JP2603668B2 - 細胞スクリーニング、装置および方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、被検物（specimens）を自動的にスクリー
ニングするために細胞、特に動物細胞を検査する方法お
よび装置に関する。このために、本発明は頚部塗抹標本
（cervicalsmears）、生検、喀痰および他の体液および
組織から得られた細胞の検査における適用を見出すこと
に関する。

一般に、粒子、細胞または染色体母集団の検査につい
ての最近の方法は： （ａ） よく確立された手動式顕微鏡検査細胞学的技
術、または （ｂ） 経費を要する複雑な器械、例えば「FACS」（蛍
光活性セルソーター（Fluorescence Activated Cell So
rter））、「サイトフルオログラフ（Cytofluorograp
h）」および「クールター（Coulter）」に関する。これ
らのシステムは与えられた母集団の特徴または分類の詳
細な情報を与えるが、しかし個々の標本（preparation
s）のシーケンスが検査されていない。一般に、これら
のシステムは液体層流における懸濁物の流れによりおよ
び／または懸濁物を狭いオリフィス（100〜200μｍ直
径〕に通すことにより操作されるから、これらのシステ
ムでは体液または食品材料の天然、被検物の日常試験に
ついて適当でない。これらすべてのシステムの操作には
液体被検物が用いられている。

（ｃ） 画像分析システム（image analysis systems）
は細胞または粒子の標準顕微鏡的標本を表示、走査およ
び検査するのに用いられている。「クオンティメト（Qu
antimet）」（メタルス リサーチ リミテッド（Metal
s Research Limited））または「セルビフィプ（Cervif
ip）」のようなこれらのシステムには、正常および異常
細胞の標準染色顕微鏡スライド標本（standard stained
microscope slide preparations）から画像認知パター
ンを発生する顕微鏡システムに取付けるビデオ−カメラ
が用いられている。適当なマイクロコンピューター ハ
ードウェアおよびソフトウェアによって、疑わしい（su
spect）細胞をフラッグする（flagged）ことができる。
しかしながら、これらのシステムは養成された細胞学者
および病理学者が必要となり、しかもシステムは正常細
胞および形質転換細胞についての被検物のプレスクリー
ニング（Pre−screening）に対して速やかでも、自動的
でもない。

既知の直接蛍光顕微鏡（DFM）法は、異常、例えば形
質転換細胞および正常細胞の両細胞から高い信号対雑音
（S:N）比を与える。それ故、正常および異常細胞が被
検物に存在する場合には、この技術を両細胞の差異を認
めるのに使用困難である。伝統的な直接蛍光抗体技術、
例えば蛍光イソチオシアネート（Fluorescein isothio
cyanate）（FITC）は、定量分析および信号分析に対し
て不適当なS:N比を生ずる異常細胞の低いレベルの蛍光
標識を与える。

有効な自動スクリーニング システムを要求する一つ
の特定分野は癌スクリーニングである。この場合には、
他の塗抹標本、膣鏡および生検検査による二次検査につ
いての臨床に被検者を紹介する前に、頚部塗抹標本、生
検などをプレスクリーニングするある手段を行うことに
よる婦人科学者、細胞学者および他の高度に適格をスタ
ッフ（highly qualified staff）における被検物検査の
負担を軽減する差し迫った必要性がある。

適切な初期および反復スクリーニング並びに診断によ
り、悪性頚部癌の発生率を減少できるとされていること
は広く認められている。

本発明の目的は細胞の試料を検査する自動スクリーニ
ング方法およびこの問題に応ずる関連試薬キットを具え
た装置を提供することである。

本発明の他の目的は異常細胞（例えば形質転換）を正
常細胞から容易に自動検出および識別する方法および装
置を提供することである。

本発明は、被検物の自動連続検査装置において、被検
物支持体、装置を介して被検物支持体を移動する関連駆
動手段を具えた被検物支持体取扱い手段、被検物を被検
物支持体に塗布するアプリケーター、被検物を被検物支
持体に固定する手段、被検物の異常部分を被検物の正常
部分から識別するために被検物の異常部分を標識付けす
る処理手段、処理後被検物を照射する手段、照射処理被
検物を走査しおよび被検物の標識異常部分の存在を検出
する信号を生じさせる検出器手段からなることを特徴と
する。

また、本発明は被検物を蛍光抗体標識で標識付けする
方法を提供するもので、本発明の方法は蛍光抗体標識を
発色団処理被検物に被着する前に、発色団を上記被検物
に適用することを特徴とする。

また、本発明は蛍光抗体検定に用いる蛍光試薬を提供
するもので、本発明の蛍光試薬はアクリジニウム（acri
dinium）化合物と反応したストレプタビジン（streptav
idin）からなることを特徴とする。

この場合、被検物の調製は塗抹標本、生検、喀痰およ
び他の体液または組織試料を得ること、および次に示す
技術を単独で、または組合せて痰分散細胞分散物を得る
ことを含んでいる： （ｉ）音波処理、（ii）遠心法（密度勾配遠心法を包
含する）、（iii）吸着および脱着、（iv）濾過（膜お
よび限外濾過を包含する）、（ｖ）電気泳動またはエレ
クトロカイネシス（electrokinesis）、（vi）酵素また
は化学処理、（vii）pHおよびイオン調整、（viii）逆
浸透。調製された被検物に、本発明の装置において処理
する前に、標準標識付けまたはマーキング技術を施すこ
とができ、マーキングはかかる処理中で行うのが好まし
い。次の方法の一つを用いることができる： （ａ） 液体被検物における、または被検物を担体媒
体、例えば多孔性支持プラスチック フィルム、ガラス
プレートまたはフィルム、金属またはセラミックまた
はフィルム、膜または他のフィルターに適用する非蛍光
標準色素染色処理（non−fluorescent standard chroma
tic staining procedures）。

（ｂ） それ自体既知の方法によるが、しかし細胞を優
先的に染色するRNA、DNAまたはクロマチンを含む細胞ま
たは材料の表面の他の蛍光色素染色処理を包含する直接
蛍光色素染色（direct fluorochrome staining（DF
S））。

（ｃ） 直接および間接蛍光抗体（IF）および免疫色素
染色（immunochromatic staining）技術；これによって
（ｉ）形質転換細胞の特定細胞膜／細胞壁、細胞形質、
核または核小体決定に上げられる蛍光標識抗血清または
（ii）単クローン細胞または多クローン細胞決定に上げ
られるビオチン結合抗血清はアビシンまたはストレプタ
ビジン結合蛍光体−マーカーに結合して −調製における正常細胞と形質転換剥離細胞との間の特
定識別、 −CIN 1,2および３クローン原性細胞と癌性細胞との間
の分化、および −正常細胞と他の細胞との対比染色が得られる。

（ｄ） 過ヨウ素酸塩−シッフ，チオニン−フォイルゲ
ン，パパニコロウ（Papanicolaou）（PAP）を包含する
分色（differential chromatic）および／または蛍光染
色技術。

本発明の目的を達成する好ましい方法は代替（altern
ative）単クローン抗体（MAB）、または１つの第二抗体
だけを用いる特定抗原（例えば腫瘍遺伝子、核、核小体
または細胞形質）決定に対して上げられるMABの組合わ
せを用いることのできる変性ストレプタビジン−ビオチ
ン処理（SB法）に適用される方法に基づくものである。

SB法は、記載する方法が任意の決定基の測定に適用さ
れるけれども、次の決定基のために開発されている： （ｉ）抗−RAS−腫瘍遺伝子、核抗原、 （ii）抗−P145−核小体抗原、および （iii）アンチシトケラチン−細胞形質中間体フィラメ
ント。

また、好ましい方法は、被検物に存在する正常細胞お
よび基材料（background material）によって非特異的
係合結合（non−specific flour−binding）を減少する
ことにより高められたコントラストに対して提供される
調製被検物の初期固定および予備処理を用いる。

予備処理は有彩染料（chromatic dyes）、非蛍光染色
またはネガティブ染色、または正常細胞および基材料に
より取上げられおよび結合するが、しかし決定形成異常
細胞またはその蛋白質と結合するストレプタビジン−ビ
オチン結合蛍光体（蛍光抗体標識）により所望の特異結
合に影響を及ぼさない化学薬品の使用を含んでいる。

固定した後で、しかも蛍光抗体標識で処理する前に、
被検物を発色団で処理することによって、蛍光抗体標識
被検物を後で検査する場合に、信号対雑音比が著しく改
善することを見出した。すなわち、被検物の発色団によ
る処理は、発色団で処理しない同じ被検物と比べた場合
に、異常細胞における蛍光抗体標識からの信号対バック
グラウンド ノンズの比を高める。発色団は有彩染料、
染料（stain）または化学薬品を意味する。

異常細胞、例えば癌細胞を標識するのに用いられる蛍
光抗体標識は細胞におけるまたは細胞上の特定部位に結
合し、標識付けする。異常および正常細胞は細胞におけ
るまたは細胞上の同じ部位に蛍光抗体標識をある程度結
合するが、しかし異常細胞と正常細胞とを可視的に識別
するのを難かしくする。

発色団は、特別の試験を評価する異常細胞に存在しな
い正常細胞におけるまたは正常細胞上の特定部位に結合
し、このために正常細胞におけるこれらの部位に結合す
ることから、しかも異常細胞における相当する部位から
でなく、蛍光抗体標識を抑制するものと思われる。それ
故、割合で表わした場合に、異常細胞によって係合した
蛍光体標識の量が増加するのにつれて、正常細胞によっ
て結合した蛍光体標識の量は減少する。このために、発
色団を用いる方法による測定の感度は異常細胞が少なく
ても許容されるように高まる。実際に、存在する蛍光抗
体標識付けの方法は、多くの場合、異常細胞の検出を許
容するのに十分に敏感でない。

適当な発色団はヨウ素、またはハロゲン化カリウムで
あり、この発色団は正常細胞のグリコーゲンに結合する
が、しかしグリコーゲンの不足するある癌細胞には結合
しない。また、蛍光抗体標識は異常細胞におけるまたは
異常細胞上の部位に結合するが、しかしこれらは発色団
により閉塞されるために正常細胞におけるまたは正常細
胞上の部位に結合しない。

他の適当な発色団としてはエタン酸およびブロムチモ
ール ブルー、ニグロシン、インディアン インクおよ
びスダン ブラックを包含している。例えば、スダン
ブラックは脂質に結合し、およびエタン酸およびブロム
チモール ブルーは蛋白質に結合する。

発色団は有彩染料、染料または化学薬品であり、正常
細胞および基材料の蛍光抗体標識の後結合を抑制、閉塞
または減少する異常細胞への発色団の結合と比べた場合
に、正常細胞および基材料に優先的に結合するが、しか
も異常細胞に結合せず、それ故正常細胞および基材料へ
の蛍光抗体標識の結合量に比べて異常細胞への蛍光抗体
標識の結合量の割合が増加する。

１つの好適な標識付け方法を次に記載する。この方法
はそれ自体で用いることができるが、しかしここに記載
する装置と関連させて用いるのが好ましい。特に好まし
い例において、この方法はここに記載する装置を用いる
場合に特に好ましい結果が得られる。なぜらなば、装置
は照射において蛍光抗体標識異常細胞からの蛍光の最初
の一時的（約２〜３＋１秒の間）増加を探知および記録
できるためである。このために、装置を好ましい方法と
用い、蛍光抗体標識異常細胞からの最初の一時的な高い
レベルの蛍光を測定することによって、試験の感度が高
まる。

１つの好ましい標識方法（SB法）の例 頚部塗抹標本の秤価 手順 段階（１） 単位量の頚部塗抹標本を単位面積、例えば1.0×2.0cm
または1.5〜2.0cmの直径の固体または多孔性基体担体に
被着する。

段階（２） 被検物をエアオーブンに通し、または基体担体を介し
て25℃で乾燥し、ただちに化学固定を施す。適当な化学
固定液（chemical fixators）としてはプロパン−２−
オール、エタノールを包含している。

段階（３） 固定被検物および担体に発色団の溶液を作用させる。
適当な発色団としてはヨウ素、ハロゲン化カリウム、溶
液、エタン酸、ブロムチモール ブルー、または他の有
彩染料を包含している。次いで、被検物および担体を等
張性緩衝液pH7.2でゆすぐ。

段階（４） 固定被検物および担体を選定抗血清または抗血清に作
用させるが、しかし必ずしも酵素結合抗血清、または抗
血清にする必要がない。抗血清は液体またはエーロゾル
として、または固定被検物および担体上に、これらを介
してまたはこれらと接触させて位置する多孔性マトリッ
クスに吸着する形態で供給する。適当な抗血清としては
アンチシトケラチン、抗−RASおよび抗−P145を包含し
ている。反応は、試薬を除去する前に規定時間、好まし
くは15分間にわたり、規定温度、好ましくは37℃で継続
させる。

次いで、被検物および担体を等張性緩衝液pH7.2でゆ
すぐ。

段階（５） 固定被検物を段階（４）に記載するように抗−種特異
（anti−species specific）、好ましくは抗−マウス、
ビオチン化（biotinylated）IgG（免疫グロブリンＧ）
を含む試薬として規定時間、好ましくは10分間にわた
り、規定温度、好ましくは37℃で維持する。次いで、被
検物および担体を等張性緩衝液pH7.2でゆすぐ。

段階（６） 被検物および担体を段階（４）に記載するように維持
し、ストレプタビジンおよび標識蛍光体を含む試薬に作
用させる。適当な標識蛍光体としてはアクリジニウム染
料、テキサス レッド（Texas red）、フィコビリ蛋白
質を包含する。被検物、担体および試薬を規定時間、好
ましくは10分間にわたり規定温度、好ましくは37℃で維
持する。

段階（７） 次いで、固定および処理した被検物および担体を、検
査前に添加剤を含む等張性緩衝液pH7.2においてゆす
ぐ。適当な添加剤としては0.2％（W/V）グリセロールを
包含する。

これらの方法の目的は、本発明の関連装置との関連に
おいて正常および異常細胞（または細胞の部分）または
被検物の部分を識別する器械により検出および作用でき
る信号を発生する調製被検物を提供することである。

更に、アクリジニウム タイプの標識蛍光体は、普通
の蛍光体、例えばFITCと比べた場合に、高められた蛍光
が得られることを確めた。好ましいアクリジニウム蛍光
体はアクリジン イソチオシアネート（AITC）である。
アクリジニウム蛍光体、例えばAITCはストレプタビジン
と反応し、次いで生成化合物を抗−種特異ビオチン化Ig
Gで処理した被検物と反応する。生成する蛍光は、被検
物を照射および検査する場合に、アクリジニウム化合物
以外の蛍光体と反応したストレプタビジンを用いて得ら
れる蛍光より大きい。ストレプタビジンおよびアクリジ
ニウム化合物による高められた蛍光は、ここに記載する
方法の感度を更に増大する。

それ故、本発明の他の観点においては、蛍光抗体検定
法に用いるアクリジニウム化合物と反応したストレプタ
ビジンからなる蛍光試薬を提供することである。

ここに記載する方法のモジュール性質は異なる蛍光色
素に結合する各決定基についての特異なキサント抗血清
（specific xanthoantisera）を同時に用いて異常細胞
に数個のマーカー（markers）を標識付けすることがで
きる。他の例において試薬を、一般に液体状態で被検物
と接触する前に、例えば不活性担体に吸収または吸着す
ることができる。

好ましくは、装置は被検物を支持体に乾燥および固定
しやすくする空気加熱器を含む被検物塗布段階、被検物
に対する液体標識付け試薬（labelling reagent）を支
持体に被着する手段を含む少なくとも１つの処理段階、
被検物を通常の室温から異なる温度で維持することによ
って過剰の試薬を除去する手段、被検物を照射する手
段、被検物を走査する検出器手段、被検物の異常部分の
存在を確定する手段、および上記段階間に被検物支持体
を前進する駆動手段を含む手段からなる。

被検物は、照射および検出段階前に、上記段階の１つ
の段階において約37℃の温度に維持するのが好ましい。
各段階における処理の持続時間は0.5〜20分の範囲が有
利である。

被検物の部分とは、制限するものでないが、細胞、組
織および細胞および組織の部分を含むことを意味する。

被検物は液体被検物（細胞懸濁物）として処理する
か、または微孔性担体、カラス プレート、ガラス繊
維、金属またはセラミック プレートまたはフィルム、
膜または他のフィルター面のような適当な支持体に固定
した場合に処理し、あるいは球形、矩形または円形形状
の多溜め（multiple well）被検物試験プレートを用い
ることができる。好ましい支持体はヌクレオポール フ
ィルター（Nucleopore filter）（登録商標）または微
孔性ポリカーボネート フィルターのような微孔性担体
である。微孔性担体とは、被検物中の細胞が微孔性担体
を透過できないような大きさの細孔、孔、ボイドまたは
空間を有する担体を意味し、むしろ細胞を微孔性担体の
表面上にまたはその近くに保持し、同時に液体および試
薬は微孔性担体の構体を自由に通す。微孔性担体は、別
々に移動でき、かつ装置の種々の段階に保持できる離散
ユニット、例えばディスクの形態が適当である。選定担
体または支持体は、いずれの場合においても、癌細胞の
表面内にまたは表面上に示される形質転換（悪性）決定
基に対する結合剤、付着改良剤、蛍光体またはキサント
抗血清（蛍光体または有彩染料による標識付けまたは非
標識付け）を含む単一または組合せ試薬で下塗すること
ができる。装置には、励起／信号放出システムに結合す
る目的物によって適当な抗血清を含有する溜めにおいて
検査するために存在する多溜め被検物担体または支持体
プレートを取扱う手段を含めることができ、あるいは、
またプレートの溜めに添加した調製被検物における蛍光
体−標識形質転換細胞および母集団の反応からの信号出
力を検出または測定する光学繊維／ダイオード バンク
検出器と関連して用いることができる。

検出器手段は光学像増強装置からなり、測定しうるマ
ーカーは被検物における細胞または細胞成分（細胞壁／
膜、細胞質、クロマチン、核蛋白質、DNAまたはRNAのよ
うな）に特異な材料である。光学顕微鏡または光学繊維
素子は検出器として有利に用いることができ、また被検
物を水銀蒸気、キセノンまたはハロゲン化タングステン
灯、ナノセカンド フラッシュ灯またはレーザー（例え
ばアルゴン）のような光源からの人工照明または照射す
ることができる。あるいは、光学繊維または光学繊維、
またはバンドルを含むことのできる、およびフォトダイ
オード バンクまたは光電子増倍管装置び接続して選択
波長信号発生、検出および伝送を達成することのできる
照明または光電子信号伝送装置を用いることができる。
装置は励起および放射波長を偏向する手段を含めること
ができる。

組合せ装置および対物レンズ システムを含む励起お
よびバリヤー光学または干渉フィルター、コンデンサ、
ミラーおよびレンズを適当な二色性または波長識別ミラ
ーと組合せて、被検物における標識細胞と非標識細胞と
を区別するおよび区別を高める標識マーク細胞とバック
グラウンドとの間の所望の信号対雑音（S:N）比、例え
ば形質転換（悪性）細胞（S1）と正常細胞（S2）との間
のS1:S2比を得るようにする。

検出器手段は光電子増倍器、フォトダイオード バン
クまたは配列、光化学検出器の１または２以上の組合せ
からなる単一または多信号検出装置を含めることができ
る。

正常細胞または形質転換細胞、または細胞成分の標識
付けのために、特定波長範囲内に、特に蛍光波長に生す
る信号はアナログからディジタル信号に転換してデータ
処理を容易にするのが好ましい。

要約すると、処理被検物は後述する種々の素子の組合
せを用いる装置により検査するのが好ましい。

処理被検物を検査する装置 被検物を付着した担体を次の特別の構成部分を含む装
置を用いて検査する。

（ｉ） 水銀蒸気、石英ハロゲン化物（quartz halid
e）、キセノンまたはレーザー照明、 （ii） 励起フィルター、二色性ミラー、ビーム スプ
リッティング ミラーおよび光学ウェッジ フィルター
を含む光学拡大素子、 （iii） 被検物の照明および／または信号検索（retri
eval of signal）のための光学繊維素子、 （iv） エミッションおよびバリヤー フィルター、 （ｖ） 対物レンズおよび二色ミラーと連結して用い
る、または光学繊維素子を直接に用いる単色アナライザ
ー、光電子増倍管、フォトダイオードまたはフォトダイ
オード マトリックスを含む信号検出装置、 （vi） Ｘ−Ｙ段、傾斜ミラー スキャナーまたはライ
ナー（linear）を用いる試料および担体の全範囲の１部
を走査する手段、またはスパイラル トラッキング装置
（spiral tracking device）、 （vii） 装置または他の器械を用いて後再配置（re−l
ocation）および再検査するために標識細胞のＸ−Ｙ座
標を得るための被検物試料からの信号の走査、トラッキ
ングおよび検出の制御手段。

上述する方法および装置は、体液の液体被検物または
試料をスクリーニングしてモノ−分散細胞懸濁物を得、
特に主として正常細胞および非特異基材料の母集団にし
ばしば少数の異常、例えば形質転換または悪性細胞の存
在を調べる。

上述する装置の基本的な構成部分は次の部分からなる
のが好ましい： （ｉ） 被検物担体のホルダー （ii） 方法の記載に示す順次段階を実施する、好まし
くは各段階間における被検物および担体の自動移動手段
を含むチャンバーまたは一連のチャンバー、 （iii） 被検物および担体を各段階で処理するための
試薬、すすぎ溶液などの溜め、 （iv） 被検物および担体を各段階に滞留する試薬流
速、温度および時間の制御手段、 （ｖ） 担体上の被検物の自動走査および信号分析、お
よび （vi） 後確認のための、標識細胞または細胞グループ
の放出信号の特定波長およびＸ−Ｙ座標の記録における
分析。

次に、本発明の装置を線図的に示す添付図面（第１
図）に基づいて例を挙げて説明する。

第１図において、細胞の被検物を処理および検査する
装置は細胞の被検物を被検物支持体２、例えば微孔性ポ
リカーボネートに塗布するアプリケーター１、および装
置の種々の段階を通じてアプリケーター１から被検物支
持体を前進する駆動手段（図に示していない）を有して
いる。次いで、被検物支持体２上の細胞の被検物を４個
の処理チャンバーに通す。最初に、被検物支持体および
その細胞の被検物を処理チャンバー３に送り、乾燥して
固定した後、100μの１％w/Vヨウ素水（aqueous iodi
ne）（発色団）を添加し、25℃で30秒間残留させ、次い
でりん酸塩食塩水（phosphate saline）緩衝液pH7.2を
用いて洗浄する。次いで、被検物支持体および細胞の関
連被検物を駆動手段により50μのネズミの単クローン
性決定基を加えた処理チャンバー４に送り、37℃で15分
間残留させる。次いで、試薬をリン酸塩食塩水緩衝液pH
7.2で洗い落す。次いで、被検物および細胞の関連被検
物を駆動手段により50μの抗−マウス ビチオン化Ig
Gを加えた処理チャンバー５に送り、37℃で10分間残留
させる。次いで、この試薬をリン酸塩食塩水緩衝液pH7.
2で洗い落す。次いで、被検物支持体および細胞の関連
被検物を駆動手段により50μのストレプタビジン蛍光
体錯体を加えた処理チャンバー６に送り、37℃で10分間
残留させる。次いで、この試薬をりん酸塩緩衝液pH7.2
で洗い落す。試薬の流れ、保留および温度、および試薬
および／または被検物支持体を処理チャンバーに残留す
る時間を制御する手段（図に示していない）は装置に含
めることができる。次いで、４個の処理チャンバーを通
過させた後、被検物支持体上の細胞の処理被検物を検査
部に送り、ここで被検物を、例えば水銀灯８で照射し、
検出器手段９が照射細胞被検物から到来する信号を検出
する。検出手段は、例えば光学繊維素子にすることがで
き、照射細胞被検物からの信号を、例えばフィルター、
コンデンサおよびミラーを介して光電子増倍管に選定お
よび通して標識異常細胞と正常細胞との間の正確な信号
対雑音比を得る。次いで、検出器手段９からの信号をア
ナライザー10に通す。アナライザー10は、例えば検出器
手段からの信号を使用しうるデータ、例えば異常細胞の
位置および数に換えるマイクロプロセッサーにすること
ができる。検出器手段９の下において、被検物支持体を
可動ステージ11上に載置し、このステージ11は被検物支
持体を少なくともｘおよびｙ方向に移動することができ
る。ステージ11および検出器手段９からアナライザー10
への情報の組合せはアナライザーが異常細胞の正確な座
標を定め、所望とする座標に換えるようにできる。

本発明の他の観点によれば、本発明は細胞を識別する
方法を提供することであり、この方法は被検物を採取
し、この被検物の単分散細胞懸濁物をそれ自体既知の技
術により調製し、および自動セクエンスにおいて、調製
被検物を支持体に塗布し、塗布被検物を固定し、被検物
を検査しうるマーカー試薬で標識付けし、標識被検物を
走査できる自動検出器に通し、および標識細胞の存在ま
たは不存在を記録してマイクロプロセッサーにおいて分
析データに転換することのできる信号を生ずるようにす
る各工程からなる。

本発明の他の方法においては、被検物を被検物支持体
に塗布する前に標識付けする。このために、例えば細胞
懸濁物を染色試薬で処理することができる。

更に、本発明は多数の試薬キットを提供するもので、
この各キットは好ましくは被検物付着改良剤または結合
剤で下塗りした被検物支持体、固定液、検査しうるマー
カー試薬を含む標識付け溶液、および必要に応じて適当
な緩衝液および洗浄液からなる。

次に、本発明の方法を例を挙げて説明する。

プロトコールSB3（ストレプタビジン−ビオチン）の特
定例 1. 細胞または被検物の標準塗抹標本を調製し、空気に
より25℃で乾燥し、およびエタノールで固定した。

2. 100μの1.0％w/vヨウ素水を発色団として３秒間2
5℃で添加した。

3. 試薬をりん酸塩食塩水緩衝液pH7.2でゆすぎ落し
た。

4. 50μのネズミの単クローン性決定基を添加し、15
分間37℃で反応させた。

5. 試薬をりん酸塩食塩水緩衝液pH7.2でゆすぎ落し
た。

6. 50μの抗−マウス ビオチン化IgGを添加し、10
分間37℃で反応させた。

7. 試薬をりん酸塩食塩水緩衝液pH7.2でゆすぎ落し
た。

8. 50μのストレプタビジン−蛍光体錯体を添加し、
10分間37℃で反応させた。

9. 試薬をりん酸塩食塩水緩衝液pH7.2でゆすぎ落し
た。

10. 上述する装置を用いて検査した。プロトコールSB3
a対照形成異常（異常）および正常細胞染色、およびポ
ジティブおよびネガティブ被検物を用いて、次の結果を
得た： 更に、プロトコールのSB族は細胞母集団または被検物
細胞に対する形質転換度（形質異常DOT）で表わすこと
ができる。

頚部癌、スクリーニングの場合、このDOTは対照細胞
学的、例えばパパニコラウ染色処理（Papanicolaou sta
ining procedures）により調製された塗抹標本における
頚部上皮細胞間腫瘍性（Cervical Intraepithelial Neo
plastis）（CIN）細胞の伝統的な等級付けに関係するこ
とを確めた。

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第１に発色団を被検物に付与し、次いで蛍
   光抗体標識を発色団処理被検物に被着することを特徴と
   する蛍光抗体標識で被検物を標識付けする方法。
2. 【請求項２】発色団をヨウ素、ハロゲン化カリウム、エ
   タン酸およびブロムチモールブルーからなる群より選択
   する請求の範囲１記載の方法。
3. 【請求項３】最初に被検物を支持体に被着させ、発色団
   を付与する前に固定する請求の範囲１又は２記載の方
   法。
4. 【請求項４】発色団処理後、抗血清による処理からなる
   第１段階、抗−種特異ビオチニル化IgGによる処理から
   なる第２段階、および蛍光試薬による処理からなる第３
   段階の３つの段階において蛍光抗体標識を前記固定被検
   物に被着する請求の範囲３記載の方法。
5. 【請求項５】被検物を支持体に被着および固定し、発色
   団を前記固定被検物に付与し、過剰の発色団を前記固定
   被検物から除去し、抗血清を付与し、過剰の抗血清を除
   去し、抗−種特異ビオチニル化IgGを付与し、過剰の抗
   −種特異ビオチニル化IgGを除去し、蛍光試薬を付与
   し、過剰の蛍光試薬を除去し、前記処理被検物を照射
   し、および前記照射被検物を走査して標識付けした被検
   物の部分を定めることを特徴とする方法。
6. 【請求項６】蛍光試薬がアクリジニウム化合物と反応し
   たストレプタビジンである請求の範囲１〜５のいずれか
   一つに記載の方法。
7. 【請求項７】蛍光試薬がアクリジン イソチオシアネー
   トと反応したストレプタビジンである請求の範囲第６記
   載の方法。
8. 【請求項８】前記蛍光試薬がアクリジン イソチオシア
   ネートと反応したストレプタジンを含む請求の範囲１〜
   ７のいずれか一つに記載の免疫蛍光アッセイに用いる蛍
   光試薬。