DE4309328C2 - Verfahren zur Differenzierung, Konzentrationsbestimmung und Sortierung von Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten - Google Patents

Description

Die Erfindung gehört in den Bereich der optischen Durchflußzytometrie, bei der Mikropartikel und biologische Zellen optisch gezählt und hinsichtlich ihrer Streu- und Fluoreszenzeigenschaften charakterisiert werden.

Die Durchflußzytometrie wird u. a. zur Konzentrationsbestimmung von Blutzellen in der klini­ schen Diagnostik angewendet. Die Durchflußzytometrie ist ein Verfahren, bei dem eine große Anzahl von Blutzellen einzeln nacheinander durch einen sensitiven Bereich treten, in dem sie opti­ sche oder elektrische Signale erzeugen, die der Zählung und Differenzierung der Zellen dienen (siehe z. B. "Flow Cytometry and Sorting", herausgegeben von Melamed, Lindmo und Mendelson, 1990, Wiley-Liss). In der Hämatologie ist die Konzentrationsbestimmung der Erythrozyten (rote Blutkörperchen), Thrombozyten (Plättchen) und Gesamtleukozyten (weiße Blutkörperchen) ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel. Die Konzentrationsbestimmung wird mit Hilfe der oben be­ schriebenen optischen und elektrischen Durchflußzytometer durchgeführt. Für die hämatologische Praxis sind diese Geräte teil- oder vollautomatisiert, um einen hohen Probendurchsatz zu ermögli­ chen. In diesen Geräten werden im allgemeinen mehrere Meßverfahren kombiniert.

Bei dem elektrischen Zählverfahren erzeugen die Zellen, deren elektrische Leitfähigkeit erheblich kleiner als die der umgebenden Flüssigkeit (isotone NaCl-Lösung) ist, beim Durchtritt durch die Meßöffnung wegen der Erhöhung des elektrischen Widerstandes einen entsprechenden Span­ nungsimpuls. Dabei ist der Spannungsimpuls proportional zum Volumen der einzelnen Zelle. Op­ tische Durchflußzytometer beinhalten Laserlichtquellen oder klassische Lichtquellen, deren fo­ kussierter Strahl mit einem Fokusdurchmesser im Mikrometerbereich das sensitive Volumen bil­ det. Die Zellen erzeugen beim Durchtritt durch dieses Wechselwirkungsvolumen Streu- und Fluoreszenzsignale, die in geeigneter Weise detektiert werden und zur Zählung und Differenzie­ rung der Blutzellen dienen. Andere Geräte messen das gestreute Licht in mehreren Raumwinkel­ bereichen bzw. den Polarisationsgrad des gestreuten Lichtes relativ zur Linearpolarisation des einfallenden Laserlichtes. Die Untersuchung und Konzentrationsbestimmung erfolgt u. U. in meh­ reren, parallelen Meßkanälen für die verschiedenen Blutzelltypen (siehe z. B. "Praktische Blutzell­ diagnostik", herausgegeben von Heller und Boll, 1991, Springer-Verlag). Daneben gibt es opti­ sche Durchflußzytometer, die besonders für Fluoreszenzuntersuchungen geeignet sind. Eine direkte Konzentrationsbestimmung wie in den oben beschriebenen Hämatologieautomaten ist nicht möglich, da diese Geräte für immunologische Anwendungen konzipiert sind. Durch die Anbindung von fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern an Oberflächenantigene der Zellen oder durch die Anbindung von Fluoreszenzfarbstoffen an die Zellkerne ist eine Identifizierung bestimmter Zellpopulationen und deren funktionale Untersuchung möglich (siehe z. B. "Flow Cytometry in Hematology", herausgegeben von Laerum und Bjerknes, 1992, Academic Press). Voraussetzung dafür ist, daß die Bindung der monoklonalen Antikörper oder der Kernfarbstoffe spezifisch ist und einen hohen Prozentsatz der Zellpopulation anfärbt. Die Zuordnung zu den einzelnen Zellpopulationen erfolgt durch die Korrelation der Fluoreszenzsignale und der Signale der Lichtstreuung. Das an den Blutzellen gestreute Licht wird dabei in einem Kleinwinkelbereich um die Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls (Vorwärtsstreuung) und in einem Raumwinkelbereich senkrecht zur Ausbreitungsrichtung (90° Streuung) detektiert. Werden die Erythrozyten vorher durch eine Hämolyse zerstört, ermöglicht die simultane Detektion der Vorwärtsstreuung und der seitlichen 90°-Streuung, neutrophile Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten anhand ihrer Streulichtintensitäten zu unterscheiden. Die relativen Streuintensitäten der Leukozytensubpopulationen hängen von der Streuwellenlänge und den beobachteten Raumwinkelbereichen ab. In kommerziellen optischen Durchflußzytometern wird überlicherweise ein Ar⁺-Laser bei 488.0 nm benutzt, da bei dieser Wellenlänge eine Anregung von vielen kommerziell verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen möglich ist.

Erythrozyten stellen den überwiegenden Teil der Blutzellen dar und erzeugen Streuintensitäten in der Vorwärtsrichtung und in der seitlichen Richtung, die im Bereich der Streuintensitäten der Leukozyten liegen. Damit ist eine Identifizierung der Leukozytenimpulse bei der Verwendung von Vollblutproben ohne zusätzliche Präparationsschritte nicht durchführbar. Entsprechend dem Stand der Technik wird entweder eine Zerstörung der Erythrozyten (Hämolyse) oder eine Anfärbung von weißen Blutzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt.

Der präparative Schritt der Hämolyse der Erythrozyten hat mehrere Nachteile. Es ist bekannt, daß der Prozeß der Lysierung die anderen Zellarten nachteilig beeinflussen kann. Eine Schädigung oder Zerstörung der Leukozyten ist nicht auszuschließen. Dadurch beinhaltet die Konzentrations­ angabe der Leukozytenuntergruppen Fehler, da nach der Lysierung weiße Blutkörperchen verän­ dert oder zerstört worden sind und sich auf diese Weise einer Zählung und Differenzierung ent­ ziehen. Auf jeden Fall befinden sich die Leukozyten nach der Lysierung nicht mehr im nativen Zustand. Darüber hinaus werden in kommerziellen Geräten verschiedene Lysiermittel eingesetzt, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Leukozyten haben. Damit ist eine Vergleichbarkeit der mit verschiedenen Geräten erhaltenen Ergebnisse nicht immer gewährleistet.

Methoden zur Markierung von weißen Blutkörperchen durch Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstof­ fen haben den Nachteil, daß sie nicht vollständig spezifisch sind und einen weiteren Präparations­ schritt darstellen, der bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern zudem zeit- und ko­ stenintensiv ist. So wird beispielsweise in der US 48 82 284 ein Verfahren zur Unterscheidung von roten und weißen Blutkörperchen in nichtlysiertem Blut angegeben, bei dem die Leukozyten mittels eines bei der Wellenlängen des HeNe-Lasers absorbierenden Fluoreszenzfarbstoffes angefärbt werden. Damit lassen sich Leuko­ zytenuntergruppen in nicht lysiertem Blut unterscheiden, wenn gleichzeitig die beim Durchtritt der Zellen durch einen HeNe-Laserstahl auftretende Fluoreszenz mit der Streuung in Vorwärts- und seitlicher Richtung gemessen wird. Eine Unterscheidung von Erythrozyten und Leukozyten und deren Subpopulationen anhand der Lichtstreuung alleine läßt sich mit diesem Verfahren jedoch nicht erreichen.

Ein Durchlicht-Verfahren zur Unterscheidung von roten Blutzellen und Blutplättchen oder deren Agglomerate in einer Vollblutprobe, d. h. ohne weitere Präparationsschritte, wurde von DE 33 41 749 A1 vorgeschlagen. Beim Durchtritt der Blutkörperchen durch einen Licht­ strahl der Wellenlänge von 415 nm sollen der Lichtverlust (Extinktion) sowie die Vorwärtsstreu­ ung gemessen werden. Der Vorschlag beruht auf der nicht zutreffenden Annahme, daß die Ab­ sorption des Lichtes der Wellenlänge 415 nm durch das Hämoglobin der roten Blutzellen zu einer Erhöhung der Extinktion führt, die dann zur Unterscheidung von roten Blutzellen und Blutplätt­ chen bzw. deren Agglomerate ausgenutzt werden kann. Da die erhöhte Absorption des Lichtes durch Hämoglobin nahezu vollständig durch eine Verminderung der Streulichtverluste von Erythrozyten kompensiert wird und die Schwächung (Extinktion) des Lichtes die Summe aus Ab­ sorption und Streulichtverlusten darstellt, lassen sich im Durchlicht rote Blutzellen von Agglome­ raten aus Blutplättchen und weißen Blutzellen nicht unterscheiden.

Ein Durchflußzytometer zum Nachweis vor allem der Fluoreszenz gefärbter Zellen wird von Steinkamp, J.A. et al., Rev. Sci. Instrum. 62: 2751-2764 (1991) beschrieben. Um eine Vielzahl verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Absorp­ tionsbanden anregen zu können, werden Argon-Ionen-Laser (333-363 nm, 488 nm, 514 nm), ein Krypton-Ionen-Laser (413 nm) und ein Farbstofflaser (Rhodamin 6G) eingesetzt. Außerdem kön­ nen mit diesem System die Extinktion sowie die Kleinwinkelstreuung (Vorwärtsstreuung) gemes­ sen werden. Die Verwendung von Lichtwellenleitern und langbrennweitigen Linsen läßt jedoch nur die Beobachtung der Vorwärtsstreuung in einem Winkelbereich von 0,5°-2° zu. Eine Unter­ scheidung von roten Blutzellen und ungefärbten weißen Blutkörperchen ist - auch bei Verwen­ dung der Wellenlänge 413 nm - wegen des Raumwinkelbereichs von 0,5°-2° mit diesem Gerät nicht möglich.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Erythrozyten, Thrombozyten und Leuko­ zyten in einer mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnten Blutprobe anzugeben, bei dem

• - der verfälschende Einfluß der Hämolyse auf die Leukozyten ausgeschlossen wird,
• - als einziger Präparationsschritt die Verdünnung der Blutprobe in isotonischer Kochsalzlösung notwendig ist,
• - Leukozyten aufgrund ihrer optischen Signale in ihrer Gesamtheit von Erythrozyten und Thrombozyten unterschieden und in ihren Untergruppen identifiziert werden können,
• - keine Fluoreszenzmarkierung oder Anbindung von Farbstoffen zur Identifizierung der Leu­ kozytenpopulationen notwendig ist,
• - eine Datenerfassung die Aufnahme der optischen Signale mit einer derart kurzen Verarbei­ tungszeit zuläßt, daß die Datenaufnahme der Erythrozytenimpulse durch ihre große Häufig­ keit nicht die Datenaufnahme der Leukozytenimpulse beeinträchtigt.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Es wird ausgenutzt, daß die Erythrozyten in einem hohen Maße Hämoglobin enthalten. Das Hämo­ globin beeinflußt das Lichtstreuverhalten der einzelnen Erythrozyten, wobei im Bereich des Ab­ sorptionsmaximums des Hämoglobins im blauen Spektralbereich von 405 nm bis 425 nm die hohe Absorption des Hämoglobins eine verminderte Streuintensität der Erythrozyten bewirkt. Dadurch ist es möglich, die Streusignale der Erythrozyten von denen der Leukoyzten zu unterscheiden, da die Streuintensitäten der Leukozyten aufgrund des fehlenden Hämoglobins keine ausgeprägte Wellenlängenabhängigkeit der Streuintensität zeigen. Darüber hinaus können Leukoyztenunter­ gruppen durch ihr unterschiedliches Streuverhalten identifiziert werden.

Das Streulichtverfahren wird realisiert, indem man eine Laserwellenlänge verwendet, die im Ma­ ximum der spektralen Hämoglobinabsorptionskurve liegt. Dazu bieten sich besonders die drei Wellenlängen eines Krypton-Ionenlasers an, die im Wellenlängenbereich zwischen 406 nm und 415 nm liegen. Das Streulicht der einzelnen Blutzellen, die den Laserfokus passieren, wird in zwei Raumwinkelbereichen aufgenommen. Der erste Raumwinkelbereich liegt in der Vorwärtsrichtung in Bezug auf die Ausbreitungsrichtung des direkten Laserstrahls (Vorwärtsstreuung). Der zweite Winkelbereich ist ein Konus rechtwinklig zur Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls (90°-Streu­ ung). Die Streusignale in der Vorwärtsrichtung und der seitlichen Richtung werden in geeigneter - Weise detektiert und dem Datenerfassungssystem zugeführt. Die Datenaufnahme erfolgt korreliert für die Meßparameter, damit nach der Messung eine simultane, korrelierte Darstellung beider Streueigenschaften (Vorwärtsstreuung, seitliche 90°-Streuung) möglich ist. Für eine Konzentra­ tionsbestimmung wird das während einer Messung durchgesetzte Probenvolumen gemessen. Aus der während eines Meßintervalls detektierten, korrelierten Ereignisanzahl für Erythrozyten und Leukozyten ergibt sich mit einer gegebenenfalls notwendigen Korrektur der Zählverluste die Konzentration der Erythrozyten und Leukozyten.

Das Streulichtverfahren soll im folgenden mit Hilfe der Zeichnungen erläutert werden. Dabei zei­ gen Fig. 1 eine mögliche Ausführungsform des Meßaufbaus, Fig. 2 ein Meßbeispiel (Streudiagramm).

Bei dem Meßaufbau gemäß Fig. 1 haben die Bezugszeichen folgende Bedeu­ tung:
(1) Teleskop aus sphärischen Linsen, (2) Teleskop aus Zylinderlinsen, (3) Punktblende, (4) Raumfilter, (5) Neutralglasfilter und (6) Photodetektor.

Als Laserlichtquelle wird beispielsweise ein Krypton-Ionenlaser verwendet, der die Laserlinie bei λ = 413,1 nm emittiert. Diese Laserwellenlänge liegt im Absorptionsmaximum des roten Blut­ farbstoffes und ist deswegen aufgrund der vorstehenden Erläuterungen sehr gut geeignet. Der Laserstrahl wird durch Linsenteleskope im Strahlengang derart geformt, daß ein elliptischer La­ serstrahlquerschnitt entsteht. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv in den Flußkanal der Quarzkapillare fokussiert und hat dort die Abmessungen von 10 µm in der Höhe und 50 µm in der Breite. Die Zellen treten senkrecht durch den Laserstrahl (d. h. senkrecht zur Zeichenebene) mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 10 m/s hindurch und erzeugen dabei Streulichtimpulse, die in der Vorwärtsrichtung in einem Raumwinkelbereich von 3° bis 17°, gemessen von der Aus­ breitungsrichtung des direkten Laserstrahls (0°-Richtung), durch ein Mikroskopobjektiv aufge­ nommen werden. In der seitlichen Richtung wird der Raumwinkelbereich durch die Apertur des verwendeten Mikroskopobjektivs bestimmt, so daß hier ein Winkelbereich von ±26° um die 90°- Richtung detektiert wird. Der direkte Laserstrahl wird in der Vorwärtsrichtung durch eine Punkt­ blende abgeschattet, da nur das gestreute Licht beobachtet werden soll. Ein Raumfilter, bestehend aus einem Mikroskopobjektiv und einer Lochblende von 50 µm Durchmesser, bewirkt, daß uner­ wünschtes Streulicht, das z. B. an den Innenwänden der Quarzküvette entsteht, nicht beobachtet wird. In der Vorwärtsrichtung wird das an den Zellen gestreute Licht mittels einer Photodiode detektiert; für die seitliche Streuung wird eine Photomultiplierröhre eingesetzt, da das Streulicht in diesen Raumrichtungen etwa einen Faktor 100 schwächer ist. Die Stromsignale der Photode­ tektoren werden in Strom-Spannungs-Wandlern in Spannungsimpulse umgewandelt. Die Band­ breite dieser Module ist mit 1,5 MHz den Anstiegszeiten der optischen Signale im Bereich von einigen hundert Nanosekunden angepaßt. Die optischen Signale der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung, die beim Durchgang einer Zelle durch den Laserfokus gleichzeitig auftreten, werden durch das nachgeschaltete Datenerfassungssystem in ihrer Impulsamplitude detektiert und als simultanes Ereignis abgespeichert.

Die mit isotonischer Kochsalzlösung um einen Faktor von beispielsweise 50 verdünnte Vollblut­ probe befindet sich in einer Präzisionsglasspritze mit einem Fassungsvolumen im Milliliterbereich. Der Kolben der Spritze wird kontinuierlich von einem Gleichstrommotor vorgeschoben. Während eines Meßintervalls wird ein Probenvolumen von 50 µl mit einem Fehler von ca. 0,1% durchge­ setzt.

Die Fig. 2 zeigt die korrelierte Darstellung der Impulse der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung einer in isotonischer Kochsalzlösung verdünnten Vollblutprobe bei einer Meßwellen­ länge von λ = 413,1 nm. Jeder Punkt bedeutet mindestens eine Zelle. Die Populationen (1) bis (4) stellen die Impulse der neutrophilen Granulozyten (1), Monozyten (2), Lymphozyten (3) und Erythrozyten (4) dar. Durch die Auszählung der Bereiche (1) bis (4) und unter Einbeziehung des während des Meßintervalls durchgesetzten Probenvolumens kann somit eine Konzentrationsan­ gabe der Erythrozyten, Gesamtleukozyten (Bereiche (1) bis (3)) und einzelnen Leukozytensubpo­ pulationen (1), (2) und (3) erfolgen. Gegebenenfalls wird eine statistische Korrektur der Zählver­ luste bei hohen absoluten Zählraten mit einbezogen.

Die mit dem Meßverfahren erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß

• - in der korrelierten Darstellung der Vorwärtsstreuung und der 90°-Streuung die Leukozyten­ impulse unabhängig von den Erythrozytenimpulsen detektiert werden können,
• - die Probenpräparation nur aus der Verdünnung der Vollblutprobe in isotonischer Kochsalzlö­ sung besteht.

Claims (2)

1. Verfahren zur Differenzierung, Konzentrationsbestimmung und Sortierung von Erythro­ zyten, Thrombozyten und Leukozyten und verschiedenen Leukozytensubpopulationen in einem Durchflußzytometer mit hydrodynamischer Fokussierung, wobei die Blutzellen ein­ zeln das aktive Volumen einer Flußzelle passieren, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Bestimmung der Konzentrationen der Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten und der Leukozytensubpopulationen verdünnte Vollblutproben verwendet werden und eine Zerstörung der Erythrozyten durch Hämolyse nicht durchgeführt wird,
weitere Präparationsschritte außer der Verdünnung der Vollblutprobe nicht erforderlich sind,
die Unterscheidung der Leukozyten und Leukozytensubpopulationen von Thrombozyten und Erythrozyten und die Unterscheidung der Leukozytensubpopulationen untereinander durch die gleichzeitige Messung der Intensität des in zwei geeignet gewählten Raumwinkel­ bereichen gestreuten Lichtes vorgenommen wird, wobei Streulichtimpulse in Vorwärtsrich­ tung in einem Raumwinkelbereich von 3° bis 17° durch ein Mikroskopobjektiv aufgenom­ men werden, wobei Streulichtimpulse in seitlicher Richtung in einem Winkelbereich von ±26° um die 90°-Richtung durch ein weiteres Mikroskopobjektiv detektiert werden, und wobei eine diskrete Wellenlänge oder ein Wellenlängenband zur Lichtstreuung verwendet wird, die im Bereich der starken Absorption des Hämoglobins zwischen λ = 350 nm und λ = 460 nm liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Depolarisation des gestreuten Lichtes gemessen wird, wobei das zur Streuung verwendete Licht polarisiert ist.