DE69804612T2

DE69804612T2 - Verfahren zur charakterisierung von proben unter verwendung statistischer zwischendaten

Info

Publication number: DE69804612T2
Application number: DE69804612T
Authority: DE
Inventors: Peet Kask
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2018-06-11
Also published as: EP0884583A1; DE69804612D1; ES2173600T3; US6515289B1; ATE215694T1; WO1998057150A1; DK0988525T3; JP2002505742A; EP0988525B1; EP0988525A1; JP4201058B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Proben auf der Basis von statistischen Zwischendaten.
Bei vielen pharmakologischen, biologischen und chemischen Problemen geht es im Wesentlichen darum, Substanzen in einer Probe nachzuweisen oder die Wechselwirkung oder Reaktion dieser Substanzen zu messen. Um die Substanzen in einer Probe spezifischer zu messen, ist gewöhnlich wenigstens einer der Reaktanten radioaktiv oder lumineszent markiert. Eine zweckmäßige und empfindliche Art von Markern sind Fluoreszenzmarker.
Weit verbreitete Verfahren zur Überwachung von Wechselwirkungen durch Fluoreszenz beinhalten die Bestimmung von Änderungen der Gesamtfluoreszenzintensität oder der Anisotropie der Fluoreszenz. Mehrere Nebenwirkungen, wie Oberflächenbindung oder Fluoreszenz von Verunreinigungen, führen jedoch häufig zu Interpretationsproblemen und Artefakten. Ein zweiter Grund, der Interesse an verfeinerten Analyseverfahren verursacht hat, ist die Notwendigkeit, auf dem Gebiet des Hochdurchsatz-Screenings und in der im großen Maßstab durchgeführten Diagnostik mit einer großen Anzahl von Proben in kleinen Mengen zu arbeiten.
Neue Gelegenheiten zur Entwicklung von Assays eröffneten sich, als die Technologie zur Beobachtung der Fluoreszenz von einzelnen Fluorophormolekülen verfügbar wurde. Die ersten erfolgreichen Studien über Fluktuationen der Fluoreszenzintensität wurden von Magde, Elson und Webb durchgeführt (Biopolymers, Vol. 13, 29-61, 1974), die die Möglichkeit aufzeigten, Zahlenfluktuationen von fluoreszenten Molekülen nachzuweisen, und ein Forschungsgebiet begründeten, das Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) genannt wird. FCS wurde primär als Verfahren zur Bestimmung von chemischen Geschwindigkeitskonstanten und Diffusionskoeffizienten entwickelt. Das Experiment besteht im Wesentliche darin, die zeitliche Variation der Anzahl von Molekülen spezifischer Reaktanten in einem definierten offenen Volumen der Lösung zu messen. Mikroskopische Fluktuationen der Konzentration des Reaktanten werden als Fluktuationen der Fluoreszenzintensität aus einem kleinen offenen Messvolumen nachgewiesen. Das Messvolumen wird durch einen fokussierten Laserstrahl, der die Fluoreszenz anregt, und eine Lochblende in der Bildebene des Mikroskops, das die Fluoreszenz auffängt, definiert. Die Intensität der Fluoreszenzemission fluktuiert proportional zu den Änderungen in der Anzahl der fluoreszenten Moleküle, während sie in das Messvolumen hinein und aus dem Messvolumen heraus diffundieren und während sie durch die chemischen Reaktionen gebildet oder eliminiert werden. Technisch gesehen ist das direkte Ergebnis eines FCS-Experiments die berechnete Autokorrelationsfunktion der gemessenen Fluoreszenzintensität.
Eine wichtige Anwendung von FCS ist die Bestimmung von Konzentrationen fluoreszenter Spezies mit verschiedenen Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Gemisch. Um die beiden Terme, die der Translationsdiffusion von zwei Arten von Teilchen entsprechen, in der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensität zu trennen, benötigt man wenigstens etwa einen Unterschied in der Diffusionszeit gemäß einem Faktor zwei, was im Allgemeinen einem Unterschied in der Masse der Teilchen gemäß einem Faktor von acht entspricht. Wenn es gelingt, die beiden Terme in der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensität zu trennen, ist dies weiterhin noch nicht ausreichend, um die entsprechenden Konzentrationen zu bestimmen, außer wenn man die relative Helligkeit der beiden verschiedenen Arten von Teilchen kennt.
Die internationale Patentanmeldung WO-A-98/16814 beschreibt ein Verfahren zur Charakterisierung von Proben durch Messen der Anzahl der Photonen, die von Einheiten in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wurden, in einem repetitiven Modus pro Zeitintervall einer definierten Länge und Bestimmung einer Funktion der Anzahl der Photonenzählereignisse pro Zeitintervall, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Basis der Funktion der Anzahl der Photonenzählereignisse eine Funktion der spezifischen Helligkeit der Einheiten bestimmt wird. Dieses Verfahren kann auch auf die Untersuchung von fluoreszenten Proben angewendet werden. Diese spezielle Ausführungsform ist die sogenannte Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA). Während FCS zwischen verschiedenen Spezies anhand ihrer Diffusionszeit unterscheidet, unterscheidet FIDA zwischen ihnen anhand ihrer spezifischen Helligkeit. Sowohl FCS als auch FIDA beruhen auf einer einzigen spezifischen physikalischen Eigenschaft. Im Prinzip können die durch FCS oder FIDA erhaltenen eindimensionalen statistischen Funktionen jedoch verwendet werden, um Verteilungen von Teilchen in mehr als einer spezifischen physikalischen Eigenschaft zu bestimmen (z. B. Verteilung von Teilchen sowohl in Bezug auf den Translations- als auch den Rotationsdiffusionskoeffizienten), aber diese Option ist begrenzt und ist zuweilen wenig zuverlässig.
Die Europäische Patentanmeldung EP-A-0 359 681 offenbart modulierte dynamische Lichtstreuungsmethoden, die sich zeitliche und räumliche Modulationen des eintreffenden oder gestreuten Lichts sowie Modulationen, die durch statistische Brownsche Bewegungen der Teilchen verursacht werden, zur Messung bestimmter Eigenschaften zu Nutze machen.
Ein weiteres Verfahren, das sich die Fluoreszenz zu Nutze mache, ist die Fluoreszenzanalyse bei der Zellsortierung (FACS). Bei FACS-Maschinen wird die Intensität des von einem einzelnen Teilchen emittierten Lichts mit relativ hoher Genauigkeit gemessen, und Intensitäten, die verschiedenen Wellenlängen, Streu- oder Polarisationswinkeln entsprechen, können gleichzeitig aufgezeichnet werden. Das US-Patent 3,824,402 (Mullaney et al.) offenbart eine solche photometrische Apparatur und ein Verfahren zur Messung der Lichtansprecheigenschaften von in geeigneter Weise angefärbten biologischen Zellen. Wenigstens zwei Lichtansprecheigenschaften werden gemessen und miteinander verglichen, um durch Störlicht induziertes Rauschen zu eliminieren. Insbesondere werden die von den Zellen verursachte Lichtstreuung und das von den Zellen emittierte Fluoreszenzlicht als Reaktion auf einen einfallenden Lichtstrahl nachgewiesen. Gewöhnliches FACS kann jedoch nicht in solchen Fällen angewendet werden, wo die untersuchten Teilchen auf statistischen Wegen ankommen und das Messvolumen wieder verlassen, so dass viele davon nicht durch die Mitte des Brennpunkts kommen. Außerdem ist die Gruppe der in FACS verwendeten Verfahren in solchen Fällen nicht anwendbar, wo die Lichtintensität, die einzelnen Teilchen entspricht, so schwach ist, dass der stochastische Fehler ihrer Messung Unterschiede in den Intensitäten, die verschiedenen Spezies von Teilchen entsprechen, übersteigt. Weiterhin ist FACS nur bei äußerst geringen Konzentrationen von Teilchen anwendbar, die viel weniger als einem Teilchen pro Messvolumen entsprechen.
Ein Ziel der Erfindung besteht darin, die Zuverlässigkeit der Analyse von Proben zu erhöhen und die Gefahr einer Fehlinterpretation der gemessenen Daten zu reduzieren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, den Anwendungsbereich der mehrdimensionalen Analyse von Proben beträchtlich zu erweitern.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung werden mit dem Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 erreicht. Die Ansprüche 4 sowie 6-23 definieren zusätzliche Merkmale.
Die folgende Beschreibung soll erläuternd und nicht einschränkend sein. Bei der Durchsicht der folgenden Beschreibung werden dem Fachmann viele Ausführungsformen einfallen. Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Überwachung von Anzahlen von Photonenzählereignissen durch Licht, das von fluoreszenzmarkierten Teilchen in einer Probe emittiert wird, beschrieben. Fluoreszenz ist ein sehr empfindliches Mittel, das die Beobachtung einzelner Moleküle ermöglicht, und doch recht selektiv, das zwischen verschiedenen Spezies zu unterscheiden erlaubt.
Der Ausdruck "Einheit einer Probe" bezieht sich im Allgemeinen auf Teile einer Probe, die in der Lage sind, Strahlung zu emittieren, zu streuen und/oder zu reflektieren. Eine Probe könnte mehrere identische Einheiten oder verschiedene Einheiten, die vorzugsweise zu Spezies gruppiert werden können, enthalten. Der Ausdruck "verschiedene Spezies" bezieht sich auch auf verschiedene Zustände, insbesondere verschiedene Konformationszustände, einer Einheit, wie eines Moleküls. Fluoreszenzmarkierte oder natürlicherweise fluoreszente Moleküle, Molekülkomplexe, Vesikel, Zellen, Kügelchen und andere Teilchen in Wasser oder anderen Flüssigkeiten können Beispiele für fluoreszente Einheiten in flüssigen Proben sein, während Beispiele für fluoreszente Einheiten einer festen Probe Verunreinigungsmoleküle, -atome oder -ionen oder andere Fluoreszenzzentren sind.
Der Ausdruck "spezifische physikalische Eigenschaft" bedeutet im Allgemeinen eine physikalische messbare Eigenschaft, die für eine Spezies einen bestimmten Wert oder ein Intervall von Werten oder eine Verteilung von Werten hat und für eine andere Spezies im Allgemeinen einen anderen Wert oder ein anderes Intervall von Werten oder eine andere Verteilung von Werten hat. Beispiele für spezifische physikalische Eigenschaften sind: Diffusionskoeffizient, Absorptionsquerschnitt, Quantenausbeute der Fluoreszenz, spezifische Helligkeit, Anisotropie der Fluoreszenz, Abklingzeit der Fluoreszenz, Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten, die durch verschiedene optische Filter treten, usw.
Die spezifische Helligkeit im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine physikalische Eigenschaft, welche ausdrückt, in welchem Ausmaß eine Einheit einer gegebenen Spezies in der Lage ist, Strahlung zu emittieren, zu streuen und/oder zu reflektieren. Sie soll einzelne Einheiten charakterisieren, und daher hängt der Wert der spezifischen Helligkeit weder von der Konzentration der Einheiten noch von der Anwesenheit anderer Einheiten ab. Wenn eine Änderung der Gesamtzählrate der aus dem Messvolumen emittierten, gestreuten und/oder reflektierten Photonen nur auf eine Änderung der Konzentration der gesamten Anzahl der Einheiten zurückzuführen ist, beeinflusst sie also nicht den Wert der spezifischen Helligkeit. Die spezifische Helligkeit einer Einheit wird gewöhnlich als mittlere Zählrate pro Einheit ausgedrückt und ist ein gewogenes Mittel der Zählrate der Einheit über Koordinaten im Messvolumen.
Der Ausdruck "wenigstens zweidimensionale gemeinsame statistische Funktion" bedeutet eine Funktion von zwei oder mehr Argumenten, die aus Sequenzen von Photonenzählereignissen bestimmt werden kann, die von einem einzigen, zwei oder mehr Photonendetektoren nachgewiesen werden. Das Adjektiv "statistisch" bedeutet, dass die Funktion als Mittel über die Zeit oder über Realisierungen bestimmt wird, während ihr Erwartungswert eine nichttriviale Funktion sein soll, die wertvolle Informationen über die Probe ausdrückt. Das Adjektiv "gemeinsam" soll bedeuten, dass die mehrdimensionale statistische Funktion aus einer Sequenz oder Gruppe von Sequenzen von Photonenzählereignissen erzeugt werden kann, ohne dass es erforderlich ist, wenigstens eine eindimensionale statistische Funktion für jede von mehreren getrennt nachgewiesenen Sequenzen oder Gruppen von Sequenzen von Photonenzählereignissen zu erzeugen und die mehrdimensionale statistische Funktion aus diesen eindimensionalen Funktionen zusammenzusetzen. "Getrennt nachgewiesen" soll bedeuten, dass die Sequenz oder die Gruppen von Sequenzen von Photonenzählereignissen mit getrennten Detektoren bzw. Gruppen von Detektoren nachgewiesen werden oder in aufeinanderfolgenden Messungen mit demselben Detektor bzw. derselben Gruppe von Detektoren nachgewiesen werden. Wenn eine Korrelationsfunktion der Lichtintensität zum Beispiel unter verschiedenen Bedingungen (z. B. unter verschiedenen Winkeln eines Polarisationswürfels) bestimmt wird, gilt die resultierende zweidimensionale Funktion G (t, α) (mit ihren Argumenten Verzögerungszeit und Winkel) nicht als gemeinsame statistische Funktion, während die Wahrscheinlichkeit p (n&sub1;, n&sub2;), n&sub1; Photonen mit Detektor 1 und n&sub2; Photonen mit Detektor 2 zu zählen, ein typisches Beispiel für eine gemeinsame statistische Funktion ist. Weitere Beispiele für zweidimensionale gemeinsame statistische Zwischenfunktionen sind die folgenden: Anzahl der Ereignisse als Funktion der Anzahl der Zählereignisse und der Zeitverzögerung gegenüber einer zufälligen Zählung; zweidimensionales Fourier-Spektrum der Photonennachweisfunktion durch zwei Photonendetektoren; zweidimensionale Momente der zweidimensionalen gemeinsamen Verteilung der Anzahl der Photonenzählereignisse; Wahrscheinlichkeit als Funktion der Anzahl der Photonenzählereignisse in einem Zählzeitintervall und (als Funktion) der Breite des Zählzeitintervalls p (n, T). Die Korrelationsfunktion und die Verteilungsfunktion können als Ausgangspunkte für mehrere verschiedene Arten von mehrdimensionalen gemeinsamen statistischen Funktionen angesehen werden, wobei mathematische Transformationen für ihre große Vielfalt verantwortlich sind.
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung für die Charakterisierung von Proben kann durch das folgende, nicht einschränkende Beispiel veranschaulicht werden: Angenommen, eine Lösung enthält relativ kleine markierte Ligandenmoleküle und Kügelchen (Beads), die zwei Rezeptoren tragen, dann muss man zwischen drei fluoreszenten Spezies unterscheiden: freies Ligandenmolekül (L), ein Ligandenmolekül, das an ein Kügelchen gebunden ist (BL), und zwei Ligandenmoleküle, die an ein Kügelchen gebunden sind (BLL). Es wird angenommen, dass bei der Bindung keine Löschung der Fluoreszenz erfolgt.
FCS würde bestenfalls zwei Terme voneinander trennen: den ersten mit der Diffusionszeit von L und den zweiten mit der Diffusionszeit sowohl von BL als auch von BLL, die praktisch gleich sind, da das Kügelchen ein viel größeres Molekulargewicht hat als der Ligand. Das Ergebnis von FIDA wären zwei Werte der spezifischen Helligkeit, wobei diejenige von BLL zweimal so groß ist wie die von BL oder L. Die Schlussfolgerung aus diesen Analysen könnte sein, dass die Probe zwei Spezies enthält, und im Falle eines Verhältnisses der Amplituden von etwa 1 : 1 könnte man nicht entscheiden, welcher Wert der Diffusionszeit welchem Wert der spezifischen Helligkeit entspricht.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedoch angewendet werden, um zwischen allen drei Spezies zu unterscheiden, da sie sich untereinander in wenigstens einer der beiden spezifischen Analyseeigenschaften unterscheiden.
Gemäß der Erfindung wird eine neue Qualität der Charakterisierung von Proben möglich, die Einheiten enthalten, welche Strahlung emittieren, streuen und/oder reflektieren. Im ersten Schritt werden Intensitätsfluktuationen der Strahlung, die von Einheiten in wenigstens einem Messvolumen emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, mit wenigstens einer Nachweiseinrichtung überwacht, die in der Lage ist, die Strahlung nachzuweisen. In einem zweiten Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung werden aus den nachgewiesenen Intensitätsfluktuationen statistische Zwischendaten ermittelt, die eine wenigstens zweidimensionale gemeinsame statistische Funktion umfassen. Es könnte bevorzugt sein, zusätzlich noch andere Daten als die gemeinsame statistische Funktion als Teil des Satzes statistischer Zwischendaten zu berücksichtigen. Insbesondere könnte es bevorzugt sein, dass die statistischen Zwischendaten zusätzlich eindimensionale statistische Funktionen umfassen. In einem dritten Schritt werden aus den statistischen Zwischendaten Informationen über eine gemeinsame Verteilung von Einheiten bestimmt.
Ein wichtiger Schritt der Verfahrens gemäß der Erfindung ist die Bestimmung eines Satzes von statistischen Zwischendaten, der wenigstens eine wenigstens zweidimensionale gemeinsame statistische Funktion umfasst, aus den gemessenen stochastischen Daten der Fluktuationen der Strahlungsintensität. Welcher Satz von Zwischendaten bestimmt werden soll, hängt von den interessierenden spezifischen physikalischen Eigenschaften ab. Wenn der Diffusionskoeffizient und die spezifische Helligkeit als die beiden spezifischen Eigenschaften gewählt werden, um zwischen verschiedenen Spezies in der Probe zu unterscheiden, muss die zweidimensionale gemeinsame statistische Funktion irgendwie sowohl von der spezifischen Helligkeit der Spezies als auch von der Geschwindigkeit, mit der die Spezies in das Messvolumen gelangen und es wieder verlassen, abhängen. In diesem besonderen Fall ist p (n, k) eine geeignete Wahl, das ist die bedingte Wahrscheinlichkeit, n Photonen im k-ten Zeitintervall zu zählen, wenn im 0-ten Zeitintervall ein zufällig einfallendes Photon gezählt wurde. Es gibt auch andere Wahlmöglichkeiten, wie zum Beispiel p (n, T), das ist die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Anzahl der Zählereignisse als Funktion der Breite des Zählzeitintervalls.
Ein weiteres Beispiel ist die Charakterisierung von Proben auf der Basis der beiden spezifischen Helligkeiten, die der parallelen und der senkrechten Polarisation entsprechen. (Es sei angemerkt, dass sich verschiedene Spezies nicht nur durch die Helligkeit der Fluoreszenz, sondern auch durch die Anisotropie der Polarisation, d. h. durch das Verhältnis der beiden Helligkeiten, voneinander unterscheiden.) In diesem Fall ist es angemessen, zwei Nachweiseinrichtungen zu verwenden, eine für die parallele und die andere für die senkrechte Polarisation. Als statistischen Zwischendatensatz kann man p (n&sub1;, n&sub2;) wählen, das ist die gemeinsame Wahrscheinlichkeit, während desselben Zählintervalls n&sub1; Photonen mit der Nachweiseinrichtung für parallele Polarisation und n&sub2; Photonen mit der anderen Nachweiseinrichtung zu zählen. Aus der gemeinsamen Verteilung p (n&sub1;, n&sub2;) kann man charakteristische Polarisationsverhältnisse für zwei oder mehr fluoreszente Spezies gleichzeitig bestimmen, ohne dass man Lösungen einzelner Spezies herstellen und messen muss, was häufig schwierig oder sogar unmöglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die fluktuierende Strahlungsintensität gemessen, indem Zahlen von Photonenzählereignissen in vorzugsweise aufeinanderfolgenden Zeitintervallen gegebener Länge bestimmt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Intensitätsfluktuationen der Strahlung dadurch gemessen, dass die Zeit der Ankunft von Photonen und/oder die Länge von Zeitintervallen zwischen einer gegebenen Zahl von aufeinanderfolgenden Photonenzählereignissen bestimmt werden.
Es könnte bevorzugt sein, statistische Zwischendaten aus einer Gruppe auszuwählen, die aus unbedingten und bedingten Verteilungen der Zahl der Photonenzählereignisse, Verteilungen von Zeitintervallen zwischen aufeinanderfolgenden Photonenzählereignissen, Autokorrelationsfunktionen, Kreuzkorrelationsfunktionen und Kombinationen davon ausgewählt sind.
Wenigstens eines der Argumente der gemeinsamen statistischen Funktion könnte die Zeit sein. In einer anderen Ausführungsform ist wenigstens eines der Argumente der gemeinsamen statistischen Funktion die Zahl der Photonenzählereignissen in Zeitintervallen gegebener Länge oder die Länge von Zeitintervallen zwischen einer gegebenen Anzahl von aufeinanderfolgenden Photonenzählereignissen. Es könnte weiterhin bevorzugt sein, dass wenigstens eines der Argumente zu der Klasse von Argumenten mathematischer Transformationen von entweder Wahrscheinlichkeits- oder Korrelationsfunktionen gehört.
Es könnte bevorzugt sein, in Schritt c) (siehe Ansprüche 1, 2, 3 und S) die Anwesenheit oder Abwesenheit oder die Konzentration wenigstens einer Einheit oder Spezies von Einheiten mit einer spezifischen Kombination von wenigstens zwei physikalischen Eigenschaften zu bestimmen. Auf der Basis von wenigstens zwei physikalischen Eigenschaften könnten wenigstens zwei Spezies getrennt wahrgenommen werden.
Es könnte auch bevorzugt sein, in das Verfahren die Trennung wenigstens einer Spezies von einem Hintergrundeinfluss auf der Basis wenigstens einer physikalischen Eigenschaft aufzunehmen und/oder wenigstens eine eindimensionale Statistik abzuleiten, nachdem man eine Trennoperation auf der Basis von wenigstens einer physikalischen Eigenschaft durchgeführt hat.
In Bezug auf Schritt c) wird in einer weiteren Ausführungsform eine gemeinsame Verteilung von Einheiten als Funktion von wenigstens zwei spezifischen physikalischen Eigenschaften aus den statistischen Zwischendaten bestimmt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die statistischen Zwischendaten in Schritt b) direkt von den Intensitätsfluktuationen oder von Fluktuationen lokaler statistischer Funktionen der Intensität abgeleitet.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Einheiten Teilchen, Moleküle, Aggregate, Vesikel, Zellen, Viren, Bakterien, Zentren oder Gemische davon in Festkörpern, Flüssigkeiten oder Gasen. Es könnte bevorzugt sein, Einheiten zu Spezies zu gruppieren, die anhand wenigstens einer ihrer spezifischen physikalischen Eigenschaften voneinander unterschieden werden können. Wenigstens eine der Spezies kann lumineszent, vorzugsweise fluoreszent, und/oder lumineszenzmarkiert sein.
Es könnte bevorzugt sein, die Intensitätsfluktuationen der Fluoreszenz mit Hilfe nur einer einzigen Nachweiseinrichtung zu überwachen. Wenn man an der Charakterisierung von Spezies anhand von mehr als einer spezifischen Helligkeit interessiert ist, die zum Beispiel unterschiedlichen Polarisationen oder spektralen Empfindlichkeiten des Fluoreszenznachweises entsprechen, könnte es bevorzugt sein, mehr als eine Nachweiseinrichtung zu verwenden. Jeder Detektor, der in der Lage ist, Strahlung nachzuweisen, die von Einheiten in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, kann verwendet werden. Geeignete Nachweiseinrichtungen, wie eine Lawinenphotodiode, ein Photomultiplier (Sekundärelektronenvervielfacher) oder herkömmliche Photodioden sind dem Fachmann wohlbekannt. Es könnte auch bevorzugt sein, einen Multidetektor zu verwenden, der aus einer monolithischen Konfiguration von mehreren Detektoren besteht, insbesondere wenn man eine Gruppe von Proben parallel messen will, wie es beim miniaturisierten Hochdurchsatz-Screening der Fall ist. Es könnte weiterhin bevorzugt sein, einen zweidimensionalen Multiarraydetektor zu verwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die diese Einheiten charakterisieren, der Diffusionskoeffizient oder die Korrelationszeit der Intensitätsfluktuationen der Strahlung oder irgendeine andere Eigenschaft, die zum Ausdruck bringt, wie schnell oder langsam die Brownsche Bewegung gegebener Einheiten ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die eine Einheit charakterisieren, die spezifische Helligkeit. Mehr Einzelheiten über die Bestimmung der spezifischen Helligkeit sowie Anwendungen sind in der internationalen Patentanmeldung WO- A-98/16814 offenbart.
Weiterhin kann bevorzugt sein, dass wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die fluoreszente Einheiten charakterisieren, das Polarisationsverhältnis ihrer Fluoreszenz oder die Anisotropie der Fluoreszenz oder irgendeine andere Eigenschaft, die das Ausmaß der Polarisation der Fluoreszenz zum Ausdruck bringt, ist. Zum Beispiel wird eine Lösung von zwei fluoreszenten Spezies nicht nur durch das Polarisationsverhältnis der Fluoreszenz der gesamten Probe beschrieben, sondern auch durch zwei spezifische Polarisationsverhältnisse, die die beiden Spezies charakterisieren. Gewöhnlich werden diese letzten beiden Eigenschaften bestimmt, indem man die Fluoreszenz reiner Lösungen gegebener Spezies untersucht. Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Eigenschaften auch durch Überwachen der Fluktuationen der Fluoreszenzintensität des Gemischs der Spezies bestimmt werden.
In einer Ausführungsform ist wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die fluoreszenten Einheiten charakterisieren, das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten, die verschiedenen Anregungswellenlängen und/oder verschiedenen spektralen Empfindlichkeiten des Fluoreszenznachweises oder irgendeiner anderen Eigenschaft, die die Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Anregungs- und/oder Nachweiswellenlänge zum Ausdruck bringt, entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die fluoreszenten Einheiten charakterisieren, die Lebensdauer der Fluoreszenz.
Die spezifischen physikalischen Eigenschaften, insbesondere die Lumineszenzeigenschaften, wie Fluoreszenzlebensdauer oder Anisotropie der Fluoreszenz, der Einheiten können variiert werden, indem man sie über verschiedene Linkermoleküle mit einem spezifischen Luminophor konjugiert. Es kann bevorzugt sein, polymere Linkermoleküle zu verwenden, die aus einer variablen Anzahl von gleichen oder verschiedenen Monomeren bestehen.
Die Lumineszenzeigenschaften der Einheiten können auch variiert werden, indem man sie mit einem ersten Molekül, wie z. B. Biotin, konjugiert, das ein lumineszenzmarkiertes zweites Molekül, wie z. B. lumineszenzmarkiertes Avidin oder Streptavidin, bindet.
Die Lumineszenzeigenschaften einer Einheit können also durch Energieübertragung geändert werden. Von einer Donoreinheit absorbierte Energie wird bei nahem Kontakt zum Luminophor einer Akzeptoreinheit übertragen und anschließend emittiert.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist für Hochdurchsatz- Screening, diagnostische Zwecke, Überwachung von Polymerisations-, Aggregations- oder Abbauvorgängen, Teilchensortierung, Nucleinsäuresequenzierung oder für allgemeine analytische Zwecke, wie Umweltanalytik oder Verfahrenssteuerung, besonders gut geeignet.
Bei Screening-Verfahren können Substanzen, die möglicherweise pharmakologisch aktiv sind, durch ihre Wechselwirkung mit spezifischen Rezeptoren analysiert werden, indem man diese Wechselwirkung unter Bindung eines lumineszenzmarkierten Liganden an Rezeptoren untersucht, wobei natürliche Rezeptoren auf ihren Trägerzellen sowie Rezeptoren auf Rezeptor-überexprimierenden Trägerzellen oder Rezeptoren auf Vesikeln oder Rezeptoren in Form von exprimierten Molekülen oder Molekülkomplexen verwendet werden können. Überdies kann die Wechselwirkung von Substanzen mit Enzymen in Lösung oder in ihrer natürlichen zellulären Umgebung nachgewiesen werden, indem man eine Änderung des Substrats des Enzyms überwacht, z. B. eine Änderung der Größe, Helligkeit, Rotationsdiffusion oder irgendeiner anderen der oben genannten Fluoreszenzeigenschaften. Ein weiteres Mittel zur Bestimmung der Enzymaktivität ist das Hinzufügen eines fluoreszenzmarkierten Moleküls, das entweder an das Edukt oder an das Produkt der enzymatischen Reaktion bindet. Ein weiteres Verfahren zur Untersuchung der pharmakologischen Wirkung von Substanzen ist die Messung von Reportersystemen, wie die Expression von grünem fluoreszierendem Protein (GFP), und der Eigenschaften von Molekülen, an die GFP gebunden ist. Weitere Anwendungen, insbesondere bezüglich der Durchführung von Assays, sind in WO-A-94/16313 offenbart.
Zum Nachweis spezifischer Erkennungsreaktionen können potentielle aktive Substanzen in komplexen natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Gemischen vorhanden sein, die vor der Analyse einer Trennung unterzogen werden. Diese Gemische können z. B. zuerst durch Chromatographie getrennt werden, um die einzelnen Fraktionen auf die Gegenwart von funktionellen Verbindungen zu testen, vorzugsweise mitlaufend in einer Kapillare am Ende einer Trennmatrix. Die Kopplung von Fraktionierungsverfahren mit FCS-Nachweis ist ausführlich in WO-A-94/16313 beschrieben.
In Bezug auf die Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen Antigenen und Antikörpern wird das Antigen häufig in einer rohen biologischen Matrix präsentiert, die eine Quelle für hohe Hintergrundsignale, wie Autofluoreszenz, sein kann oder das "reine" Signal in anderer Weise verzerren kann, z. B. durch Absorption von Fluoreszenzphotonen oder unspezifische Bindung der markierten Sonde an andere Teilchen der Probe. Indem man die Antigen-Antikörper- Komplexe zum Beispiel über die Größe des Molekülkomplexes und seine Helligkeit identifiziert, können sie von dem durch Artefakte verursachten Signal getrennt werden.
Eine weitere Aufgabe in der Diagnostik besteht darin, Nucleinsäurestränge durch ein markiertes Sondenmolekül, wie ein spezifisches Oligomer, zu identifizieren. Durch Verwendung eines Primer-"Cocktails", das z. B. aus Primern bestehen kann, die mit Farbstoffen unterschiedlicher Helligkeit markiert sind, kann eine Zielnucleinsäure anhand der Diffusionszeit und der Zahl der daran gebundenen Primer identifiziert werden. Ein Verfahren zur direkten Identifizierung weniger Nucleinsäurestränge mit einem Primercocktail, das vorzugsweise aus einem Gemisch verschiedener kurzer Primer besteht, jeder mit einer sogenannten Antisensesequenz, die zu einem Abschnitt des Zielmoleküls komplementär ist, und mit einem oder mehreren Farbstoffmolekülen markiert, ist in DE-A-195 08 366 offenbart.
Häufig sind Aggregation und Abbau zu überwachende Phänomene. Aggregate haben Helligkeiten und Diffusionszeiten, die von denen der Monomere verschieden sind. Bei der Bestimmung beider Eigenschaften werden die Messungen genauer und weisen keine Verfälschung aufgrund von unterschiedlichen Molekülhelligkeiten auf, wie es bei FCS allein der Fall wäre.
Bei der Sequenzierung nach dem Verfahren von Sanger werden Oligomere verschiedener Länge identifiziert, deren terminale Nucleinsäure mit einem Farbstoff markiert ist. Fortgeschrittene Techniken, wie z. B. die in DE-A-38 07 975 beschriebene, verwenden Farbstoffe, die je nach der Art von Base, an die sie gebunden sind, unterschiedliche Eigenschaften, wie Fluoreszenzlebensdauer, aufweisen. Die Bestimmung einer Base ist viel sicherer, wenn mehrere Eigenschaften, wie Fluoreszenzlebensdauer und Helligkeit oder irgendeine andere spezifische physikalische Eigenschaft, gemäß der Erfindung bestimmt und auf Konsistenz gegengecheckt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die zu sequenzierende Probe durch Gel- oder Kapillarelektrophorese aufgetrennt, oder ein Trennschritt wird durch Kapillarelektrochromatographie, elektrohydrodynamische Migration oder verwandte elektrokinetische Verfahren durchgeführt.
Bei der Teilchensortierung, insbesondere bei der Zell- oder Kügelchensortierung, besteht die Aufgabe darin, Zellen oder Kügelchen gemäß ihren biologischen oder chemischen Eigenschaften zu trennen, die anhand ihrer Fluoreszenzeigenschaften überwacht werden können. Im Stand der Technik wird nur die Fluoreszenzintensität oder die Intensität des gestreuten Lichts in einem Messvolumen, das viel größer als die Größe der Zelle oder von vergleichbarer Größe wie das Kügelchen ist, überwacht. Daher können Zellen oder Kügelchen, die nur zum Teil einen Liganden binden, der in der umgebenden Lösung auch ungebunden vorhanden ist, im Stand der Technik nicht überwacht werden. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem auch für relativ große Messvolumina durch Bestimmung der Fluoreszenz und/oder von Molekülparametern, die sich von der bloßen Intensität unterscheiden, und ermöglicht so die Trennung von beiden Beiträgen, dem vom gebundenen und dem vom ungebundenen Liganden.
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung für die Charakterisierung von Proben kann weiterhin durch das folgende, nicht einschränkende Beispiel veranschaulicht werden: Angenommen, eine Lösung enthält relativ kleine lumineszente Ligandenmoleküle, die leicht Aggregate bilden, sowie Kügelchen mit mehrfachen Bindungsstellen für diese lumineszenten Ligandenmoleküle. Dann könnte man zwischen Aggregaten mit einer bestimmten Anzahl von lumineszenten Ligandenmolekülen (A) und Kügelchen, an die dieselbe Zahl von lumineszenten Ligandenmolekülen gebunden ist (B), unterscheiden wollen. Die zweidimensionale Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Unterscheidung zwischen Spezies A, die eine schnell diffundierende Komponente mit einer spezifischen Helligkeit ist, und Spezies B, die eine langsamer diffundierende Komponente mit derselben spezifischen Helligkeit wie A ist.
In einer Ausführungsform werden die statistischen Zwischendaten unter Verwendung von a-priori-Informationen über die Probe angepasst. In einer weiteren Ausführungsform werden die statistischen Zwischendaten unter Anwendung einer mehrdimensionalen inversen Transformation mit linearer Regularisierung (ITR) oder einer inversen Transformation mit Nebenbedingungen (ITC) oder einer inversen Transformation mit Regularisierung und Nebenbedingungen (ITRC) verarbeitet. Inverse Transformation kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche Zusammensetzung der Probe die theoretischen Werte des Satzes von statistischen Zwischendaten ergeben würde, der am nächsten bei den experimentellen Daten liegt. Wegen statistischer Fehler und begrenzter Größen gemessener Daten ist die inverse Transformation häufig ein schlecht gestelltes mathematisches Problem, das im Ergebnis durch heftige Oszillationen charakterisiert ist. ITR, ITC und ITRC stabilisieren das mathematische Problem, indem sie nach einer "regulären" (z. B. einer glatten) oder durch Nebenbedingungen eingeschränkten Lösung suchen, indem sie zum Beispiel die Summe der quadrierten Abweichungen von statistischen Daten und einer Funktion der Lösung selbst minimieren, wobei "irreguläre", gewöhnlich nicht reproduzierbare Strukturen im Ergebnis oder Werte ohne physikalische Bedeutung unterdrückt werden. Ein Beispiel für eine Nebenbedingung ist der Ausschluss von negativen Werten für Konzentrationen. (Wegen des Verfahrens der ITR, siehe z. B. W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, B. P. Flannery, Numerical recipes in C: the art of scientific computing, second edition, Cambridge University Press, 1992, S. 808).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Messvolumen nur ein Teil des Gesamtvolumens der Probe, und die Einheiten diffundieren und/oder werden aktiv in das Messvolumen hinein und heraus transportiert, und/oder die Probe wird aktiv transportiert und/oder optisch abgetastet. Wenn die Einheiten, z. B. fluoreszente Teilchen, ausreichend klein sind, ist die Diffusion für die Datenerfassung aus einer großen Zahl von Zählintervallen schnell genug. Wenn die charakteristische Diffusionszeit jedoch wesentlich länger ist als das Zeitintervall zur Messung der Fluoreszenzintensität, kann ein aktiver Transport (Strom oder Abtastung) in beträchtlichem Maße Zeit bei der Datenerfassung sparen.
Bei Fluoreszenzuntersuchungen kann es vorteilhaft sein, Messungen vorzunehmen, um die Hintergrundzählrate, die sich aus der Raman-Streuung im gelösten Material und der Dunkelzählrate des Detektors ergibt, gegenüber der Zählrate pro Einheit zu reduzieren. Insbesondere ist es in manchen Fällen bevorzugt, Messvolumina von unter 10&supmin;¹² I, besonders bevorzugt unter 10&supmin;¹&sup4; I, zu verwenden.
Die Messvolumina können vorzugsweise auf zweidimensionalen Trägern, wie Membranen oder Platten mit Näpfen, angeordnet sein. Geeignete Trägersysteme sind in WO-A-94/16313 sowie in der Deutschen Patentanmeldung DE-A- 196 53 766.5 beschrieben. Letztere offenbart eine polymere Scheibe mit mehreren Näpfen. Insbesondere hat diese Scheibe die Abmessungen bekannter Compaktdisks (CD) oder Mini-CDs.
Vorteilhafterweise können das hohe Verhältnis von Signal zu Hintergrundzählrate und das kleine optische Messvolumen erreicht werden, indem man wenigstens ein Mikroskopobjektiv, vorzugsweise mit einer numerischen Apertur von 0,9, in konfokaler Weise sowohl zum Fokussieren eines einfallenden Laserstrahls als auch zum Auffangen der Strahlung, die von Einheiten in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, verwendet. Eine geeignete Vorrichtung ist in WO-A-94/16313 offenbart.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Messvolumen durch die Verwendung von Elementen der optischen Nahfeldmikroskopie eingeschränkt. Optische Nahfeldmikroskopie bedeutet hier, dass das Licht durch eine Öffnung tritt, bei der wenigstens eine der Abmessungen kleiner ist als die Wellenlänge des verwendeten Lichts und die sich in direktem Kontakt mit dem Messvolumen befindet. Die Öffnung kann aus einer undurchsichtigen Schicht mit wenigstens einem Loch mit dem genannten Durchmesser oder wenigstens einem Schlitz geeigneter Breite und/oder aus einer sich verjüngenden Glasfaser oder einem Wellenleiter mit einem Durchmesser der Spitze mit der genannten Weite, gegebenenfalls außen mit einer undurchsichtigen Schicht beschichtet, bestehen. Die optische Nahfeldmikroskopie kann verwendet werden, um das Anregungslicht für die Einheiten zu fokussieren und/oder um das von den Einheiten emittierte Licht zu sammeln. Eine geeignete Vorrichtung ist in WO-A-96/13744 offenbart.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform kombiniert die optische Nahfeldmikroskopie für den Anregungslichtweg mit herkömmlicher optischer Mikroskopie für den Emissionslichtweg oder umgekehrt. Die vorliegende Erfindung profitiert von einer solchen Realisierung in dem Sinne, dass die Größe des Messvolumens im Vergleich zur herkömmlichen konfokalen Mikroskopie reduziert ist. Die vorliegende Erfindung kann also verwendet werden, um eine höhere Konzentration an Teilchen zu messen als bei anderen optischen Konfigurationen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird Mehrfachphotonenanregung verwendet, um eine Einheit anzuregen. Mehrfachphotonenanregung bedeutet, dass die Summe, Differenz oder irgendeine andere Kombination von Wellenfrequenzen von zwei, drei oder mehr Photonen für die Anregung z. B. von Lumineszenz verwendet wird. Ein solches Anregungsschema hat den Vorteil, dass die Anregungswahrscheinlichkeit nicht linear von der Anregungsintensität abhängt, sondern von der zweiten oder einer höheren Potenz. Die Mehrfachphotonenanregung ist also meistens auf das Volumen des Laserbrennpunkts beschränkt, während außerhalb des Laserbrennpunkts keine Störanregung erzeugt wird. Die vorliegende Erfindung profitiert von einem solchen Anregungsschema in dem Sinne, dass im Vergleich zur Einzelphotonenanregung weniger Hintergrund erzeugt wird und dass keine Lochblende notwendig ist, um das Messvolumen einzuschränken. Geeignete Laserquellen für Picosekunden- oder Subpicosekundenpulse sind dem Fachmann wohlbekannt.
Die Natur und die Vorteile der Erfindung werden auf der Grundlage der folgenden Figuren leichter verständlich.
Fig. 1. Veranschaulichung der Fähigkeit von FCS zur Analyse von Gemischen. Die Korrelationsfunktion G(t), die für ein Gemisch von zwei Spezies mit einem um den Faktor zwei unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten berechnet wird, ist von dem für eine einzige Spezies berechneten G(t) geringfügig verschieden. Wenn die Korrelationsfunktion für ein Gemisch mit ausreichender Präzision gemessen wird, ergibt die Analyse Amplituden und Diffusionszeiten der Terme, die beiden Spezies entsprechen.
Fig. 2. Veranschaulichung der Fähigkeit von FIDA zur Analyse von Gemischen. Die Verteilungsfunktion der Anzahl der Photonenzählereignisse p(n), die für ein Gemisch von zwei Spezies mit einer um den Faktor zwei unterschiedlichen spezifischen Helligkeit berechnet wird, ist von dem für eine einzige Spezies berechneten p(n) offensichtlich verschieden. Die Werte der Konzentrationen und der spezifischen Helligkeiten werden so gewählt, dass man für beide Fälle den gleichen Mittelwert und die gleiche Varianz der Anzahl der Zählereignisse erhält. Wenn die Verteilungsfunktion p(n), die dem Gemisch entspricht, genau gemessen wird, ergibt die Analyse Konzentrationen (Anzahl der Teilchen pro Messvolumen) und spezifische Helligkeiten (Anzahl der Photonenzählereignisse pro Teilchen) von beiden Spezies.
Fig. 3. Veranschaulichung der Fähigkeit der vorliegenden Erfindung zur Analyse von Gemischen. Ein Satz von statistischen Zwischendaten, p(n, k), ist für zwei Fälle theoretisch berechnet, die identische Korrelationsfunktionen G(t) und Verteilungsfunktionen der Anzahl der Photonenzählereignisse p(n) ergeben, aber im ersten Fall diffundieren dunklere Teilchen zweimal so schnell wie hellere, während im zweiten Fall die dunkleren Teilchen langsamer sind. Die berechneten Kurven p(n, k) für diese beiden Fälle unterscheiden sich voneinander, was bedeutet, dass die vorliegende Erfindung zwischen den Fällen unterscheiden kann, die sowohl für FCS als auch für FIDA ununterscheidbar sind.
Fig. 4. Veranschaulichung der Fähigkeit der vorliegenden Erfindung zur Analyse von Gemischen von zwei Spezies. Ein Satz von statistischen Zwischendaten, p(n&sub1;, n&sub2;), ist für zwei Fälle theoretisch berechnet. Beide Fälle entsprechen Gemischen von zwei fluoreszenten Spezies. Im ersten Fall ist die Fluoreszenz einer Spezies polarisiert: die mittlere Anzahl der Zählereignisse pro Teilchen beträgt 4,0 für den ersten und 2,0 für den zweiten Detektor. Die Fluoreszenz der zweiten Spezies ist unpolarisiert: die mittlere Anzahl der Zählereignisse pro Teilchen beträgt für beide Detektoren 3,0. Im zweiten Fall ist die Fluoreszenz beider Spezies mäßig polarisiert: die mittlere Anzahl der Zählereignisse pro Teilchen beträgt 4,0 bzw. 3,0 für Spezies 1, aber 3,0 bzw. 2,0 für Spezies 2. Diese beiden Fälle würden identische Verteilungsfunktionen der Anzahl der Photonenzählereignisse p(n&sub1;) und p(n&sub2;) ergeben. Die zweidimensionale Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von p(n&sub1;, n&sub2;) kann jedoch Fall 1 von Fall 2 unterscheiden.
Fig. 5. Verteilungen p(n) und p(n, k), gemessen für eine 0,5 nM Lösung von Tetramethylrhodamin in Wasser. Die Breite des Messzeitfensters beträgt 40 us, und die Datensammelzeit beträgt 60 s.
Fig. 6. Verteilungen p(n&sub1;, n&sub2;), gemessen für wässrige Lösungen von 1,1 nM Tetramethylrhodamin (Fig. 6a), 1,9 nM Rhodamin Red-X (Fig. 6b) und 1,1 nM Rhodamin Red-X (Fig. 6c).
Fig. 7. Verteilungen c(q&sub0;, q&sub1;), bestimmt aus den experimentellen Daten, die in Fig. 6 aufgezeichnet sind. Die Verteilungen (a) und (b), die einzelnen Spezies entsprechen, haben tatsächlich einen einzelnen Peak, während die Verteilung (c) zwei Peaks hat, die zwei Arten von Molekülen entsprechen.
Fig. 8. Einzelspeziesauflösung auf der Basis einer mehrkomponentigen Analyse eines Global-Fit-Algorithmus für die Wechselwirkung von Theophyllin-TAMRA (Fig. 8a) und Theophyllin-Spacer-TAMRA (Fig. 8b) mit einem polyklonalen Anti-Theophyllin-Antikörper. Die Daten wurden gemäß einem Modell angepasst, das zwei identische und unabhängige Bindungsstellen beschreibt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel stellt eine zweidimensionale Kombination von FIDA und FCS dar.
Die Ausrüstung besteht aus einem konfokalen Mikroskop (ConfoCor®, Carl Zeiss Jena) mit einem Wasserimmersionsobjektiv (60x, n.A. 1, 2), einer Lochblende in der Bildebene, einem He-Ne-Laser mit einer 543-nm-Emissionslinie, einer Lawinenphotodiode (SPCM-AQ-131, EG&G Optoelectronics, Kanada) als Photonendetektor und einem Computer mit einer geeigneten Datenerfassungskarte. Der Strahl wurde im Brennpunkt auf etwa 200 uW gedämpft. Die Emission von Proben wurde mit einem Bandpassfilter mit einer zentralen Wellenlänge von 580 nm optisch gefiltert. Eine Sequenz der Anzahl der Photonenzählereignisse in aufeinanderfolgenden Zeitintervallen von gegebener Länge (20 oder 40 us) wurde als Rohdaten gesammelt.
Aus der Sequenz der Anzahl der Zählereignisse, die als n (i = 1, ..., N) bezeichnet wird, wurde die gemeinsame statistische Zwischenfunktion gemäß der folgenden Formel bestimmt:
wobei k die Verzögerungszeit, dividiert durch die Breite des Zählzeitintervalls, bezeichnet. Die aus Experimenten bestimmten Zwischendaten wurden weiterverarbeitet, um die beste Anpassung an ein theoretisches Modell zu erreichen. Das theoretische Modell kombiniert Theorien von FIDA und FCS miteinander. Als Ergebnis der Kurvenanpassung erhält man geschätzte Werte von Konzentrationen, Helligkeiten und Korrelationszeiten von so vielen Spezies, wie man annimmt, dass vorhanden sind.
Fünf Experimente wurden mit einer 0,5 nM Lösung von Tetramethylrhodamin (TMR, Molecular Probes) in PBS-Puffer durchgeführt, wobei man dasselbe Messzeitintervall T = 20 us verwendete. Die Dauer jedes Experiments betrug 40 s. Außerdem wurden fünf weitere Experimente mit T = 40 us unter Verwendung einer 0,2 nM Lösung von TMR durchgeführt. Der dritte Satz von Dateien wurde halbartifiziell erzeugt, wobei man Paare der bei T = 20 us und T = 40 us erhaltenen Anzahlen der Photonenzählereignisse summierte, um ein Gemisch von "dunkleren", aber "schnelleren" Teilchen mit zweimal so "hellen", aber zweimal so "langsamen" Teilchen zu simulieren. Das Gemisch der fluoreszenten Spezies mit der um den Faktor zwei unterschiedlichen Diffusionszeit liegt an der Auflösungsgrenze von FCS, während eine um den Faktor zwei unterschiedliche spezifische Helligkeit an der Auflösungsgrenze von FIDA liegt. Die experimentell erhaltenen Daten wurden unter der Annahme von einzelnen Spezies analysiert. Die halbartifiziellen Daten wurden unter der Annahme von zwei Spezies analysiert. Die Ergebnisse der Analyse sind unten in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht das Prinzip der zweidimensionalen Fluoreszenz- Intensitätsverteilungsanalyse (2D-FIDA).
Die Ausrüstung ist mit der von Beispiel 1 fast identisch, außer dass die Fluoreszenz aus dem Messvolumen mit Hilfe von zwei Photonendetektoren überwacht wird. In diesem Beispiel unterscheiden sich die beiden Detektoren durch die Transmissionsspektren der optischen Filter: ein Filter lässt Licht im Bereich von 555 bis 590 nm durch, während der Transmissionsbereich des anderen Filters 580 bis 630 nm beträgt. Die beiden spezifischen physikalischen Eigenschaften, die verschiedene fluoreszente Spezies charakterisieren, sind Zählraten pro Moleküle einer gegebenen Spezies, die den beiden Nachweiskanälen entsprechen. Die in diesem Beispiel bestimmte zweidimensionale gemeinsame statistische Funktion ist die (relative) Anzahl von Ereignissen als Funktion der Anzahl der Zählereignisse in Detektor 1 bzw. 2, P(n&sub1;, n&sub2;). Fig. 6a zeigt die experimentelle gemeinsame Verteilung P(n&sub1;, n&sub2;) einer 1,1 nM Lösung von Tetramethylrhodamin (TMR, Molecular Probes). Die Analyse unter Verwendung von inverser Transformation mit Regularisierung und Nebenbedingungen (ITRC) ergibt eine Verteilung der spezifischen Helligkeiten mit einem einzigen Peak, wie sie in Fig. 7a graphisch dargestellt ist. Ähnliche Ergebnisse erhält man mit der Lösung eines anderen Farbstoffs, Rhodamin Red-X (RRX, Molecular Probes), siehe Fig. 6b und 7b. Die beiden Proben unterscheiden sich durch Werte der beiden spezifischen Eigenschaften: TMR ist durch Werte von 51 und 71,5 kHz/Molekül charakterisiert, während RRX Werte für dieselben Eigenschaften von 15,6 und 48 hat. Die dritte Probe ist ein Gemisch von TMR- und RRX-Lösungen, siehe Fig. 6c und 7c. Wie man feststellen kann, lassen sich in der Analyse zwei Peaks unterscheiden, von denen einer TMR und der andere RRX entspricht. Diese Art von Analyse kann für die Bestimmung von Konzentrationen fluoreszenter Spezies verwendet werden.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird ein Fall vorgestellt, bei dem nur die zweidimensionale Fluoreszenz-Intensitätsverteilungsanalyse (2D-FIDA) sinnvolle Ergebnisse liefert, während dies bei 1D-FIDA nicht der Fall ist. Die Bindung von zwei TMRmarkierten Theophyllinen (Theophyllin-TAMRA und Theophyllin-Spacer-TAMRA (EVOTEC BioSystems GmbH, Deutschland)) mit einem polyklonalen Anti- Theophyllin-Antikörper (Europa Bioproducts, Niederlande) wurde bei verschiedenen Antikörperkonzentrationen untersucht. Alle Bindungsstudien wurden unter Verwendung der folgenden Vorschrift durchgeführt:
Die Vorratslösungen von Antikörper und Antigenen werden in Assaypuffer (PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung + 0,05% Tween 20) verdünnt. Nach dem Mischen der Verbindungen wurde das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Lösung unter Verwendung eines 1D- und eines 2D-FIDA-Ansatzes gemessen. Antikörper-Verdünnungsreihen wurden bei einer Ligandenkonzentration von 2 nM hergestellt. Alle willkürlichen Antikörperkonzentrationen beziehen sich auf effektive Verdünnungen. In FIDA-Studien wurde die Lösung auf Einzelmolekülbedingungen (0,5 bis 1 Teilchen) verdünnt und nach dem Verdünnen schnell analysiert. Das System wurde unter Verwendung eines 4-mW-He/Ne-Lasers (Uniphase, Großbritannien) bei 543 nm angeregt. Lösungen von freiem TAMRA-Farbstoff und von freien Ligandenkonjugaten wurden zur Ausrichtung des Instruments verwendet. Alle Messungen wurden bezüglich des Wasserhintergrunds korrigiert, von dem sich zeigte, dass er in jedem Kanal unter 1 kHz lag.
Als Referenz dienende scheinbare Bindungskonstanten (Kd) für Antikörpertitrationsreihen wurden durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auf der Basis einer einfachen Annäherung für eine einzige Bindungsstelle bestimmt. In 1D-FIDA-Studien erschienen zwei Ligandenmoleküle, die an ein einziges Antikörpermolekül gebunden waren, als Komponente mit einer fast doppelt so großen charakteristischen Fluoreszenzhelligkeit wie das freie Antigen oder Antikörpermoleküle mit einem einzigen gebundenen Liganden. Die Helligkeiten des Liganden und der einfach gebundenen Spezies sind ähnlich, so dass 1D-FIDA nicht verwendet werden kann, um Bindungskonstanten für die zweistufige Bindung zu bestimmen.
In 2D-FIDA-Experimenten wurden durch Anwendung eines FIT-Modus-Verfahrens einzelne Spezies getrennt, Signale klassifiziert, und Kd-Werte wurden mit FCS-Bindungsdaten verglichen, wobei ein Modell verwendet wurde, bei dem man das Vorliegen von zwei identischen, aber unabhängigen Bindungsstellen annimmt:
wobei L der Ligand ist und R der Antikörper mit zwei Bindungsstellen ist. Es gelten die folgenden Massenbeziehungen:
[L] = [L&sub0;] - [RL] - 2[RL&sub2;]
[R] = [R&sub0;] - [RL] - [RL&sub2;]
Das Modell wurde unter Verwendung der Softwarepakete MathCadTM (MathSoft, US) und ScientistTM (MicroMath, US) simuliert und angepasst. 2D-FIDA konnte zwischen (wenigstens) drei Spezies mit unterschiedlichen Helligkeiten und ihren aus einer Global-Fit-Analyse bestimmten Konzentrationen unterscheiden. Unter Verwendung von 2D-FIDA kann das Auftreten von Zwischenstufen sehr leicht gezeigt werden, wie durch Untersuchung der Konzentration des doppelt gebundenen Liganden bei verschiedenen Antikörperkonzentrationen veranschaulicht wird (Fig. 8a, b).
Die experimentellen Daten sind in guter Übereinstimmung mit Simulationen gemäß dem Modell, bei dem zwei identische und unabhängige Bindungsstellen angenommen werden. Die Anpassung der Datensätze führt zu Bindungskonstanten, die mit helligkeitskorrigierten FCS-Daten für die verschiedenen verwendeten Antigene im Einklang stehen. Tabelle 1

Claims

1. Verfahren zur Charakterisierung von Proben, die fluoreszente Moleküle oder Teilchen enthalten, umfassend die folgenden Schritte:

a) Überwachen von Intensitätsfluktuationen von Strahlung, die von den Molekülen oder Teilchen emittiert wird, in wenigstens einem Messvolumen durch Nachweis von Sequenzen von Photonenzählereignissen durch zwei oder mehr Photonendetektoren;

b) Bestimmen statistischer Zwischendaten, die eine Wahrscheinlichkeitsfunktion von wenigstens zwei Argumenten umfassen, aus den Sequenzen von Photonenzählereignissen, wobei wenigstens eines der Argumente eine Anzahl von Photonenzählereignissen n1 ist, die von Detektor 1 gezählt wurden, und ein anderes Argument eine Anzahl von Photonenzählereignissen n2 ist, die von Detektor 2 gezählt würden;

c) Bestimmen einer Verteilung von Molekülen oder Teilchen als Funktion von wenigstens zwei spezifischen physikalischen Eigenschaften aus den statistischen Zwischendaten.

2. Verfahren zur Charakterisierung von Proben, die fluoreszente Moleküle oder Teilchen enthalten, umfassend die folgenden Schritte:

a) Überwachen von Intensitätsfluktuationen von Strahlung, die von den Molekülen oder Teilchen emittiert wird, in wenigstens einem Messvolumen durch Nachweis von Sequenzen von Photonenzählereignissen durch einen, zwei oder mehr Photonendetektoren;

b) Bestimmen statistischer Zwischendaten, die eine Wahrscheinlichkeitsfunktion von wenigstens zwei Argumenten umfassen, aus den Sequenzen von Photonenzählereignissen, wobei wenigstens eines der Argumente eine Anzahl von Photonenzählereignissen ist und ein anderes eine Breite eines Zählzeitintervalls ist;

3. Verfahren zur Charakterisierung von Proben, die fluoreszente Moleküle oder Teilchen enthalten, umfassend die folgenden Schritte:

b) Bestimmen statistischer Zwischendaten, die eine Wahrscheinlichkeitsfunktion von wenigstens zwei Argumenten umfassen, aus den Sequenzen von Photonenzählereignissen, wobei wenigstens eines der Argumente eine Anzahl von Photonenzählereignissen ist und ein anderes eine Zeitverzögerung gegenüber einem zugehörigen Zählereignis ist;

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Wahrscheinlichkeitsfunktion die Wahrscheinlichkeit ausdrückt, n Photonen im k-ten Zeitintervall zu zählen, wenn im 0-ten Zeitintervall zufällig ein Photon gezählt wurde, und k die Zeitverzögerung dividiert durch die Breite des Zählintervalls bezeichnet.

5. Verfahren zur Charakterisierung von Proben, die fluoreszente Moleküle oder Teilchen enthalten, umfassend die folgenden Schritte:

b) Bestimmen statistischer Zwischendaten, die eine Wahrscheinlichkeitsfunktion von wenigstens zwei Argumenten umfassen, aus den Sequenzen von Photonenzählereignissen, wobei wenigstens eines der Argumente eine Anzahl von Photonenzählereignissen ist und ein anderes eine Länge von Zeitintervallen zwischen aufeinanderfolgenden Photon-Zählereignissen ist;

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei man die Moleküle oder Teilchen nach Spezies gruppieren kann, die anhand wenigstens einer ihrer spezifischen physikalischen Eigenschaften unterschieden werden können.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 6, wobei in Schritt c) die Anwesenheit oder Abwesenheit oder die Konzentration wenigstens einer Spezies von Molekülen oder Teilchen mit einer spezifischen Kombination von wenigstens zwei physikalischen Eigenschaften bestimmt wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die statistischen Zwischendaten zusätzlich statistische Funktionen eines einzigen Argumentes umfassen.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Probe Aggregate, Vesikel, Zellen, Viren, Bakterien, Kügelchen, Zentren oder Gemische davon in Feststoffen, Flüssigkeiten oder Gasen enthält.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die Moleküle oder Teilchen charakterisieren, der Diffusionskoeffizient oder die Korrelationszeit der Intensitätsfluktuationen der Strahlung oder irgendeine andere Eigenschaft, die direkt mit dem Diffusionskoeffizienten zusammenhängt, ist.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die Moleküle oder Teilchen charakterisieren, ihre Fähigkeit ist, Strahlung zu emittieren, zu streuen und/oder zu reflektieren.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die Moleküle oder Teilchen charakterisieren, die Eigenschaft der Moleküle oder Teilchen ausdrückt, polarisierte Fluoreszenz zu emittieren.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die Moleküle oder Teilchen charakterisieren, das Verhältnis von Fluoreszenzintensitäten, die verschiedenen Anregungswellenlängen und/oder verschiedenen spektralen Empfindlichkeiten des Fluoreszenznachweises entsprechen, oder irgendeine andere Eigenschaft, die die Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Anregungs- und/oder Nachweiswellenlänge ausdrückt, ist.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei wenigstens eine der spezifischen physikalischen Eigenschaften, die die Moleküle oder Teilchen charakterisieren, die Lebensdauer der Fluoreszenz ist.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die spezifischen physikalischen Eigenschaften, insbesondere Lumineszenzeigenschaften, wie Fluoreszenzlebensdauer oder Fluoreszenzanisotropie, der Moleküle oder Teilchen variiert werden, indem man sie über verschiedene Linkermoleküle mit einem spezifischen Luminophor konjugiert.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Lumineszenzeigenschaften der Moleküle oder Teilchen durch Energieübertragung geändert werden, wobei von dem Molekül oder Teilchen absorbierte Energie bei engem Kontakt mit einem Luminophor eines Akzeptormoleküls oder - teilchens übertragen und anschließend emittiert wird.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Verwendung beim Hochdurchsatz-Screening, in der Diagnostik, Überwachung von Polymerisations-, Aggregations- und Abbauvorgängen, Teilchensortierung oder Nucleinsäuresequenzierung.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die statistischen Zwischendaten unter Verwendung von a-priori-Informationen über die Probe angepasst werden.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die statistischen Daten unter Anwendung einer mehrdimensionalen inversen Transformation mit linearer Regularisierung und/oder linearen Nebenbedingungen verarbeitet werden.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Messvolumen nur ein Teil des Gesamtvolumens der Probe ist und ein Volumen von ≤ 10&supmin;¹² I, vorzugsweise ≤ 10&supmin;¹&sup4; I, hat.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei wenigstens ein Mikroskopobjektiv, vorzugsweise mit einer numerischen Apertur von ≥ 0,9, in konfokaler Weise sowohl zum Fokussieren eines einfallenden Laserstrahls als auch zum Auffangen der Strahlung, die von Molekülen oder Teilchen in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, verwendet wird.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Messvolumen durch die Verwendung von Elementen der optischen Nahfeldmikroskopie eingeschränkt ist.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei multiple Photonenanregung verwendet wird, um die Moleküle oder Teilchen anzuregen.