JPH01501893A - 細胞スクリーニング、装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ス　１−ニング　お　び　′ 本発明は、被検物（ｓｐｅｃｉａ＋１ｎｓ）を自動的にスクリーニングするため に細胞、特に動物細胞を検査する方法および装置に関する。このために、本発明 は頚部塗抹標本（ｃｅｒｖｉｃａｌｓｍｅａｒｓｒ）　、生検、喀痰および他の 体液および組織から得られた細胞の検査における適用を見出すことに関する。

一般に、粒子、細胞または染色体母集団の検査についての最近の方法は： （ａ）　よく確立された手動式顕微鏡検査細胞学的技術、または （ロ）経費を要する複雑な器械、例えばｒＦＡｃｓＪ　（蛍光活性セルソーター （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒ） ）、「サイトフルオログラフ（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈ）　Ｊおよび「 クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）　Ｊに関する。これらのシステムは与えられた母 集団の特徴または分類の詳細な情報を与えるが、しかし個々の標本（ｐｒｅｐａ ｒａｔｉｏｎｓ）のシーケンスが検査されていない、一般に、これらのシステム は液体層流における懸濁物の流れによりおよび／または懸濁物を狭いオリフィス （１００〜２００μ園直径〕に通すことにより操作されるから、これらのシステ ムは体液または食品材料の天然、被検物の日常試験について適当でない、これら すべてのシステムの操作には液体被検物が用いられている。

（Ｃ）　画像分析システム（ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍｓ） は細胞または粒子の標準顕微鏡的標本を表示、走査および検査するのに用いられ ている。「クオンティメト（Ｑｕａｎｔｉｓ＋ｅｔ）　Ｊ（メタルス　リサーチ 　リミテッド（Ｍｅｔａｌｓ　ＲｅｓｅａｒｃｈＬｉｍｉｔｅｄ）　）または「 セルビフィブ（Ｃｅｒｖｉｆｉｐ）　Ｊのようなこれらのシステムには、正常お よび異常細胞の標準染色顕微鏡スライド標本（ｓｔａｎｄａｒｄ　５ｔａｉｎｅ ｄ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅ　５ｌｉｄｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）から画像認 知パターンを発生する顕微鏡システムに取付けるビデオ−カメラが用いられてい る。適当なマイクロコンピュータ−ハードウェアおよびソフトウェアによって、 疑わしい（ｓｕｓｐｅｃｔ）細胞をフラッ゛グする（ｆｌａｇｇｅｄ）　ことが できる、しかしながら、これらのシステムは養成された細胞学者および病理学者 が必要となり、しかもシステムは正常細胞および形質転換細胞についての被検物 のプレスクリーニング（Ｐｒｅ−ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に対して速やかでも、自 動的でもない。

既知の直接蛍光顕微鏡（ＤＰＩ＋）法は、異常、例えば形質転換細胞および正常 細胞の両細胞から高い信号対雑音（Ｓ　：　Ｎ）比を与える。それ故、正常およ び異常細胞が被検物に存在する場合には、この技術を両細胞の差異を認めるのに 使用困難である。伝統的な直接蛍光抗体技術、−例えば蛍光イソチオシアネー） 　（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏ　ｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ） 　は、定＼量分析および信号分析に対して不適当なＳＩＮ比を生ずる異常細胞の 低いレベルの蛍光標識を与える。

有効な自動スクリーニング　システムを要求する一つの特定分野は癌スクリーニ ングである。この場合には、他の塗抹標本、膣鏡および生検検査による二次検査 についての臨床に被検者を紹介する前に、頚部塗抹標本、生検などをプレスクリ ーニングするある手段を行うことによる婦人科学者、細胞学者および他の高度に 適格をスタッフ（ｈｉｇｈｌｙｑｕａｌｉｆｉｅｄ　５ｔａｆｆ）における被検 物検査の負担を軽減する差し迫った必要性がある。

適切な初期および反復スクリーニング並びに診断により、悪性頚部癌の発生率を 減少できるとされていることは広く認められている。

本発明の目的は細胞の試料を検査する自動スクリーニング方法およびこの問題に 応する関連試薬キットを具えた装置を提供することである。

本発明の他の目的は異常細胞（例えば形質転換）を正常細胞から容易に自動検出 および識別する方法および装置を提供することである。

本発明は、被検物の自動連続検査装置において、被挟物支持体、装置を介して被 挟物支持体を移動する関連駆動手段を具えた被挟物支持体取扱い手段、被検物を 被挟物支持体に塗布するアプリケーター、被検物を被挟物支持体に固定する手段 、被検物の異常部分を被検物の正常部分から識別するために被検物の異常部分を 標識付けする処理手段、処理後被検物を照射する手段、照射処理被検物を走査し および被検物の標識異常部分の存在を検出する信号を生じさせる検出器手段から なることを特徴とする。

また、本発明は被検物を蛍光抗体標識で標識付けする方法を提供するもので、本 発明の方法は蛍光抗体標識を発色団処理被検物に被着する前に、発色団を上記被 検物に通用することを特徴とする。

また、本発明は蛍光抗体検定に用いる蛍光試薬を提供するもので、本発明の蛍光 試薬はアクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）化合物と反応したストレプタビ ジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）からなることを特徴とする。

この場合、被検物の調製は塗抹標本、生検、喀痰および他の体液または組織試料 を得ること、および次に示す技術を単独で、または組合わせて用いて単分散細胞 分散物を得ることを含んでいる： （ｉ）音波処理、（ｉｉ　）遠心法（密度勾配遠心法を包含する）、（ｉｊ）吸 着および脱着、（ｉｖ）濾過（膜および限外濾過を包含する）、（ｖ）を気泳動 またはエレクトロカイネシス（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）、（ｖｉ）酵素 または化学処理、（ｖｉ）ｐＨおよびイオン調整、（暢）逆浸透、調製された被 検物に、本発明の装置において処理する前に、標準標識付けまたはマーキング技 術を施すことができ、マーキングはかかる処理中で行うのが好ましい。次の方法 の一つを用いることができる： （ａ）　液体被検物における、または被検物を担体媒体、例えば多孔性支持プラ スチック　フィルム、ガラス　プレートまたはフィルム、金属またはセラミック またはフィルム、膜または他のフィルターに適用する非蛍光標準色素染色処理（ ｎｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｃｈｒｏａ＋ａｔｉｃ　 ｓｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）　＊ （ロ）　それ自体既知の方法によるが、しかし細胞を優先的に染色するＲＮＡ　 、　ＤＮＡまたはクロマチンを含む細胞または材料の表面の他の蛍光色素染色処 理を包含する直接蛍光色素染色（ｄｉｒｅｃｔ　ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏａ＋ｅ　 ｓｔａｉｎｉｎｇ（ＤＦＳ））　＊（Ｃ）　直接および間接蛍光抗体（ＩＰ）お よび免疫色素染色（ｉ＋ｅ＋ｎｕｎｏｃｈｒｏ＋ｌ１ａｔｉｃ　ｓｔａｉｎｉｎ ｇ）技術；これによって（ｉ）形質転換細胞の特定細胞膜／細胞壁、細胞形質、 核または核小体決定に上げられる蛍光標識抗血清または（ｉｉ）単クローン細胞 または多クローン細胞決定に上げられるビオチン結合抗血清はアビジンまたはス トレブタビジン結合蛍光体−マーカーに結合して 一調製における正常細胞と形質転換剥離細胞との間の特定識別、 −ＣＩＮ　１．　２および３クローン原性細胞と癌性細胞との間の分化、および −正常細胞と他の細胞との対比染色が得られる。

（ｄ）　過ヨウ素酸塩−シッフ、チオニンーフオイルゲン、パパニコロウ（Ｐａ ｐａｎｉｃｏｌａｏｕ）　（ＰＡＰ）を包含する分色（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ ｌ　ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）および／また。は蛍光染色技術。

本発明の目的を達成する好ましい方法は代替（ａｌｔｅｒｎａｔｉνｅ）単クロ ーン抗体（ＦｌＡＢ）　、または１つの第二抗体だけを用いる特定抗原（例えば 腫瘍遺伝子、核、核小体または細胞形質）決定に対して上げられるＭＡＲの組合 わせを用いることのできる変性ストレプタビジンービオチン処理（ＳＢ法）に適 用される方法に基づくものである。

ＳＢ法は、記載する方法が任意の決定基の測定に適用されるけれども、次の決定 基のために開発されている：（ｉ）抗−ＲＡＳ−１！！瘍遺伝子、核抗原、（ｉ ｉ　）抗−Ｐ１４５−核小体抗原、および（…）アンチシトケラチン−細胞形質 中間体フィラメント。

また、好ましい方法は、被検物に存在する正常細胞および基材料（ｂａｃｋｇｒ ｏｕｎｄ　ｍａｔｅｒｉａｌ）によって非特異的蛍光結合（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉ ｆｉｃ　ｆｌｕ’ｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ）を減少することにより高められたコン トラストに対して提供される調製被検物の初期固定および予備処理を用いる。

予備処理は有彩染料（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｄｙｅｓ）、非蛍光染色またはネガ ティブ染色、または正常細胞および基材料により取上げられおよび結合するが、 しかし決定形成異常細胞またはその蛋白質と結合するストレプタビジンービオチ ン結合蛍光体（蛍光抗体標識）により所望の特異結合に影響を及ぼさな゛い化学 薬品の使用を含んでいる。

固定した後で、しかも蛍光抗体標識で処理する前に、被検物を発色団で処理する ことによって、蛍光抗体標識被検物を後で検査する場合に、信号対雑音比が著し く改善することを見出した。すなわち、被検物の発色団による処理は、発色団で 処理しない同じ被検物と比べた場合に、異常細胞における蛍光抗体標識からの信 号対バックグラウンド　ノンズの比を高める。発色団は有彩染料、染料（３ｔａ ｉｎ）または化学薬品を意味する。

異常細胞、例えば癌細胞を標識するのに用いられる蛍光抗体標識は細胞における または細胞上の特定部位に結合し、標識付けする。異常および正常細胞は細胞に おけるまたは細胞上の同じ部位に蛍光抗体標識をある程度結合するが、しかし異 常細胞と正常細胞とを可視的に識別するのを難かしくする。

発色団は、特別の試験を評価する異常細胞に存在しない正常細胞におけるまたは 正常細胞上の特定部位に結合し、このために正常細胞におけるこれらの部位に結 合することから、しかも異常細胞における相当する部位からでなく、蛍光抗体標 識を抑制するものと思われる。それ故、割合で表わした場合に、異常細胞によっ て結合した蛍光抗体標識の量が増加するのにつれて、正常細胞によって結合した 蛍光抗体標識の量は減少する。このために、発色団を用いる方法による測定の怒 度は異常細胞が少なくても許容されるように高まる。実際に、存在する蛍光抗体 標識付けの方法は、多くの場合、異常細胞の検出を許容するのに十分に敏怒でな い。

適当な発色団はヨウ素、またはハロゲン化カリウムであり、この発色団は正常細 胞のグリコーゲンに結合するが、しかしグリコーゲンの不足するある癌細胞には 結合しない。

また、蛍光抗体標識は異常細胞におけるまたは異常細胞上の部位に結合するが、 しかしこれらは発色団により閉塞されるために正常細胞におけるまたは正常細胞 上の部位に結合しない。

他の適当な発色団としてはエタン酸およびブロムチモール　ブルー、ニグロシン 、インディアン　インクおよびスダン　ブラックを包含している。例えば、スダ ン　ブラックは脂質に結合し、およびエタン酸およびブロムチモールブルーは蛋 白質に結合する。

発色団は有彩染料、染料または化学薬品であり、正常細胞および基材料の蛍光抗 体標識の後結合を抑制、閉塞または減少する異常細胞への発色団の結合と比べた 場合に、正常細胞および基材料に優先的に結合するが、しかも異常細胞に結合せ ず、それ故正常細胞および基材料への蛍光抗体標識の結合量に比べて異常細胞へ の蛍光抗体標識の結合量の割合が増加する。

１つの好適なｍｓ付は方法を次に記載する。この方法はそれ自体で用いることか できるが、しかしここに記載する装置と関連させて用いるのが好ましい。特に好 ましい例において、この方法はここに記載する装置を用いる場合に特に好ましい 結果が得られる。なぜならば、装置は照射において蛍光抗体標識異常細胞からの 蛍光の最初の一時的（約２〜３＋１秒の間）増加を探知および記録できるためで ある。このために、装置を好ましい方法と用い、蛍光抗体標識異常細胞からの最 初の一時的な高いレベルの蛍光を測定することによって、試験の悪魔が高まる。

１つの　嘘しい　−′ＳＢ゛）の ｉ・の ■ 段階（１） 単位量の頚部塗抹標本を単位面積、例えば１．ＯＸ２．Ｏｃｍまたは１．５〜’ １．Ｑｃｍ直径の固体または多孔性基体担体に被着する。

段階（２） 被検物をエアオーブンに通し、または基体担体を介して２５℃で乾燥し、ただち に化学固定を施す、適当な化学固定液（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆｉｘａｔｏｒｓ） としてはプロパン−２−オール、エタノールを包含している。

段階（３） 固定被検物および担体に発色団の溶液を作用させる。適当な発色団としてはヨウ 素、ハロゲン化カリウム、溶液、エタン酸、ブロムチモール　ブルー、または他 の有彩染料を包含している０次いで、被検物および担体を等強性緩衝液ｐＨ７， ２でゆすぐ。

段ｉ　（４） 固定被検物および担体を選定抗血清または抗血清に作用させるが、しかし必ずし も酵素結合抗血清、または抗血清にする必要がない、抗血清は液体またはエーロ ゾルとして、または固定被検物および担体上に、これらを介してまたはこれらと 接触させて位置する多孔性マトリックスに吸着する形態で供給する。適当な抗血 清としてはアンチシトケラチン、抗−ＲＡＳおよび抗−Ｐ１４５を包含している ０反応は、試薬を除去する前に規定時間、好ましくは１５分間にわたり、規定温 度、好ましくは３７゛Ｃで継続させる。

次いで、被検物および担体を等強性緩衝液ｐＨ７，２でゆすぐ。

段階（５） 固定被検物を段階（４）に記載するように抗一種特異（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅ ｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ）　、好ましくは抗−マウス、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎ ｙｌａｔｅｄ）　ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を含む試薬として規定時間、好ま しくは１０分間にわたり、規定温度、好ましくは３７℃で維持する９次いで、被 検物および担体を等強性緩衝！ｐＨ７，２でゆすぐ。

段階（６） 被検物および担体を段階（４）に記載するように維持し、ストレプタビジンおよ びＩｓ議蛍光体を含む試薬に作用させる。適当な標識蛍光体としてはアクリジニ ウム染料、テキサス　レッド（丁ｅｘａｓ　ｒｅｄ）　、フィコビリ蛋白質を包 含する。

被検物、担体および試薬を規定時間、好ましくは１０分間にわたり規定温度、好 ましくは３７℃で維持する。

段階（７） 次いで、固定および処理した被検物および担体を、検査前に添加剤を含む等強性 緩衝液ｐＨ７，２においてゆすぐ、適当な添加剤としては０．２χ（Ｗ／Ｖ）グ リセロールを包含する。

これらの方法の目的は、本発明の関連装置との関連において正常および異常細胞 （または細胞の部分）または被検物の部分を識別する器械により検出および作用 できる信号を発生する調製被検物を提供することである。−更に、アクリジニウ ム　タイプの標識蛍光体は、普通の蛍光体、例えばＦＩＴＣと比べた場合に、高 められた蛍光が得られることを確めた。好ましいアクリジニウム蛍光体はアクリ ジン　イソチオシアネート（ＡＩＴＣ）である、アクリジニウム蛍光体、例えば ＡＩＴＣはストレプタビジンと反応し、次いで生成化合物を抗一種特異ビオチン 化１ｇＧで処理した被検物と反応する。生成する蛍光は、被検物を照射および検 査する場合に、アクリジニウム化合物以外の蛍光体と反応したストレブタビジン を用いて得られる蛍光より大きい。

ストレブタビジンおよびアクリジニウム化合物による高められた蛍光は、ここに 記載する方法の感度を更に増大する。

それ故、本発明の他の観点においては、蛍光抗体検定法に用いるアクリジニウム 化合物と反応したストレブタビジンからなる蛍光試薬を提供することである。

ここに記載する方法のモジュール性質は異なる蛍光色素に結合する各決定基につ いての特異なキサント抗血清（ｓｐｅｃｉｆｔｃ　ｘａｎｔｈｏａｎｔｉｓｅｒ ａ）を同時に用いて異常細胞に数個のマーカー（ｍａｒｋｅｒｓ）を標識付けす ることができる。他の例において試薬を、一般に液体状態で被検物と接触する前 に、例えば不活性担体に吸収または吸着することができる。

好ましくは、装置は被検物を支持体に乾燥および固定しやすくする空気加熱器を 含む被挟物塗布段階、被検物に対する液体標識付は試ｉ（ｌａｂｅＨｉｎｇ　ｒ ｅａｇｅｎｔ）を支持体に被着する手段を含む少なくとも１つの処理段階、被検 物を通常の室温から異なる温度で維持することによって過剰の試薬を除去する手 段、被検物を照射する手段、被検物を走査する検出器手段、被検物の異常部分の 存在を確定する手段、および上記段階間に被挟物支持体を前進する駆動手段を含 む手段からなる。

被検物は、照射および検出段階前に、上記段階の１つの段階において約３７℃の 温度に維持するのが好ましい。各段階における処理の持続時間は０．５〜２０分 の範囲が有利である。

被検物の部分とは、制限するものでないが、細胞、組織および細胞および組織の 部分を含むことを意味する。

被検物は液体被検物（細胞懸濁物）として処理するか、または微孔性担体、カラ ス　プレート、ガラス繊維、金属またはセラミック　プレートまたはフィルム、 膜または他のフィルター面のような適当な支持体に固定した場合に処理し、ある いは球形、矩形または円形形状の多溜め（ｍｕｌｔｉｐｌｅｉｍｅｌｌ）被挟物 試験プレートを用いることができる。好ましい支持体はヌクレオボール　フィル ター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　ｆｉｌｔｅｒ）（登録商標）または微孔性ポリカ ーボネート　フィルターのような微孔性担体である。微孔性担体とは、被検物中 の細胞が微孔性担体を透過できないような大きさの細孔、孔、ボイドまたは空間 を有する担体を意味し、むしろ細胞を微孔性担体の表面上にまたはその近くに保 持し、同時に液体および試薬は微孔性担体の構体を自由に通す。微孔性担体は、 別々に移動でき、かつ装置の種々の段階に保持できる離散ユニット、例えばディ スクの形態が適当である。選定担体または支持体は、いずれの場合においても、 癌細胞の表面内にまたは表面上に示される形質転換（悪性）決定基に対する結合 剤、付着改良剤、蛍光体またはキサント抗血清（蛍光体または有彩染料による標 識付けまたは非標識付け）を含む単一または組合せ試薬で下塗することができる 。

装置には、励起／信号放出システムに結合する目的物によって適当な抗血清を含 有する溜めにおいて検査するために存在する多溜め被挟物担体または支持体プレ ートを取扱う手段を含めることができ、あるいは、またプレートの溜めに添加し た調製被検物における蛍光体−標識形質転換細胞および母集団の反応からの信号 出力を検出または測定する光学繊維／ダイオード　バンク検出器と関連して用い ることができる。

検出器手段は光学像増強装置からなり、測定しうるマーカーは被検物における細 胞または細胞成分（細胞壁／１１、細胞質、クロマチン、核蛋白質、ＤＮＡまた はＲＮＡのような）に特異な染料である。光学顕微鏡または光学繊維素子は検出 器として有利に用いることができ、また被検物を水１ｉ’ｉ気、キセノンまたは ハロゲン化タングステン灯、ナノセカンド　フラッシュ灯またはレーザー（例え ばアルゴン）のような光源からの人工照明または照射することができる。

あるいは、光学繊維または光学繊維、またはバンドルを含むことのできる、およ びフォトダイオード　バンクまたは光電子増倍管装置に接続して選択波長信号発 生、検出および伝送を達成することのできる照明または光電子信号伝送装置を用 いることができる。装置は励起および放射波長を偏向する手段を含めることがで きる。

組合せ装置および対物レンズ　システムを含む励起およびバリヤー光学または干 渉フィルター１、コンデンサ、ミラーおよびレンズを適当な二色性または波長識 別ミラーと組合せて、被検物における標識細胞と非標識細胞とを区別するおよび 区別を高める標的マーク細胞とバックグラウンドとの間の所望の信号対雑音（Ｓ ：Ｎ）比、例えば形質転換（悪性）細胞（Ｓｌ）と正常細胞（Ｓ２）との間の５ １：Ｓ２比を得るようにする。

検出器手段は光電子増倍器、フォトダイオード　バンクまたは配列、光化学検出 器の１または２以上の組合せからなる単一または多信号検出装置を含めることが できる。

正常細胞または形質転換細胞、または細胞成分の標識付けのために、特定波長範 囲内に、特に蛍光波長に生する信号はアナログからディジタル信号に転換してデ ータ処理を容易にするのが好ましい。

要約すると、処理被検物は後述する種々の素子の組合せを用いる装置により検査 するのが好ましい。

几　る 被検物を付着した担体を次の特別の構成部分を含む装置を用いて検査する。

（ｉ）　水銀蒸気、石英ハロゲン化物（ｑｕａｒｔｚ　ｈａｌｉｄｅ）、キセノ ンまたはレーザー照明、 （ｉｉ　）　励起フィルター、二色性ミラー、ビーム　スプリッティング　ミラ ーおよび光学ウェッジ　フィルターを含む光学拡大素子、 （ｉ）　被検物の照明および／または信号検索（ｒｅｔｒｉｅｖａｌｏｆ　ｓｉ ｇｎａｌ）のための光学繊維素子、（ｉｖ　）　エミッシヨンおよびバリヤー　 フィルター、（Ｖ）　対物レンズおよび二色ミラーと連結して用いる、または光 学繊維素子を直接に用いる単色アナライザー、光電子増倍管、フォトダイオード またはフォトダイオード　マトリックスを含む信号検出装置、（ｖｉ）　Ｘ−Ｙ 段、傾斜ミラー　スキャナーまたはライナー（ｌｉｎｅａｒ）を用いる試料およ び担体の全範囲の１部を走査する手段、またはスパイラル　トランキング装置（ ｓｐｉｒａｌ　ｔｒａｃｋｉｎｇ　ｄｅｖｉｃｅ）、（ｖｉ）　装置または他の 器械を用いて後再配置（ｒｅ−１ｏｃａｔｉｏｎ）および再検査するために標識 細胞のＸ−Ｙ座標を得るための被検物試料からの信号の走査、トラッキングおよ び検出の制御手段。

上述する方法および装置は、体液の液体被検物または試料をスクリーニングして モノ−分散細胞懸濁物を得、特に主として正常細胞および非特異基材料の母集団 にしばしば少数の異常、例えば形質転換または悪性細胞の存在を調べる。

上述する装置の基本的な構成部分は次の部分からなるのが好ましい： （ｉ）　被挟物担体のホルダー （ｉｉ）　方法の記載に示す順次段階を実施する、好ましくは各段階間における 被検物および担体の自動移動手段を含むチャンバーまたは一連のチャンバー、（ ｉｎ）　被検物および担体を各段階で処理するための試薬、すすぎ溶液などの溜 め、 （ｉｖ　）　被検物および担体を各段階に滞留する試薬流速、温度および時間の 制御手段、 （Ｖ）　担体上の被検物の自動走査および信号分析、および （ｖｉ）　後確認のための、標識細胞または細胞グループの放出信号の特定波長 およびｘ−ｙ座標の記録における分析。

次に、本発明の装置を線図的に示す添付図面（第１図）に基づいて例を挙げて説 明する。

第１図において、細胞の被検物を処理および検査する装置は細胞の被検物を被挟 物支持体２、例えば微孔性ポリカーボネートに塗布するアプリケーター１、およ び装置の種々の段階を通じてアプリケーター１から被挟物支持体を前進する駆動 手段（図に示していない）を有している０次いで、被挟物支持体２上の細胞の被 検物を４個の処理チャンバーに通す、最初に、被挟物支持体およびその細胞の被 検物を処理チャンバー３に送り、乾燥して固定した後、１００μｆの１％−／Ｖ ヨウ素水（ａｑｕｅｏｕｓ　１ｏｄｉｎｅ）　（発色団）を添加し、２５°Ｃで ３０秒間残留させ、次いでりん酸塩食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　５ａｌｉｎｅ ）緩衝液ｐＨ１，２を用いて洗浄する０次いで、被挟物支持体および細胞の関連 被検物を駆動手段により５０μｌのネズミの単クローン性決定基を加えた処理チ ャンバー４に送り、３７°Ｃで１５分間残留させる。次いで、試薬をリン酸塩食 塩水緩衝液ＰＨ７，２で洗い落す。次いで、被検物および細胞の関連被検物を駆 動手段により５０μ！の抗−マウス　ビオチン化１ｇＧを加えた処理チャンバー ５に送り、３７℃で１０分間残留させる。次いで、この試薬をリン酸塩食塩水緩 衝液ｐｉ（７，２で洗い落す０次いで、被挟物支持体および細胞の関連被検物を 駆動手段により５０μ！のストレプタビジン蛍光体錯体を加えた処理チャンバー ６に送り、３７°Ｃで１０分間残留させる。次いで、この試薬をりん酸塩緩衝液 ｐｎ　７．２で洗い落す。試薬の流れ、保留および温度、および試薬および／ま たは被挟物支持体を処理チャンバーに残留する時間を制御する手段（図に示して いない）は装置に含めることができる０次いで、４個の処理チャンバーを通過さ せた後、被挟物支持体上の細胞の処理被検物を検査部に送り、ここで被検物を、 例えば水銀灯８で照射し、検出器手段９が照射細胞被検物がら到来する信号を検 出する。検出器手段は、例えば光学繊維素子にすることができ、照射細胞被検物 からの信号を、例えばフィルター、コンデンサおよびミラーを介して光電子増倍 管に選定および通して標識異常細胞と正常細胞との間の正確な信号対雑音比を得 る。

次いで、検出器手段９からの信号をアナライザー１０に通す。

アナライザーｌＯは、例えば検出器手段がらの信号を使用しうるデータ、例えば 異常細胞の位置および数に換えるマイクロプロセッサ−にすることができる、検 出器手段９の下において、被挟物支持体を可動ステージ１１上に載置し、このス テージ１１は被挟物支持体を少なくともＸおよびｙ方向に移動することができる 。ステージ１１および検出器手段９からアナライザーｌＯへの情報の組合わせは アナライザーが異常細胞の正確な座標を定め、所望とする座標に換えるようにで きる。

本発明の他の観点によれば、本発明は細胞を識別する方法を提供することであり 、この方法は被検物を採取し、この被検物の単分散細胞懸濁物をそれ自体既知の 技術により調製し、および自動セクエンスにおいて、調製被検物を支持体に塗布 し、塗布被検物を固定し、被検物を検査しうるマーカー試薬で標識付けし、標識 被検物を走査できる自動検出器に通し、および標識細胞の存在または不存在を記 録してマイクロプロセッサ−において分析データに転換することのできる信号を 生ずるようにする各工程からなる。

本発明の他の方法においては、被検物を被挟物支持体に塗布する前に標識付けす る。このために、例えば細胞懸濁物を染色試薬で処理することができる。

更に、本発明は多数の試薬キットを提供するもので、この各キットは好ましくは 被挟物付着改良剤または結合剤で下塗りした被挟物支持体、固定液、検査しうる マーカー試薬を含む標識付は溶液、および必要に応じて適当な緩衝液および洗浄 液からなる。

次に、本発明の方法を例を挙げて説明する゛。

プロトコール５Ｂ３（ストレプ　ビジンービオチン）の１、細胞または被検物の 標準塗抹標本を調製し、空気により２５°Ｃで乾燥し、およびエタノールで固定 した。

２、　１００μ！の１．０χ−／Ｖヨウ素水を発色団として３秒間２５°Ｃで添 加した。

３、　試薬をりん酸塩食塩水緩衝液ｐＨ７，２でゆすぎ落した。

４．５０μ！のネズミの単クローン性決定基を添加し、１５分間３７℃で反応さ せた。

５、　試薬をりん酸塩食塩水緩衝液ｐＨ７，２でゆすぎ落した。

６．５０μ！の抗−マウス　ビオチン化１ｇＧを添加し、１０分間３７°Ｃで反 応させた。

７０．試薬をりん酸塩食塩水緩衝液ｐＨ７，２でゆすぎ落した。

８．５０μ！のストレブタビジンー蛍光体話体を添加し、１０分間３７℃で反応 させた。

９、　試薬をりん酸塩食塩水緩衝液ｐ）ｌ　７．２でゆすぎ落した。

１０、上述する装置を用いて検査した。プロトコール５Ｂ３ａ対照形成異常（異 常）および正常細胞染色、およびポジティブおよびネガティブ被検物を用いて、 次の結果を得た一望号対ＩＬｔ北 細胞のタイプ　マイクロアンペア　ナノアンペア（細胞のミクロン直径／細胞に 対する）平均　ＳＤ　平均　ＳＤ 形成異常／ポジティブ　３．４　０．７２　８９０　１２６正常／ネガテイブ　 １．１７　０．６３　２４３　７９更に、プロトコールのＳＢ族は細胞母集団ま たは被挟物細胞に対する形質転換度（形質異常ＤＯＴ）で表わすことができる。

頚部癌、スクリーニングの場合、このＤＯＴは対照細胞学的、例えばパパニコラ ウ染色処理（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ　ｓｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｓ）により調製された塗抹標本における頚部上皮細胞間腫瘍性（Ｃｅｒｖｉｃａ ｌ　ＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌＳａｌ　Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｓ）（ＣＩＮ）細胞 の伝統的な等板付けに関係することを確めた。

悶腔謹香報告 ＋ｍｅｗ、＊＋ｗ、ａｍ、、−１＋ｓ、ＰＣ’：’・Ｇ＝　ミε、″口ＱＣε三 国際調査報告 ＧＢ　８８０００６５

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．被検物支持体、装置を介して被検物支持体を移動する関連駆動手段を具えた 被検物支持体取扱い手段、被検物を被検物支持体に塗布するアプリケーター、被 検物を被検物支持体に固定する手段、被検物の異常部分を被検物の正常部分から 識別するために被検物の異常部分を標識付けする処理手段、処理後被検物を照射 する手段、照射処理被検物を走査しおよび被検物の標識異常部分の存在を検出す る信号を生じさせる検出器手段からなることを特徴とする被検物の自動連続検査 装置。
2. ２．被検物支持体を微孔性担体から形成した請求の範囲１記載の装置。
3. ３．被検物支持体は微孔性ポリカーボネート　フィルターのディスクからなる請 求の範囲１記載の装置。
4. ４．処理手段は少なくとも１個のチャンバーからなり、この場合被検物を少なく とも１種の液体試薬で処理して被検物の正常部分から異なる被検物の異常部分を 標識付けするようにした請求の範囲１記載の装置。
5. ５．処理手段は被検物および／または試薬を適当な温度に加熱し、維持する加熱 手段を含む請求の範囲１記載の装置。
6. ６．関連駆動手段は装置を介して個々の被検物支持体を移動する手段からなる請 求の範囲１記載の装置。
7. ７．装置は、被検物支持体を装置を介して移動する速度、被検物支持体およびそ の関連被検物を装置の各段階に維持する時間、被検物支持体および関連被検物お よび試薬の温度、および試薬を被検物支持体およびその関連被検物と接触させる 時間を制御する調整手段を含む請求の範囲１記載の装置。
8. ８．検出器手段には、検出器に関して被検物の分離部分を配置し、およびかかる 部分を連続的に再配置するようにする記録手段を設ける請求の範囲１記載の装置 。
9. ９．装置には、前記信号から被検物の異常部分の存在および／または割合を定め るアナライザー手段を設ける請求の範囲１記載の装置。
10. １０．被検物の分離部分を走査する手段はＸ−Ｙ　ステージ、傾斜ミラー　スキ ャナー、ライナー　トランキング装置およびスパイラル　トラッキング装置を含 む請求の範囲８記載の装置。
11. １１．微孔性被検物支持体、装置を介して前記被検物支持体を移動する関連駆動 手段を具えた被検物支持体取扱い手段、支持体に被検物、被検物において２５℃ で吹付ける空気および被検物を被検物支持体に固定するイソプロパノールを付与 するアプリケーター手段、前記固定被検物を少なくとも１種の試薬でおよび正常 部分とは異なる被検物の異常部分を標識付けする適当な温度で処理する１または ２個以上のチャンバー、被検物を照射する手段、照射被検物を走査して信号を生 じさせる検出器手段、被検物の分離部分を検出器に関して配置し、連続的に配置 する位置を確認する記録手段、および前記信号から被検物における異常部分の割 合を測定するアナライザー手段からなり、装置の使用において多数の被検物の連 続自動処理、および前記被検物の任意の異常部分の割合およびスパイラル配列に ついての情報を得る被検物の自動分析するように構成したことを特徴とする被検 物の自動連続検査装置。
12. １２．蛍光抗体標識を発色団処理被検物に被着する前に、発色団を被検物に付与 することを特徴とする蛍光抗体標識で被検物を標識付けする方法。
13. １３．発色団を付与する前に被検物を支持体に被着および固定し、および標識被 検物を走査して被検物の標識部分の存在を定めるようにする請求の範囲１２記載 の方法。
14. １４．発色団はヨウ素、ハロゲン化カリウム、エタン酸またはプロムチモール　 プルーからなる請求の範囲１２記載の方法。
15. １５．発色団処理法、抗血清による処理からなる第１段階、抗−種特異ビオチニ ル化ＩｇＧによる処理からなる第２段階、および蛍光試薬による処理からなる第 ３段階の３つの段階において蛍光抗体標識を前記被検物に被着する請求の範囲１ ２記載の方法。
16. １６．被検物を支持体に被着および固定し、発色団を前記固定被検物に付与し、 過剰の発色団を前記固定被検物から除去し、抗血清を付与し、過剰の抗血清を除 去し、抗一種特異ビオチニル化ＩｇＧを付与し、過剰の抗一種特異ビオチニル化 ＩｇＧを除去し、蛍光試薬を付与し、過剰の蛍光試薬を除去し、前記処理被検物 を照射し、および前記照射被検物を走査して標識付けした被検物の部分を定める 請求の範囲１２記載の方法。
17. １７．蛍光試薬をアクリジン　イソチオシアネートと反応したストレプタビジン とする請求の範囲１５記載の方法。
18. １８．蛍光試料をアクリジニウム化合物と反応したストレプタビジンとする請求 の範囲１５記載の方法。
19. １９．蛍光試薬がアクリジニウム化合物と反応したストレプトクビジンからなる 蛍光抗体検定に用いる蛍光試薬。
20. ２０．アクリジニウム化合物をアクリジン　イソチオシアネートとした請求の範 囲１９記載の蛍光試薬。