

-Me-

Spektralkurve 7 Basisch Qrange21

2OO 350

22O

α OO

ZCO 2SO «50 5OO

Wellenlänae in nm

3OO 6OO

320

65Ο

7OO

360 750

Spektralkurve Borrel-Blau

^C/aa

Wellenlänae in nm

die feinere Zytochemie zurückziehen muß, bevor die Farbentwicklung der Zellen erfolgt, wobei die spektrale Differenzierung der aufgezählten Mitglieder der Familie der Leukozyten, Lymphozyten und Granulozytenzellen durchgeführt werden kann, bevor die mikroskopischen Untersuchungen entweder manuell oder mittels automatischer Differentialleukozytenzähleinrichtungen beginnen.

Es können folgende Arten fixiermittelfreier Blutproben verwendet werden:

1. Antikoaguliertes (EDTA, Citrat, Heparin) Gesamtblut,

2. Suspensionen von Leukozyten, die mittels Dextran und/ oder Schwerkraftsedimentierung des antikoagulierten Gesamtbluts erhalten worden sind,

3. Proben des Gesamtbluts, das mit einer hypotonischen Lösung behandelt worden ist, um eine Auflösung der roten Blutzellen zu bewirken, wobei primär weiße Blutzellen und -plättchen zurückbleiben,

4. Proben anderer Körperflüssigkeiten,' wie Rückenmarkflüssigkeit oder Rippenfellflüssigkeit oder Bauchwasserflüssigkeit sowie Proben vereinigter Flüssigkeiten, sofern die weißen Blutzellen von Interesse sind.
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Obgleich die Erfindung nicht spezifisch auf eine automatische Differentialleukozytenzähleinrichtung abgestellt ist, sind derartige Einrichtungen einer genauen überprüfung unterzogen worden.
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Das Kolleg der amerikanischen pathologischen Konferenz in Aspen, Colorado, August 1975 hat eine Reihe von Druckschriften veröffentlicht, die zu dieser Zeit in Form einer Sammlung herausgegeben worden ist, die den Titel "Differentialleukozytenzählung" trägt. Diese Berichte ge-

ben Auskunft über die Entwicklung und den Stand der Technik auf dem Gebiet der automatischen Differentialblutzellenzählcomputer. Auch ist auf die US-PS 3 916 205 sowie die US-PS 4 146 604 (Kleinerinan) hinzuweisen, wonach bestimmte fluoreszierende Farbstoffe in bestimmten Kombinationen zur automatischen Differenzierung bestimmter Leukozyten und anderer Blutzellen aufgrund des Ansprechens des fluoreszierenden Lichts verwendet werden. Diese Literaturstellen sind hinsichtlich des Gegenstands und der Aufgabe der vorliegenden Erfindung relevant. Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß Kleinerman nicht von der bei der mikroskopischen Untersuchung von Leukozyten üblichen Fixierung der Zellen abgeht. Nach dem Stand der Technik werden verschiedene Grade der Diskriminierung in dem Verhalten bei der Leukozytendifferentialzählung getroffen. Grundlegend oder primär ist die Differenzierung zwischen polymorphkernigen Zellen und mononuklearen Zellen. Dazwischen liegt die Differenzierung der polymorphen in neutrophile, eosinophile und basophile Zellen sowie die Trennung der mononuklearen Zellen in Monozyten und Lymphozyten, was im Prinzip als möglich bezeichnet wird.

Der ansche'inend dritte Schwierigkeitsgrad, der die Unterscheidung der neutrophilen Zellen in reife und unreife Formen sowie die Trennung der Lymphozyten in normale und reaktive Arten umfaßt, wurde ursprünglich erkannt und in der älteren Anmeldung erwähnt. Soweit bekannt, stellt die Erfindung die einzige Methode dar, um auf einfache Weise mit einem einzigen reinen Farbstoff die Blasten, die myeloide Reihe, Bänder, polymorphkernige Leukozyten (neutrophile), eosinophile und basophile Zellen, B-Zellen und T-Zellen sowie Monozyten und Plättchen mit einem einzigen Farbstoff in einer einzigen Probenfraktion zu unterscheiden.

Der gegenwärtige Stand der Technik bei automatischen Differentialleukozytenzählern befindet sich deutlich in einem Entwicklungsstadium, das die Verwendung von weißem 'Licht und einem einfachen wäßrigen Farbstoff angeht. Manuelle Differentialzählungen mit den vorstehend beschriebenen Schwierigkeiten scheinen die zu sein, auf die man sich hauptsächlich verläßt. Die automatischen Differentialzähler werden in zwei Hauptklassen oder -gruppen eingeteilt: 1. Bilderkennungssysteme und 2. zytochemische Differenzierungssysteme. Es ist darauf hinzuweisen, daß nach dem Stand der Technik Anfärbemethoden mit mehr oder weniger großem Erfolg angewendet werden, wobei die Bedienungsperson des Geräts den Betrieb Zelle für Zelle überwachen kann. Im allgemeinen werden lediglich 100 Zellendifferentialzählungen durchgeführt. Obgleich sie genau sind, müssen für die zytochemischen Systeme noch zufriedenstellende Kalibratoren entwickelt werden, desgleichen erfordern sie hochqualifizierte Bedienungspersonen.

Bei einer Übersicht über die Fluoreszenzmethoden nach dem Stand der Technik ist auf folgende Punkte hinzuweisen. 1. Es sind wenigstens zwei Lichtquellen wesentlich, einschließlich violettem und ultraviolettem Licht; 2. eine dritte Lichtquelle wird offenbar auch benötigt. 3. Das System erfordert eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen, um die Leukozytenarten zu identifizieren und zu differenzieren. 4. Das System erfordert alkoholfixierte Blutabstriche. 5. Die erforderliche Anfärbezeit liegt in der Größenordnung von 10 Minuten, wobei ein Abspülen von 1 Minute, das von einem Trocknen gefolgt ist, erforderlich ist. 6. Es scheint eine Abnahme der Fluoreszenz zu geben in der Reihenfolge von a) eosinophilen zu b) neutrophilen Zellen zu c) Monozyten zu d) Lymphozyten. (Die Identifizierung der basophilen Zellen wird nicht beschrieben.) 7. In einem Strömungsrohrsystem werden die Blutzel-

rl·

len mit Formaldehyd fixiert und mit drei verschiedenen Farbstoffen angefärbt. 8. Die festgestellten I^kozytenfluoreszenzen werden differentialgezählt und mittels Fluoreszenzlichtverhältnissen klassifiziert. 9. In einem Patent wird die Identifizierung von lediglich vier der fünf Leukozytenarten beschrieben. 10. Es werden drei Fluoreszenzfarbstoffe genannt, die kombiniert werden müssen, um eine einzige Farbstoffzusammensetzung zu ergeben, welche Kombination von Farbstoffen für die Arbeitsweise oder das Verfahren wesentlich ist, also nicht lediglich vorteilhaft zu sein scheint.

Bei der vorliegenden Erfindung ist lediglich gewöhnliches weißes Licht notwendig. Es ist keine Änderung von dessen Intensität erforderlich. Es ist möglich, nur einen der in der älteren Anmeldung beschriebenen Farbstoffe oder Farbanfärbungen zu verwenden, um wirklich nur einen "einzigen" reinen Farbstoff einzusetzen. Es ist jedoch festgestellt worden, daß die reinen Farbstoffe bei der älteren Anmeldung wie bei der vorliegenden Erfindung auch sowohl kombiniert wie allein verwendet werden können, und die spektrale Differenzierung in einer einzigen menschlichen Blutprobenanalyse zu verbessern oder zu erhöhen.

Die beschriebenen Methoden basieren auf einer supravitalen Technik. Es ist ein kontinuierliches Überwachungssystem bei der Krankenhausdiagnose und -behandlung möglich, wo eine kontinuierliche kritische weiße Blutzellenüberwachung direkt am Patienten .ein erwünschtes Ziel ist.

Der Ausdruck supravitaler Farbstoff oder Färbemittel sowie der Ausdruck suprayitales Anfärben schließt die Möglichkeit einer kontinuierlichen Perfusion durch die Blutgefäße eines lebenden Organismus und die kontinuierliche

35..überwachung sämtlicher möglicher weißer Blutzellen nicht

aus, wenn dieselben durch ein spezielles Bypass-Rohr zur überwachung und zur Zählung hindurchtreten.

Es ist bekannt, daß die meisten Farbstoffe toxisch sind, wenn sie unter supravitalen Bedingungen eingesetzt werden. Soweit bisher festgestellt wurde, ist Basischorange 21 der am wenigsten toxische Farbstoff für den erfindungsgemäßen Zweck. Nach dem Stand der Technik ist festgestellt worden, daß die weißen Zellen sehr leicht beschädigt werden, wenn alle roten Zellen in einer Wärmebox bei 37⁰C angefärbt werden. Nach dem Stand der Technik ist es auch bekannt, daß, wenn eine Gruppe von Zellen stimuliert oder beschädigt wird, die Reaktion gegenüber den Farbstoffen sich deutlich ändert. Es ist nicht ungewöhnlich, daß das Anfärben mit einigen Farbstoffen relativ lange Zeit in Anspruch nimmt, in der Größenordnung von einer halben Stunde, um eine maximale Farbintensität zu erreichen. Die Lymphozyten- und Leukozytenfarbstoffe der Erfindung färben fast augenblicklich an, so daß keine Zeit nach dem Inberührungbringen erforderlich ist. Die Zellen werden daher der Überprüfung in der am wenigsten denaturierten Form, die bisher bekannt ist, unterzogen. Eine übermäßige Einwirkungszeit kann die genaue ursprüngliche Differenzierung beeinträchtigen.

Aufgrund der Grenzen, die panoptisch angefärbten Proben eigen ist, wurde in den letzten Dekaden eine Anzahl von zytochemischen Tests vorgeschlagen, um eine Blutzellenart von einer anderen genauer zu unterscheiden. Im allgemeinen zielen diese Tests darauf ab, einen höheren Anteil einer Art einer Verbindung in einer bestimmten Zelle im Vergleich zu einer anderen festzustellen, oder eine Substanz (Substanzen) in einem charakteristischen zellulären Bestandteil in einer Zelle gegenüber einer anderen festzustellen. Beispielsweise ist die Aktivität der nichtspezi-

fischen Esterase in Monozyten ungewöhnlich hoch, wobei diese Aktivität insbesondere hinsichtlich der Inhibition durch Natriumfluorid empfindlich zu sein scheint. In ähnlicher Weise hängt die· Identifizierung der Granulozytenzellen meistens von einer Sichtbarmachung der Eigenschaften der Lysosomen ab. Aus diesem Grunde hat sich die Bestimmung der Aktivität der Myeloperoxidase und der spezifischen Esterase als geeigneter zytochemischer Test erwiesen. Die Lysosomalkörnchen der eosinophilen Zellen enthalten Myeloperoxidase, die gegenüber einer Inhibition durch Natriumcyanid resistent ist, wobei die Körnchen der basophilen Zellen mit einer Vielzahl von Farbstoffen zum Teil aufgrund ihres hohen Gehalts an kationischen Substanzen, wie Heparin, metachrömatisch anfärbbar sind.

Eine Ausweitung der Untersuchungen mit Basischorange 21 . hat eine überraschende Weiterentwicklung gegenüber der älteren Anmeldung ergeben. Es wurde ursprünglich festgestellt, daß Basischorange 21 einige ungewöhnliche Eigenschäften besitzt,und diese Anmeldung setzt die ursprünglichen Beobachtungen in die Tat um.

Es ist darauf hinzuweisen, daß Monozyten keine anfärbende nukleare Reaktion zeigen, jedoch durch zytoplasmatisehe und Körnchenfarbdifferenzierung identifiziert werden können.

Verglichen mit den herkömmlichen zytochemisehen Färbemitteln zur Identifizierung von Monozyten, neutrophilen Leukozyten, eosinophilen und basophilen Zellen, weist das supravitale Anfärben peripherer Blutleukozyten mit Basischorange 21 mehrere Vorteile auf. Es ist von Vorteil, weil es rasch verläuft, nämlich weniger als 2 Minuten für eine maximale Farbentwicklung benötigt. Es ist auch von Vorteil, weil es den Einsatz synthetischer Sub-

strate und komplexer Azofarbstoffe und -kuppler/ wie sie bei den herkömmlichen zytochemischen Tests verwendet werden, vermeidet. Die bekannten zytochemischen Tests sind wegen der unspezifischen Ausfällung der Farbreagenzien, der Verschlechterung der Substrate und der Notwendigkeit nach einer komplizierten Einstellung des pH-Werts und des Metallionengehalts schwierig zu interpretieren.

Die supravitale Anfärbetechnik, bei der lebende Blutzellen verwendet werden und bei der unterschiedliche Affinitäten gegenüber einem supravitalen Anfärben dieser Zellen mit verdünnten wäßrigen, fxxxermxttelfreien Farbstoffen auftreten, vermeidet Artefakte, die häufig bei herkömmlichen Fixiermitteln auftreten. Die erfindungsgemäße Vitalanfärbetechnik stellt eine genauere Wiedergabe der zellulären Lokalisation des Farbstoffs (z. B. Lysosome, fibrillHre Strukturen, nukleares Chromatin) gegenüber den bisher verwendeten herkömmlichen Färbemitteln dar. Mit zunehmender Erfahrung und Verbesserungen der automatisehen Technologie der differentiellen Blutzellenzählung stellt die supravitale, fixiermittelfreie Anfärbung von peripheren Blutleukozyten einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der Zytochemie dar.

Es ist festzustellen, daß die Nomenklatur, mit der Basischorange 21 identifiziert wird, aus dem "Colour Index" stammt. Es ist auch mit anderen Normen zu identifizieren. Wegen möglicher Verwechslungen der Nomenklatur und aufgrund der Tatsache, daß Basischorange 21 allein wirksam ist, während sein nächster Nachbar in dem "Colour Index" Basischorange 22 mit einer (wie oben angegeben) fast identischen chemischen Struktur unwirksam ist und keine Metachromasie bei der erfindungsgemäßen Verwendung zeigt, geben die Spektralkurven und die bekannten chemischen Struktüren für die Identifizierung der spezifischen quaternären

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kationischen Farbstoffe der Erfindung den Ausschlag. Es ist interessant, festzustellen, daß sämtliche erfindungsgemäß wirksamen Farbstoffe Monozyten metachromatisch identifizieren.
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In diesem Zusammenhang erscheint es zweckmäßig, auf die Fig. I Bezug zu nehmen, um das Verständnis der erfindungsgemäßen Identifizierung und Differenzierung der Leukozyten zu erleichtern.

Die Beschränkung auf eine Schwarz-Weiß-Wiedorgabe der Fig. I und der Umstand, daß die wesentlichen Darstellungen dreidimensionale Gegenstände sowie Farbunterschiede umfassen, die durch die Ungenauigkeit der Sprache nicht genau identifizierbar sind, stellt einen Nachteil dar, der auf die Schwarz-Weiß-Wiedergabe von Patentschriften zurückzuführen ist.

Sämtliche Blutzellen scheinen von undifferenzierten Stammzellen, sogenannten mesenchymalen Zellen, herzurühren. Die unmittelbaren Nachkommen der Stammzellen werden Blasten genannt, wobei die spezifischen Myeloblasten als Vorstufen der differenzierten Leukozyten anzusehen und identifizierbar und aufzählbar bei supravitalen Analysen sind, wenn sie Basischorange 21 in einer fixiermittelfreien wäßrigen Lösung ausgesetzt werden. Die Myeloblasten sind erfindungsgemäß durch die Abwesenheit von Körnchen der Lysosomen identifizierbar, die charakteristisch die drei davon abstammenden Zellen der Myeloidreihe durch ihre metachromatische Farbabsorption erkennen lassen. Die drei abstammenden Zellen, nämlich Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten werden jeweils in der beschriebenen Art und Weise durch die metachromatische und unterschiedliche Farbe und Farbverteilung separat identifiziert.

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Promyelozyten werden leicht durch folgende manuelle und automatische überprüfung identifiziert. Sie sind im allge meinen der Größe nach die größten der Myeloidreihe. Der ovale Nucleus N-1 wird durch Basischorange 21 nicht angefärbt, wobei er einen relativ großen Teil der gesamten Granulozytenzelle darstellt. Das Zyto.plasma C ist dicht mit einer großen Anzahl relativ kleiner primärer Körnchen mit einer orangeroten Farbe 1 gepackt, wobei wenige verstreute violette Körnchen 2 im allgemeinen beobachtet werden können, die in der Masse der orangeroten Körnchen verteilt sind.

Myelozyten weisen gleichfalls einen nicht angefärbten, eiförmigen Nucleus N-2 mit etwas verminderter Fläche (Volumen) auf. Der herausragende Unterschied ist die eindeutige Entwicklung großer sekundärer gelber Körnchen (Granula) 4 in einer unreifen Myelozytenzelle mit im allgemeinen zunehmendem Halbmond. Die beiden imaginären Linien a - a grenzen die zunehmende Anzahl größerer sekundärer gelber Körnchen 4' der Myelozyten von der abnehmenden Anzahl kleiner orangeroter primärer Körnchen 6 ab. Es ist festzustellen, daß die Myelozyten von den Promyelozyten sich durch die bemerkbar isolierte Komponente der Entwicklung sekundärer großer gelber Körnchen 4 unterscheiden.

Metamyelozyten weisen gleichfalls einen ungefärbten Nucleus N-3 auf, der anfängt, eine lobuläre Form zu entwickeln, im Unterschied zu der vorstehend beschriebenen Eiform der ersten Zelle in der Myeloidreihe. Die kleiner werdende Masse kleiner, primärer, orangeroter Körnchen 6 wird nun zu einer vergleichsweise kleinen Fläche der gesamten Fläche des beobachteten Zytoplasmas C-2 der Zelle. Größere sekundäre gelbe Körnchen 8 scheinen einen erhebliehen mittleren Bereich des vorherigen eiförmigen nicht

angefärbten Nucleus N-3 zu ersetzen, was den Wechsel wie dergibt, der verbal mit "von der Eiform zu der lobulären Form" wiedergegeben wird.

Die Bänder werden zunehmend unterscheidbar und setzen sich von den drei ersten vorstehend beschriebenen Zellen ab, die ein metachromatisches Anfärben der Körnchen zeigen und die Mitglieder der myeloiden Reihen sind.

Soweit bekannt, waren Verbände bisher nicht von den anderen Leukozyten durch Metachromasie mit einem Farbstoff unterscheidbar.

Die Bänder unterscheiden sich von allen anderen Leukozyten durch einen ungefärbten lobulären Nucleus N-5, der zusammen mit der gesamten Bandgröße eine merklich verminderte Fläche (Volumen) aufweist im Vergleich zu den bisherigen Leukozytenzellen der Myeloidreihen. Darüber hinaus ist die lobuläre Form des unangefärbten Nucleus N-5 stärker gegabelt worden durch weiteres Wachstum des Zytoplasmas C-6 nach innen. Die Zunahme der Zahl der sekundären gelben Körnchen 12 in dem Zytoplasma hat bis auf ein sehr kleines Band restlicher primärer kleiner orangeroter Körnchen 10 alles ersetzt. Es ist darauf hinzuweisen, daß das Band der roten Körnchen 10 spezifisch in dem nach innen gerichteten Vorsprung oder der Bewegung des Zytoplasmas C-6 angeordnet ist, der bzw. die den Nucleus N-5 zu teilen bestrebt ist. Größere sekundäre gelbe Körnchen 12 beginnen damit, das Zytoplasma C-6 bis auf diese charakteristische kontrastreiche Farbgruppe der Bänder zu übernehmen. Ein wichtiger Punkt der Trennung Bänder ist der schmale Verband der roten Körnchen 10 in. dem Zytoplasma C-6 bei 10.

Dieser herausragende Punkt der Differenzierung der Bänder

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von allen anderen Leukozyten wird als außerordentlich nützlich bei der Entwicklung automatischer Einrichtungen angesehen, die die kleinen primären, orangeroten Körnchen 10, die von einem großen Übergewicht sekundärer gelber gro ßer Körnchen 12 umgeben sind, umfassen können.

Die Möglichkeit, Bänder leicht, schnell und genau von allen anderen Leukozyten mit einem einzigen Farbstoff, wie vorstehend angegeben, zu unterscheiden, zu identifizieren und aufzuzählen ist völlig unerwartet und mit keiner bekannten Theorie der Bandfunktion vereinbar.

Neutrophile Zellen sind reife weiße Blutzellen und können von den interessanten fünf Hauptklassen weißer Blutzellen nach der älteren Anmeldung unterschieden werden. Es konnten nunmehr weitere interessante Details festgestellt werden.

Neutrophile, eosinophile und basophile Zellen sind aufgrund der fehlenden farbigen Darstellung in der Zeichnung in ihrer physikalischen Form alle relativ ähnlich. Bei der Verwendung von Basischorange 21 als einzigen supravitalem Farbstoff in einer fixiermittelfreien Umgebung werden die neutrophilen Zellen durch sekundäre Körnchen 16 in dem Zytoplasma C-8 identifiziert, wobei sie hauptsächlich gelb sind. Der Nucleus N-8 ist nicht angefärbt und im allgemeinen geteilt. Die großen sekundären gelben Körnchen 16 bilden die größte Fläche (Masse) des Zytoplasmas C-8.
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Eosinophile Zellen besitzen gleichfalls einen geteilten unangefärbten Nucleus N-10, jedoch unterscheiden sich die großen sekundären Körnchen 18 von den neutrophilen und basophilen Zellen durch ihre orange Farbe, die' das charakteristische und wichtigste Merkmal des Zytoplasmas

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C-10 ist.

Basophile Zellen weisen gleichfalls einen geteilten von Basischorange 21 unangefärbten Nucleus N-12 auf, wobei die sekundären Körnchen 20 von den Körnchen der neutrophilen Zellen 16 und den eosinophilen Zellen 18 dadurch unterscheiden, daß die basophilen Körnchen 20 durch metachromatische Anfärbung eine helle karmesinrote Farbe annehmen, die einen schwach blauen Farbton oder Unterton aufweist.

Bei der angegebenen Zellstruktur ist darauf hinzuweisen, daß jede der in der Figur dargestellten Leukozyten, neutrophilen, eosinophilen und basophilen Zellen in Wirklichkeit von ihren spezifischen Vorstufen abstammen. Die Figur der Zeichnung stellt diese Entwicklung im einzelnen nicht dar. Promyelozyten werden als Vorstufen der Monozyten bezeichnet.

B-Lymphozyten und T-Lymphozyten haben einen im wesentlichen ovalen Nucleus N-14 bzw. N-16. Jeder Nucleus N-14 - und N-16 ist in ähnlicher Weise gelb angefärbt. Das Zytoplasma C-14 und C-16 bleibt in jedem Falle unangefärbt. Ein charakteristisches Merkmal des Zytoplasmas C-16 der T-Lymphozyten differenziert wiederum klar die T-Lymphozyten von den B-Lymphozyten. Dies ist die Gegenwart einer kleiner Ansammlung roter Körnchen 22 in dem Zytoplasma C-16.

Eine bemerkenswerte Feststellung, die auch in der älteren Anmeldung getroffen wird, besteht darin, daß die Monozyten mit sämtlichen basischen quaternären kationischen Farbstoffen reagieren, die für die Leukozytenidentifizierung und -differenzierung metachromatisch aktiv sind.

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Mit Basischorange 21 werden die Monozyten,· was ihren im allgemeinen eiförmigen Nucleus N-18 betrifft, nicht angefärbt. Jedoch nimmt das Zytoplasma C-18 einen rosa Ton an, in dem eine verstreute, relativ kleine Anzahl von karmesinroten und rosaroten Körnchen 24 erkennbar ist, die sich im Farbton, dem Wert und der Farbe hinreichend von dem "rosa" Ton des Zytoplasmas C-18 unterscheiden, um optisch eindeutig von dem Plasma C-18 differenziert zu werden, das im allgemeinen eine ähnliche rosa Färbung besitzt.

Die Identifizierung und Aufzählung der Monozyten ist durch die Feststellung des Satzes ungewöhnlicher Farbstoffe vereinfacht worden, der in der älteren Anmeldung beschrieben ist. Die zytochemische fluoridsensitive, nichtspezifische Esterase-Standardreaktion, die für die Monozytenidentifizierung verwendet wird, erfordert häufig eine Stunde oder mehr, bis sie abgeschlossen ist, wobei um erfolgreich zu sein, eine exakte zytochemische Handhabung notwendig ist. Mit irgendeinem der beschriebenen Farbstoffe kann das Anfärben des Leukozytenfilms im zentrifugierten Blut, des gesamten Bluts oder abgetrennter Fraktionen auf einfache Weise in der Größenordnung von Minuten ohne chemische Einstellungen durchgeführt werden.

Das Anfärben der Monozyten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich mit Basischorange 21 erfolgt augenblicklich, was das Zytoplasma und die Körnchen in dem Zytoplasma betrifft.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die metach.roraatischen Farbstoffe die Zellen schließlich in einem Ausmaß anfärben, wo eine Identifizierung nicht mehr möglich ist. Die beschriebenen Farbunterschiede gehen also verloren oder vermindern sich in einem starken Ausmaß, wenn die Analysen nicht unverzüglich durchgeführt werden. Da in der Praxis

das Anfärben jedoch sofort erfolgt, ist jedoch bis zur Bildung maximaler Unterschiede keine Wartezeit erforderlich.

Die Identifizierung und Differenzierung der Monozyten wird nach dem Stand der Technik durch zeitaufwendige und komplizierte zytochemische Behandlung der Zellen durchgeführt, die eine Nichtesterasereaktion, eine Präparierung fixierter Zellen, eine Hexazotierung, eine pH-Einstellung und eine Anfärbung mit Mehrfachfarbstoffen umfaßt, wobei etwa 60 Minuten benötigt werden, um das zu erreichen, was mit irgendeinem Farbstoff der älteren Anmeldung erforderlichenfalls in weniger als einer Minute durch Inberührungbringen eines einfachen Farbstoffs und einer Blutprobe in einem wäßrigen System durchgeführt werden kann. Mit dem erfindungsgemäßen spezifischen Farbstoff wird ebenfalls eine sofortige bevorzugt Anfärbung des Zytoplasmas der Monozyten erreicht.

Der einzigartige Farbstoff wird für die erfindungsgemäße Anwendung durch Filtrieren einer wäßrigen Lösung von reinem Basischorange 21 in destilliertem Wasser in einer Konzentration von etwa 1 % erhalten. Die Farbstoffkonzentration ist nicht besonders kritisch, vielmehr sind Abweichungen möglich. Vorzugsweise werden frische wäßrige Lösungen verwendet, die keine toxischen Zusätze enthalten. Eine Beeinflussung der metachromatischen Reaktion zwischen dem Farbstoff und der spezifischen Art oder Klasse von Leukozyten kann vollständig durch die Anwesenheit eines der bekannten herkömmlichen Fixiermittel verhindert werden.

Die Bezeichnung "supravital" stellt eine wichtige Einschränkung dar. Sie bezieht sich auf die ursprüngliche Blutprobe und wird für lebende Zellen, die frisch aus

einem lebenden Organismus entfernt worden sind oder von einem frisch getöteten Organismus oder dergleichen stammen, verwendet. Durch diese Bezeichnung sollen sämtliche "Fixiermittel" ausgeschlossen werden, jedoch nicht die Verwendung eines Antikoagulans (Heparin, EDTA etc.). Die Blutzellen können auch aus dem Knochenmark, Urin oder anderen dieselben enthaltenden biologischen Teilen entfernt werden, einschließlich beispielsweise lymphatischem Gewebe und der Milz.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt:

Es wird eine 1 %-ige Lösung in destilliertem Wasser aus einem ausgewählten basischen quaternären kationischen Farbstoff, hier Basischorange 21, hergestellt. Falls es sich in der Praxis als notwendig erweisen sollte, kann einer oder mehrere der betreffenden Farbstoffe in Form von Lösungen zugemischt werden. Basischorange 21 (Spektralkurve #7) ist spezifisch.

Die wäßrige Lösung des ausgewählten, vorstehend identifizierten, einzigen reinen Farbstoffs (oder es werden Kombinationen von einem oder mehreren reinen Farbstoffen eingesetzt wie in den Tabellen I und II angegeben und in der Tabelle III der älteren Anmeldung veranschaulicht) wird gelöst, um eine einfache wäßrige Farbstofflösung zu bilden. Durch Berücksichtigung verschiedener Volumenanteile de.r wäßrigen Farbstoff lösung und verschiedener Stärken der wäßrigen Farbstofflösung können optimale Bedingungen für verschiedene spezifische zytologische Analysen erhalten werden. Versuche dürften zu bestimmten Kombinationen führen, die besondere Vorteile aufweisen, was jedoch über den Rahmen dieser Beschreibung hinausgehen würde.

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Die Blutproben können von verschiedenen Quellen erhalten werden und können frische Proben venösen Bluts, von denen die Erythrozyten entfernt worden sind (Zentrifugierung, hypotonische Lysis, Schwerkraftsedimentation, Dichtegradientensedimentation usw.) oder eine Probe eines nach bekannten physiko-chemisehen Verfahren mit weißen Blutzellen angereicherten Plasmas sein. Fixiermittel werden vermieden.

Vorzugsweise werden der wäßrige Farbstoff und die Blutprobe, die beide frisch hergestellt worden sind, bei normaler Blutoder Körpertemperatur (etwa 36 bis 40⁰C) miteinander vereinigt, wenn die geplanten Analysen dies angezeigt erscheinen lassen. Es wird im allgemeinen ein schnelleres und kontrastreichers Anfärben bei einer höheren Temperatür erreicht. Basischorange 21 scheint nicht temperatur-, empfindlich oder -kritisch zu sein.

Die Farbstoff- und Blutlösungen funktionieren ordnungsgemäß, wenn sie in einem Volumenverhältnis von 1 : 4 miteinander vereingt werden. Das Gemisch wird einige Sekunden leicht bewegt und ein Tropfen des Gemisches wird sofort als nasse Auftragung unter Verwendung eines Deckglases mit einem Lichtmikroskop oder falls vorhanden mit einer automatischen Differentialleukozytenzähleinrichtung untersucht. Weitere Möglichkeiten des Kontakts zwischen dem Farbstoff und den Blutzellen umfassen bekannte Medien, beispielsweise Gelatine, Emulsionen usw., die mit dem Farbstoff in einer Konzentration von etwa 1 % imprägniert sind. Eine Fixierung der Probe beeinträchtigt ernsthaft die ungewöhnliche metachromatische Wechselwirkung des erfindungsgemäßen Farbstoffs mit den Leukozyten.

Die Verwendung von Basischorange .21-Farbstoff ermöglicht es, eine der folgenden Spezies von den anderen, falls sie zusammen vorliegen, zu unterscheiden: Myeloblasten, Pro-

HO

myelozyten, Metamyelozyten, Myelozyten, Bänder, neutrophile, eosinophile und basophile Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Monozyten. Die Differenzierungsmaßnahmen zur Aufzählung und andere Untersuchungen sind vorstehend anhand der Figur umrissen worden.

Die beschriebenen Beispiele dienen der Erläuterung und ermöglichen es dem Fachmann, das Ausmaß des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erkennen. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen nicht zuletzt in der Leukozytenzählung (insgesamt), der Zählung von Leukozytenspezies, der Diagnose von Krankheiten, insbesondere der Leukämie, sowie der überwachung von Patienten, die eine Vielzahl kritischer Behandlung erfahren, beispielsweise eine Chemotherapie, Bestrahlungstherapxe, ACTH usw.

Es ist bekannt, daß die Identifizierung und Aufzählung sämtlicher Leukozytenarten häufig von kritischer Bedeutung bei der Diagnose und der Behandlung von Krankheiten ist.

Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Durchführung und der Brauchbarkeit der Erfindung. Sie sind selbstverständlich weder erschöpfend noch einschränkend zu verstehen.

Beispiel I
(Basischorange #21 - Spektralkurve #7)

Es wurden umfangreiche Reihen von Methin-, Polymethin-, Chinoid- und/oder Carbocyaninfarbstoffen hergestellt, aufgrund der ursprünglichen Feststellung, daß Basischorange #21 sich als ungewöhnlich metachromatisch in bezug auf die differentielle Anfärbung weißer Blutzellen herausgestellt hat. Von der großen Gruppe der getesteten Färb-

stoffe war nicht nur eine allgemeine strukturelle Ähnlichkeit mit der vorstehend genannten Klasse vorhanden, vielmehr war, wie im Falle von Basischorange #22 eine Struktur gegeben, die lediglich in geringfügigen Substitüentenunterschieden abwich (vgl. oben).

Es stellte sich heraus, daß lediglich Basischorange #21 von der großen Gruppe der älteren Anmeldung die hier beschriebene ungewöhnliche Metachromasie zeigte. 10

50 ml peripheres Blut wurden von normalen Personen in Serien heparinisierter Reagenzgläser erhalten.

Zwei Reagenzgläser wurden mit 10 ml einer 1 %-igen Lösung von Basischorange #21-Farbstoff in destilliertem Wasser bei etwa 37 ⁰C vermischt. Es wurdp festgestellt, daß die Temperatur bei Verwendung dieses Farbstoffs nicht kritisch ist.

Eine mikroskopische Untersuchung ergab, daß eosinophile Zellen, die nach der ursprünglichen Beschreibung braune Körnchen aufweisen, hier genauer dadurch beschrieben werden, daß sie große orangefarbene Körnchen in dem Zy toplasma mit einem nicht angefärbten lobulären Nucleus besitzen; Die basophilen Zellen zeigten eine ähnliche geometrische Konfiguration, jedoch waren die Körnchen im Hauptton leuchtend karmesinrot mit einem schwachen, blauen Unterton. Der Nucleus war gleichfalls lobulär und nicht angefärbt. Die Monozyten unterschieden sich deutlieh durch einen nichtangefärbten, ovalen Nucleus und ein rosafarbenes Zytoplasma, das karmesinrote und rosafarbene Körnchen enthielt. Der Ausdruck "nicht angefärbt" kann auch sehr blasse Töne umfassen, was etwas von der Zeit abhängig ist, während der der Objektträger untersucht wird.

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Bemerkenswert ist, daß die differentielle Anfärbung sowohl der ausgereiften, erwachsenen wie auch der nichtausgereiften neutrophilen Zellen spezifischer war als es bisher mit irgendeinem Farbstoff festgestellt wurde. Die ausgereiften neutrophilen Zellen waren spektral identifizierbar durch die hauptsächlich gelben großen Körnchen in dem Zytoplasma und den nicht angefärbten lobulären Nucleus. Es wurde festgestellt, daß sich die unausgereiften Körnchen (Fig. 1) durch die orangeroten Körnchen in dem Zytoplasma und den im allgemeinen ovalen, nicht angefärbten Nucleus identifizieren lassen.

Beispiel 2

T-zellenreiche und B-zellenreiche Suspensionen menschlichen Bluts wurden aus 50 ml Proben peripheren Bluts hergestellt/ das von normalen Personen in heparinisierten "Vacutainer"-Reagenzgläsern durch Durchleiten von Ficoll-Hypaque angereicherten Fraktionen durch .Nylongewebemikrosäulen erhalten wurden. Die T-zellenreichen und B-zellenreichen Suspensionen wurden von den Säulen unter kontrollierten Temperaturbedingungen und mit ausgewählten unterschiedlichen Puffern gemäß dem Stand der Technik eluiert.

Fraktionen dieser gewonnenen Suspensionen wurden einer immunologischen Analyse unterworfen, indem für die T-ZeI-len eine T-Zellenrosettenbildung und bezüglich der B-Zellen eine Oberflächenimmunoglobulinbestimmung zur Anwendung kommt. Ein Tropfen einer 1 %-igen wäßrigen Lösung des Basischorange 21-Farbstoffs wurde 5 Tropfen der gewonnenen Suspension in getrennten Reagenzgläsern einverleibt. Jedes Reagenzglas enthielt etwa 2x10 Lymphozyten. Die Lymphozyten, die mit Hilfe der T-Zellenrosettenbildung als T-Zellen identifiziert wurden, wurden mikroskopisch unter-

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sucht, um festzustellen, daß sie kleine Gruppen oder Ansammlungen von fünf bis zehn oder mehr roten Körnchen enthielten. Die Lymphozyten, die durch immunologische' Methoden als B-Zellen identifiziert wurden, zeigten lediglich eine schwach rot angefärbte Granula in dem Zytoplasma, während die B-Lymphozyten keine roten Körnchen in dem Zytoplasma aufwiesen. Der Nucleus war sowohl bei den T-ZeI-len wie bei den B-Zellen oval und gelb gefärbt. Die Farbstoffe Rhodanitblau und Carbocyanin K-5 (ältere Anmeldung) färbten gleichfalls im allgemeinen Lymphozyten an, jedoch waren die Körnchen nicht so lebhaft gefärbt wie mit Basischorange 21-Farbstoff.

Die Verwendung von Basischorange 21 stellt eine neue, schnelle Methode zur Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung von T- und B-Lymphozyten oder -Zellen zu den gegenwärtigen Methoden dar. Die gegenwärtigen Methoden umfassen den Einsatz instabiler biologischer Reagenzien (Schafzellen), erfordern Radioisotopentechniken, die · teuer und zeitaufwendig sind und machen die Kontrolle vieler Variabler, einschließlich der Temperatur, des'pH-Werts des Inkubationsmediums usw. erforderlich, was nicht langer notwendig erscheint.

25Beispiel3

Periphere Blutproben normaler gesunder Personen zeigen in der Regel keine unausgereiften Leukozyten der myeloiden Reihe, einschließlich Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten. Diese sind bei bestimmten Krankheitszuständen festzustellen, beispielsweise tritt eine Invasion des Knochenmarks bei Krebs auf, ferner wurde eine "leukämoide" Reaktion bei ernsthaften Infektionen, chronischer Granulozytenleukämie usw. festgestellt. Bei einer Reihe von Versuchen wurde beobachtet, daß Basischorange 21 kranke

HH

Leukozyten mit Farbe anfärbt, die sich von normalen Leukozyten unterscheiden. Durch einen Vergleich von Standard- oder gesunden normalen peripheren Blutproben wurde festgestellt, daß die Körnchen der eosinophilen Leukozy-. 5 ten dunkelorange angefärbt werden, während die Körnchen der eosinophilen Leukozyten von Personen mit akuter Infektion goldgelb angefärbt werden.

Beispiel 4

Bei einer 48 Jahre alten Frau, die Brustkrebs im Endstadium aufwies, trat kurz vor dem Tod Septikämie und hohes Fieber auf. Zu dieser kritischen Zeit stieg ihre Zahl der weißen Blutzellen auf 45000 pro mm³ . Durch Verwendung des Standard Wright-Färbemittels wurde festgestellt, daß 60 % der peripheren Blutleukozyten Bänder waren, die einen charakteristischen ungeteilten Nucleus aufwiesen.

Proben des Bluts der Patientin wurden mit einer 1 %-igen wäßrigen Lösung von Basischorange 21 als supravitalem Anfärbemittel ohne Fixiermittel angefärbt.

Die Bänder wurden anhand der ständigen Anwesenheit kleiner schmaler Ansammlungen rot angefärbter (primärer) Körnchen unter einer großen Anzahl großer (sekundärer) Körnchen identifiziert, die metachromatisch gelb angefärbt waren wie der typische nichtgeteilte Nucleus.

Es war also möglich, eine positive Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung der Bandformen anhand ihrer zytoplasmischen Reifung und Farbe durchzuführen, die die primäre gegenüber der sekundären Granulation anstelle von lediglich der Größe und der Form des Nucleus differenzierte.
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Beispiel5

Von fünf Patienten,von denen bekannt war, daß sie an unbehandelter chronischer lymphatischer Leukämie litten,
wurden Proben peripheren venösen Bluts entnommen.

Durch Verwendung herkömmlicher immunologischer Identifizierungsmittel (T-Zellenrosette, IgG-Oberflächenmarkierung) wurde festgestellt, daß sie alle vom B-Zellentyp
waren.

Fünf Tropfen d>;r Probenf raktionen jeder Spenderprobe wurden mit einem Tropfen frisch hergestellter 1 %-iger wäßriger, filtrierter Lösung von Basischorange 21 in Reagenz- glasserien gemischt. Die Objektträger wurden bei nasser

Auftragung mit einem Lichtmikroskop untersucht, wobei keiner Zellen zeigte, die Ansammlungen roter Körnchen in dem Zytoplasma aufwiesen, wie es für T-Lymphozyten oder T-ZeI-len charakteristisch ist. Sämtliche kranken Zellen wurden im Nucleus gelb angefärbt, wie es bei B-Lymphozyten oder
B-Zellen normal ist.

Diese Untersuchungsergebnisse bestätigten ohne lange Verzögerung und langwierige Zytologie das erste Ergebnis
der Abwesenheit von T-Zellen und stützen die vorliegende
Theorie, daß chronische Lymphozytenleukämie eine B-zellenabhängige Krankheit ist.

Beispiel 6

Ein 62 Jahre alter männlicher Patient wurde in ein Krankenhaus mit einer Temperatur von 103°f(39°C), Schüttelfrost und Fieber eingeliefert. Eine Röntgenuntersuchung
ergab eine for !,geschrittene Lungenentzündung .in dem rochten unteren Lungenflügel. Blutkulturen ergaben eine posi-

tive Reaktion für Klebsiella pneumoniae. unter Verwendung von konventionellem Wright-Anfärbemittel wurde vor der Behandlung mit Antibiotika eine weiße Blutzellenzählung von 36000 pro mm³ erhalten. Das Blut enthielt zahlreiche Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten sowie reife neutrophile Zellen.

Chromosomale Studien ergaben, daß der Patient unter einer leukämischen Reaktion und nicht unter Leukämie litt. 10

Eine heparinisierte periphere Blutprobe wurde entnommen und einer supravitalen, fixiermittelfreien Analyse unterworfen, indem fünf Tropfen einer Blutfraktion mit einem Tropfen einer frisch hergestellten 1 %-igen wäßrig.en Lösung von Basischorange 21 verwendet wurden. Die Farbstoffprobe wurde bewegt und sofort als nasser Auftrag untersucht. Promyelozyten wurden anhand primärer Körnchen unterschieden, die leuchtend orangerot oder karmesinrot bis fuchsinfarben angefärbt waren. Myelozyten wiesen einen kleinen Anteil gelber Körnchen bis orangeroter Körnchen in dem Zytoplasma im Vergleich zu den Metamyelozyten aif, wobei die roten Körnchen (Lysosomen) der letzteren in dem kleineren Endabschnitt des Zytoplasmas zusammengeballt vorlagen und ein auffallendes zweifarbiges Muster zeigten. Die neutrophilen Zellen wurden anhand eines hauptsächlich gelben sekundären granulären Zytoplasmas identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, daß Basischorange 21-Farbstoff eine sorfortige Differenzierung der verschiedenen erkennbaren Stufen der Reifung granulozytischer Zellen ärmöglicht und daß dieselben in Blut oder Gewebeflüssigkeitspräparationen identifizieit werden können.

In der vorstehenden Beschreibung und den Beispielen ist die Bedeutung der Vorteile der Erfindung im Hinblick auf automatische Differentialleukozytencomputer hervorgehoben

ΗΊ-

Es ist kein serienmäßiges Gerät bekannt, das gegenwärtig ohne Modifizierung in der Lage wäre, die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, das manuell durchgeführt wurde, zu verwirklichen. Die Fachleute auf dem Gebiet der medizinischen Technologie wissen jedoch um die Bedeutung einer raschen genauen Bestimmung der verschiedenen Differentialleukozytenzählungen zu den verschiedensten Zwecken. Es ist geschätzt worden, daß in den USA jeden Tage eine halbe Million Differentialleukozytenzählungen durchgeführt werden, die meisten manuell mit jährlichen Kosten von 750 Millionen US-Dollar.

Diese Zählungen, ob manuell oder automatisch, stellen ein grundlegendes Krfordernis bei der Identifizierung, Spektraldifferenzicrung, Aufzählung und ein diagnostisches Hilfsmittel in der medizinischen Praxis dar. Der vorstehend umrissene grundlegende Fortschritt wird zweifellos zu Fortschritten bei automatischen Zusatzeinrichtungen führen, wie angegeben.

Blutzählungen, ob manuell oder automatisch, wie sie hier beschrieben sind, sind lebenswichtige Hilfsmittel bei der Untersuchung und der Bestimmung der Natur einer Krankheit. Fieber unbekannter Ursache, ob virulent oder als nichtpyogene Infektion, pyogene, die den Blinddarm, die Gallenblase, die Eileiter betreffen, die Prognose bei Patienten mit verschiedenen Krankheiten unterschiedlicher Stadien, maligne Stadien, einschließlich der Hodgkin-Krankheit, die Lungenkrankheit, die Überwachung der Behandlung von Patienten mit adrenocorticalen Steroiden, verschiedene Arten akuter und chronischer Leukämie, die diagnostische Differenzierung zwischen aseptischer Knocheninfarktion und Osteomyelitis; bakterielle Infektionen und viele andere medizinische Fragen werden bei der Diagnose, Prognose und der Behandlung durch eine genaue Zählung, Analyse und zytolo-

gisches Studium der Leukozyten erleichtert.

Die Bezeichnung "metachromatisch", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich nicht nur auf die außergewöhnliche und sonderbare Eigenschaft der beschriebenen Farbstoffe, sondern auch auf die Eigenschaft der verschiedenen Bestandteile, beispielsweise des Nucleus und des Zytoplasmas, jede der einzelnen Spezies der Leukozyten, die metachromatisch in einer einem Synergismus ähnlichen Weise reagieren, um eine Differenzierung hinsichtlich des spektralen Ansprechens zu erzeugen, die zu den beschriebenen zytochemisch möglichen Fortschritten führt. Im wesentlichen absorbiert (oder absorbiert nicht) jede weiße Blutzellenart einen einzigen metachromatischen Farbstoff in etwas ungewöhnlicher und einzigartiger Art und Weise, so daß jede Zelle mit absorbiertem Farbstoff ein individuelles und unterschiedliches Lichtspektrum wiedergibt.

Es ist bekannt, daß bestimmte granuläre Leukozyten gegenüber verschiedenen Farbstoffen unterschiedliche Affinitäten aaf weisen, d.h. basophile zeigen eine Affinität gegenüber basischen Farbstoffen, eosinophile weisen eine Affinität gegenüber sauren Farbstoffen auf, während neutrophi-Ie weder mit sauren noch mit basischen Farbstoffen intensiv angefärbt werden, wobei davon ausgegangen wird, daß die morphologischen Merkmale und das chemische Verhalten die Spezifität von Basischorange 21 in bezug auf die klaren Unterschiede ausmachen, die hier zwischen T-Lymphozyten und B-Lymphozyten festgestellt worden sind, ferner auf die ungewöhnliche Unterscheidung der Bänder.

Dies ist um so überraschender, als festgestellt worden ist, daß Basischorange 22, dessen chemische Struktur sich lediglich in der vorstehend erwähnten Abänderung zweier sekundärer Gruppenpositionen unterscheidet, für

den erfindungsgemäßen Zweck völlig unwirksam ist.

Die Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung von Monozyten ist von großer diagnostischer Bedeutung. Eine zunehmende Anzahl von Monozyten im Blut weist auf die Anwesenheit von aktiver Tuberkulose, Septikämie oder Blutvergiftung sowie Lymphomas, wie die Hodgkin-Krankheit bei der Diagnose hin. Eine Zunahme der Anzahl der Monozyten im Blut von Personen, die sich von hypoplastischer oder aplastischer Anämie erholen, kann eine günstige Prognose für den Patienten ankündigen. Eine schnelle und genaue mikroskopische Analyse von Monozyten durch dieses Verfahren begünstigt die ausgedehnte Anwendung einer wertvollen Technik.

Die Feststellung, Identifizierung und Aufzählung von polymorphkernigen Leukozyten (neutrophilen) stellt einen kritischen Parameter bei allen Blutbestimmungen dar. Sie sind vor allem bei der Diagnose von akuten Infektionen, wie Lungenentzündung oder Bauchfellentzündung von entscheidender Bedeutung, bei denen die Zahl der neutrophilen Zellen anwächst. Sie sind bei der Überwachung von Patienten von Bedeutung, die chemotherapeutisch oder strahlungstherapeutisch behandelt werden. Eine abnehmende Anzahl kann bei einer starken Infektion auftreten, wie sie sich bei Arzneimittelvergiftungen, einer Hyperaktivität der Milz und bei akuter Leukämie zeigt.

Wenn die absolute Neutrophilenzählung unter 1000 mm³ sinkt, steigt das Infektionsrisiko stark an. Der erfindungsgemäße spezifische Farbstoff färbt sofort die Granula oder Lysosomen an, die charakteristisch sind, um die Struktur der polymorphkernigen Leukozyten oder neutrophilen Leukozyten zu identifizieren.
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Eosinophile Zellen spielen bei einer allergischen Reaktionen eine Rolle, desgleichen die basophilen. Lymphozyten spielen bei Entzündungen eine Rolle und in einem größeren Ausmaß bei Immunreaktionen und Reaktionen auf Antigene (Fremdkörper). Eosinophile Zellen werden hier sofort anhand der großen orangen Körnchen in dem Zytoplasma identifiziert, ferner anhand der lobulären Struktur des ungefärbten Nucleus.

1.0 Eosinophilenzählungen werden bei der medizinischen Verabreichung des adrenocorticotropen Hormons ACTH bei der Behandlung unter klinischen Bedingungen durchgeführt. Nach den bisherigen Methoden wurden Artefakte und undefinierbare Formen, die verwechselbar ähnlich sind, mit eosinophilen Zellen verwechselt. Die Genauigkeit der Blutzellenzählung nach dem Stand der Technik nimmt mit der Zeit zwischen der Blutprobenpräparierung und der Beendigung der Zählung ab. Mehrfachfarbstoffe wurden im wesentlichen verwendet. Häufig ist eine saure und eine basische Anfärbung erforderlich. Die nach dem Stand der Technik verwendeten Farbstoffe neigen dazu, beim Stehen aus der Lösung auszukristallisieren.

Lymphozyten, die als Klasse spezifisch mit Borrelblau identifizierbar sind, sind bekannt, daß sie mit Entzündungen und der Immunität zusammenhängen. Ihre Zahl erhöht sich im Blut von Personen mit chronischer lymphatischer Leukämie und bei Personen mit Pertussis (Keuchhusten). Die Zählrate kann bei Patienten herabgesetzt sein, die einer Chemotherapie oder Radiotherapie unterzogen werden, bei Patienten mit Lymphoma und bei verschiedenen Arten von vererbbaren immunologischen Störungen.

Basophile Zellen haben ein Zytoplasma, das große Körnchen enthält, die reich an kationischen Substanzen, wie

Heparin, Serotonin und Histamin sind. Sie spielen beispielsweise bei allergischen Reaktionen eine Rolle.

Der Hauptvorteil der Erfindung ist darin zu sehen, festgestellt zu haben, daß gegenwärtig ein einziger Farbstoff existiert, der Lymphozyten differenziert anfärbt, die bisher lediglich als eine Klasse mit Borrelblau bei niedrigen Temperaturen angefärbt wurden, das in einer einzigen reinen Form sowohl zur manuellen wie automatischen Identifizierung und Untersuchung jeder angegebenen Spezies verwendet werden kann. Es ist klar, daß potentielle Vorteile dann aufgefunden werden können, wenn Kombinationen der in der älteren Anmeldung beschriebenen Farbstoffe mit dem speziellen Basischorange 21 dieser Anmeldung verwendet werden.

Die bekannten Untersuchungen von T-Zellen und B-Zellen zu deren Unterscheidung umfassen kompliziertere biochemische Präparationen und Verfahren, einschließlich: 1. Säurephosphatase (Enzyme); 2. nichtspezifische Esterase;

3. Fragmente von menschlichen Immunoglobulinen (IgG);

4. fluoreszierende Farbstoffe;und 5. Präparationen roter Blutzellen von Schafen (SRBC, die eine Lebensdauer von etwa 14 Tagen aufweisen, das die Grundlage für die Rosettenbildung zur Identifizierung der T-Zellen darstellt und temperaturabhängig ist).

T-Lymphozyten werden zu 60 bis 80 % im peripheren Blut und zu 85 bis 90 % im Brustlymphgang aufgefunden. Es ist bekannt, daß diese Zellen mit der Allograftabstoßung zusammenhängen., wobei sowohl die T-Zellen wie die B-Zellen in der Immunologie und Pathologie eine große Rolle spielen. Die B-Zellen kommen zu 10 bis 30 % im germinalen Zentrum sowie im Rückenmark vor.

Drogenabhängige zeigen eine auffallende Verminderung der

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T-Zellen.

Die größte Zahl der kongenitalen immunologischen Störungen weist einen Zusammenhang mit dem T-Zellen- und B-ZeI-lensystem auf. Auch ist bekannt, daß das immunogenetische System bei neoplastischen Krankheiten eine Rolle spielt, wobei Abnormalitäten des T-Lymphozyten- und B-Lymphozytensystems festgestellt wurden. Ein Erwachsenen-Lymphomas gehen sehr häufig auf B-Zellen zurück. Ein Kinder-Lymphomas weist andererseits T-Zellenanzeichen auf, wobei angenommen wird, daß dies mit einem aktiveren Thymus während der frühen Kindheit zusammenhängt.

Chronische lymphozytische Leukämie ist B-zellenabhängig, wobei leukämische Zellen B-Zellen sind und keine T-Zellenansammlungen aufweisen. Aus dieser kurzen Darstellung ist die Bedeutung einer leichten Identifizierung, eines Vergleichs und einer Aufzählung dieser Zellen in ihrem weitreichenden Umfang deutlich.

Die mikroskopischen Beobachtungen umfassen in allen Fällen eine Beleuchtung mit weißem Licht, wie sie bei der klinischen Mikroskopie üblicherweise verwendet wird. Eine automatische Differentialleukozytenzählung ist gegenwärtig bei Beleuchtung mit normalem weißem Licht möglicht, jedoch existiert, soweit bekannt, im Handel kein Gerät, das hier direkt verwendbar wäre. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, zahlreiche Probleme zu überwinden, die eine erfolgreiche Entwicklung von Computern bei automatischen Differentialleukozytenzähleinrichtungen verzögert haben.

Die Bezeichnung "metachromatisch" dürfte zuerst von Ehrlich (1897) benutzt worden sein, um einen Farbstoff zu beschreiben, der seine Farbe deutlich ändert, wenn er 5 von bestimmten Zellen absorbiert wird. Ein solcher Farb-

stoff zeigt Metachromasie, welche eine Eigenschaft relativ weniger reiner Farbstoffe ist, hauptsächlich basischer kationischer Farbstoffe, einschließlich Methinen, Polymethinen und Carbocyaninen, die Gewebeteile mit verschiedenen Farben anfärben. Metachromasie setzt voraus, daß verschiedene Substanzen zu verschiedenen Farbspektren führen, wenn sie mit dem gleichen Farbstoff angefärbt werden. In der Zytologie sind metachromatische Körner jene, die eine Farbe annehmen,die anders ist als die des Farb-Stoffs, der zu ihrer Anfärbung benutzt wurde.

Im Zusammenhang mit der vorstehenden Erörterung der Bezeichnungen "metachromatisch" und "Metachromasie" sind zwei Faktoren zu nennen. Einer ist die biologische Zelle (und ihre spezialisierten Teile), die "metachromatisch" und "chromotrop" bezeichnet wird und ein Wesensmerkmal und eine Eigenschaft der biologischen Zellprobe darstellt, und der andere ist die Qualität des Farbstoffs. Sehr wenige Farbstoffe besitzen die wesentliche Eigenschaft, eine Struktur oder Strukturen in der Zelle zu stimulieren, damit Metachromasie auftritt. Conn (9. Auflage) berichtet, daß "es nur eine geringe Anzahl reiner Farbstoffe gibt, die diese Reaktion zeigen". Es konnten nur wenige Berichte festgestellt werden, die andeuten, daß dieses Phänomen mehr als zwei unterschiedliche Farbspektren umfaßt. In einem Fall wurde von "einem hellgrün-blauen Nucleus-Färbemittel mit einer violetten Metachromasie für Knorpel" berichtet. Bei Farbstoffen, die normalerweise bei fixierten Geweben angewendet werden, deren chemische und physikaiische Natur sich durch das übliche Präparationsverfahren vor dem Anfärben ändert, also die wesentliche Wechselwirkung zwischen dem Charakter der natürlichen biologischen Strukturen innerhalb einer Zellprobe (kann sich hiedurch ändern und unempfindlich werden gegenüber etwas, was sonst reagiert), so daß eine Farbstoffabsorption nicht

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erfolgt.

Fluoreszenzfarbstoffe sind bekannt. Bei der Fluoreszenz wird bei ausgewählten schmalen Frequenzen mehr Lichtenergie emittiert als bei diesen ausgewählten Frequenzen absorbiert wird, obgleich das gesamte reflektierte Licht nicht mehr als das gesamte absorbierte Licht darstellt. Die fluoreszierende Metachromasie ist bekannt (z. B. bestimmte Farbstoffe der Acridinchromophoren-Klasse). Diese Art der Metachromasie wird jedoch nicht von der Bezeichnung "Metachromasie" umfaßt, wie sie hier verwendet wird. Die hier verwendete Bezeichnung ist in Übereinstimmung mit der, die in Conn (9. Auflage) und Gurr "Synthetische Farbstoffe in der Biologie, Medizin und Chemie" sowie Gurr, "Vernünftige Verwendung von Farbstoffen in der Biologie" zu finden ist, wo eine Bezugnahme auf die "fluoreszierende Metachromasie" nicht festzustellen ist.

Es können jedoch für den erfindungsgemäßen Zweck auch Farbstoffe geeignet sein, die eine gewisse Fluoreszenz zeigen, beispielsweise eine fluoreszierende Eigenschaft in Lösung, wobei ihre Wirksamkeit für den erfindungsgemäßen Zweck jedoch nicht von der Eigenschaft einer "fluoreszierenden Metachromasie" abhängt. Der Ausdruck "Metachromasie", wie er hier verwendet wird, ist unabhängig von dem fluoreszierenden Ansprechen bei irgendeiner gegebenen Lichtwellenlänge.

Es sind spezifische chromophore Gruppen zur weiteren Klassifizierung der Farbstoffe entsprechend dem "Colour Index" eingesetzt worden. Von den identifizierten Klassen erwiesen sich lediglich eine sehr geringe Anzahl von Farbstoffen als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignete Farbstoffe. Von besonderem Interesse und am vielversprechendsten ist die Klasse der Methin-, Polymethin-, Chinolin-

_ r- a _

und Carbocyaninfarbstoffe, bei denen die identifizierten chromophoren Gruppen Brücken zwischen anderen chromophoren Gruppen der kationischen Klasse bilden. Häufig wird beispielsweise eine Methin- oder Polymethingruppe festgestellt, die eine Brücke zwischen einem oder mehreren Chinolin aufweisenden Chromophoren bildet.

Geeignete Vertreter wurden ferner in der großen Klasse der Arylmethane gefunden, wobei von dieser großen Klasse eines der wenigen für den erfindungsgemäßen Zweck geeigneten ausgewählten Farbstoffe ein Triaminotriarylmethan {Hofmans Violett) und ferner ein Phenylnaphthylmethan (Nachtblau) ist. Es haben sich lediglich zwei von dieser großen Klasse aus einer Vielzahl von überprüften Vertretern dieser Klasse als geeignet erwiesen. Andere Klassen, von denen bekannt ist, daß sie wenige wirksame Arten aufweisen, stellen die Oxazine, Thiazine und Indamine dar. Keine der anderen Klassen chromophorer Gruppen, die inder"Colour Index"-Klassifizierung aufgeführt sind, haben sich als wirksam erwiesen.

Die große Klasse basischer Farbstoffe, die die metachromatischen Farbstoffe dieser Erfindung einschließt, umfaßt jene, bei denen die auxochrome Gruppe eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amingruppe ist. Einem Stickstoff kommt wenigstens die Funktion eines quaternären Stickstoffatoms zu, wobei bei Zugabe eines farblosen Anions, am häufigsten einer Halogensäure, sich ein Salz bilden kann. Da die Halogensäuren relativ stark sind, verglichen mit der Immoniumbase, reagieren sie meist schwach sauer oder zeigen einen sauren pH. Die organische chromophore Gruppe ist ein Kation, das eine positive Ladung trägt, wobei das Halogenion ein Anion oder eine negative Ladung darstellt.

Nach Hinterlegung der älteren Anmeldung stellte sich zu-

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nächst Basischorange 21, ein Polymethinfarbstoff/ als geeignet für die weiße Blutzellenklassifizierurig heraus, wobei Proben anderer Basischorange-Farbstoffe, die nach dem "Colour Index" identifiziert werden, nämlich 22, 27, 42, 44 und 46, bezüglich der Metachromasie überprüft wurden. Diese Farbstoffe werden der Polymethinklasse zugeschrieben. Basischorange 24, 25, 26 und 28 wurden gleichfalls überprüft. Keiner dieser Farbstoffe gehört zu den PoIymethinen. Von sämtlichen überprüften Basischorange-Farbstoffen, einschließlich Polymethin- und Methinbasischorange-Farbstoffen, erwies sich lediglich Basischorange 21-Farbstoff für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet.

Da Basischrot 13 und Basischviolett 16 der Polymethin-Klasse sich als metachromatisch geeignet bei der Blutzellenidentifizierung nach der älteren Anmeldung herausgestellt haben, wurden die Untersuchungen ausgedehnt, um sich auf ähnlich identifizierte und zugängliche Methin- und Polymethinrot- und -violett-Farbstoffe des "Colour Index" zu erstrecken. Es stellte sich heraus, daß Basischrot 14, 15, 27, 37, 68 und 102 bei der Überprüfung ergaben, daß ihnen die Metachromasie-Eigenschaft fehlt, die für das Anfärben von Monozyten und/oder anderen Leukozyten wesentlich ist. Es wurde jedoch festgestellt, daß Basischrot 35,. 36 und 49 (alles Polymethine) für die differentielle metachromatische Anfärbung weißer Blutzellen, die nach, der älteren Anmeldung bereits von Interesse sind, geeignet sind.

Basischviolett 7, 15, 16, 39 und 40 (wiederum alles Polymethine) haben sich als geeignet und wirksam herausgestellt. Hingegen entwickelte Basischviolett 14, das nach dem "Colour Index" nicht als ein Polymethin klassifiziert wird, im Gegensatz zu Basischviolett 16 beim Anfärben von weißen Blutzellen keine Metachromasie.

Es ist darauf hinzuweisen, daß nach dem "Colour Index" sämtliche vorstehenden Farbstoffe identifiziert werden, wobei die Spektralkurven letztlich bei sämtlichen hier in Frage kommenden FarbstoffIdentifizierungen den Ausschlag geben, da diese Kurven, auf die sich die vorstehenden "Colour Index"-Zahlen beziehen, verfügbar sind.

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Claims (11)

PATENTANWÄLTE DR. KADOR & DR. KLUNKER 13990/24 Lawrence Kass 1939 Ridge Road Hinckley, Ohio 44233, U.S.A. Metachromatisches Farbstoffabsorptionsverfahren zur differentiellen Bestimmung der Entwicklungsstufen von neutrophilen und granulozytischen Zellen sowie anderen Leukozyten Patentansprüche

1.) Mikroskopisches Verfahren zur supravitalen Analyse ler Leukozyten und Lymphozyten des normalen oder pathologischen menschlichen Bluts, einschließlich leukämischer Lymphoblasten, die in einer DonorbIutprobe potentiell vorhanden sind, in einer fixiermittelfreien, wäßrigen Umgebung, gekennzeichnet durch (1) die Gegenwart oder Abwesenheit einer Farbe oder eines Musters des Nucleus und (2) die relative Anzahl, Größe, Anordnung oder das Muster sowie die Farbe oder die Farben der Körnchen im Zytoplasma, wenn die Blutprobe oder eine Fraktion derselben dem Farbstoff Basischorange (Spektralkurve 7) ausgesetzt wird, wobei jede der angefärbten Spezies, die in der Probe vorhanden sind, den Farbstoff metachromatisch und differenziert absorbiert.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das menschliche Blut der Donorblutprobe eine oder mehrere der folgenden Spezies umfaßt: Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metaryelozyten, Bänder, Noutrophile, Eosinophile, Basophi le, B-Zellen, T-Zellen und Monozyten, dadurch gekennzeichnet , daß jede Spezies gegenüber den anderen Spezies optisch identifiziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -

kennzeichnet, daß von den normalen oder pathologischen Lymphozyten die B-Zellen und T-.Zellen von Interesse sind, wobei sie jeweils individuell identifizierbar sind und als Teil der Analyse identifiziert und gezählt werden können.

4. Verfahren zur Untersuchung und zur Krankheitsbehandlung eines Patienten, dadurch gekennzeichnet , daß eine Fraktion der Donorblutprobe des Patienten in fixiermittelfreiem Zustand in einer wäßrigen Umgebung einer supravitalen Anfärbung mit dem Farbstoff Basischorange 21 (Spektralkurvel 7) unterworfen wird, die dadurch angefärbten oder nichtangefärbten Donorleukozyten mikroskopisch verglichen werden mit einer bekannten, nicht krankhaften Blutprobe, die ähnlich hergestellt worden ist und als Grundstandard für den Vergleich dient, wobei die Abweichungen von dem Standard in den Anfärbeeigenschaften der Körnchen in dem Zytoplasma und des Nucleus der zu diagnostizierenden Donorblutprobe festgehalten werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit einer Krankheit festzustellen, die sich auf einen oder mehrere Leukozyten auswirkt, so daß Abweichungen des Materials von dem Standard in der Donorblutprobenfraktion auftreten.

5. Verfahren zur Untersuchung menschlicher Krankheiten

durch mikroskopische Analyse und durch Vergleich von supravitalen, fixiermittelfreien Donorblutproben, die Leukozyten enthalten, dadurch gekennzeichnet , daß eine Fraktion der DonorbIutprobe ^ mit Basisorange Nr. 21 (Spektralkurve 7) gefärbt wird und jede der für die Untersuchung wichtigen und in der Probe vorhandenen Leukozytenspezies durch metachromatische und differenzierte Anfärbung identifiziert, gezählt und verglichen wird, und zwar durch die Gegenwart, Abwesenheit oder Änderungen der Farbe und des Musters des Nucleus und durch die relative Anzahl, Größe, Anordnung oder das Muster sowie die Farbe oder Farben oder Abweichungen in den Farben oder Teilen der Farben der Körnchen in dem Zytoplasma, verglichen mit einem entsprechenden nicht krankhaften Standard.

6. Mikroskopisches Verfahren zur Analyse supravitalen normalen oder pathologischen menschlichen Bluts, bei dem potentiell vorhandene Lymphozyten oder leukämische Lymphoblasten selektiv spektral bestimmbar gemacht werden, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine supravitale menschliche Blutprobonfraktion in einem fixiermittelfreien Zustand in einer wäßrigen Umgebung mit wenigstens einem basischen quaternären kationisehen Farbstoff in Berührung gebracht wird, der im wesentlichen die chromophore Kombination von Struktur und Gruppe aufweist, wie sie in Basisorange 21 (Spektralkurve 7) vorliegt, wodurch die einzelnen Spezies der Zellen voneinander differenziert werden, so daß eine Klassifizierung und Zählung der aufgefundenen, vorhandenen Spezies durch die Analyse möglich ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die metachromatisch diffe- renzierten Lymphozyten und Lymphoblasten durch menschli-

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ehe Beobachtung weiter identifiziert und gezählt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß die metachromatisch differenzierten Lymphozyten und Lymphoblasten durch physikalische Einrichtungen, die auf das Lichtspektrum ansprechen, weiter identifiziert und gezählt werden.

9. Mikroskopisches Verfahren zur Analyse von supravitalem menschlichem Blut, dadurch gekennzeichnet , daß eine optische Differenzierung, Vergleich und Zählung von T-Lymphozyten und B-Lymphozyten durch metachromatisches Anfärben wenigstens einer supravitalen, fixiermittelfreien menschlichen Blutprobenfraktion durch Kontakt in einer wäßrigen Umgebung mit Basischorange 21-Farbstoff (Spektralkurve 7) durchgeführt wird, wobei eine Differenzierung der vorhandenen T-Zellen von den B-Zellen durch Ansammlungen von roten Körnchen in dem sonst nicht angefärbten Zytoplasma der T-Zellen erfolgt und bei B-Zellen im Zytoplasma diese Ansammlungen roter Körnchen nicht auftreten, wobei der Nucleus der T-Zellen und der B-Zellen gelb angefärbt ist.

10. Mikroskopisches Verfahren zur Analyse von supravitalem menschlichem Blut, dadurch gekennzeichnet , daß eine optische Differenzierung, Vergleich und Zählung von vorhandenen Bändern durch metachromatische Anfärbung von wenigstens einer supravitalen,fixiermittelfreien menschlichen Blutprobe durch Kontakt in wäßriger Umgebung mit Basischorange 21-Farbstoff (Spektralkurve 7) durchgeführt wird, wobei eine Differenzierung der Bandzellen von anderen potentiell in der Probe vorhandenen Leukozyten durch eine relativ kleine Ansammlung orangeroter Körnchen erfolgt, die sich vom zytoplasmatischen Feld absetzen, das aus einer großen Zahl gelber

Körnchen um einen nicht angefärbten Nucleus besteht.

11. Mikroskopisches Verfahren zur Analyse von supravitalem menschlichem Blut, dadurch gekenn-5zeichnet, daß eine Differenzierung, Zählung und Vergleich jedes Vertreters einer granulozytischen myeloiden Reihe, einschließlich, falls vorhanden, Promyelozyten, Myelözyten, Metamyelozyten, Bänder und Neutrophile, durchgeführt wird durch Anfärben wenigstens einer supravitalen, fixiermittelfreien menschlichen Blutprobenfraktion durch Kontakt in einer wäßrigen Umgebung mit Basischorange 21-Farbstoff (Spektralkurve 7), wobei eine Differenzierung der Promyelozyten durch vorwiegend orangerote primäre Körnchen in dem Zytoplasma, der Myelözyten durch ein Gemisch vorwiegend orangeroter primärer Körnchen in einem kleineren sichelförmigen Abschnitt und einer geringeren Masse gelber sekundärer Körnchen in einem dickeren sichelförmigen Abschnitt des Zytoplasmas; der Metamyelozyten durch eine kleinere Masse orangeroter primärer Körnchen in dem kleineren sichelförmigen Abschnitt und gelbe sekundäre Körnchen in einer proportional größeren dickeren Masse eines zweiten Abschnitts des sichelförmigen Abschnitts, der das Zytoplasma bildet; der Bänder durch eine relativ kleine Ansammlung primärer orangeroter Körnchen in einem vorherrschenden Feld sekundärer gelber Körnchen, die das Zytoplasma bilden, und der Neutrophilen durch fast ausschließlich gelbe Körnchen in dem Zytoplasma erfolgt, wobei jeder Vertreter der vorstehenden Reihe eine anscheinend abnehmende proportionale Fläche (Volumen) des Kerns, der im wesentlichen ungefärbt ist, aufweist, wobei die ersten drei Vertreter der Reihe im allgemeinen eine insgesamt größere Zellgröße (Fläche oder Volumen) als die anderen beiden Vertreter der Reihe aufweisen.