DE3586380T2

DE3586380T2 - Verfahren zur messung von strahlungsschwankungen und anwendung desselben zum nachweis eines analyten.

Info

Publication number: DE3586380T2
Application number: DE8585306450T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Briggs
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1984-09-12
Filing date: 1985-09-11
Publication date: 1993-03-11
Anticipated expiration: 2005-09-12
Also published as: DE3586380D1; CA1277505C; US4676640A; EP0175545A3; AU4737485A; JPS6183938A; JPH052180B2; ATE78586T1; EP0175545B1; AU584351B2; EP0175545A2

Description

Das Zählen von Teilchen in Fluid-Suspensionen durch Fluoreszenzemission findet einen breiten Anwendbarkeitsbereich in Immunoassaytechniken und in der Charakterisierung von biologischen Materialien im allgemeinen. Bekannte Verfahren erfordern jedoch speziell entworfene Öffnungen, Flußleitungen oder Aufspürzonen oder komplexe Rechentechniken, um die interessierenden Teilchen von fremden oder unerwünschten Komponenten in der Probe zu unterscheiden.
Demgemäß gibt es einen Bedarf für eine preiswerte, jedoch genaue Technik, die eine direkte Anzeige von Teilchengegenwart, -konzentration und/oder -größe bereitstellt, insbesondere, wenn die Teilchen mit einem niedrigen Signal- zu Rauschverhältnis nachgewiesen werden.
Die Verwendung von Durchflußzytometern, die den sorgfältig kontrollierten Durchfluß einer Zellsuspension durch einen engen Flußkanal beinhalten, wird bei Miller et al., "Usage of the Flow Cytometer-Cell Sorter", Journal of Immunological Methods, 47, 13-24 (1981); Hoffman et al., "Immunofluorescent Analysis of Blood Cells by Flow Cytometry", Int. J. Immunopharmac., 3(3), 249-254 (1981); beschrieben; ein allgemeiner Übersichtsartikel über Durchflußzytometrie wird in Flow Cytometry and Sorting, M.R. Melamed, P.E. Mullaney und M.L. Mendelsohn, Herausgeber, J. Wiley and Sons, N.Y., N.Y. 1979; Hansen et al., U.S. Patent Nr. 4 284 355, herausgegeben am 18. August 1981; Hansen et al., U.S. Patent Nr. 4 284 412, herausgegeben am 18. August 1981; Auer et al., U.S. Patent Nr. 4 284 924, herausgegeben am 4. August 1981; und Stevens, U.S. Patent Nr. 3 275 834, herausgegeben am 27. September 1966, gefunden.
Die Verwendung von Laserstrahlen und Schlitzen, um Teilchen basierend auf ihrer relativen Größe durch die Korrelation von Fluoreszenzfluktuationen in einem relativ großen Probenvolumen zu unterscheiden, ist bei: Briggs et al., "Homogeneous Fluorescent Immunoassay," Science, 212, 1266-1267 (1981) und Nicoli et al., "Fluorescence Immunoassay Based on Long Time Correlations of Number Fluctuations, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77(8), 4904-4908 (1980) beschrieben.
US-Patent Nr. 4 421 860 (Elings et al.) beschreibt einen homogenen Fluoroimmunoassay, der die Autokorrelationsverarbeitung von optisch aufgespürten Signalen beinhaltet. Das US-Patent Nr. 4 407 964 (Elings et al.) offenbart einen homogenen Fluoroimmunoassay, der das Aufspüren von Strahlung für Vorwärts- und Rückwärtsrichtungen beinhaltet.
Ein immunologisches Reagenz und ein Radioimmunoassay werden von Dreyer im US-Patent Nr. 3 853 987 offenbart.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Messen von Intensitätsfluktuationen eines elektromagnetischen Signals aus einem flüssigen Medium bereitgestellt, worin die Intensität von Fluktuationen ein Ergebnis der Gegenwart von Teilchen in dem flüssigen Medium ist und das Signal während einer Mehrzahl von Sammelintervallen erhalten wird und autokorreliert wird und die Autokorrelation ein einziges Korrelationsintervall ungleich Null einer Dauer, die kurz im Vergleich zu der mittleren Dauer der Intensitätsfluktuationen ist, verwendet und die Dauer der Sammelintervalle geringer ist als die Dauer der Intensitätsfluktuationen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, bereitgestellt, umfassend -
(a) das Vereinigen der Probe mit einem Assayreagenz, um eine Assaymischung bereitzustellen, die fluoreszierende Teilchen enthält, wo die Fluoreszenzintensitäten der Teilchen mit der Gegenwart des Analyten in Beziehung stehen,
(b) das aufeinanderfolgende Bestrahlen einer Mehrzahl von teilweise überlappenden Volumina der Probe mit einer Lichtwellenlänge zwischen ungefähr 250 nm und 1200 nm, wobei jedes der bestrahlten Probenvolumina relativ wenige fluoreszierende Teilchen aufweist,
(c) das Bestimmen der Fluoreszenzintensitätswerte bei einer Mehrzahl von gleichen Fluoreszenzsammelintervallen, wobei die Dauer von jedem der Fluoreszenzsammelintervalle geringer ist als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb des bestrahlten Probenvolumens,
(d) das Autokorrelieren der Fluoreszenzintensitätswerte bei den Sammelintervallen; worin die Autokorrelation ein einziges Korrelationszeitintervall verwendet, das eine Dauer aufweist, die gleich ist mit oder ein kleines Vielfaches ist von der Dauer von jedem der Sammelintervalle, und das im Vergleich zur mittleren Verweilzeit von fluoreszierenden Teilchen in dem bestrahlten Probenvolumen kurz ist, und das Verfahren weiter den Schritt von
(e) dem Inbeziehungsetzen der autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerte mit ähnlichen autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerten aus einem Assaymedium, das eine bekannte Menge an Analyt aufweist, einschließt.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt, worin ein Analyt in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, bestimmt werden soll, und wo der Analyt ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ("sbp-Mitglied"), bestehend aus Ligand und seinem homologen Rezeptor, ist, umfassend -
(a) Mittel zum aufeinanderfolgenden Bestrahlen einer Mehrzahl von teilweise überlappenden Volumina der Probe mit einer Lichtwellenlänge zwischen ungefähr 250 nm und 1200 nm, wobei die Probe mit einem Assayreagenz vereinigt worden ist, um eine Assaymischung bereitzustellen, die fluoreszierende Teilchen enthält, die aus der Bindung zwischen sbp-Mitgliedern im Verhältnis zu der Menge an Analyt in dem Medium resultieren,
(b) Mittel zur Bestimmung der Fluoreszenzintensitätswerte bei einer Mehrzahl von gleichen Fluoreszenzsammelintervallen, wobei die Dauer der Fluoreszenzsammelintervalle geringer ist als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb eines bestrahlten Probenvolumens,
(c) Mittel zum kontinuierlichen Autokorrelieren der Fluoreszenzintensitätswerte bei den Sammelintervallen; worin das Mittel zum kontinuierlichen Autokorrelieren der Fluoreszenzintensität so eingerichtet ist, daß es über ein einziges Korrelationsintervall ungleich Null einer Dauer, die im Vergleich zur mittleren Verweilzeit von fluoreszierenden Teilchen in dem bestrahlten Probenvolumen kurz ist, korreliert, und die Vorrichtung ferner:
(d) Mittel zum Inbeziehungsetzen der autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerte zu ähnlich autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerten aus einem Assaymedium, das eine bekannte Menge an Analyt enthält, einschließt.
Das autokorrelierende Mittel kann Software oder angepaßte Hardware sein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zum Messen von Intensitätsfluktuationen eines elektromagnetischen Signals von einer Wellenlänge zwischen z. B. 350 nm bis 1200 nm aus einem flüssigen Medium nützlich.
In einer speziellen Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden Fluktuationen von Fluoreszenzintensitätswerten in einem flüssigen Medium gemessen, wo solche Fluktuationen ein Ergebnis der Gegenwart von fluoreszierenden Teilchen in dem flüssigen Medium sind. Die bei einer Mehrzahl von Sammelintervallen erhaltenen Fluoreszenzintensitätswerte werden autokorreliert. Zeitlich aneinandergrenzende Intervalle stellen Werte für die Fluoreszenzintensitäten von teilweise überlappenden Volumina des flüssigen Mediums, worin die Volumina relativ wenige fluoreszierende Teilchen enthalten, zur Verfügung. Die Verbesserung der vorliegenden Erfindung resultiert aus der Verwendung eines Sammelintervalls, dessen Dauer geringer ist als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens in einem solchen Volumen; und das Autokorrelationsintervall ist gleich dem Sammelintervall oder ein kleines Vielfaches oder ein Bruchteil davon.
Das verbesserte Verfahren der vorliegenden Erfindung findet speziell für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie einen solchen Analyten enthält, Anwendung. Die Probe wird mit einem Assayreagenz vereinigt, um eine Mischung bereitzustellen, die fluoreszierende Teilchen enthält, wo die Fluoreszenzintensitäten der Teilchen zu der Gegenwart des Analyten in Beziehung stehen. Eine Mehrzahl von teilweise überlappenden Volumina der Probe wird mit einer Lichtwellenlänge zwischen ungefähr 250 nm und 1200 nm bestrahlt. Das bestrahlte Probenvolumen weist relativ wenige fluoreszierende Teilchen auf. Die Fluoreszenzintensitätswerte bei einer Mehrzahl von gleichen Fluoreszenzsammelintervallen werden bestimmt, wobei die Dauer solcher Fluoreszenzsammelintervalle geringer ist als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb des bestrahlten Probenvolumens. Die Fluoreszenzintensitätswerte bei den Sammelintervallen werden über ein Autokorrelationszeitintervall, das gleich dem Sammelintervall oder ein kleines Vielfaches davon oder ein Bruchteil davon ist, autokorreliert. Die autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerte werden dann zu ähnlich autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerten aus einem Assaymedium, das eine bekannte Menge an Analyt aufweist, in Beziehung gesetzt.
Das vorliegende Verfahren stellt eine Verbesserung bei Verfahren zum Messen von Intensitätsfluktuationen eines elektromagnetischen Signals einer Wellenlänge zwischen ungefähr 350 nm bis 1200 nm aus einem flüssigen Medium zur Verfügung. Die Verbesserung umfaßt das Autokorrelieren der Intensität des Signals über ein Intervall ungleich Null, dessen Dauer kurz ist im Vergleich zu der mittleren Dauer der Fluktuationen.
Die vorliegende Erfindung findet beim Nachweis von Intensitätsfluktuationen, die z. B. aus fluoreszierenden Teilchen resultieren, Anwendung, wenn ein niedriges Signal-zu-Rausch-Verhältnis vorhanden ist. Signalstärken werden oft in Form der Anzahl von Zählereignissen in einem festgesetzten Zeitintervall registriert; z. B. Anzahl von Photo-Zählereignissen pro Zeitintervall als Maß von Lichtintensität (wie beim Photonen-Zählen). Selbst wenn ein Analog-Nachweis verwendet wird, ist das Signal im allgemeinen proportional zu n, wobei n der Anzahl von Zählereignissen pro festgesetztem Zeitintervall gleich ist. Durch kontinuierliche Überwachung von n können übermäßige Fluktuationen als Anzeichen der Gegenwart von Teilchen, die große Signale abgeben, in der Probe beobachtet werden. Das ist bei Techniken nützlich, wo ein kleines Probenvolumen verwendet wird, um die Fluoreszenz von einem oder wenigen Teilchen (oder Zellen) nachzuweisen, wie z. B. bei Durchfluß- Zytometrie oder einem faseroptischen Sondenzytometer. Ein Standardmaß für die Größe von Fluktuationen wird erhalten, indem man das mittlere Quadrat des gemessenen Signals, < n2/i> berechnet, wobei der Index i bedeutet, daß ein Ensemble von Zählereignissen verwendet wird, wobei jedes ins Quadrat gesetzt wird, bevor der Durchschnitt berechnet wird (angezeigt durch die spitzen Klammern). Wenn ein typischer Wert von n gegeben ist durch ni = plus δni, wobei der Mittelwert ist und δni die Fluktuation ist, dann
< ni> = < ( + δni)²>
= < n² + 2 δni + δn2/i>
= < ²> + < δn2/i>
= ² + < δn2/i>
worin < > = und < nδ i> = n < δni> = 0.
Dann ist die absolute Größe der Fluktuationen durch die Standardabweichung
α = [ < ni> - ²]1/2 = [< δn2/i> ]1/2
charakterisiert, und die relative Größe ist durch den Variationskoeffizienten (C.V.), der gleich σ/ ist, gegeben.
Der C.V. eines Ensembles von Ablesungen aus einem kleinen Probenvolumen, während Teilchen hindurchwandern, wäre ein Anzeichen, ob die einzelnen Teilchen ein Signal abgeben oder nicht. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens hängt von der Größe des C.V. bei einer Probe ab, wenn die Teilchen wenig oder kein Signal erzeugen.
Der primäre Hintergrundbeitrag zum C.V. besteht aus Poissonzahl-Fluktuationen. Selbst wenn das wahre Signal nicht variierend ist, fluktuieren aufeinanderfolgende Messungen dieses Signals durch Zählen der Ereignisse mit
σPoisson = [ ]1/2
Dies bedeutet, daß die relative Größe der Hintergrundfluktuationen
(C.V.)Poisson = -1/2
ist. In Situationen mit geringem Signal (kleinem n) ist der C.V. inhärent groß und deshalb kein empfindlicher Indikator für die Gegenwart von schwach markierten Teilchen (Teilchen, die ein schwaches Signal abgeben).
Der Gegenstand dieser Erfindung ist eine Verbesserung für ein Verfahren zur Berechnung der relativen Größe der Fluktuationen des Signals derart, daß die Poisson-Fluktuationen keinen Beitrag leisten. Ein Sammelintervall wird zum Zählen der diskreten Ereignisse (z. B. Photo-Zählereignisse) so ausgewählt, daß zwischen zwei aneinandergrenzenden Sammelintervallen die Teilchenverteilung in einem kleinen Meßvolumen relativ konstant ist. Daß heißt, ein Sammelintervall wird ausgewählt, das im Vergleich mit der Teilchendauerzeit in dem Meßvolumen kurz ist. Dann wird anstelle der Verwendung des Quadrats einer einzelnen Ablesung, um den C.V. zu berechnen, das Produkt von Ablesungen von aneinandergrenzenden Sammelintervallen verwendet.
In dem vorliegenden Verfahren wird bei der Berechnung der relativen Größe von Fluktuationen die Autokorrelationsfunktion von Ablesungen, die durch ein im Vergleich zur Teilchendauerzeit kurzes Zeitintervall getrennt sind, verwendet. Auf diesem Weg gibt es nur Beiträge von Fluktuationen, die über dieses begrenzte Intervall korreliert sind. Da Poisson-Fluktuationen zwischen unabhängigen Sammelintervallen vollständig unkorreliert sind, liefern diese Poisson-Hintergrundsfluktuationen keinen Beitrag. Da jedoch die Teilchenkonfiguration in dem Probenintervall über zwei aneinandergrenzende Sammelintervalle relativ unverändert ist, liefert ein Signal von Teilchen einen Beitrag.
Die Fluktuationen werden gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Formel
ausgewertet, worin (C.V.)p der Variationskoeffizient für ein Teilchen ist, n die Photo-Zählrate (proportional zur Fluoreszenzintensität) ist, < > das Bilden des Mittelwerts über ein Ensemble von aufeinanderfolgenden Sammelintervallen bedeutet und C(t) die Autokorrelation von Photo-Zählereignissen über Sammelintervalle, die durch das Autokorrelationsintervall t getrennt sind, ist.
In den Verfahren des Standes der Technik, wo Autokorrelationsfunktionen verwendet worden sind, um Signalfluktuationen zum Nachweis der Gegenwart von relativ großen Teilchen zu analysieren, wurde das genau gleiche Probenvolumen periodisch überprüft. Die Autokorrelationsfunktion des Signals wurde berechnet, wobei die Korrelationszeit der Periode von wiederholten Proben gleich war (1 bis 10 Sekunden). Relativ große Teilchen diffundieren langsam genug, so daß ihre Konfiguration über die lange Korrelationszeit unverändert ist. Ihr Signal trägt zu der Autokorrelationsfunktion bei. Kleine Teilchen (z. B. freie Moleküle) verteilen sich während dieses Zeitraums jedoch schnell zufällig und liefern so keinen Beitrag. Diese Studien verwendeten ein langes Korrelationsintervall, um zwischen freiem und gebundenem Signal zu unterscheiden. Um eine statistisch signifikante Korrelationsfunktion zu erhalten, mußte die gesamte Meßzeit im Vergleich zur Korrelationszeit lang sein (typischerweise 1000 Perioden oder 10³ bis 10&sup4; Sekunden).
Im Stand der Technik verwendet eines der herkömmlichen Maße der relativen Größe der Fluktuationen die Autokorrelationsfunktion von Ablesungen mit einem Zeitunterschied von 0. Bei diesem Vorgehen liefern alle Typen von Fluktuationen einen Beitrag.
Bevor mit einer Beschreibung der vorliegenden Erfindung weiter fortgefahren wird, wird eine Anzahl von Begriffen definiert.
"Fluktuationen eines elektromagnetischen Signals" - die Rückwärts- und Vorwärtsveränderung eines elektromagnetischen Signals. Das elektromagnetische Signal kann ein Resultat von Fluoreszenz, gestreutem Licht, durchgelassenem Licht oder dergleichen sein. Fluktuationen in der Fluoreszenz kommen normalerweise in kontinuierlichen Medien vor und können durch verschiedene Kombinationen von Teilchen und kontinuierlichen Medien verstärkt werden. Zum Beispiel können in Flüssigkeiten die Kombinationen fluoreszierende Teilchen in einer relativ gering fluoreszierenden Flüssigkeit, nicht-homogen fluoreszierende Teilchen in einer fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Flüssigkeit oder Teilchen in einer fluoreszierenden Flüssigkeit, wobei die Teilchen relativ geringer fluoreszierend sind als die Flüssigkeit, einschließen. Weiter kann die Fluoreszenzfluktuation in Flüssigkeiten ein Resultat von Aggregation von Teilchen, von der Tatsache, daß nicht-fluoreszierende Teilchen fluoreszierend werden, fluoreszierende Teilchen nicht-fluoreszierend werden oder von Veränderungen in der Fluoreszenz der Flüssigkeit sein. Die Teilchen können Polymere, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, natürliche Teilchen, wie z. B. Virionen und Zellen, z. B. Blutzellen und Bakterien, oder dergleichen umfassen. Teilchengrößen können von 0,05 bis 100 um variieren, wobei synthetische Teilchen im allgemeinen einen Durchmesser von ungefähr 0,1 um bis 10 um aufweisen. Der Begriff "Fluktuationen des elektromagnetischen Signals" schließt Fluktuationen von Fluoreszenzintensitätswerten in einem flüssigen Medium ein. Andere Fluktuationen eines elektromagnetischen Signals können das Ergebnis von Veränderungen im elastisch gestreuten Licht von Teilchen, Zellen usw. in einem flüssigen Medium oder Veränderungen im durchgelassenem Licht zwischen einer Quelle und einem Detektor aufgrund der Durchwanderung von Teilchen sein.
Ein fluoreszierendes Signal kann durch die Verwendung irgendeiner herkömmlichen fluoreszierenden Verbindung erhalten werden. Fluoreszenz-emittierende Teilchen können erhalten werden, indem man eine fluoreszierende Verbindung an die Teilchenoberfläche bindet oder indem man Teilchen verwendet, die in ihrem natürlichen Zustand mit fluoreszierenden Komponenten an der Oberfläche vorkommen. Typische Fluoreszenzfarbstoffe schließen Xanthen-Farbstoffe, wie z. B. Fluoresceine, Rosamine und Rhodamine, Naphthylamine, Cumarinderivate, wie z. B. 3-Phenyl-7- hydroxycumarin, 4-Methyl-7-dimethylaminocumarin und 4-Methyl-7-methoxycumarin, Stilbenderivate, wie z. B. 4-Dimethylamino-4'-cyanostilben, und Pyrene ein. Beschreibungen von Fluoreszenzfarbstoffen können bei Brand et al., Ann. Rev. Bio. Chem., 41: 843-868 (1972) und Stryer, Science, 162:526 (1968) gefunden werden.
"Autokorrelation" der Intensitätsfluktuationen eines elektromagnetischen Signals - Ein bequemer Weg, um die Fluktuationen eines Signals zu überwachen, ist, die bekannte Intensitätsautokorrelationsfunktion
C(t) = < n(t')n(t'-t)> t'
in der n(t') die Anzahl der Photo-Zählereignisse pro Sammelintervall zur Zeit t' ist und n proportional zur Intensität ist und das Symbol < ...> t' einen Durchschnitt des Intensitätsprodukts über eine große Anzahl von Probennahmezeiten t' anzeigt, auszuwerten.
Die Autokorrelation wird bestimmt, indem man ein elektronisches Signal, das proportional ist zu der Anzahl an Photo-Pulsen, die während eines gegebenen Sammelintervalls auftreten, erhält und eine große Anzahl von Produkten zweier solcher Signale, die in zwei verschiedenen Sammelintervallen erhalten wurden, mittelt, wobei diese Sammelintervalle zeitlich durch das Korrelationsintervall t getrennt sind.
"Sammelintervall" - Der Zeitabschnitt, währenddessen Photo-Pulse gezählt werden, auch als "Gate Time" bezeichnet. Die Dauer des Sammelintervalls ist geringer als die mittlere Dauer der Intensitätsfluktuation des elektromagnetischen Signals, z. B. geringer als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb eines bestimmten Volumens. Das Sammelintervall liegt im allgemeinen im Bereich von ungefähr 0,01 bis 100 Millisekunden, gewöhnlicher ungefähr 1 bis 10 Millisekunden.
"Effektives Volumen" - ein Volumen in dem flüssigen Medium, in dem das elektromagnetische Signal aufgespürt wird. Im allgemeinen enthält das effektive Volumen relativ wenige interessierende Teilchen. In seiner einfachsten Form besteht eine niedrige Wahrscheinlichkeit, mehr als ein interessierendes Teilchen in dem effektiven Probenvolumen zu finden.
"Analyt" - die zu messende Verbindung, das zu messende Teilchen oder die zu messende Zusammensetzung, die (das) eine Zelle, eine Organelle, ein Mikroorganismus sein kann und ein spezifisches Bindungspaar (sbp) enthalten oder ein Mitglied davon sein kann und ein Ligand, der ein- oder mehrwertig ist, d. h. eine oder eine Mehrzahl von Determinantenstellen aufweist, ein Antigen, eine einzige Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen, die sich mindestens eine gemeinsame Determinantenstelle teilen; oder ein Rezeptor sein kann.
"Sbp-Mitglied" - ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, welches aus zwei verschiedenen Molekülen besteht, wo eines der Moleküle einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung aufweist, der sich spezifisch an eine spezielle räumliche oder polaren Organisation des anderen Moleküls bindet. Die sbp-Mitglieder werden als Ligand und Rezeptor (Anti-Ligand) bezeichnet und Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars werden als homolog bezeichnet.
"Ligand" - irgendeine organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
"Rezeptor (Anti-Ligand)" - Irgendeine makromolekulare Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, d. h. Epitopen- oder Determinantenstelle, zu erkennen (eine verstärkte Bindungsaffinität dazu aufweist). Erläuternde Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, und dergleichen ein. Der Begriff "Antikörper" wird in diesem Fall als erläuternd für einen Rezeptor und diesen allgemeiner bezeichnend verwendet.
"Zelle" - irgendeine der winzigen protoplasmischen Massen, die organisiertes Gewebe ausmachen, umfassend eine Masse von Protoplasma, das von einer Membran umgeben ist, einschließlich Zellen mit und ohne Zellkern, Organellen, Sporen und Ovocyten.
Die vorliegende Erfindung findet spezielle Anwendung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält. Die Probe wird mit einem Assayreagenz vereinigt, um eine Teilchen enthaltende Assaymischung bereitzustellen, worin die Fluoreszenzintensitäten der Teilchen oder der Lösung zu der Gegenwart des Analyten in Beziehung stehen. Die Teilchen können direkt als Teil des Assayreagenz zu der Probe hinzugefügt werden, oder die Teilchen können Teil der Probe sein, wie z. B. dann, wenn die Probe Zellen enthält. Auf der anderen Seite können die Teilchen als Resultat des Mischens des Assayreagenz mit der Probe z. B. durch Agglutination oder dergleichen gebildet werden. Breit definiert enthält das Assayreagenz jene Mittel, die nach Vereinigung mit der Probe eine Teilchen enthaltende Assaymischung bereitstellen, worin die Fluoreszenzintensitäten der Teilchen oder der Lösung zu der Gegenwart des Analyten in der Probe in Beziehung stehen.
Eine Mehrzahl von teilweise überlappenden effektiven Volumina der Probe wird nacheinander mit einer Lichtwellenlänge zwischen ungefähr 250 nm und 1200 nm, bevorzugt ungefähr 325 nm bis 700 nm, bestrahlt. Der Begriff "teilweise überlappend" bedeutet, daß ein Teil des flüssigen Mediums aufeinanderfolgend überprüften effektiven Volumina gemeinsam ist. Das heißt, daß teilweise überlappende effektive Volumina bedeuten, daß ein gegebenes Teilchen zum aufgezeichneten Signal von mehr als einem aufeinanderfolgenden Sammelintervall beiträgt.
Ein Mittel zur Bestrahlung der überlappenden effektiven Volumina besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu verwenden, die in der US-Patentanmeldung Serial Nr. 397 285, eingereicht am 12. Juli 1982, entsprechend US-A-4 564 598, beschrieben werden. Im Grunde wird das effektive Volumen bestrahlt, indem man eine optische Faser verwendet, wobei das effektive Volumen durch die Konstruktion der optischen Faser bestimmt wird. Die Gestalt des Volumens ist normalerweise konisch. Die optischen Fasern sind typischerweise aus einem Kernbereich und einem Umhüllungsbereich aufgebaut, deren Dicke (Durchmesser) und relative Brechungsindices sowohl den Halbwinkel des Konus als auch den kleinsten Durchmesser des Konus an der Spitze der Faser bestimmen. Die effektive axiale Länge wird durch die Intensität des Anregungsstrahls und die Abnahmerate bezüglich der Intensität des Anregungslichts mit zunehmender axialer Entfernung von der Faserspitze bestimmt. Die Rate hängt von dem Halbwinkel des Konus ab, wobei größere Halbwinkel größere Intensitätsabfallraten und daher kürzere effektive Konuslängen verursachen. Auch Lichtstreuung und Absorptionseigenschaften des Mediums beeinflussen den Intensitätsabfall.
Die verschiedenen Parameter, die das beobachtete Signal beeinflussen, werden so gewählt, daß sichergestellt ist, daß ein vernünftiger Schwellenwert für ein effektives Probenvolumen erhältlich ist, was eine Unterscheidung gegenüber Hintergrundsignalen gestattet.
Die verschiedenen effektiven Volumina können das Ergebnis eines ausgedehnten Zeitraums sein, der die Diffusion von Teilchen in das Probenvolumen hinein und aus ihm heraus gestattet, oder von der Tatsache, daß man eine Mehrzahl von optischen Fasern hat, wobei jede Signale aus verschiedenen effektiven Volumina empfängt. Alternativ kann ein dynamisches System verwendet werden, worin die Probe an einer oder mehreren optischen Fasern vorbeifließt oder sich eine oder mehrere optische Fasern durch die Probe bewegen.
Das Anregungslicht kann durch Bestrahlen der gesamten Probe oder eines größeren Teils der Probe mit Anregungslicht bereitgestellt werden. Alternativ und bevorzugt kann das Anregungslicht durch die optische Faser bereitgestellt werden, so daß das Probenvolumen proportional zum bestrahlten Volumen ist.
Eine besonders nützliche optische Faservorrichtung ist die im Handel erhältliche Vorrichtung, die als Koppler oder Multiplexer bekannt ist, welche aus drei optischen Fasern besteht, die so zusammengefügt sind, daß sie eine sich gabelförmig teilende Leitung mit drei Endausgängen, die bequemerweise als Einspeisungsausgang, in den Anregungslicht eingespeist wird, als Sondenausgang, der in die Probe eingetaucht wird, und als Nachweisausgang bezeichnet werden, bilden. In einer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bequemen Form sind die Fasern auf solche Weise zusammengefügt, daß im wesentlichen alles Licht, das den Einspeisungsausgang betritt, zum Sondenausgang übertragen wird. Licht, das in den Sondenausgang eintritt, wie z. B. aus der Fluoreszenzemission, kann am Leitungsverbindungspunkt aufgespalten werden, so daß sich ein Teil zum Einspeisungsausgang bewegt und ein zweiter Teil zum Nachweisausgang. Alternativ kann am Verbindungspunkt ein dichroitischer Spiegel verwendet werden, der im wesentlichen das ganze fluoreszierende Licht zum Nachweisausgang leitet. Solche Vorrichtungen sind von Handelshäusern, z. B. Kaptron, Inc., Palo Alto, Kalifornien, erhältlich.
In der nächsten Stufe in einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Fluoreszenzintensitätswerte bei einer Mehrzahl von gleichen Fluoreszenzsammelintervallen bestimmt. Die Dauer der Fluoreszenzsammelintervalle ist im allgemeinen geringer als die Verweilzeit des Fluoreszenzteilchens in dem bestrahlten Probenvolumen. Vorzugsweise werden die Fluoreszenzintensitätswerte unter Verwendung der oben beschriebenen optischen Faser bestimmt.
In der nächsten Stufe im vorliegenden Verfahren werden die Fluoreszenzintensitätswerte bei den oben erwähnten Sammelintervallen über ein Korrelationszeitintervall, das gleich dem Sammelintervall oder ein kleines, vorzugsweise ganzes, Vielfache oder ein Bruchteil, vorzugsweise ungefähr das Ein- bis Zehnfache, mehr bevorzugt ungefähr das Ein- bis Dreifache, des Sammelintervalls ist, autokorreliert. Im allgemeinen ist das Korrelationsintervall gleich oder größer als die Dauer eines Sammelintervalls und geringer als die Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb des bestrahlten Probenvolumens. Das Korrelationsintervall beträgt gewöhnlich ein Drittel bis ein Hundertstel, bevorzugt ein Drittel bis ein Zehntel, der Verweilzeit des Fluoreszenzteilchens innerhalb des bestrahlten Probenvolumens.
Als nächstes können die korrelierten Fluoreszenzintensitätswerte zu ähnlich korrelierten Fluoreszenzintensitätswerten aus einem Assaymedium, das eine bekannte Menge an Analyt aufweist, in Beziehung gesetzt werden. Die Autokorrelationsfunktion und das Inbeziehungsetzen der Ergebnisse aus der bekannten und der unbekannten Probe kann unter Verwendung eines Computers, der das geeignete Programm zur Durchführung der Autokorrelationsfunktionen enthält, durchgeführt werden. Demgemäß berechnet der Computer, basierend auf der obigen Bestimmung, dann automatisch die Konzentration an Analyt in der Probe.
Bei Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens in einem Fluoreszenzassay kann eine große Anzahl von Protokollen und Reagenzien verwendet werden. Eine Gruppe von Protokollen beinhaltet das Messen von fluoreszierenden Teilchen. Diese Gruppe kann in Assays eingeteilt werden, in denen (1) der Analyt fluoreszierende Teilchen umfaßt, die einzigartige Absorption und/oder Emission in Bezug auf alle anderen fluoreszierenden Teilchen im Medium aufweisen und die deshalb direkt durch deren Fluoreszenzfluktuationen nachgewiesen werden können; (2) entweder Analyt oder ein komplementäres sbp-Mitglied des Analyten an ein fluoreszierendes Teilchen geknüpft ist, worin sich das sbp-Mitglied auf dem Teilchen und ein komplementäres sbp-Mitglied verbinden, um Aggregation der Teilchen zu verursachen und eine entsprechende Änderung in den Fluktuationen zu erzeugen; (3) entweder der Analyt oder ein komplementäres sbp-Mitglied des Analyten an nicht-fluoreszierende Teilchen geknüpft ist, wenn ein zu dem sbp-Mitglied auf den Teilchen komplementäres sbp-Mitglied entweder fluoreszierend ist oder durch spezifische Bindung oder Reaktion eines fluoreszierenden Reagenz, wie z. B. eines dritten mit Fluoreszenzfarbstoff markierten sbp-Mitglieds, fluoreszierend gemacht wird; (4) entweder der Analyt oder ein sbp-Mitglied des Analyten an nicht-fluoreszierende Teilchen geknüpft ist, worin ein zu dem sbp-Mitglied auf den Teilchen komplementäres sbp-Mitglied Agglutination der Teilchen verursacht und eine Änderung in der Fluoreszenzfluktuation durch die resultierenden teilchenförmigen Aggregate, die ein gleiches Volumen einer gelösten Fluoreszenzfarbstoff enthaltenden Lösung verdrängen, veranlaßt wird.
Die obigen Techniken illustrieren nur einige der vielen Typen von Assays, die zur Bestimmung von Analyten zugänglich sind. Diese Assays können in einer Anzahl von Artikeln und Patenten gefunden werden, wobei einige der Patente durch die US-Patente Nr. 3 826 613; 3 853 987; 3 925 541; 4 061 466; 5 062 935; 4 141 965; 4 164 558; 4 256 834; 4 275 149; und 4 318 707 veranschaulicht werden. Die Beschreibung der verschiedenen Methoden wird hierin durch Bezugnahme aufgenommen, wobei diese Beschreibungen nicht erschöpfend, sondern vielmehr die Vielfalt von Verfahren, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, veranschaulichen sollen.

BEISPIELE

Die Erfindung wird weiter durch das folgende erläuternde Beispiel, das zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung aufgeführt wird, erläutert.

BEISPIEL

Ein homogener Fluoreszenzassay wurde für das Antigen der Gruppe A von menschlichen roten Blutzellen (RBCs) durchgeführt. In dem Assay wurden 50 ul Vollblut 10 Minuten mit 50 ul fluoreszierend markiertem (Fluoresceinisothiocyanat- FITC) Anti-A-Antikörper (monoklonales IgM, Chembiomed, Edmonton, Alberta) inkubiert. Die Probe wurde dann mit 7,5 ml Puffer (0,1 M Natriumbicarbonat, 20 mM EDTA, 0,17 Rinderserumalbumin (BSA), pH 8,5) verdünnt und mit dem faseroptischen Sondenzytometer gelesen.
Die Sondenfaser eines "Y"-förmigen faseroptischen Multiplexers, der von Kaptron, Inc., Palo Alto, Kalifornien erhalten worden war , wurde in die Suspension eingetaucht. Die Faser hatte einen Durchmesser von 50 um und erzeugte einen Anregungskonus mit einem Halbwinkel von 12º und ein effektives Überprüfungsvolumen von 1·10&supmin;&sup7; ml. Anregungslicht aus einem He-Cd-Laser wurde in eine der zwei Zweigfasern eingespeist und von dem Multiplexer zur Sondenfaser überführt. Ein Konus von Anregungslicht trat aus der Sonde, mit welcher die Probe mechanisch durchmustert wurde, aus. Der aus dem Überprüfungsvolumen emittierte Teil der Fluoreszenz, der wieder in die eingetauchte Fasersonde eintrat, wurde durch den Multiplexer zur zweiten Zweigfaser überführt, welche nach Filtern an einen hochverstärkenden Sekundärelektronenvervielfacher gekoppelt war, wobei das Filtern Licht bei den Anregungswellenlängen zugunsten von Licht bei den Fluoreszenzemissionswellenlängen abschwächte.
Die Fasersonde wurde mit ungefähr 1 cm/Sekunde durch die Zellsuspension bewegt; dies bedeutet, daß sich eine gegebene Zelle im Überprüfungsvolumen ungefähr 5 ms unter der Faserspitze befand. Fluoreszenz aus der Fasersonde wurde alle 1 ms (dem Sammelintervall) in Form der Anzahl von Photo-Zählereignissen pro ms (n) aufgezeichnet. Bei diesem Assay war der Durchschnitt dieser Zahl typischerweise 45. In tausend aufeinanderfolgenden Ablesungen wurden die Fluktuationen relativ zu dem Mittelwert der Ablesungen mit zwei Verfahren analysiert. Bei einem gegebenen Assay wurde der Fluktuationsgrad für zehn getrennte Blöcke von eintausend Ablesungen gemittelt, um das Endergebnis zu ergeben.
Bevor die beiden Analyseverfahren für die Fluktuationen beschrieben werden, sollte die Beziehung zwischen den Fluoreszenzfluktuationen und der Tatsache, ob die Probe positiv oder negativ ist, verstanden werden. Falls das Blut von der Gruppe A war (positive Probe), dann teilt sich die Fluoreszenz aus einer frei in Lösung befindlichen zu einer an die RBCs über die Antikörper-Zelloberflächenantigenreaktion gebundenen auf. Die fluoreszierenden Zellen, die vor der Fasersonde vorbeiwandern, erzeugen ein fluktuierendes Signal. Wenn jedoch das Blut von der Gruppe B oder O war (negative Proben), dann würde die Fluoreszenz frei in Lösung verbleiben und die Fasersonde würde ein einheitlicheres Signal empfangen. So entspricht in diesem Assay eine große Menge an Fluoreszenzfluktuationen einer positiven Probe.
Die Fluktuationen wurden unter Verwendung eines bekannten Verfahrens ausgewertet. Der Variationskoeffizient (C.V.) der Photozählereignisse pro Sammelintervall (1 ms) wurde unter Verwendung der Formel
ausgewertet, worin ni die Photo-Zählrate (proportional zur Fluoreszenzintensität) während des i-ten Sammelintervalls ist und < > das Ermitteln des Durchschnitts über ein Ensemble von aufeinanderfolgenden Sammelintervallen bedeutet. Der Index T bezieht sich auf die Tatsache, daß dieses Verfahren ein Gesamt-C.V. ist; d. h. alle Typen an Fluktuationen liefern einen Beitrag. Der Gesamt-C.V. kann als Ausdruck der Korrelationsfunktion, die zu verschiedenen Zeiten erfaßte Photozählereignisse in Beziehung setzt, umgeschrieben werden,
C(t) = < n(t')n(t'-t)> t'
Man bemerke, daß der Gesamt-C.V. die Korrelationsfunktion mit dem Zeitunterschied Null, t = 0, beinhaltet.
Die Fluktuationen wurden gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Formel
ausgewertet, worin (C.V.)p der Variationskoeffizient für ein Teilchen ist, n die Photozählrate (proportional zur Fluoreszenzintensität) ist, < > das Ermitteln eines Durchschnitts von einem Ensemble aufeinanderfolgender Sammelintervalle bedeutet und C(t) die Autokorrelation von Photozählereignissen über Sammelintervalle, die durch das Autokorrelationsintervall t getrennt sind, ist. In diesem Fall ist t gleich t, dem Sammelintervall (1 ms für das vorliegende Beispiel). Nur Fluktuationen, die über mindestens 1 Sammelintervall autokorreliert sind, trugen zu diesem Maß des Fluktuationsgrades bei.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 aufgeführt. Jede von fünf Vollblutproben wurde fünfmal einem Assay unterzogen; die fünf Proben bestanden aus einer stark positiven (A&sub1;), einer schwach positiven (A&sub2;B), einer sehr schwach positiven (schwaches A&sub2;B) und zwei negativen (B und 0). In jedem Fall werden der Mittelwert und die Standardabweichung der fünf gleichen Assays für beide Verfahren der Fluktuationsanalyse angegeben. Tabelle I Verfahren der Erfindung Mittelwert Standardabweichung Bekanntes Verfahren Positiv schwaches Negativ
Das Verfahren der Erfindung gestattete, daß das schwächste positive Ergebnis gut aufgelöst wurde. Die ganze Trennung zwischen den negativen und den schwächsten positiven Ergebnissen ging klar verloren, wenn das bekannte Verfahren verwendet wurde.
Gewöhnlich wird ein Schwellenwert zwischen negativen und positiven Ergebnissen beim Mittelwert plus drei Standardabweichungen aufgestellt, wobei die Verteilung von allen negativen Ergebnissen verwendet wird. Beim obigen Beispiel lag der Schwellenwert im Verfahren der Erfindung bei 5,2 und im bekannten Verfahren bei 18,4. Mit dem Verfahren der Erfindung wären alle fünf Assays mit dem schwachen A&sub2;B als positiv registriert worden, und das niedrigste einzelne positive Ergebnis (bei 7,3) war von diesem Schwellenwert durch volle sechs Standardabweichungen getrennt, wohingegen keiner der individuellen fünf Assays mit der schwachen A&sub2;B-Probe unter Verwendung des bekannten Verfahrens als positive registriert worden wäre.
Aus den obigen Ergebnissen wird offensichtlich, daß das vorliegende Verfahren einen einfachen, genauen Weg zur Bestimmung niedriger Konzentrationen einer großen Vielfalt von Liganden bereitstellt. Das vorliegende Verfahren ist ohne weiteres an eine große Vielfalt von Assays, die fluoreszierende Markierer verwenden, anpaßbar. Zusätzlich kann das vorliegende Verfahren auf neue Protokolle angewendet werden, an denen das Zählen von fluoreszierenden Körpern beteiligt ist, worin die Körper alle im wesentlichen die gleiche Fluoreszenz oder eine in starkem Maß variierende Fluoreszenz aufweisen können. Die Apparateausrüstung ist einfach, kann ohne weiteres automatisiert werden und kann ein direktes Ablesen der Menge an Analyt in der Probe, basierend auf dem beobachteten Signal, gewährleisten.
Das vorliegende Verfahren stellt eine Verbesserung gegenüber den Verfahren des Standes der Technik dar, worin eine Autokorrelationsfunktion unter Verwendung langer Korrelationszeiten gleich dem Zeitraum wiederholter Messungen oder der Autokorrelation bei der Meßzeit 0 verwendet wird, um zwischen freier und gebundener Fluoreszenz in einer homogenen Immunoassaytechnik zu unterscheiden. Was den ersten Fall betrifft, ist in der vorliegenden Erfindung, in der die Probe mechanisch auf einfache Weise durchmustert werden kann, periodisches Messen nicht erforderlich. Auch ist die Gesamtmeßzeit viel kürzer. In der vorliegenden Erfindung können mit einem Sammelintervall von 1 ms 1000 Beiträge zu der Autokorrelationsfunktion in 1 Sekunde angesammelt werden, wohingegen bei einer periodischen Probennahme mit einer Periode von 1 Sekunde 1000 Beiträge zur Autokorrelationsfunktion 1000 Sekunden in Anspruch nehmen. Was den zweiten Fall betrifft, eliminiert die vorliegende Technik die Beiträge von Hintergrund-Poisson-Fluktuationen, die um ein Vielfaches größer sein können als das spezifische Signal, das mit Teilchen einhergeht, die schwache Fluoreszenz aufweisen, wie zum Beispiel schwach markierten Zellen.
Die vorliegende Technik gestattet eine bessere Empfindlichkeit als die bekannte Technik, weil im vorliegenden Verfahren eine bessere Unterscheidung des Signals gegenüber dein Hintergrund erhalten wird. Teilchen, die eine Fluoreszenzintensität aufweisen, die nur etwas größer ist als die des Gesamtmediums, können nachgewiesen werden. Alternative Verfahren, die die gleiche Empfindlichkeit erreichen wie die, die im vorliegenden Verfahren erhalten wird, erfordern sehr starke Laser und Durchflußsysteme. Herkömmliche Nicht-Durchfluß-Fluoreszenznachweistechniken können ohne sehr lange Meßzeiten nicht ein solches Maß an Empfindlichkeit bereitstellen.
Obwohl die vorangehende Erfindung durch Erläuterungen und Beispiele für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses in einigem Detail beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß gewisse Änderungen oder Modifikationen ausgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zum Messen von Intensitätsfluktuationen eines elektromagnetischen Signals aus einem flüssigen Medium, worin die Intensitätsfluktuationen ein Ergebnis der Gegenwart von Teilchen in dem flüssigen Medium sind und während einer Mehrzahl von Sammelintervallen erhalten werden und autokorreliert werden; dadurch gekennzeichnet, daß die Autokorrelation ein einziges von Null verschiedenes Korrelationsintervall einer Dauer, die verglichen mit der mittleren Dauer der Intensitätsfluktuationen kurz ist, verwendet und die Dauer der Sammelintervalle geringer ist als die mittlere Dauer der Intensitätsfluktuationen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das elektromagnetische Signal durch Fluoreszenzemission erzeugt wird, und die Intensitätsfluktuationen über ein Intervall, daß eine Dauer von einem Drittel bis einem Hundertstel der mittleren Dauer der Fluktuationen hat, autokorreliert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Teilchen fluoreszierende Teilchen sind, die Fluoreszenzintensitätswerte, die während der Mehrzahl von Sammelintervallen erhalten werden, über das einzige Korrelationsintervall autokorreliert werden, worin zeitlich aneinandergrenzende Sammelintervalle Werte für die Fluoreszenzintensität von teilweise überlappenden Volumina des flüssigen Mediums liefern, worin jedes solcher Volumina relativ wenige fluoreszierende Teilchen enthält, worin die Dauer von jedem der Sammelintervalle kürzer ist als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb des Volumens und worin die Dauer des Autokorrelationsintervalls gleich der Dauer von jedem der Sammelintervalle ist oder ein endliches, aber kleines Vielfaches davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Fluoreszenzintensitätswerte unter Verwendung einer optischen Fasersonde erhalten werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3, in dem die Menge eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie einen solchen Analyten enthält, bestimmt wird und die Fluktuationen in den Fluoreszenzintensitätswerten der Probe mit den Fluktuationen in den Fluoreszenzintensitätswerten einer Referenzprobe verglichen werden.

6. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, umfassend -

(a) das Zusammengeben der Probe mit einem Assayreagens, um eine Assaymischung bereitzustellen, die fluoreszierende Teilchen enthält, worin die Fluoreszenzintensitäten der Teilchen zur Gegenwart des Analyten in Beziehung stehen,

(b) das aufeinanderfolgende Bestrahlen einer Mehrzahl von teilweise überlappenden Volumina der Probe mit einer Lichtwellenlänge zwischen ungefähr 250 nm und 1200 nm, wobei jedes der bestrahlten Probenvolumina relativ wenige fluoreszierende Teilchen aufweist,

(c) das Bestimmen der Fluoreszenzintensitätswerte bei einer Mehrzahl von gleichen Fluoreszenzsammelintervallen,

(d) das Autokorrelieren der Fluoreszenzintensitätswerte bei den Sammelintervallen; dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer eines jeden der Fluoreszenzsammelintervalle geringer als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb des bestrahlten Probenvolumens ist, die Autokorrelation ein einziges Korrelationszeitintervall verwendet, das eine Dauer hat, die gleich der Dauer eines jeden der Sammelintervalle ist oder ein kleines Vielfaches davon ist und das im Vergleich zu der mittleren Verweilzeit von fluoreszierenden Teilchen in dem bestrahlten Probenvolumen klein ist, und das Verfahren weiter den Schritt einschließt von

(e) dem Inbeziehungsetzen der autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerte zu ähnlich autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerten aus einem Assaymedium, das eine bekannte Menge an Analyt aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Analyt in dem bestrahlten Probenvolumen als Ergebnis von Licht aus einer optischen Faser, die in die Assaymischung eingetaucht ist, bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Dauer des einzigen Korrelationsintervalls ein Drittel bis ein Hundertstel der mittleren Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb des bestrahlten Probenvolumens ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin das fluoreszierende Teilchen eine rote Blutzelle oder eine Latexperle ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Fluoreszenz des Teilchens mittels Liganden-Rezeptor-Bindung, worin die Bindung vorzugsweise immunochemisch ist, moduliert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 6, worin die autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerte eine Funktion der Aggregationsgrade von Teilchen, vorzugsweise die Bindung eines fluoreszierenden Teilchens an ein nichtfluoreszierendes Teilchen umfassend, sind.

12. Vorrichtung, worin ein Analyt in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, bestimmt werden soll und wobei der Analyt ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp-Mitglied"), das aus Ligand und seinem homologen Rezeptor besteht, ist, umfassend -

(a) Mittel zum aufeinanderfolgenden Bestrahlen einer Mehrzahl von teilweise überlappenden Volumina der Probe mit einer Lichtwellenlänge zwischen ungefähr 250 nm und 1200 nm, wobei die Probe mit einem Assayreagens vereinigt worden ist, um eine Assaymischung bereitzustellen, die fluoreszierende Teilchen, die aus der Bindung zwischen sbp-Mitgliedern im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe resultieren, enthält,

(b) Mittel zum Bestimmen der Fluoreszenzintensitätswerte bei einer Mehrzahl von gleichen Fluoreszenzsammelintervallen,

(c) Mittel zum kontinuierlichen Autokorrelieren der Fluoreszensintensitätswerte bei den Sammelintervallen; dadurch gekennzeichnet daß die Dauer der Fluoreszenzsammelintervalle geringer ist als die mittlere Verweilzeit eines fluoreszierenden Teilchens innerhalb eines bestrahlten Probenvolumens, das Mittel zum kontinuierlichen Autokorrelieren der Fluoreszenzintensität so eingerichtet ist, daß es über ein einziges von Null verschiedenes Korrelationsintervall einer Dauer, die im Vergleich zu der mittleren Verweildauer von fluoreszierenden Teilchen in dem bestrahlten Probenvolumen kurz ist, korreliert, und die Vorrichtung weiter einschließt:

(d) Mittel zum Inbeziehungsetzen der autokorrelierten Fluoreszenzintensitätswerte zu ähnlich autokorrelierten Fluoreszensintensitätswerten aus einem Assaymedium, das eine bekannte Menge an Analyt enthält.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, worin das Mittel zum kontinuierlichen Autokorrelieren der Fluoreszenzintensitätswerte bei den Sammelintervallen entweder Hardware oder Software ist.