DE69622176T2

DE69622176T2 - Überwachung des refraktionsindex von optischen sensoren zur bestimmung von änderungen in der oberflächenstruktur

Info

Publication number: DE69622176T2
Application number: DE69622176T
Authority: DE
Inventors: Bengt Ivarsson; Esa Stenberg
Original assignee: Biacore AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: WO1997009618A1; EP0852010B1; ATE220208T1; SE9503028D0; US6127183A; DE69622176D1; JPH11512186A; JP3490458B2; EP0852010A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Analyse chemischer oder physikalischer Wechselwirkungen, die in einer Filmschicht an einer optischen Sensoroberfläche stattfinden, indem der Brechungsindex durch lichtintensive Signale produzierende Techniken bestimmt wird.

Hintergrund der Erfindung

Das Interesse an oberflächenempfindlichen Messtechniken hat kürzlich erheblich zugenommen, da mehrere sogenannte Label-freie optische Techniken zur Messung und Quantifizierung biomolekularer Wechselwirkungen entwickelt worden sind. Ein bisher häufig verwendetes derartiges optisches Verfahren geht zurück auf die Oberflächenplasmonresonanz, im folgenden häufig SPR genannt.
Wenn Licht von einem optisch dichteren Medium (d. h. mit einem höheren Brechungsindex) in ein weniger dichtes Medium (d. h. mit geringerem Brechungsindex) gelangt, tritt interne Totalreflexion (TIR) an der Grenzschicht zwischen den beiden Medien auf, wenn der Winkel, in dem das Licht auf die Grenzfläche trifft, über einem kritischen Winkel liegt. Wenn TIR auftritt, pflanzt sich eine elektromagnetische "evaneszente Welle" von der Grenzfläche in das Medium mit dem geringeren Brechungsindex fort.
Wenn die Grenzfläche mit einer dünnen Schicht bestimmter leitender Materialien (z. B. Gold oder Silber) beschichtet ist, kann die evaneszente Welle an der Leiteroberfläche mit Konstellationen freier Elektronen koppeln, Oberflächenplasmon genannt. Eine derartige Resonanzkopplung tritt bei einem spezifischen Winkel des einfallenden Lichts auf, wodurch Lichtenergie absorbiert und ein charakteristischer Abfall der Intensität des reflektierten Lichts bei diesem Winkel verursacht wird. Die elektromagnetische Oberflächenwelle erzeugt eine zweite evaneszente Welle mit einem verstärkten elektrischen Feld, das in das Medium mit der geringeren Dichte eintritt.
Der Resonanzwinkel reagiert empfindlich auf eine Anzahl an Faktoren umfassend die Wellenlänge des einfallenden Lichts sowie die Eigenart und die Dicke des leitenden Films. Am wichtigsten hängt der Winkel jedoch ab von dem Brechungsindex des Mediums, in dem die evaneszente Welle der Oberflächenplasmonwelle sich fortpflanzt. Solange andere Faktoren konstant gehalten werden, liefert der Resonanzwinkel daher eine direkte Angabe des Brechungsindex des Mediums mit der geringeren Dichte, da der Winkel sehr empfindlich auf Veränderungen des Brechungsindex in dem Medium reagiert. Für eine detaillierte Beschreibung der dielektrischen Gleichungen, die diese Abhängigkeit beschreiben, sei auf Kretschmann, E., Z. Phys. B241, 313 (1971), verwiesen.
Die SPR-evaneszente Welle nimmt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab und dringt effektiv mit einer Tiefe von ungefähr einer Wellenlänge in das Medium mit dem geringeren Brechungsindex ein. Daher können nur Veränderungen des Brechungsindex sehr nahe an der Grenzfläche festgestellt werden.
Falls der Metallfilm mit einer entsprechenden Nachweisschicht (z. B. einem Antikörper) bedeckt ist, der in der Lage ist, spezifische Wechselwirkungen mit einem Molekül einzugehen (z. B. einem Antigen), das in der Fluidprobe vorliegt, die mit der Nachweisschicht in Kontakt steht, können chemische Sensoren auf SPR-Basis konstruiert werden, wobei die Wechselwirkung an der Sensoroberfläche die Konzentration der Lösung und die Konzentration der gebundenen Oberfläche verändert und damit auch den Brechungsindex innerhalb des Eindringbereichs der evaneszenten Welle. Eine Vielfalt an chemischen Sensoren auf SPR-Basis ist entwickelt worden, wobei die Veränderung der Reflektionskurve (Intensität des reflektierten Lichtes in Abhängigkeit vom Einfallswinkel oder der Wellenlänge) gegen die Zeit bestimmt worden ist und wobei diese Veränderung in Korrelation zum Brechungsindex an der Oberfläche gesetzt worden ist.
Verschiedene Techniken können eingesetzt werden, um das Licht mit der Sensoroberfläche in Wechselwirkung zu bringen. Ein allgemein verwendetes Nachweissystem basiert auf der Konfiguration von Kretschmann (Kretschmann und Raether, Z. Naturforsch. Teil A 23: 2135- 2136, 1968). Bei dieser Konfiguration wird eine dünne Schicht eines reflektierenden Metalls (Gold oder Silber) auf der Grundfläche eines Prismas niedergeschlagen und TM-polarisiert, monochromatisches Licht wird durch das Prisma mit der SPR-Welle gekoppelt.
Ein Beispiel eines kommerziellen Biosensorsystems, das auf der Basis der Kretschmann-Konfiguration konstruiert worden ist, ist BIAcoreTM, das durch Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Schweden) vermarktet wird. Dieses Biosensorsystem beinhaltet ein SPR-Nachweissystem auf der Basis einer Kretschmann-Konfiguration mit einem Mikrofluidsystem, um den Fluss an Reagenzien, der bei den Analysen erforderlich ist, zu kontrollieren. Mit dieser Vorrichtung können biomolekulare Wechselwirkungen, die an der Sensoroberfläche vonstatten gehen, in Realzeit überwacht werden. Die Vorrichtung und der theoretische Hintergrund hierzu ist vollständig von Jönsson et al., 1991, BioTechniques 11, 620-627 beschrieben worden. Es sei ebenfalls auf unsere US-A-5,313,264 verwiesen.
Biomolekulare Wechselwirkungen werden dadurch überwacht, dass die Entwicklung der SPR-Antwort oder des Brechungsindex des Oberflächenfilms gegen die Zeit verfolgt werden. Ausgehend von diesem Zusammenhang können nicht nur die Konzentration an Biomolekülanalyt, sondern auch kinetische Parameter bestimmt werden, wie die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten für die Wechselwirkung des Biomoleküls mit der Sensoroberfläche.
Alternativ zu dem Reflektionsminimumwinkel kann der Winkel des Schwerpunktes der Reflektionskurve überwacht werden.
Einige SPR-Sensoren, wie bereits oben aufgeführt, führen das Licht mit einem vorgegebenen Winkel ein und messen die Wellenlänge, bei der SPR auftritt (siehe z. B. US-A-5,359,681) und nicht den Winkel des einfallenden Lichtes, bei dem SPR (d. h. das Reflektionsminimum) auftritt, allerdings gibt die SPR in beiden Fällen ein Reflektionsminimum der Reflektionskurve wieder.
Wenn kinetische Parameter untersucht werden, ist es selbstverständlich wichtig zu wissen, wann die Wechselwirkung an der Oberfläche Massetransport-begrenzt und wann sie reaktionskinetisch kontrolliert ist. Dieses kann nicht einfach über die oben aufgeführte Brechungsindex-gegen-Zeit-Kurve ermittelt werden, weshalb stets ein Risiko einer nicht korrekten Abschätzung von kinetischen Konstanten besteht. Ferner kann nicht einfach über die Brechungsindex-gegen-Zeit-Kurve bestimmt werden, ob die Wechselwirkung an der Oberfläche irgendwelche strukturellen Änderungen der Oberfläche, die eine Heterogenität zum Ergebnis haben, bewirkt hat.
Parameter, wie die Intensität des Reflektionsminimums (Rmin) und die Halbwertsbreite (Φ1/2) der Reflektionskurve, sind bereits in anderen Zusammenhängen als mit chemischen SPR- Sensoren untersucht worden.
Pockrand, L, Surface Science, Vol. 72, Seiten 577-588 (1978) beschreibt den Einfluss dünner dielektrischer Schichten auf die Eigenschaften von Oberflächenplasmaoszillationen, die sich entlang einer Metalloberfläche fortpflanzen, unter Verwendung einer Anordnung zur abgeschwächten Totalreflexion (ATR), um eine SPR anzuregen. Eine allgemeine Verschiebung und Verbreiterung der Resonanzkurve ist beobachtet worden. Die Tiefe der Resonanz Rmin bleibt von transparenten Beschichtungen unbeeinflusst, wohingegen sie stark von der Dicke einer absorbierenden Beschichtung abhängt.
Fontana, E., Pantell und Moslehi, Applied Optics, Vol. 27, (1988) Seite 3336, charakterisiert dielektrisch beschichtete Metallspiegel unter Verwendung der Oberflächenplasmonspektroskopie. Es werden analytische Ausdrücke für die SPR-Winkelverschiebung, die Halbwertsbreite und das Reflektionsminimum wiedergegeben.
Chu, K. C., et al., Mol. Cryst. Liq. Cryst., Vol. 59, Seiten 97-108, (1980), offenbart eine Untersuchung eines isotrop-nematischen Phasenüberganges von 4-Cyano-4'-n-pentylbiphenyl auf Gold als Funktion der Temperatur mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanztechnik. Veränderungen in der Halbwertsbreite der Reflektionskurve sowie das Auftreten zweier Reflektionsabfälle wurden beobachtet. Einer der beiden Resonanzwinkel korrespondiert mit dem Brechungsindex der isotropen Phase, der andere mit dem Brechungsindex der nematischen Phase. Der Zusammenhang zwischen den Senkentiefen der "Doppelsenkenreflektionskurve" wurde als ein Maß für die Brechung des Mediums in jedem der zwei Phasen verwendet.
Pollard, J. D., und Sambles, J. R., Optics Communications, Vol. 64, Seiten 529-533 (1987), beschreiben die Analyse der Zeitabhängigkeit von SPR-Reflektionskurvenparametern, den Reflektionsminimumwinkel, die Reflektionsminimumtiefe und die Reflektionskurvenbreite, um die laterale Ausdehnung zweier Phasen einer kondensierten Flüssigkeit zu studieren, d. h. als Tropfen bzw. als homogener Film. Die Existenz zweier unterschiedlicher Brechungsindizes in unterschiedlichen Bereichen einer bestrahlten Goldoberfläche lieferte zwei Reflektionskurven, welche zusammen eine Reflektionskurve mit zwei Minima ergab, wobei die Tiefe der jeweiligen Minima mit dem beidseitigen Grad an Bedeckung der Goldoberfläche korrespondierte.
Rothenhäusler und Knoll, Surface Science, Vol. 191, Seiten 585-594, (1987), offenbart Reflektivität-gegen-Winkel-Aufnahmen von Silber/Luft-Grenzflächen gemäss ATR- Konfiguration nach Kretschmann bei Einsatz von p-polarisiertem Laserlicht. Falls innerhalb des Bereichs des Laserpunktes auf dem Probenfilm eine Stufe von einer Dicke zu einer anderen vorliegt, werden zwei Resonanzminima erhalten, jedes bei einem Winkel, der mit einem der zwei "unendlichen" Schichtstrukturen korrespondiert. Die Intensitäten der Resonanzminima hängen von den relativen Flächenanteilen der zwei unterschiedlichen Grenzflächen ab, die durch den Laserpunkt abgedeckt werden.
Rothenhäusler und Knoll, Appl. Phys. Lett., Vol. 51, Seiten 783-785, (1987), offenbart den Einsatz von SPR in Verbindung mit der Beugung, um einen diskreten Film aus zwei Medien mit unterschiedlichen Schichtstrukturen zu untersuchen. Der gegenseitige Zusammenhang zwischen den Reflektionsminima zweier gleichzeitiger SPRs wird verwendet, um den Grad der Oberflächenbedeckung durch das jeweilige Medium zu bestimmen.
Yeatman und Ash, SPIE, Vol. 897, Seiten 100-107, (1988), Seite 107 offenbart eine SPR- Mikroskopietechnik zur Untersuchung lateraler Strukturen (Oberflächenheterogenitätsverteilung) in biologischen Monoschichten und anderen überlagerten Schichten. Es wird vorgeschlagen, dass die Position, die Breite und die Tiefe des Reflektionsminimums gemessen wird, um unterschiedlichen Kontrastmechanismen aufgrund ihrer unterschiedlichen Relativeffekte auf die drei Parameter zu ermöglichen, aufgetrennt werden zu können
Zhang, Y. et al., Surface Sci., Vol. 184, Seiten 214-226, (1987), beschreibt die Verwendung von Oberflächenplasmonoszillationen für die Untersuchung der Kinetik der Adsorption eines Polystyrolfilms auf einer metallischen Oberfläche. Die Resonanzwinkelverschiebung, die Halbwertsbreite der Senke und der Wert des Resonanzminimums wurden verwendet, um die Charakteristika der adsorbierten Schicht zu bestimmen.
Silin, V. L, et al., Optics Communications, Vol. 97, Seiten 19-24, (1993), beschreibt eine Verbreiterung einer Oberflächenplasmonlinie bedingt durch Unregelmäßigkeiten, Rauhigkeit oder sogar eine diskrete Struktur auf dem untersuchten Film bei einem Biosensorsystem, bei welchem eine immunologische Reaktion des Antigen/Antikörper-Typs stattfindet, woraus ein starker Abfall der Empfindlichkeit bei der Messung des Reflektionskurvenminimums resultiert.
Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G. und Macleod, H., Biochemica et Biophysica Acta, 1195(2), Seiten 267-75 (1994), berichtet über theoretische Modelle für experimentelle Oberflächenplasmonresonanzergebnisse, um die Dicke, den Brechungsindex und den Extinktionskoeffizienten von sich selbst aufbauenden Lipiddoppelschichten zu bestimmen sowie um die adsorbierte Masse und das Volumen zu berechnen. Über diese berechneten Daten wird die durchschnittliche Struktur der Lipidschicht im stationären Zustand charakterisiert. Es wird gezeigt, dass die Ablagerung einer Lipidschicht die SPR-Reflektionskurve derart verändern kann, dass (i) die Position des Resonanzminimums zu größeren Einfallswinkeln verschoben wird; (ii) die Intensität des reflektierten Lichts beim Resonanzminimum zunimmt; und (iii) die SPR-Kurve sich verbreitert. Die Beobachtung nur eines Resonanzminimums deutet an, dass die Bedeckung der Silberoberfläche durch die Probenmoleküle homogen ist.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass, während, wie oben beschrieben, es im Stand der Technik anerkannt ist, dass die Form der Oberflächenplasmonresonanzkurve gewisse strukturelle Informationen über einen festen oder flüssigen, SPR-beprobten Film enthalten kann, Messungen des Wertes (d. h. der Tiefe) des Reflektionsminimums oder der Halbwertsbreite der Reflektionskurve niemals in Biosensoranwendungen auf SPR-Basis verwendet wurden, um Oberflächenwechselwirkungen zu überwachen. Auch wurde nicht vorgeschlagen, dass solche Informationen der Reflektionskurve dabei von irgendwelchen Nutzen sein würden.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel für die Analyse von Wechselwirkungen, die an optischen Sensoren stattfinden, mit Hilfe von Oberflächenbrechungsindexmessungen verfügbar zu machen, wie z. B. SPR, um festzustellen, wann eine Wechselwirkung Massetransport-begrenzt und wann sie kinetisch kontrolliert ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel für die Analyse von Wechselwirkungen, die an optischen Sensoren stattfinden, mit Hilfe von Oberflächenbrechungsindexmessungen verfügbar zu machen, wie z. B. SPR, um den Grad an Heterogenität in der untersuchten Oberflächenschicht während oder als Ergebnis der Wechselwirkung zu bestimmen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, dass die obigen und weitere Ziele und Vorteile erreicht werden können, indem zusätzlich zur Überwachung der Veränderung des Brechungsindex an der Oberfläche durch Messung des Minimums, Maximums oder Schwerpunktes der Lichtintensitätssignalkurve auch die Veränderung des Wertes des Lichtintensitätssignals am Minimum, Maximum oder Schwerpunkt sowie optional auch die Halbwertsbreite der Lichtintensitätssignalkurve überwacht wird.
Insbesondere wurde gefunden, dass sich verändernde Signalintensitätsminimum- oder -maximumwerte eine Massetransport-Begrenzung der Wechselwirkung an der Oberfläche darstellen, wohingegen stabilisierte Minimum- oder Maximumwerte auf eine kinetische Kontrolle der Wechselwirkung hinweisen. Hierdurch wird ermöglicht, die kinetischen Konstanten leichter und mit einem wesentlich höheren Grad an Genauigkeit als mit den Methoden des Standes der Technik zu ermitteln.
Ferner zeigt ein veränderter (angestiegener oder verminderter) stabilisierter Minimum- oder Maximumwert an, dass in dem untersuchten Film eine resultierende Veränderung der Homogenität/Heterogenität vorliegt. Beispielsweise kann hierdurch auch die Dauer und der Grad an Veränderung der Homogenität/Heterogenität in dem untersuchten Film genau bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Analyse einer chemischen (einschließlich biochemischen) oder physikalischen (einschließlich biophysikalischen) Wechselwirkung zur Verfügung, die in einer Filmschicht an einer optischen Sensoroberfläche stattfindet, wenn die Filmschicht mit einer Fluidprobe in Kontakt gebracht wird, welche eine Spezies enthält, die in der Lage ist, mit der Filmschicht wechselzuwirken, wobei die Wechselwirkung mittels einer ein lichtintensives Signal generierenden Technik über die Bestimmung des Brechungsindex der besagten Filmschicht überwacht wird, indem das Verhältnis zwischen einem Parameter des einfallenden und/oder reflektierten Lichts und von einem des Minimums, des Maximums oder des Schwerpunktes der Lichtintensitätssignalkurve gemessen wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Überwachung des Brechungsindex ebenfalls die Variation des Lichtintensitätssignalwertes bei besagtem Minimum, Maximum oder Schwerpunkt in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommen wird, um wenigstens zu bestimmen (i) den Grad an Homogenität der Probenspezieskonzentration in dem untersuchten Filmschichtvolumen, um darüber zu bestimmen, wann die Wechselwirkung Massetransport-begrenzt und wann die Wechselwirkung kinetisch kontrolliert ist, wobei ein variierendes Lichtintensitätssignalniveau eine Begrenzung des Massetransports anzeigt und ein stabilisiertes Lichtintensitätssignalniveau kinetische Kontrolle anzeigt; (ii) den Grad an resultierender Homogenität/Heterogenität in dem untersuchten Filmschichtvolumen während oder nach der Wechselwirkung, wobei ein verändertes stabilisiertes Lichtintensitätssignalniveau den Grad an Veränderung bei der Homogenität/Heterogenität anzeigt und hierzu korrespondiert.
Die lichtintensive Signale produzierende Technik, die für die Messung der Brechungsindizes verwendet wird, kann ausgewählt werden aus einer Vielfalt an etablierten optischen Methoden, umfassend die herkömmliche Reflektometrie, die Reflektionsellipsometrie, die Reflektionsinterferometrie und die resonanzkontrollierte Detektion in einem Wellenleiter. Während diese Verfahren auf dem Nachweis eines Reflektionsminimums basieren, kann dieses Minimum sich auch als Maximum des Lichtintensitätssignals manifestieren, beispielsweise indem sich auf die reflektierte Intensität von unterschiedlich polarisiertem Licht bezogen wird.
Bei der herkömmlichen Reflektometrie wird die Sensoroberflächenreflektivität (Absolutwert der Reflektionskonstanten) über die reflektierte Lichtintensität als Funktion eines geeigneten Parameters ermittelt, üblicherweise über den Einfallswinkel und/oder die Wellenlänge. Der Reflektionsmodus kann intern (unter Beteiligung einer evaneszenten Welle) oder extern sein. Unter den internen Reflektionsverfahren können solche genannt werden, die auf der Oberflächenplasmonresonanz (SPR), dem Brewster-Winkel und dem kritischen Winkel basieren. Externe Reflektionsverfahren beinhalten die Brewster-Winkel-Detektion.
Bei der Reflektionsellipsometrie wird die Phasenverschiebung (Phase der Reflektionskonstanten), welche über die ganze Oberfläche auf den Polarisationszustand des reflektierten Lichts geführt wird, über die detektierte Lichtintensität als Funktion eines geeigneten Parameters ermittelt, üblicherweise über den Polarisator-(Analysator)-Winkel, den Kompensationswinkel, den Einfallswinkel oder die Wellenlänge. Der Reflektionsmodus kann intern (Ellipsometrie der evaneszenten Welle) oder extern (herkömmliche Ellipsometrie) sein.
Bei der Reflektionsinterferometrie wird die Phasenverschiebung (Phase der Reflektionskonstanten), welche durch die Sensoroberfläche eingeführt wird und welche die Intensität oder den Polarisationszustand des reflektierten Lichtes verändert, über die detektierte Lichtintensität als Funktion eines geeigneten Parameters ermittelt, üblicherweise über den Polarisator-(Analysator)-Winkel, den Kompensationswinkel, den Einfallswinkel oder die Wellenlänge. Der Reflektionsmodus kann intern (unter Einbindung einer evaneszenten Welle) oder extern sein.
Bei der resonanzkontrollierten Modusdetektion in einem Wellenleiter wird die Moduskopplung, welche auf die Sensoroberfläche zurückgeht und welche die Transmission des Lichtes über ihre Absorption oder Phasenverschiebung verändert, über die Detektion der Lichtintensität als Funktion eines geeigneten Parameters ermittelt, gewöhnlich über den Einfallswinkel oder die Wellenlänge. Der Reflektionsmodus ist intern (unter Einbindung einer evaneszenten Welle). Verfahren, die sich dieser Detektionstechnik bedienen, umfassen solche, die auf frustrierter Totalreflektion basieren (Resonanzhohlraum).
Das Licht kann mit der Sensoroberfläche mittels Transmission, Gitterkopplung oder Kopplung via frustrierter interner Totalreflektion (evaneszente Wellenkopplung) wechselwirken, wie in Resonanzspiegelvorrichtungen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durchgeführt werden mit einer Kombination aus wenigstens zwei Wellenlängen und einem festen Einfallswinkel. Gemäss einem weiteren Beispiel kann eine Kombination aus mindestens zwei Wellenlängen und mindestens zwei Einfallswinkeln eingesetzt werden. In einem weiteren Beispiel kann ein kontinuierlicher Scan eines vorab festgelegten Einfallswinkel- oder Wellenlängenbereichs verwendet werden. Gemäss eines noch weiteren Beispiels kann die Überwachung durchgeführt werden, indem man mindestens zwei unterschiedliche Polarisationszustände sowie feste Einfallswinkel und Wellenlängen verwendet. In einem weiteren Beispiel wird ein kontinuierlicher Scan eines vorab festgelegten Polarisationszustandsbereiches eingesetzt.
Während die Fluidprobe grundsätzlich ein Gas sein kann, ist sie üblicherweise eine Flüssigkeit.
Das Verfahren der Erfindung kann selbstverständlich für die gleichzeitige Überwachung von zwei oder mehreren Sensoroberflächen eingesetzt werden, was an sich aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Bestimmung des Zeitintervalls oder der Intervalle für die Wechselwirkung der Probenspezies mit der Oberflächenschicht, wenn die Wechselwirkung an der Oberfläche kinetisch kontrolliert ist, anhand der Überwachung der Reflektionsminimum- oder -maximumwerte sowie die Bestimmung der Assoziations- und/oder Dissoziationskonstanten über die Wechselwirkung zwischen dem Brechungsindex und der Zeit, gemessen während dieses Intervalls oder der Intervalle. Bevorzugt wird eine derartige Bestimmung der kinetischen Konstanten, wenn festgestellt wird, dass die Wechselwirkung kinetisch kontrolliert verläuft, automatisch initiiert, z. B. über die Modifikation von Software, die für die Auswertung derartiger Konstanten zum Einsatz kommt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Bestimmung des Zeitintervalls, in dem die Wechselwirkung an der Oberfläche Massetransport-begrenzt ist, anhand der Überwachung der Reflektionsminimum- oder -maximumwerte sowie der Konzentration der Probenspezies über den Zusammenhang zwischen Brechungsindex und der Zeitdauer während dieses Intervalls oder dieser Intervalle. Vielfach ist es wünschenswert, sowohl die Konzentration als auch die kinetische Konstante oder Konstanten zu ermitteln.
Die Homogenität/Heterogenität der Filmschicht steht üblicherweise in Beziehung zu einem oder mehreren der folgenden Zustände, dem physikalischen Zustand (Konzentration, Struktur, Proteinaggregate, Kristallinität, Phase, Gas), dem thermodynamischen Zustand (Temperatur, Oberflächenenergie) und dem chemischen Zustand (pH, Ionenstärke, Ladung) der Filmschicht.
Zwei unterschiedliche Fälle können identifiziert werden in Abhängigkeit von der Größe des Proben(analyt)moleküls:
(i) Eine makromolekulare Probe wird in Lösung (z. B. ein Protein) an einen aktivierten immobilisierten Film gebunden oder reagiert mit diesem, wodurch sich dieser in einen mehr heterogenen oder mehr homogenen verändert. Im ersten Fall wird das Reflektionsminimum auf einem höheren Niveau stabilisiert als vor der Probenzugabe, während in dem letzten Fall das Reflektionsminimum auf einem niedrigeren Niveau stabilisiert wird, wie nachfolgend detaillierter beschrieben wird. Die Homogenität der Probenanbindung ist dann an einer Referenzsensoroberfläche nachzuweisen. Dadurch kann eine festgestellte und quantifizierte Homogenitätsveränderung dem immobilisierten Film zugewiesen werden.
(ii) Eine niedermolekulare Probe (z. B. Wirkstoffe, kleine, in der Zelle in einer Lösung außerhalb des Sensorvolumens produzierte Moleküle) bindet an/reagiert mit dem aktivierten immobilisierten Film, wodurch dieser sich in einen mehr heterogenen oder mehr homogenen verwandelt. Diese kleinen Moleküle sind jedoch nicht selber in der Lage, eine signifikante Veränderung des Brechungsindex zu liefern, können aber eine signifikante strukturelle Veränderung eines makromolekularen immobilisierten Films bewirken.
Häufig ist es von Wert, die Probenspezieskonzentration in Bezug zu einer bestimmten Veränderung der Homogenität/Heterogenität der Filmschicht zu bestimmen. Die Bestimmung der Homogenität/Heterogenität kann ebenfalls genutzt werden zur Qualitätskontrolle einer präimmobilisierten Reaktantenkonzentration oder Struktur im Hinblick auf die Homogenität.
Insbesondere ist die Heterogenität der Oberflächenfilmschicht zurückführbar auf Proteinaggregate, erzeugt durch Ausfällung, Agglutinations-, oder Ausflockungsreaktionen; Membrankomplexe, wie z. B. biologischen Zellen oder Zellmembranfragmenten; makromolekularen Produktkomplexen, erzeugt durch enzymatische Reaktionen; und zelluläre Produktkomplexe.
Ein Stabilitätstest einer Proteinlösung kann durchgeführt werden, indem gleichzeitig die Konzentration an gebundenem Protein und die Heterogenität des gebundenen Proteinfilms aufgrund von Proteinaggregaten in der Probe bestimmt werden.
Wenn die Heterogenität auf Membrankomplexen beruht, kann eine gleichzeitige Bestimmung an gebundener Probenkonzentration und dazu in Beziehung stehender Anbindung oder Freisetzung von Probenpartikeln, wie z. B. biologischen Zellen oder Zellmembranfragmenten, vorgenommen werden.
Wenn die Heterogenität auf makromolekularen Produktkomplexen beruht, kann die gleichzeitige Bestimmung der Konzentration an gebundener Probe und dazu in Beziehung stehender enzymatischer Produktion, Aktivierung oder Hemmung, wie z. B. Coagulation, Verkrustung, enzymatische Kaskadenreaktionen (wie z. B. bei dem System der Blutcoagulation oder dem immunologischen Komplementsystem) vorgenommen werden.
Wenn die Heterogenität auf einer zellulären Adhäsionsverteilung oder auf zellulären Produktkomplexen basiert, kann eine gleichzeitige Bestimmung entweder der Konzentration der an der Probenoberfläche gebundenen Probe oder der Lösungskonzentration und der dazu in Beziehung stehenden zellulären Adhäsionsverteilung, wie Vervielfältigung oder Abbau, oder der zellulären Molekülproduktion vorgenommen werden.
Die Überwachung der Halbwertsbreite der in Rede stehenden Intensitätskurve des Lichtsignals kann ebenfalls zusätzliche Informationen über den Zustand der Homogenität/Heterogenität innerhalb des untersuchten Oberflächenvolumens liefern.
Im Fall eines auf interner Reflektion basierenden Verfahrens können die Daten, die bei mehreren Wellenlängen gemessen werden, verwendet werden, um den Zustand der Homogenität/Heterogenität in Richtung der Eindringtiefe der evaneszenten Welle zu bestimmen, wobei die Eindringtiefe sich mit der Wellenlänge ändert.
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen vornehmlich mit Bezug auf den SPR-Nachweis detaillierter beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt (i) schematische, überlagerte Darstellungen eines Sensorgramms (SPR-Antwortgegen-Zeit) und einer Reflektionsminimum-gegen-Zeit-Kurve für SPR-Messungen von Oberflächenwechselwirkungen sowie (ii) eine Anzahl an schematischen Ausschnittsansichten einer Durchflusszelle, womit unterschiedliche Zustände in der Durchflusszelle, die zu bestimmten Abschnitten des Sensorgramms und der Reflektionsminimumkurven korrespondieren, veranschaulicht werden;
Fig. 2a stellt eine überlagerte Darstellung eines Sensorgramms (SPR-Antwort-gegen-Zeit) und eine Reflektionsminimum-gegen-Zeit-Kurve für die Wechselwirkung von Trypsin mit immobilisiertem Trypsin-Inhibitor dar;
Fig. 2b stellt eine Wiedergabe von berechneten Reflektion-gegen-Einfallswinkel-Kurven für drei unterschiedliche Brechungsindizes für ein Zweiphasenfilmmodell, das zu der Wechselwirkung gemäss Fig. 2a korrespondiert, dar;
Fig. 3a stellt eine überlagerte Darstellung eines Sensorgramms (SPR-Antwort-gegen-Zeit) und einer Reflektionsminimum-gegen-Zeit-Kurve für die Adsorption von rabbit antimouse IgG dar;
Fig. 3b stellt eine Wiedergabe von berechneten Reflektion-gegen-Einfallswinkel-Kurven für drei unterschiedliche Brechungsindizes für ein Zweiphasenfilmmodell, das zu der Wechselwirkung gemäss Fig. 3a korrespondiert, dar;
Fig. 4a stellt eine ähnliche überlagerte Darstellung eines Sensorgramms (SPR-Antwortgegen-Zeit) und einer Reflektionsminimum-gegen-Zeit-Kurve für die Wechselwirkung von monoclonalen Antikörpern gegen immobilisiertes rabbit antimouse IgG dar, wie dasjenige in Fig. 3a, wobei jedoch die Wechselwirkung aufgrund von Aggregatbildung eine permanente Heterogenität in der untersuchten Oberfläche verursacht;
Fig. 4b ist eine Wiedergabe von berechneten Reflektion-gegen-Einfallswinkel-Kurven für vier unterschiedliche Brechungsindizes für ein Zweiphasenfilmmodell, das zu der Wechselwirkung gemäss Fig. 4a korrespondiert;
Fig. 4c stellt eine Wiedergabe von berechneten Reflektion-gegen-Einfallswinkel-Kurven für vier unterschiedliche Brechungsindizes eines Dreiphasenfilmmodells dar, das zu der Wechselwirkung gemäss Fig. 4a korrespondiert.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Fig. 1 veranschaulicht schematisch in überlagertem Darstellungsformat eine typische SPRabgeleitete Reflektionskurve (SPR-Antwort, oder Resonanzwinkel-gegen-Zeit-Kurve) oder eines Sensorgramms und einer korrespondierenden Reflektionsminimum (Rmin)-Kurve für die Wechselwirkung einer einen Analyten enthaltenden Probenlösung mit einem oberflächenimmobilisierten Reaktanten in einer Durchflusszelle, wie z. B. gemäss dem BIAcoreTM-System erhalten (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden). Der Analyt ist beispielsweise ein Antikörper und der immobilisierte Reaktant ein Antigen oder umgekehrt.
Unterhalb des Kurvendiagramms wird eine Anzahl an schematischen Querschnitten von Durchflusszellen gezeigt, jede mit einer Ziffer gekennzeichnet und unterschiedliche Phasen der Passage der Probe durch die Durchflusszelle darstellend. Der Punkt auf dem Sensorgramm (SPR-Winkel) bzw. der Reflektionsminimum-(Rmin)-Kurve, der zu dem jeweiligen Abschnitt der Durchflusszelle korrespondiert, ist mit derselben Ziffer wie der Abschnitt der Durchflusszelle gekennzeichnet. Das überwachte untersuchte Oberflächenvolumen (enthaltend den Reaktanten) oder das Sensorvolumen, das zu der Eindringtiefe der evaneszenten Welle, also ungefähr 0,7 um, korrespondiert, ist mit dem Buchstaben 5 in den Durchflusszellenabschnitten gekennzeichnet. Der untere Teil des Sensorvolumens enthält eine Reaktionsschicht oder Matrix (z. B. mit einer Tiefe von etwa 100 nm), wo die Reaktanten immobilisiert vorliegen (nicht gezeigt).
Ziffer 1 bezeichnet die Grundlinie der zwei Kurven, die mit dem Zustand der Durchflusszelle vor der Einführung der Probenlösung korrespondiert, wenn nur Solvenz durch die Zelle fließt. Der Brechungsindex des Sensorvolumens, der zur Veranschaulichung mit 1,335 angenommen werden kann, wird definiert über die Brechungsindizes von Solvenz und immobilisiertem Reaktanten.
Bei 2 (Zeit = 0) beginnt die Probenlösung (Solvenz L und aufgelöste Probe P) in die Durchflusszelle einzutreten, wobei noch keine Veränderung des Brechungsindex stattfindet
Bei 3 hat die Probenfront den Durchflusszellabschnitt nahezu passiert und es existiert ein hohes Maß an Probenheterogenität innerhalb des Volumens der Durchflusszelle. Der Brechungsindex wird weiterhin hauptsächlich durch das Solvenz und den immobilisierten Reaktanten bestimmt, da der Probenanalyt im zentralen Kern des Flusses konzentriert und nicht in größerem Umfang zu dem Sensorvolumen difundiert ist. Wenngleich der Brechungsindex an diesem Punkt anzusteigen beginnt, gibt es keinen merklichen Effekt beim Reflektionsminimumwert.
Bei 4 (t = t&sub1;) ist die Durchflusszelle vollständig mit der Probenlösung gefüllt (d. h. Homogenität in Bezug auf die Probenlösung) und der Analyt beginnt in die Reaktionsschicht zu difundieren und sich an den immobilisierten Reaktanten anzubinden. Die Reaktionskinetik ist Massetransport-begrenzt, wodurch es gestattet ist, die Probenkonzentration innerhalb des Sensorvolumens anhand dieses Teils der Reflektionskurve zu bestimmen, was im Stand der Technik hinlänglich etabliert ist. Der Brechungsindex an diesem Punkt kann zur Veranschaulichung z. B. etwa 1,336 sein.
Bei 5 enthält etwa die Hälfte der lateralen Ausdehnung des Sensorvolumens gebundenen Reaktanten, wodurch ein Heterogenitätsmaximum des Sensorvolumens resultiert, was wiederum einen Höchststand des Reflektionsminimumwertes verursacht. An dieser Stelle hängt die Kinetik sowohl vom Massetransport als auch von der Reaktionsgeschwindigkeit ab.
Bei 6 liegt der Reaktant über die gesamte laterale Ausdehnung des Sensorvolumens gebunden vor, und die Analytkonzentration innerhalb des Sensorvolumens ist homogen. Der Reflektionsminimumwert hat abgenommen auf Grundlinienniveau. Die Reaktionskinetik wird nun vollständig über die Reaktionsgeschwindigkeit kontrolliert und die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante kann aus dem Sensorgramm bestimmt werden. Der Brechungsindex liegt bei diesem Punkt bei etwa 1, 356.
Bei 7 (t = 0) hat der gesamte Probenabschnitt die Durchflusszelle nahezu passiert und ist dabei durch die Waschlösung L ersetzt zu werden, wodurch nicht gebundener Analyt entfernt wird.
Bei 8 füllt die Waschlösung mehr als die Hälfte des Volumens der Durchflusszelle aus, und der nicht oder nur lose gebunden vorliegende Analyt ist aus etwa der Hälfte des Sensorvolumens entfernt worden. Dieses führt zu sofortiger Heterogenität in dem Sensorvolumen, was die kurzzeitigen Spitzen, die in der Reflektionsminimumkurve beobachtet werden, verursacht. Die korrespondierende Stufe in der Sensorgrammkurve wird durch die Veränderung des Brechungsindex eines Großteils der Lösung verursacht. Der Brechungsindex an diesem Punkt kann z. B. zum Zwecke der Veranschaulichung etwa 1,355 betragen.
Bei 9 (t = t&sub1; bei der Einführung der Waschlösung) liegt innerhalb des Sensorvolumens eine homogene Reaktantenreaktion vor, und die Reflektionsminimumkurve geht demgemäss im wesentlichen auf das gleiche Grundlinienniveau wie vor dem Probensegment zurück. Die kinetisch kontrollierte Dissoziation des gebundenen Analyten hat begonnen, und die Konstante der Dissoziationsgeschwindigkeit kann berechnet werden.
10 gibt einen zu 9 korrespondierenden Punkt für den Fall eines resultierenden höheren Grades an (permanenter) Heterogenität innerhalb des Sensorvolumens wieder. Die Reflektionsminimumkurve geht daher nicht auf das ursprüngliche Grundlinienniveau zurück wie bei 9, sondern zeigt ein angehobenes Grundlinienniveau. Wie bei 9 oben ist die Dissoziation reaktionsbedingt begrenzt, und die Konstante der Dissoziationsgeschwindigkeit kann berechnet werden.
Bei 11 (der Durchflusszellenabschnitt ist nicht abgebildet) liegt im Fall einer hohen Dissoziationskonstante eine signifikante Desorption vor, wodurch eine hohe Probenheterogenität innerhalb des Sensorvolumens resultiert, was wiederum eine Spitze in der Reflektionsminimumkurve verursacht. An diesem Punkt ist die Kinetik abhängig sowohl vom Massetransport als auch von der Reaktionsgeschwindigkeit. Die Sensorgrammkurve hat nun ein niedriges Niveau erreicht, das mit einem Brechungsindex von sozusagen etwa 1,350 korrespondiert.
Für ein exemplarisches Durchflusszellenvolumen von 0,05 ul und eine Fliessgeschwindigkeit von 5 ul/min trägt die Zeit t&sub1;, innerhalb welcher die Flüssigkeit in der Durchflusszelle ausgetauscht wird, 0,6 sek.
Wie oben dargestellt, zeigt die Überwachung der Reflektionsminimum-(Rmin)-Kurve an, (i) wann die Probe die Sensoroberfläche erreicht und eine Anbindung an diese einsetzt und (ii) wann das Probensegment durchgetreten und durch eine, die Probe entfernende Waschlösung ersetzt worden ist. Dieses findet sowohl Anwendung auf die Injektion einer Probe in einen gepufferten Trägerdurchfluss als auch auf einen segmentierten Probenlösungstransport. Es ist demgemäss möglich, den Zeitpunkt zu bestimmen, bei dem der Puffer gleichzeitig in einem Teil der untersuchten Oberfläche und in einem weiteren Teil der untersuchten Probenoberfläche präsent ist und diese Zeit zu einer korrespondierenden SPR-Winkeländerung in Bezug zu setzen.
Dieses erlaubt die Messung von kinetischen Konstanten mit der Zeit wiederholt zu synchronisieren, wenn die Assoziations-/oder Dissoziationsphasen reaktionsgeschwindigkeitskontrolliert sind, also wenn Rmin den Spitzenwert passiert hat und wieder stabilisiert vorliegt. Bei einem Instrument wie beispielsweise dem oben genannten BIAcoreTM (Pharmacia Biosensor AB) können auf einfach Weise Mittel (z. B. auf Basis von Software) entworfen werden, um automatisch eine solche Synchronisation zu bewerkstelligen.
Es wird davon ausgegangen, dass die erreichte erhöhte Genauigkeit bei der Bestimmung der obigen Zeiten für die kinetische Kontrolle von Assoziations- und Dissoziationsphasen es erlaubt, die kinetischen Konstanten mit erheblich höherer Genauigkeit als zuvor und mit wesentlich weniger Arbeit und Unannehmlichkeiten zu ermitteln.
Es ist ebenfalls vorhergehend gezeigt worden, dass gleichzeitig mit der Kinetik der SPR- Winkelangaben der Grad an Heterogenität innerhalb des Films, enthaltend den Reaktanten, bestimmt werden kann, z. B. als Ergebnis der Bildung oder Auflösung von Aggregaten, der Kristallisation, der Gasbildung, von Temperaturveränderungen, der Bildung/Auflösung von Phasen oder Domänen.
Dadurch kann beispielsweise die Zeit, Spezifizität oder Oberflächenkonzentration bei Beginn der Änderung der Homogenität/Heterogenität in der Struktur oder dem Zustand des Films, enthaltend den Reaktanten, genau bestimmt werden, vorzugsweise automatisch, wie oben beschrieben. Anhand der SPR-Winkel/Zeit-Kurve kann die korrespondierende Spezifizität oder Oberflächenkonzentration des Films, enthaltend den Reaktanten, bestimmt werden.
Über eine derartige automatische Messung der Zeit, Spezifizität und/oder Oberflächenkonzentration einer quantifizierten Veränderung der Homogenität/Heterogenität innerhalb des mit der evaneszenten Welle untersuchten Volumens kann die Abhängigkeit dieser Reaktion von funktionalen Charakteristika eines Probenmoleküls mit erheblich höherer Genauigkeit als zuvor und mit geringerem Aufwand und Mühe bestimmt werden.
Selbstverständlich kann auch die Gegenwart von permanenten Veränderungen in der Struktur des Sensorfilms auf einfach Weise bestimmt werden.
Die Experimente, die in den folgenden, nicht begrenzenden Beispielen wiedergegeben werden, wurden mit einem BIAcoreTM-System unter Verwendung eines Sensorchips CM5 (ein goldbeschichteter Glasobjektträger, der über eine Monoschicht aus langkettigen Kohlenwasserstoffen eine Schicht aus Carboxymethyldextran trägt) durchgeführt, wobei beide von Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden, zur Verfügung gestellt wurden.

Beispiel 1

Sojabohnen-Trypsin Inhibitor (STI) (Sigma) wurde nach den Angaben des Herstellers auf der Sensorchipoberfläche immobilisiert. Die Oberfläche wurde zunächst für 3 Minuten mit 1 : 1 N-Ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert. Dann wurden 80 ug/ml STI in 10 mM Zitronensäure, pH 4.0, über 7 Minuten injiziert. Die Deaktivierung der verbleibenden aktivierten Gruppen wurde für 7 Minuten mit Ethanolamin-Hydrochlorid, pH 8.5, durchgeführt. Die Oberfläche wurde mit HCl gewaschen. Der volumetrische Durchfluss während des Immobilisierungsverfahrens betrug 5 ul/min. Als Puffer wurde 10 mM Hepes, 150 mM NaCl und 0.05% BIAcoreTM Detergenz P20, pH 7.4, verwendet.
Um die kinetischen Kostanten für die Wechselwirkung von Bovine Pancreatic Trypsin (BTP) (Sigma) mit immobilisiertem STI zu bestimmen wurden die kinetischen Analyseverfahren dann mit unterschiedlichen Konzentrationen an BTP durchgeführt. Die volumetrische Fliessgeschwindigkeit betrug 10 ul/min.
In den Experimenten wurden die SPR-Antwort und das Reflektionsminimum, Rmin, überwacht. Der Zeitpunkt, der mit dem maximalen Wert von Rmin, t (Rm), korrespondiert, wurde aus der Reflektionsminimumkurve entnommen. Die Probenannahmezeit betrug 0.2 sec. Die Sensoroberfläche wurde mit HCl regeneriert.
Fig. 2a zeigt einen typischen Sensorgrammabschnitt mit assoziierter Rmin-Kurve, erhalten für 25 nM Trypsin und einer Oberflächenkonzentration an STI, die zu 413 RU korrespondiert (Resonance Units - 1000 RU korrespondieren mit einer Verschiebung des SPR-Winkels um 0.1º oder mit einer Änderung des Brechungsindex um 0.001). Wie aus Fig. 2a ersichtlich trat ein Maximum der Rmin-Kurve während des Assoziationsabschnitts auf (der dargestellte Abschnitt des Sensorgramms). Die Rmin Änderung beträgt etwa 0.06% und geht einher mit einer maximalen Änderung des Rmin-Winkels um etwa 60%. Rmin geht dann auf ungefähr das Niveau der probenfreien Lösung zurück.
Der obige Fall gibt die Situation von zwei Phasen wieder, die nahe beieinanderliegende Brechungsindizes/Reflektionskurven haben. Eine Berechnung von Rmin für ein Zweiphasenfilmmodell mit einem Übergang via einer Reichweite von 0.4 für Phase 1, n = 1.335, und einer Reichweite von 0.6 für Phase 2, n = 1.3353, lieferte die in Fig. 2b abgebildeten Resultate. Der Rmin-Spitzenwert betrug etwa 0.02% und geht einher mit einer maximalen Veränderung des Rmin-Winkels von etwa 58%, was mit einer Reichweite von 1.0 für Phase 2 korrespondiert.
Anhand der analysierten Daten konnte ermittelt werden, dass das Auftreten eines Massetransport-/kinetisch kontrollierten Haltepunktes mit dem Zeitpunkt korrelierte, zu dem Rmin den Maximalwert passiert hatte und zu dem stabilisierten Niveau zurückgekehrt war. Indem der Rmin-Wert zusammen mit dem Sensorgramm überwacht wurde, konnte demzufolge der Zeitwert, der mit der Grenze zwischen Massetransfer-kontrollierter und kinetisch kontrollierter Wechselwirkung korrespondiert, bestimmt werden. Die Eingabe dieses Zeitwertes in das Auswerteschema wird daher das Potential haben, die Berechnung der Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten zu vereinfachen und zu verbessern.

Beispiel 2

Analog zu den Beispielen 1 und 2 wurde die Immobilisierung von Rabbit Antimouse IgG (RAMFc) auf einer Sensoroberfläche mittels Adsorption bei einer Fließgeschwindigkeit von S ul/min untersucht. Das erhaltene Sensorgramm und die Reflektionsminimum-Rmin Kurve werden in Fig. 3a gezeigt. Wie der Abbildung zu entnehmen, beträgt die Spitze des Rmin Wertes etwa 26% (15611/60000) und geht einher mit einer maximalen Änderung des Rmin- Winkels von etwa 70%. Nach dem Spitzenwert kehrt Rmin zu ungefähr dem Wert der probenfreien Lösung zurück.
Der obige Fall gibt die Situation einer hohen Probenkonzentration und zweier Phasen mit gutgetrennten Brechungsindex/Reflektionskurven wieder. Eine Berechnung von Rmin für ein Zweiphasenfilmmodell mit einem Übergang via einer Reichweite von 0.57 für Phase 1, n = 1.3339, und einer Reichweite von 0.43 für Phase 2, n = 1.3498, ergab das in Fig. 3b gezeigte Ergebnis. Der Rmin Spitzenwert betrug etwa 20% einhergehend mit etwa 57% der maximalen Änderung des Rmin Winkels.

Beispiel 3

Analog zu Beispiel 1 wurde die Sensoroberfläche mit Rabbit Antimouse IgG (RAMFc) einer weiteren Charge immobilisiert und die Wechselwirkung mit der Oberfläche wurde bei einer Fliessgeschwindigkeit von 5 ul/min untersucht. Das erhaltene Sensorgramm und die Reflektionsminimum (Rmin)-Kurve werden in Fig. 4a gezeigt. Wie der Abbildung zu entnehmen ist, liegt der Spitzenwert für den Rmin-Wert bei etwa 28% (16900/60000) und geht einher mit einer maximalen Änderung des Rmin Winkels von etwa 74%. Nach dem Spitzenwert kehrt Rmin nicht zu dem Wert für eine probenfreie Lösung zurück, sondern stabilisiert sich auf einem höheren Niveau, womit eine dauerhafte Heterogenität innerhalb des untersuchten Volumens der Oberflächenschicht angezeigt wird. Die Ausfällung von Teilchen (RAMFc-Aggregatbildung) in der Probenlösung wurde ebenfalls anhand eines separaten, unabhängigen Verfahrens detektiert.
Der obige Fall gibt die Situation einer hohen Probenkonzentration und Teilchenausfällung bei zwei Phasen mit gut getrennten Brechungsindex/Reflektionskurven und einer partikulären Oberflächenfilmstruktur wieder. Eine Berechnung des korrespondierenden Rmin für ein Zweiphasenfilmmodell mit einem Übergang via einer Reichweite von 0.6 für Phase 1, n = 1.3425, und einer Reichweite von 0.4 für Phase 2, n = 1.3512, ergab das in Fig. 4b gezeigte Ergebnis. Der Rmin Spitzenwert betrug etwa 23%, einhergehend mit einer maximalen Änderung des Rmin-Winkels bei einer Reichweite von 1 bei Phase 2 etwa 79%.
Eine korrespondierende Berechnung von Rmin für einen Dreiphasenfilm mit einem Übergang via einer Reichweite von 0.33 für Phase 1, n = 1.3339, einer Reichweite von 0.33 für Phase 2, n = 1.3425, und einer Reichweite von 0.33 für Phase 3, n = 1.3512, ergab das in Fig. 4c gezeigte Ergebnis. Der Rmin-Spitzenwert betrug etwa 35%, einhergehend mit einer maximalen Änderung des Rmin-Winkels von etwa 82%.
Während keines der obigen zwei Berechnungsmodelle Ergebnisse lieferte, die mit den experimentellen Daten korrespondierten, korrespondierten sie dennoch hinreichend gut, um zu zeigen, dass es möglich ist, für eine größere Anzahl an Phasen entsprechender Brechungsindizes wie auch für eine Verteilung der Oberflächenabdeckung geeignet zu sein, um experimentelle Ergebnisse zu simulieren.

Claims

1. Ein Verfahren zur Analyse einer chemischen oder physikalischen Wechselwirkung, die in einer Filmschicht an einer optischen Sensoroberfläche stattfindet, wenn die Filmschicht mit einer Fluidprobe in Kontakt gebracht wird, welche eine Spezies enthält, die in der Lage ist, mit der Filmschicht wechselzuwirken, wobei die Wechselwirkung mittels einer ein lichtintensives Signal generierenden Technik über die Bestimmung des Brechungsindex der besagten Folienschicht überwacht wird, indem das Verhältnis zwischen einem Parameter des einfallenden und/oder reflektierten Lichts und von einem des Minimums, des Maximums und des Schwerpunkts der Lichtintensitätssignalkurve gemessen wird, gekennzeichnet dadurch, dass ebenfalls die Variation des Lichtintensitätssignalwertes bei besagtem Minimum, Maximum oder Schwerpunkt in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommen wird, um wenigstens eines zu bestimmen,

(i) den Grad an Homogenität der Probenspezieskonzentration in dem untersuchten Filmschichtvolumen, um darüber zu bestimmen, wann die Wechselwirkung Massetransport-begrenzt und wann die Wechselwirkung kinetisch kontrolliert ist, wobei ein variierendes Lichtintensitätssignalniveau eine Begrenzung des Massetransports anzeigt und ein stabilisiertes Lichtintensitätssignalniveau kinetische Kontrolle anzeigt;

(ii) den Grad an resultierender Homogenität/Heterogenität in dem untersuchten Filmschichtvolumen während oder nach der Wechselwirkung, wobei ein verändertes stabilisiertes Lichtintensitätssignalniveau den Grad an Veränderung bei der Homogenität/Heterogenität anzeigt und hierzu korrespondiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Fluidprobe eine Flüssigkeit darstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zeitintervall oder die Intervalle, wenn besagte Wechselwirkung kinetisch kontrolliert ist, über besagtes Kontrollieren des Lichtintensitätssignalwertes bestimmt wird und dass über das Verhältnis zwischen dem Brechungsindex und der zwischen besagtem Intervall oder Intervallen gemessenen Zeit die Assoziations- und/oder Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung der Probenspezies mit der Oberflächenschicht bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Assoziations- und/oder Dissoziationskonstanten automatisch ausgelöst wird, wenn die Wechselwirkung kinetisch kontrolliert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mittels besagter Überwachung des Lichtintensitätssignalwertes das Zeitintervall oder die Intervalle bestimmt werden, wenn besagte Wechselwirkung oder Wechselwirkungen Massetransport-begrenzt sind, und dass über das Verhältnis zwischen dem Brechungsindex und der zwischen dem Intervall oder den Intervallen gemessenen Zeit die Konzentration der Probenspezies bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Probenspezieskonzentration als auch die Assoziations- und/oder Dissoziationskonstanten gemessen werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich besagte Homogenität/Heterogenität auf eine oder mehrere physikalische Bedingungen, thermodynamische Bedingungen und chemische Bedingungen der besagten Filmschicht bezieht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Homogenität/Heterogenität in der Oberflächenfolienschicht ausgewählt wird aus Proteinaggregaten, die über Ausfällungs-, Agglutinations- oder Ausflockungsreaktionen erzeugt werden; Membrankomplexen wie biologischen Zellen und Zellmembranfragmenten; makromolekularen Produktkomplexen, erzeugt durch enzymatische Reaktionen; und zellularen Produktkomplexen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Konzentration der Probenspezies in Bezug zu der gemessenen Homogenität/Heterogenität gemessen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch eine Präimmobilisierung eines Reaktantenliganden auf der Sensoroberflächenfilmschicht und Bestimmung jedweder Heterogenität in der resultierenden Ligandenkonzentration oder -struktur darin.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Halbbreite der Lichtintensitätssignalkurve gegen die Zeit überwacht wird, um zusätzliche Informationen über den Grad der resultierenden Homogenität/Heterogenität innerhalb des untersuchten Filmvolumens zu erhalten.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Lichtintensität produzierende Signaltechnik auf der Reflektometrie, der Reflektionsellipsometrie, der Reflektionsinterferometrie oder der resonanzkontrollierten Detektion in einem Wellenleiter basiert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Technik auf interner Reflektion, einschließlich der Messung der Oberflächenplasmonresonanz, des Brewster-Winkels, des kritischen Winkels, der Ellipsometrie oder Resonanzmoduskopplung basiert, oder dass sie auf externer Reflektion, einschließlich der Messung des Brewster-Winkels oder der Ellipsometrie basiert.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Parameter des Lichts ausgewählt wird aus Wellenlänge, Einfallswinkel und Polarisationszustand.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Wechselwirkung überwacht wird, indem wenigstens zwei unterschiedliche Wellenlängen und ein fester Einfallswinkel verwendet werden.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Wechselwirkung überwacht wird, indem wenigstens zwei unterschiedliche Wellenlängen und wenigstens zwei unterschiedliche Einfallswinkel verwendet werden.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Wechselwirkung überwacht wird, indem ein kontinuierlicher Abtastbereich (Scan) eines vorbestimmten Einfallswinkels oder eines Wellenlängenbereiches verwendet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Wechselwirkung überwacht wird, indem wenigstens zwei verschiedene Polarisationszustände und ein fester Einfallswinkel und eine feste Wellenlänge verwendet werden.

19. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Wechselwirkung überwacht wird, indem ein kontinuierlicher Abtastbereich (Scan) eines vorbestimmten Polarisationszustandsbereiches verwendet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass interne Reflektionsdaten verwendet werden, die bei einer Anzahl an Wellenlängen gemessen worden sind, um den Zustand der Homogenität/Heterogenität in Richtung der Penetrationstiefe der evaneszenten Welle zu bestimmen, wobei besagte Penetrationstiefe sich in Abhängigkeit von der Wellenlänge ändert.

21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkungen an zwei oder mehreren Sensoroberflächen gleichzeitig unter Verwendung eines einzigen Lichtstrahles analysiert werden.

22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Fluidprobe mit der Filmschicht in einer fließenden Flüssigkeit, bevorzugt in einer Durchflusszelle, kontaktiert wird.

23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Parameter des einfallenden und/oder reflektierten Lichts und entweder das Minimum oder der Schwerpunkt der Lichtintensitätssignalkurve gemessen werden, dadurch gekennzeichnet, dass ebenfalls die Variation des Lichtintensitätssignalminimumwertes in Abhängigkeit von der Zeit überwacht wird.