DE69316620T2

DE69316620T2 - Verbesserung für optische analyse

Info

Publication number: DE69316620T2
Application number: DE69316620T
Authority: DE
Inventors: Anders Hanning
Original assignee: Biacore AB
Current assignee: Biacore AB
Priority date: 1992-06-29
Filing date: 1993-06-29
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2013-06-30
Also published as: JPH07508346A; US5641640A; DE69316620D1; ATE162627T1; EP0648328B1; AU4520093A; SE9201984D0; WO1994000751A1; EP0648328A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung von Assays des Typs, bei dem das Vorhandensein des Analyten durch Bestimmung einer Änderung des Refraktionsindexes an einer festen optischen Oberfläche nachgewiesen wird, wobei diese Änderung durch den Analyten verursacht wird, der an der Bindung einer Refraktionsindex-verstärkenden Spezies an die optische Oberfläche bzw. an der Freisetzung davon beteiligt ist bzw. die Bindung oder die Freisetzung beeinflußt.
Ein Typ an Verfahren zur Bestimmung derartiger Änderungen des Refraktionsindexes an einer optischen Oberfläche beruht auf der Oberflächen-Plasmonresonanz, die im folgenden als SPR bezeichnet wird. Das pHänomen der SPR ist gut bekannt. Kurz zusammengefaßt wird SPR als ein Abfall in der Intensität reflektierten Lichtes in einem spezifischen Winkel von der Grenzfläche zwischen einem optisch transparenten Material, wie z.B. Glas, und einem dünnen Metallfilm, üblicherweise Silber oder Gold, beobachtet und hängt neben anderen Faktoren vom Refraktionsindex des Mediums (z.B. einer Probenlösung) in der Nähe der Metalloberfläche ab. Eine Änderung des Refraktionsindexes an der Metalloberfläche, z.B. durch die Adsorption oder Bindung von Material daran, wird eine entsprechende Verschiebung des Winkels, bei welchem SPR stattfindet, bewirken. Um das Licht an die Grenzfläche zu koppeln, so daß SPR auftritt, werden zwei alternative Anordnungen verwendet, entweder ein metallisiertes Beugungsgitter (Wood Effekt) oder ein metallisiertes Glasprisma oder ein Prisma in optischem Kontakt mit einem metallisierten Glassubstrat (Kretschmann Effekt). Für weitere Details in Bezug auf SPR wird Bezug auf die WO 90/05295 derselben Anmelderin genommen. In einem SPR-basierenden Immunoassay kann ein Ligand an die Metalloberfläche gebunden werden, und seine Wechselwirkung mit einem Analyten einer wässrigen Probe in Kontakt mit der Oberfläche wird aufgezeichnet.
SPR-Assays haben jedoch bestimmte fündamentale Beschränkungen, die deren technische Leistung einschränken. Ein hauptbeschränkender Faktor ist die Sensitivität oder Signalstärke. Die SPR-Antwort hängt von dem Volumen und Refraktionsindex des gebundenen Analyten ab, wobei das Volumen durch Massentransfer, Reaktionskinetik und Gleichgewichtsparameter beschränkt ist. Z.B. haben Wasser und verdünnte wässrige Puffer einen Refraktionsindex von etwa 1,33, wohingegen die meisten Proteine einen Refraktionsindex im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 1,6 haben. Da die SPR-Meßantwort der Änderung des Refraktionsindexes proportional ist, die verursacht wird, wenn z.B. Proteinmoleküle an die Oberfläche adsorbiert werden und Wasser von der Oberfläche verdrängen, begrenzt theoretisch der Refraktionsindexunterschied zwischen dem Protein und der Pufferlösung die Stärke der Antwort, die erhalten werden kann. Es wird daher davon ausgegangen, daß SPR-basierende Immunoassays für Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht oder in niedrigen Konzentrationen vorkommend, wie z.B. Haptene, aufgrund von sehr geringen Änderungen im Refraktionsindex, die verursacht werden, wenn der Analyt an die Antikörper-beschichtete Nachweisoberfläche bindet oder von ihr dissoziiert, problematisch sind.
Ein anderer limitierender Faktor ist eine nichtspezifische Bindung an die Nachweisoberfläche, ein Problem, das allen Typen direkt messender Sensoren gemein ist, d.h. dort, wo kein markiertes Reagens, wie z.B. ein Enzym oder ein Fluorophor, verwendet wird, um das nachgewiesene Signal bereitzustellen. Da SPR ein Signal für alle Materialien erzeugt, die an die Oberfläche binden, kann der Analyt nicht von nichtspezifischen Materialien unterschieden werden.
Ein weiterer limitierender Faktor ist die Variation des Refraktionsindexes mit der Temperatur. Der Temperaturunterschied zwischen dem Ablesen der Basislinie und dem Ablesen der Analytaufhahme stellt daher der minimalen Menge an Analyt, die nachgewiesen werden kann, eine theoretische Grenze. Ebenso werden andere Parameter als die Temperatur, z.B. mechanische oder chemische Störungen, die zwischen dem Zeitpunkt des Ablesens der Basislinie und dem Ablesen der Analytaufhahme variieren können, die Meßantwort natürlich beeinflussen.
Weitere Limitationen sind z.B. eine nichtideale Optik, wie auch eine nichtideale Elektronik, und andere Fluktuationen der Basislinie.
Mehr oder weniger erfolglose Ansätze, um die Sensitivitäts- oder Signalstärkeprobleme zu vermeiden, werden in EP-A-276 142 und WO 90/11525 beschrieben (erstere verwendet in spezifischer Weise den oben erwähnten Wood Effekt, und letztere verwendet in spezifischer Weise den Kretschmann Effekt). Beide Publikationen beschreiben die Konjugation eines Reagens (z.B. des Analyten oder eines Analytanalogen in einem Kompetitionsassay) mit einer Refraktionsindex-verstärkenden Spezies oder Sonde. Eine derartige Sonde kann z.B. ein Molekül oder ein Teilchen sein, das einen hohen Refraktionsindex und/oder eine große Abmessung besitzt, wie z.B. ein Schwermetallion, ein polycyclischer Aromat oder Farbstoff oder Ferritin.
Der Hauptgrund dafür, daß die oben genannten Ansätze erfolglos waren, beruht auf der Tatsache, daß es schwierig ist, bei organischen Spezies Moleküle zu finden, die einen Refraktionsindex besitzen, der höher als etwa 1,6 - 1,7 ist. Anorganische Spezies andererseits können Reftaktionsindices von etwa 2-3 haben, es kann jedoch schwierig sein, sie chemisch mit Proteinen zu kombinieren. Die von den beiden zitierten Publikationen vorgeschlagenen Möglichkeiten, in signifikanter Weise die SPR-Signale zu verstärken, sind daher ziemlich eingeschränkt, jedoch natürlich dann nicht, wenn extrem große und dadurch unpraktische Sonden verwendet werden.
Eine erfolgreichere Lösung für das Sensitivitätsproblem wird von der Internationalen Patentpublikation Nr. WO 93/04357 der gleichen Aninelderin bereitgestellt (die gesamte Offenbarung dieser Publikation wird hiermit durch Referenz aufgenommen), die ein Verfahren zum Steigern der Sensitivität von SPR und verwandten Assays, die auf der Messung von Refraktionsindexänderungen an der Meßoberfiäche beruhen und die die Tatsache verwenden, daß der Refraktionsindex in hohem Maße von der Wellenlänge abhängt, beschreibt und beansprucht. Während für die meisten Substanzen der Refraktionsindex mit steigender Wellenlänge in der sichtbaren und nahen Infrarotregion (normale Dispersion) abnimmt, variiert er in starkem Maße in der Nähe von Resonanzwellenlängen, d.h. bei Lichtabsorptionspeaks. Hier handelt es sich um ein Phänomen, das anomale Dispersion genannt wird. In diesem Bereich ist der Refraktionsindex annähernd eine Funktion der negativen Ableitung des Absorptionsvermögens (Extinktions-koeffizient) in Bezug auf die Wellenlänge. Somit erreicht bei einer leicht höheren Wellenlänge als der Resonanzwellenlänge der Refraktionsindex ein Maximum, d.h. dort, wo die negative Ableitung des Absorptionsvermögens ein Maximum hat. Gemäß der oben erwähnten Internationalen Patentanmeldung WO 93/04357 der gleichen Anmelderin wird ein beträchtlicher Anstieg der Sensitivität daher durch Anpassung der Meßwellenlänge an das Maximum der Absorptionsfähigkeit der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies, die in den speziellen Assays verwendet werden, vorzugsweise ein Farbstoff oder ein chromophores Molekül, und in noch spezifischerer Weise dadurch, daß die Meßwellenlänge im wesentlichen dem Maximum der negativen Ableitung des Absorptionsvermögens mit Bezug auf die Wellenlänge entspricht, erhalten. Dies kann entweder dadurch erreicht werden, daß die Index-verstärkende Spezies so ausgewählt wird, daß sie an die Meßwellenlänge eines speziellen Instruments oder einer speziellen Anwendung angepaßt ist, oder dadurch, daß die Meßwellenlänge so ausgewählt wird, daß sie an eine spezifische Indexverstärkende Spezies angepaßt ist.
Es kann in diesem Zusammenhang erwähnt werden, daß SPR-Untersuchungen organischer Farbstoffe im Stand der Technik vor dem Prioritätsdatum der zuvor erwähnten Internationalen Anmeldung WO 93/04357 beschrieben wurden. Z.B. berichten Pockrand et al. in J. Opt. Soc. Am. 68(8) (1978)1147 und 3. Chem. Phys. 69(9) (1978) 4001 über Untersuchungen von Langmuir-Blodgett-Filmen von N,N'-Di(methyloctadecyl)squarylium und N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin auf Silberoberflächen. Annäherungsweise haben sie geflinden, daß der maximale Refraktionsindex der chromophoren Teile des Moleküles 3-4 ist, während der minimale Relraktionsindex nahe 0 war.
Wähling et al., Z. Naturforsch., 33a (1978) 907 und Z. Naturforsch., 36a (1981) 588, untersuchten Monolayer des Farbstoffes "S-120" auf Silberoberflächen bei verschiedenen Wellenlängen.
J. van Gent et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm., (1988), 893, Sensors and Actuators, 17 (1989) 297 und Sensors and Actuators, 25-27 (1991) 449 beschreiben Untersuchungen mit SPR-Sensoren, die Oberflächen-immobilisierte Farbstoffe besitzen, wobei die letzteren ihr Absorptionsvermögens-Spektrum und dadurch ihr Refraktionsindex-Spektrum als Folge der Aufnahme des Analyten, z.B. Ammoniak, Protonen oder Metallionen, verändern.
Während die Sensitivitat in SPR-Assays durch die Erfindung, die in der Internationalen Patentanmeldung WO 93/04357 der gleichen Anmelderin beschrieben wird, beträchtlich verbessert wurde, sind die anderen oben erwähnten Probleme des SPR-Assays immer noch vorhanden.
Ziel der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Assayverfahrens, das auf der Messung einer Änderung des Refraktionsindexes an einer optischen Oberfläche beruht, insbesondere eines SPR-Assays, wobei das Verfahren, außer daß es eine beträchtlich erhöhte Sensitivität hat, auch die anderen oben erwähnten Hauptlimitationen von SPR und verwandten Verfahren überwindet.
Erfindungsgemäß wird dies, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO 93/04357 der gleichen Anmelderin durch Verwendung des anomalen Verhaltens der Re&aktionsindexvariation mit der Wellenlänge (wobei diese Variation üblicherweise Dispersion genannt wird) erreicht, d.h. daß der Reftaktionsindex ein starkes Maximum bei einer Wellenlänge zeigt, die wenig höher ist als der Absorptionspeak, und ein Minimum bei einer leicht niedrigeren Wellenlänge als der Absorptionspeak. Anstatt jedoch die Änderung des Refraktionsindexes an einer diskreten hohen Refraktionsindex-Wellenlänge zu messen, wie in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung der gleichen Anmelderin, schlägt die vorliegende Erfindung vor, die Variation der Refraktionsindexänderung mit der Wellenlänge für eine Anzahl an, d.h. wenigstens zwei, diskreten Wellenlängen oder in einem kontinuierlichen Wellenlängenbereich zu messen, wobei die Variation verursacht wird von der Variation des Refraktionsindexes mit der Wellenlänge der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies. Im allgemeinen sollte diese gemessene Variation natürlich so hoch wie möglich sein.
Durch solche Messungen der Refraktionsindexvariation bei zwei oder mehreren diskreten Wellenlängen oder in einem kontinuierlichen Wellenlängenbereich wird in der Praxis ein Verfahren der direkten Messung, wie z.B. SPR, in ein indirektes Verfahren, d.h. ein Meßprinzip, das z.B. einem Fluoreszenz- oder Enzymimmunoassay entspricht, umgewandelt. Hierbei wird lediglich die "Markierung" und kein anderes Material, einschließlich nichtspezifisch gebundenen Materials, nachgewiesen, was bedeutet, daß ein beträchtlicher Anstieg der Selektivität erhalten wird.
Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Untersuchung eines Analyten in einer flüssigen Probe bereitgestellt, wobei das Vorhandensein des Analyten durch Bestimmung der resultierenden Änderung im Refraktionsindex an einer festen optischen Oberfläche, die in Kontakt mit der Probe ist, nachgewiesen wird, wobei die Änderung von dem Analyten verursacht wird, der an der Bindung bzw. Freisetzung einer Refraktionsindex-verstärkenden Spezies an bzw. von der optischen Oberfläche beteiligt ist bzw. Freisetzung, wobei der Refraktionsindex der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies mit der Wellenlänge variiert. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung das Bestimmen der Variation mit der Wellenlänge der resultierenden Änderung des Refraktionsindex, verursacht durch die Variation des Reftaktionsindexes mit der Wellenlänge der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies, für eine Anzahl diskreter Wellenlängen oder für einen kontinuierlichen Bereich an Wellenlängen umfaßt, wobei die Variation für die Menge des Analyten repräsentativ ist.
Die Begriffe "Assay" und "Analyt" sollen in einem breiten Sinn interpretiert werden, so daß das erfindungsgemäße Verfahren so verstanden wird, daß es den Nachweis oder die Aufzeichnung jeglicher Substanz oder Spezies für welchen Zweck auch immer umfaßt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die im folgenden als Differentialmethode bezeichnet wird, ist die gemessene Variation der Refraktionsindexunterschied zwischen den Refraktionsindices, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen werden. Vorzugsweise wird eine Meßwellenlänge an oder nahe dem Refraktionsindexmaximum ausgewählt, d.h. an oder nahe dem Maximum der negativen Ableitung des Absorptionsvermogens im Hinblick auf die Wellenlänge der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies. Die andere Meßwellenlänge sollte vorzugsweise an oder nahe dem Refraktionsindexminimum-Plateau liegen, wie unten erklärt werden wird, d.h. in der Nähe des Maximums der Ableitung des Absorptionsvermögens im Hinblick auf die Wellenlänge der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies. Die Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Diskussion bezüglich des vorteilhaften Einflusses der Erfindung (unter Verwendung der oben beschriebenen Differentialmethode) auf die oben erwähnten Unzulänglichkeiten oder Beschränkungen der SPR-Assays besser verstanden werden.
Zunächst wird Bezug auf die Figur 1 der beigefügten Zeichnungen genommen:
Figur 1 zeigt zwei übereinandergesetzte Diagramme, die die Variation der Wellenlänge für das Absorptionsvermögen (oberes Diagramm) und den Reftaktionsindex ([)iagramm unten) darstellen; und
Figur 2 ist ein Diagramm, das das theoretische (durchgezogene Linie) und experimentelle (x) Refraktionsindexspektrum einer Farbstofflösung zeigt.
Wie in Figur 1 gezeigt, entspricht das Refraktionsindexmaximum etwa dem Maximum der negativen Ableitung des Absorptionsvermögens, und das Reftaktionsindexminimum-Plateau liegt in der Nähe des Maximums der positiven Ableitung des Absorptionsvermögens.
In dem in Figur 1 dargestellten Beispiel hat der Graph des Absorptionsvermögens sein Maximum bei 760 nm, und die Breite bei halber Peakhöhe ist etwa 50 nm. Der Abstand zwischen dem Maximum (λ&sub1;) und dem Minimum (λ&sub2;) des Reftaktionsindex wird dann ebenfalls 50 nm sein. D.h. λ&sub1; ist 785 nm, und λ&sub2; ist 735 nm.
Es soll angenommen werden, daß die SPR-Nachweisoberfläche zuerst in Kontakt mit Wasser ist. Da Wasser eine bestimmte normale Dispersion in diesem Bereich hat, -33 uRIU/nm (RIU Reftaktionsindexeinheiten) im Bereich 486-656 (geringfügig weniger bei 760 nm), wird der Refraktionsindexunterschied über 50 nm dann 1650 uRIU sein. (Der konstante Einfluß der Nachweisoberfläche und optischer Systemcharakteristika wird vernachlässigt).
Es soll dann angenommen werden, daß das gesamte Wasser durch Protein ersetzt wird. Für Proteine wird die Dispersion hierin annäherungsweise etwa -76 uRIU/nm sein, was einen Refraktionsindexunterschied über 50 nm von etwa 3800 uRIU ergibt. Wird das gesamte Wasser durch Protein an der Nachweisoberfläche ersetzt, wird daher der Refraktionsindexunterschied zwischen λ&sub1; und λ&sub2; von 1650 auf 3800 uRIU verändert werden, d.h. der Unterschied wird 2200 uRIU betragen.
Eine herkömmliche SPR-Antwort würde jedoch eine im wesentlichen größere Verschiebung für diesen hypothetischen Fall, daß das gesamte Wasser durch Protein ersetzt ist, zeigen.
Eine derartige Verschiebung würde dem gesamten Refraktionsindexunterschied zwischen Pro tein und Wasser entsprechen, d.h. 1,55-1,33 = 0,22 RIU oder 220.000 uRIU. Die erfindungsgemäße Messung des Refraktionsindexunterschieds reduziert somit die Signalantwort für die Bindung von Protein, Analyt wie auch nichtspezifischem Material an die Nachweisoberfläche um einen Faktor von etwa 100.
Für einen Farbstoff ist dies ganz anders. Wie in der Internationalen Patentanmeldung WO 93/04357 der gleichen Anmelderin gezeigt, würde die Verwendung eines geeigneten Farbstoffes oder einer chromophoren Markierung eine wenigstens etwa 25-fach höhere Signalstärke ergeben als Proteine. Der Unterschied in der Signalstärke zwischen einem derartigen Farbstoff oder Chromophor und Proteinen würde somit einen Faktor von wenigstens 2500 ergeben, wird die oben gezeigte Attenuierung der Proteinantwort in Betracht gezogen. Weiterhin kann das von der Proteinadsorption ausgehende Signal, durch eine einfache Kalibrierungsprozedur weiter attenuiert werden. Zuerst werden die spezifischen Antworten für Proteinadsorption (in Abwesenheit von Chromophor) bei den beiden Wellenlängen bestimmt, und ein Skalenfaktor wird ausgerechnet. Zweitens werden, wenn das Chromophor-markierte Protein adsorbiert ist, die spezifischen Antworten nach dem erhaltenen Skalenfaktor eingestuft, bevor der Refraktionsindexunterschied ausgerechnet wird. Auf diese Weise kann die Proteinantwort theoretisch auf 0 vermindert werden.
Wie oben gezeigt, wird der Einfluß nichtspezifischer Bindung an eine SPR- oder verwandte Nachweisoberfläche beträchtlich dadurch reduziert, daß erfindungsgemäß vorgegangen wird. Jedoch werden auch die oben erwähnten Einflüsse anderer beschränkender Faktoren in der SPR in starkem Maße reduziert werden, wie unten erklärt werden wird.
Z.B. wird die Variation des Hintergrundsignales mit der Zeit (z.B. aufgrund von Änderungen der Temperatur) die Messung nicht beeinflussen, da der Refraktionsindexunterschied im wesentlichen gleichzeitig bei den beiden betreffenden Wellenlängen gemessen wird. Man kann somit sagen, daß dies eine automatische Basislinienkorrektur ist.
Zusammenfassend stellt die Erfindung die Kombination einer gesteigerten Sensitivität (d.h. Signalstärke je Analytmenge) mit einer wesentlichen Verminderung des Signalgeräuschs bereit, wobei letzteres in einem breiten Sinn definiert wird, um alle Typen an Meßfehlern zu erfassen, die von jeglichem Typ an Fehlerquelle herrühren. Es ist unmittelbar verständlich, daß die Selektivität, d.h. das Verhältnis von dem Signal, das durch die gewunschte. chemische Spezies erzeugt wird, zu dem Signal, das durch die nichtgewünschte chemische Spezies (Interferenzen, nichtspezifisches Material) erzeugt wird, beträchtlich erhöht wird.
Es ist natürlich möglich, bei mehr als zwei diskreten Wellenlängen zu messen (für ein und dieselbe Refraktionsindex-erhöhende Spezies). Dies würde mehr Information über die Dispersion und dadurch eine verläßlichere Interpretation des nachgewiesenen Signales bereitstellen, und das Geräusch bzw. Rauschen könnte durch Ausmitteln der erhaltenen Meßergebnisse reduziert werden.
Die Messung des Refraktionsindexes in schneller Folge bei einer großen Zahl an Wellenlängen wird ein Refraktionsindexspektrum erzeugen. In einem derartigen Fall kann die bestimmte Refraktionsindexvariation auf der Messung der Fläche unter dem Graphen des Spektrums basieren, statt auf dem Unterschied zwischen den Refraktionsindices von Paaren diskreter Wellenlängen.
Wie oben erwähnt, ist es auch von dem erfinderischen Konzept umfaßt, die Refraktionsindexvariation für einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich zu messen, der den anomalen Dispersionsbereich der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies abdeckt. Z.B. wird in der SPR- Messung dies zur Bestimmung einer Änderung der Form der Senke statt zum Unterschied zwischen zwei diskreten Senken führen.
Die Erfindung kann auf verschiedene Arten ausgeführt werden.
Bei einer Ausführungsform der Messung bei diskreten Wellenlängen werden die Messungen bei zwei Zeit-aufgelösten Wellenlängen gemacht. Im Falle von SPR werden dann zwei Zeitaufgelöste SPR-Intensitätssenkenminima erhalten werden. Für deren Bestimmung ist es ausreichend, den Unterschied zwischen den Minima der beiden Senken zu bestimmen. Ein Weg, um die gewünschte Zeitauflösung zu erreichen, ist die Verwendung von zwei Lichtquellen, die abwechselnd an- und ausgeschaltet werden. Eine Variation davon ist es, eine Lichtquelle mit breiter Wellenlänge in Kombination mit zwei rotierenden Hoch-Durchgangs-/Niedrig-Durchgangsfiltern zu verwenden.
Bei einer anderen Ausführungsform der Messung bei diskreten Wellenlängen werden die Messungen gleichzeitig bei zwei Wellenlängen durchgeführt. Dies kann dadurch durchgeführt werden, daß zwei Lichtquellen verwendet werden, die ihr Licht gleichzeitig ausstrahlen. Alternativ wird eine Lichtquelle, die einen breiten Wellenlängenbereich besitzt, mit einem Filter kombiniert, der das zentrale Wellenlängenintervall ausschließt, um zwei diskrete Emissionspeaks zu erzeugen. Im Falle von SPR werden zwei getrennte übereinanderliegende SPR-Senken dadurch erhalten werden. Für deren Bewertung können verschiedene Ansätze verwendet werden. Bei einem Ansatz wird die Breite der Gesamtsenke als Maß der Trennung zwischen den Keilsenken verwendet. Ein anderer Ansatz ist es, die Senken dadurch zu trennen, daß zwei Senken bekannter Form eingepaßt werden. Der Abstand zwischen den Minima der beiden eingepaßten Senken ist dann ein Maß der Senkentrennung. Ein anderer Ansatz ist die Analyse der gesamten Graphform mittels multivariater Verfahren.
Wenn die Variation für einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich gemessen wird, kann eine Lichtquelle mit breitem Wellenlängenemissionsbereich verwendet werden, wobei das Emissionsmaximum etwa mit dem Absorptionsmaximum der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies zusammenpaßt, und wobei deren Emissionsspektrum ausreichend breit ist, um wenigstens den größten Teil des anomalen Dispersionsbereiches abzudecken. Bei der SPR-Messung wird die Quantifizierung der Antwort dann auf der Analyse der Form der Antwortsenke beruhen. Im einfachsten Fall kann dies dadurch durchgeführt werden, daß die Breite der Senke berechnet wird, wohingegen in anderen Fällen eine Analyse der gesamten Graphform mittels multivariater Tech niken nötig sein kann.
Wie oben erwähnt, sollten die Messungen bei diskreten Wellenlängen im allgemeinen am oder so nahe wie moglich an dem Maximum bzw. Minimum des Refraktionsindexes in Bezug auf die Wellenlänge durchgeführt werden. Wird im Hinblick auf die Refraktionsindexmaximum-Messung die Wellenlänge auf der Seite hoher Wellenlänge des Maximums des Refraktionsindexes ausgewählt, sollte der Abstand zwischen der Meßwellenlänge und dem Maximum vorzugsweise weniger als 100 nm (entsprechend einer möglichen Verstärkung von wenigstens etwa 5-fach auf Massenbasis, abhängig vom Absorptionsvermögen) und bevorzugter weniger als 50 nm (entsprechend einer möglichen Verstärkung von wenigstens etwa 10-fach auf einer Massenbasis, abhängig vom Absorptionsvermögen) sein. Wenn andererseits die Meßwellenlänge auf der Seite niedriger Wellenlänge des Maximums des Reftaktionsindexes ausgewählt wird, so muß die Meßwellenlänge sehr nahe am Maximum sein, da der Refraktionsindex sehr schnell mit abnehmender Wellenlänge in diesem Bereich abnimmt.
Im Falle der Refraktionsindexminimum-Messung ist andererseits die Meßwellenlänge vorteilhafter innerhalb des Refraktionsindexminimum-Plateaus, wie oben erklärt. Alternativ kann die Niedrigrefraktionsindex-Messung an der Seite hoher Wellenlänge des Reftaktionsindexmaximums durchgeführt werden. Da der Refraktionsindex mit der Wellenlänge in diesem Bereich abnimmt, kann ein großer Refraktionsindexunterschied erhalten werden, wenn der Wellenlängenunterschied ausreichend groß ist. Bei diesem Modus wird die Steigerung der Sensitivität nicht ganz so groß sein, wie dann, wenn die Niedrigrefraktionsindex-Messung nahe dem Reftaktionsindexminimum durchgeführt wird, aber die Geräuschverminderung und die gesteigerte Selektivität werden noch erhalten.
Weiterhin sollte die Absorptionsfähigkeit (Extinktionskoeffizient) der Refraktionsindexverstärkenden Spezies so hoch wie möglich sein, vorzugsweise höher als 10 lg&supmin;¹ cm&supmin;¹ und noch bevorzugter höher als 20 lg&supmin;¹ cm&supmin;¹.
Durch die richtige Auswahl der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies oder Sonde kann somit ein sehr hoher Refraktionsindex erhalten werden. Welche spezifische Meßwellenlänge für eine spezifische Index-verstärkende Spezies oder Sonde, oder umgekehrt, ausgewählt werden muß, wird natürlich unter anderem von der speziellen Sonde abhängen und kann vom Fachmann leicht etabliert werden, sobald er in Kenntnis der Erfindung gelangt ist.
Zum Zwecke der Erfindung ist die Index-verstärkende Spezies oder Sonde vorzugsweise ein Farbstoff oder ein chromophores Molekül oder schließt einen Farbstoff oder ein chromophores Molekiil ein. Üblicherweise wird ein Farbstoffmolekül an ein anderes Molekül, wie z.B. ein Protein oder Polypeptid (z.B. ein Antikörper oder ein Fragment davon) konjugiert. Beispielhafte Farbstoffe sind vom Azin-, Thiazin-, Oxazin-, Cyanin-, Merocyanin-, Styryl-, Triphenylmethan-, Chlorophyll- und Phthalocyanintyp.
Die optochemischen Verfahren, für welche die Erfindung verwendet werden kann, sind, wie zuvor erwähnt, nicht auf SPR-Verfahren beschränkt, sondern erstrecken sich auf jegliches Assayverfahren, das eine Anderung des Refraktionsindexes als Anzeige des Vorhandenseins eines Analyten mißt. Derartige Verfahren schließen sowohl interne als auch externe Reflexionsverfahren ein, z.B. Ellipsometrie, externe Brewster-Winkelreflektometrie und Wellen-auflösende Reflektometrie, wobei die letztere Brewster-Winkelreflektometrie einschließt, Kritischer-Winkel- Reflektometrie, SPR-Reflektometrie, Wellen-auflösende Ellipsometrie, gesamtinterne Streureflexion (STIR), optische Wellenführungssensoren, refraktometrische optische Fasersensoren, Wellenauflösungs-basierende Abbildung, wie z. B. kritischer-Winkel-aufgelöste Abbildung, Brewster-Winkel-aufgelöste Abbildung, SPR-Winkel-aufgelöste Abbildung, usw.
Der Kontakt zwischen dem Flüssigprobenmedium und der optischen Oberfläche kann statisch oder vorzugsweise dynamisch, d.h. durch Bereitstellung der Nachweisoberfläche oder -oberflächen in einer Art von Fließzelle, sein.
Günstige Assayformate, die die Erfindung verwenden, schließen diejenigen ein, die in der zuvor erwähnten WO 90/11525 und EP-A-276 142 beschrieben wurden, ohne jedoch auf diese in irgendeiner Weise beschränkt zu sein. Diese schließen Kompetitionsassays, Verdrängungsassays und Assays vom Sandwich-Typ ein. In einem Kompetitionsassay wird die Sonde mit dem Analyten in Bezug auf die Bindung an die Nachweisoberfläche konkurrieren, wohingegen in einem Verdrängungsassay die Sonde an Nachweisoberfläche gebunden ist und von dem Analyten verdrängt werden wird. In einem Sandwich-Assay wird die Sonde an den Analyten gebunden und zwar entweder bevor oder nachdem dieser an die Nachweisoberfläche gebunden wurde.
Ein Kompetitionsassay für z.B. ein Hapten, wie z.B. Theophyllin, kann somit so durchgeführt werden, daß eine geeignete Sonde an Theophyllin konjugiert wird und daß bei zwei Wellenlängen, die an oder nahe dem Maximum bzw. Minimum des Refraktionsindexes der Sonde ausgewählt wurden, das Ausmaß gemessen wird, in welchem die Probe, wenn sie mit der Sonde gemischt ist, die Bindung des konjugierten Theophyllins an die Nachweisoberfläche beeinflußt bzw. mit dieser Bindung konkurriert.
Um die Durchführbarkeit des erfindungsgemäßen Assayverfahrens zu demonstrieren, wurden die folgenden Experimente mit einem SPR-basierenden Biosensorinstrument variabler Wellenlänge durchgeführt.

BEISPIEL 1

Variation des Inkrements des Refraktionsindexes mit der Wellenlänge für einen Farbstoff

1 mM des Farbstoffes HITC (1,1', 3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyanin, 94% Reinlieit, Sigma HO387) wurde in einem Gemisch von 50% Ethanol und 50% Citratpuffer (pH 3, 0,1 M Citrat, 0,4 M NaCl, 0,05% Tween 20) gelöst. Die Lösung wurde kontinuierlich über eine SPR- Nachweisoberfläche (BIAcore Sensor Chip CM5, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden) gepumpt, die in ein nichtkommerzielles SPR-Instrument mit einer variablen Wellenlängenquelle montiert war. Die Wellenlänge wurde schrittweise von 700 auf 850 nm erhöht, und der Winkel des SPR-Lichtintensitätsminimums (Θ) wurde für jede Wellenlänge bestimmt und mit dem Winkel verglichen, bei dem ein reines Ethanol/Puffer-Gemisch über die Oberfläche gepumpt wurde.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 unten dargestellt. In Tabelle list ΔΘ die Winkeldifferenz zwischen Lösungen mit und ohne HITC, und Δn ist der Unterschied im Refraktionsindex zwischen Lösungen mit und ohne HITC, berechnet nach Refraktionsindexkalibrierung des Instrumentes mit Glycerin/Wasser-Gemischen bekannter Zusammensetzung; DRIU = Differential- Refraktionsindexeinheit.
In Figur 2 sind die An-Daten gegen die Wellenlänge graphisch dargestellt. Die durchgezogene Linie stellt eine theoretische Vorhersage (siehe C.F. Bohren, D.R. Huffman, "Absorption and scattering of light by small particles", John Wiley & Sons, New York, 1983, Kap. 9) des Refraktionsindexes als eine Funktion der Wellenlänge dar, berechnet ausgehend von dem gemessenen Absorptionsspektrum der HITC-Lösung (maximale Absorptionsfähigkeit 260.000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ bei 743 nm). Die qualitative Übereinstimmung zwischen Theorie und Experiment ist gut, und die Maximumrefraktionsindex-Differenz wird durch Auswahl der beiden Meßwellenlängen bei etwa 700 bzw. 770 nm erhalten. Tabelle 1

BEISPIEL 2

Messung des Masseninkrements des Refraktionsindexes unter Verwendung der Differentialmethode

Ein Citratpuffer (pH 3, 0,1 M Citrat, 0,4 M NaCl, 0,05% Tween 20) wurde hergestellt und mit gleichen Mengen spektrographisch reinen Ethanols gemischt. 1,0 mM des Farbstoffes HITC (gleiche Qualität wie in Beispiel 1) wurde in einem Aliquot des Citrat/Ethanol-Gemisches gelöst. Dann wurde Saccharose (für die Analyse, getrocknet) sorgfältig gewogen und zu Konzentrationen von 0%, 0,8%, 1,6% und 3,2% in Citrat/Ethanol und in HITC/Citrat/Ethanol gelöst.
Absorptionsspektren im Bereich 500-900 nm wurden für HITC+0% Saccharose und für HITC+1,6% Saccharose nach Verdünnung auf 4 uM mit Citrat/Ethanol aufgenommen. Die beiden Spektren waren praktisch identisch: max 743,2 nm, Amax 1,062 für HITC+0% Saccharose, und max 742,8 nm, Amax 1,053 für HITC+1,6% Saccharose. Somit änderte die Zugabe von Saccharose die Spektraleigenschaften von HITC nicht.
SPR-Messungen wurden an einer SPR-Nachweisoberfläche (BIAcore Sensor Chip CM5, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden), montiert in dem gleichen Instrument wie in Beispiel 1, durchgeführt. Alle Messungen wurden bei zwei Wellenlängen durchgeführt. Die Proben wurden in kontinuierlicher Folge über die Oberfläche gepumpt, und die Wellenlängeneinstellung wurde schnell zwischen 700 und 770 nm für jede Probe verschoben. Das Instrument ist ein nichtkommerzielles und flexibles Forschungsinstrument, zeigt jedoch eine ziemlich schlechte Genauigkeit (z.B. manuelle Wellenlängeneinstellung), so daß zuerst die Wiederholbarkeit der Wellenlängenverschiebungen bestimmt wurde. Citrat/Ethanol wurde über die Oberfläche gepumpt und die Wellenlänge wurde 10 mal zwischen 700 und 770 nm verschoben.
Das Mittel des Unterschiedes zwischen 700 und 770 nm betrug 20753 mpixel (mpixel ist hier eine nichtkalibrierte Winkeleinheit) mit einer Standardabweichung von 112 mpixel.
Dann wurde Citrat/Ethanol mit 0-3,2% Saccharose zweimal über die Oberfläche gepumpt, und Ablesungen wurden bei 700 und 770 nm durchgeführt, um Kalibrierungsgraphen zu erhalten (um mpixel bei jeder Wellenlänge in Reftaktionsindexeinheiten, RIU, zu übersetzen). Die Neigungen der eingepaßten geraden Linien bei 700 und 770 nm waren nicht signifikant verschieden, so daß in nachfolgenden Experimenten keine Kalibrierung durchgeführt wurde, sondem die mpixel-Werte als solche verwendet wurden. Die mittlere Neigung der Kalibrierungsgraphen war 1337 mpixel/(% Saccharose).
Dann wurde HITC/Citrat/Ethanol mit 0-3,2% Saccharose zweimal über die Oberfläche gepumpt, und es wurde bei 700 und 770 nm abgelesen. Um die Versetzung (z.B. aufgrund von Temperaturänderungen) zu minimieren, wurden alle Werte als Unterschiede zu einer aktuellen Ablesung für reines Citrat/Ethanol genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Das Gesamtmittel der Differenz zwischen den Ablesungen bei 770 und 700 nm ist 3235 mpixel, und die Standardabweichung beträgt 153 mpixel. Diese Standardabweichung ist nicht signifikant von dem Wert 112 mpixel verschieden, der in dem Wiederholbarkeitsexperiment erhalten wurde, so daß keine Differenz zwischen den 4 Werten gezeigt ist. Es gibt auch keinerlei signifikanten Trend der mpixel-Werte in Bezug auf die Saccharosekonzentration. Dieses Experiment zeigt, daß, wenn die Differenz der Antworten bei zwei verschiedenen Wellenlängen genommen wird, der Einfluß von Variationen im absoluten Refraktionsindex eliminiert werden kann und lediglich der differentielle Beitrag von den Farbstoffmolekülen erhalten wird.

BEISPIEL 3

Assay für Theophyllin unter Verwendung der Differentialmethode

Der Farbstoff I (1,1'-(4-Sulfobutyl)-3,3,3',3'-tetramethyl-6-carboxymethylindotricarbocyanin) wurde nach P.L. Southwick et al., Cytometry, 11(1990) 418, dye XVIII synthetisiert. Dieser Farbstoff ist ein wasserlösliches und reaktives Derivat des Farbstoffs HITC, der in den vorherigen Beispielen verwendet wurde. Das Absorptionsmaximum in Wasser betrug 746 nm. Der Farbstoff 1 wurde mit TSTU (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat, Fluka, Schweiz) aktiviert und in Boratpuffer (pH 8,5, 0,1 M Borat), enthaltend Aminotheophyllin (8-(3-Aminopropyl)theophyllin), gelöst. Die Reaktion führte zu einer klaren Lösung. Dünnschichtchromatographie bestätigte, daß das Aminotheophyllin vollständig aufgebraucht war. Das Absorptionsspektrum des Reaktionsgemisches war dem des reinen Farbstoffs I ähnlich. In nachfolgenden Experimenten wurde das Reaktionsgemisch ohne weitere Reinigung verwendet. Diese Experimente wurde auf dem gleichen nichtkommerziellen SPR-Instrument wie in den vorherigen Beispielen durchgeführt. Zuerst wurden zwei Sensorchips (in Reihe) in das Instrument montiert, und der Basislinienspiegel in Gegenwart von Puffer wurde bei 700 und 770 nm abgelesen. Dann wurden vier Sensorchips mit immobilisiertem Anti-Theophyllin-Antikörper (in Reihe) montiert, und die Basislinie wurde auf die gleiche Weise abgelesen. Die mittlere Differenz in der Basislinie für Sensorchips mit und ohne Antikörper betrug 12203 mpixel bei 700 nm und 8269 mpixel bei 770 nm. Somit betrug der Skalenfaktor in Bezug auf Proteinaufnahme 8269/12203 0,68 mit einem RSD von 2%. Dies ist in vernünftiger Übereinstimmung mit dem theoretisch erhaltenen Wert von 0,76.
Lösungen des Konjugates Farbstoff 1-Aminotheophyllin (etwa 35 uM) wurden über zwei Sensorchips mit immobilisierten Anti-Theophyllin-Antikörpern während 3 Minuten gepumpt, und nach weiteren 5 Minuten wurde die Antwort bei 700 und 770 nm abgelesen. Das Mittel der Antwort betrug -150 mpixel bei 700 nm und +430 mpixel bei 770 nm (nach Teilung durch den Skalenfaktor 0,68), so daß die mittlere Differenz 580 mpixel betrug. Dieses Experiment zeigt, daß die Differentialmethode gleicherrnaßen gut für die Bindung von Molekülen an die Oberfläche angewendet werden kann.
Dann wurde das gleiche Experiment mit Zugabe von 2 ug/mi Kaninchen-anti-Maus-Fc zu der Lösung von Farbstoff 1-Aminotheophyllin wiederholt. Der Antikörper soll die "nichtspezifische Bindung" in einem realitätsnahen Assay simulieren. Aus Kontrollexperimenten wird erwartet, daß diese Antikörperkonzentration zu einer Aufnahme von 100-200 mpixel führt, es war jedoch in diesem Experiment schwierig, die genaue Menge aufgrund einer Temperaturverschiebung zu bestimmen (weil das Instrument manuell bedient wurde, verstrichen einige Minuten zwischen dem Ablesen eines jeden Winkels). Die mittlere Differenz zwischen den Antworten bei 770 bzw. 700 nm betrug 560 mpixel, was von dem Wert 580 mpixel in dem vorherigen Experiment nicht signifikant verschieden war. Dieses Experiment zeigt, daß die Differentialmethode den Beitrag der nichtspezifischen Bindung von Proteinen eliminieren kann.
Weiterhin betrug die Standardabweichung zwischen den Ablesungen der paarweisen Aufhahme (das Mittel von 2-3 Ablesungen) bei einer einzelnen Wellenlänge in den beiden Experimenten 130 mpixel. Die Standardabweichung der paarweisen Differenzen zwischen 700 und 770 nm betrug lediglich 77 mpixel, von denen man annimmt, daß der größte Teil auf die Wellenlängenverschiebungen zurückzuführen ist. (Mit zufällig verteilten Werten würde die Standardabweichung um einen Wert von 2 auf 180 mpixel für die Differenzen angestiegen sein). Aufgrund der kleinen Proben ist diese Differenz in den Standardabweichungen statistisch nicht signifikant, jedoch sieht man einen Hinweis der gesteigerten Genauigkeit der Differentialmethode.
Die Erfindung ist natürlich nicht auf die oben spezifisch beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern es können viele Veränderungen und Modifikationen innerhalb des allgemeinen erfinderischen Konzepts, wie es in den folgenden Ansprüchen definiert ist, durchgeführt werden.

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Vorhandensein des Analyten durch Bestimmung der resultierenden Änderung im Refraktionsindex an einer festen optischen Oberfläche, die in Kontakt mit der Probe ist, nachgewiesen wird, wobei diese Änderung durch den Analyten verursacht wird, der mit der Bindung einer Refraktionsindex-verstärkenden Spezies an die optische Oberfläche bzw. mit der Freisetzung einer Refraktionsindex-verstärkenden Spezies von der optischen Oberfläche verbunden ist bzw. die Bindung oder die Freisetzung beeinflußt, wobei der Refraktionsindex der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies mit der Wellenlänge variiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung das Bestimmen der Variation mit der Wellenlänge der resultierenden Änderung des Refraktionsindexes, verursacht durch die Variation des Refraktionsindexes mit der Wellenlänge der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies, für eine Anzahl diskreter Wellenlängen oder für einen kontinuierlichen Bereich an Wellenlängen umfaßt, wobei die Variation für die Menge des Analyten charakteristisch ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmte Variation die Änderung im Refraktionsindexunterschied zwischen Refraktionsindices ist, die bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Messungswellenlänge so ausgewählt ist, daß sie am oder nahe dem Refraktionsindexmaximum der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Messungswellenlänge so ausgewählt ist, daß sie an oder in der Nähe des Refraktionsindexminimumplateaus der Refraktionsindex-verstärkenden Spezies liegt und zwar auf der Seite niedriger Wellenlänge des Refraktionsindexmaximums.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Messungswellenlänge so ausgewählt ist, daß sie auf der Seite hoher Wellenlänge des Refraktionsindexmaximums liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn die Messungswellenlänge auf der Seite hoher Wellenlänge des Maximums liegt, der Abstand zwischen der Messungswellenlänge und dem Maximum weniger als 100 nm ist, bevorzugter weniger als 50 nm ist und daß, wenn die Messungswellenlänge auf der Seite niedriger Wellenlänge liegt, die Messungswellenlänge nahe dem Maximum liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung das Bestimmen der Variation des Refraktionsindexes mit der Wellenlänge bei mehr als zwei Wellenlängen umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung das Bestimmen der Variation des Refraktionsindexes mit der Wellenlänge in einem kontinuierlichen Bereich an Wellenlängen umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet daß die Refraktionsindexverstärkende Spezies ein Protein oder Polypeptid umfaßt, das mit einem Chromophor oder einem Farbstoff konjugiert ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet daß die Refraktionsindexverstärkende Spezies ein Hapten umfaßt, das mit einem Chromophor oder einem Farbstoff konjugiert ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf interner Reflexion, insbesondere auf Oberflächenplasmonresonanz, beruht.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf externer Reflexion beruht.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß der Assay ausgewählt ist aus Kompetitionsassays, Verdrängungsassays und Assays vom Sandwichtyp.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay ein Immunoassay ist.