DE10106654A1

DE10106654A1 - Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung eines Analyten

Info

Publication number: DE10106654A1
Application number: DE10106654A
Authority: DE
Inventors: Emil Palecek; Joerg Hassmann
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2001-02-12
Publication date: 2002-09-05
Also published as: DE10290517D2; US20040096859A1; WO2002064823A2; WO2002064823A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder Quantifizierung eines Analyten in einer Flüssigkeit, insbesondere von Nukleinsäuren, mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Bereitstellen von Mikropartikeln mit einer an deren Oberfläche gebundenen Sonde, welche eine spezifische Affinität für den Analyten aufweisen, DOLLAR A b) Herstellen einer den Analyten und die Mikropartikel enthaltenden ersten Lösung unter Bedingungen, unter denen der Analyt an die Sonde bindet, DOLLAR A c) Trennen der Mikropartikel von der ersten Lösung, DOLLAR A d) Nachweis des Analyten mittels eines elektromechanischen Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung eines Analyten.

Nach dem Stand der Technik ist aus der US 6,100,045 ein Ver fahren zum Nachweis eines Analyten bekannt. Dabei wird der Analyt mit einer redoxaktiven Substanz markiert und an eine feste Phase gebunden. Bei der festen Phase kann es sich um magnetische Mikropartikel handeln. Die feste Phase ist in der Nähe einer Elektrode angebracht. Mittels der redoxaktiven Markierung wird die Bindung des Analyten an die feste Phase als amperometrisches Signal über die Elektrode nachgewiesen. - Das bekannte Verfahren ist nicht besonders sensitiv. Zu dessen Durchführung ist eine relativ kompliziert aufgebaute Vorrichtung erforderlich.

Ferner ist es z. B. aus der US 5,871,918 bekannt, einen Analy ten, z. B. eine DNA, mit einer an eine Elektrode gebundene Sonde zu hybridisieren. Der Nachweis der Hybridisierung er folgt über Redoxindikatoren. In der WO 89/10556 ist beschrie ben, daß die Hybridisierung auch über die im Hybridisierungs zustand erhöhte Leitfähigkeit der DNA nachgewiesen werden kann. - Die Hybridisierung einer DNA mit einer an der Elek trodenoberfläche gebundenen Sonde ist nicht immer möglich, weil sich an der Elektrode störende dritte Moleküle anlagern. Auch diese Verfahren sind nicht besonders sensitiv.

Aufgabe er Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein möglichst schnell und einfach durchführbares Verfahren erhöhter Sensi tivität zum Nachweis eines Analyten angegeben werden.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruch 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18.

Nach Maßgabe er Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung eines Analyten in einer Flüssig keit, insbesondere von Nukleinsäuren, mit folgenden Schritten vorgesehen:

a) Bereitstellen von Mikropartikeln mit einer an deren Ober fläche gebundenen Sonde, welche eine spezifische Affini tät für den Analyten aufweist,
b) Herstellen einer den Analyten und die Mikropartikel ent haltenden ersten Lösung unter Bedingungen, unter denen der Analyt an die Sonde bindet,
c) Trennen der Mikropartikel von der ersten Lösung und
d) Nachweis des Analyten mittels eines elektrochemischen Verfahrens.

Der Begriff "Analyt" umfaßt insbesondere Nukleinsäuren, Hor mone, Antikörper, Antigene pathogene Stoffe, Medikamente, An tibiotika und dgl. (Unter einer Sonde wird ein Molekül ver standen, welches den Analyten bindet oder eine spezifische Bindungsaffinität für den Analyten besitzt. Es kann sich bei der Sonde z. B. um Antikörper, Antigene, Fragmente von Anti körpern, Rezeptoren, Nukleinsäuren oder Liganden handeln.

Bei den Mikropartikel handelt es sich um Partikel, welche ei nen mittleren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 200 µm, vor zugsweise von 1 bis 20 µm aufweisen und dazu geeignet sind, an ihre Oberfläche Sonden zu binden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist schnell und einfach durch führbar. Es ist hochsensitiv. Die hohe Sensitivität wird durch das Trennen der Mikropartikel von der ersten Lösung und dem Nachweis des Analyten mittels eines elektrochemischen Verfahrens ermöglicht.

Nach einer Ausgestaltung, die auch mit den folgenden auf den Nachweis des Analyten bezogenen Ausgestaltungen kombiniert werden kann, sind die Mikropartikel magnetisch ausgebildet. Es handelt sich dabei zweckmäßigerweise um an sich bekannte "magnetische Beads". Die magnetische Ausbildung der Mikropar tikel erleichtert deren Trennung von der ersten Lösung.

Nach einer weiteren zweckmäßigen Ausgestaltung ist der Analyt oder die Sonde mit Osmium, vorzugsweise Osmiumtretroxid, ent haltenden Komplexverbindungen markiert. Das ermöglicht auf einfache Weise einen elektrochemischen Nachweis des Analyten. Die Komplexverbindung kann, vorzugsweise endständig, an den Analyt oder die Sonde gebunden sein. Ferner ist es möglich, die Sonde mit Cystein zu markieren. Das ermöglicht in Kombi nation mit dem Einsatz Quecksilber-haltiger Elektroden ein durch katalytische Wasserstoffentwicklung bewirktes elektrochemisches Signal, welches zum Nachweis des Analyten geeignet ist.

Nach einer weiteren Ausgestaltung kann nach der Bindung des Analyten an die Sonde eine mit Cystein oder Osmium- Komplexverbindungen markierte Reporter Probe zugegeben wird, so daß die Reporter Probe mit einem einzelsträngigen Überhang des Analyten hybridisiert. Die Reporter Probe kann vom Analy ten entfernt und nachfolgend elektrochemisch nachgewiesen wird.

Vorzugsweise werden die Mikropartikel zum Nachweis des Analy ten in eine zweite Lösung überführt. Die zweite Lösung kann in ihrer Zusammensetzung hinsichtlich des Nachweises des Ana lyten mittels des elektrochemischen Verfahrens optimiert wer den. Insbesondere kann weitgehend ausgeschlossen werden, daß der elektrochemische Nachweis des Analyten durch unerwünsch te, ggf. in der ersten Lösung enthaltene, Fremdstoffe gestört wird. Wegen der besonders hohen Sensitivität des erfindungs gemäßen Verfahrens kann auf eine Amplifizierung des Analyten verzichtet werden. Der Analyt kann unmittelbar in seiner bio logisch relevanten Konzentration elektrochemisch nachgewiesen werden. Der zweiten Lösung kann nach einer weiteren Ausge staltung zum Nachweis ein für den Analyten spezifischer er ster Antikörper zugesetzt werden. Der zweiten Lösung kann auch ein den Analyten oder den ersten Antikörper chemisch mo difizierendes Enzym, vorzugsweise Peroxidase, zugesetzt wer den. Die chemische Modifikation des Analyten kann z. B. zu ei nem elektroaktiven Produkt führen, welches eine katalytisches Signal erzeugt. Bei der Verwendung von DNA als Analyt kann die chemische Modifikation auch darin bestehen, daß die DNA immunogen wird. Die immunogene DNA kann z. B. über an spezifi sche Antikörper gekoppelte Enzyme, wie z. B. Peroxidase, de tektiert werden. Es ist auch möglich, einen spezifisch an den ersten Antikörper bindenden zweiten Antikörper der zweiten Lösung zuzusetzten. Der zweite Antikörper ist vorzugsweise markiert.

Nach einem besonders vorteilhaften Ausgestaltungsmerkmal wird der Analyt in der zweiten Lösung mittels Säure hydrolisiert. Bei Verwendung von DNA als Analyt werden bei der Hydrolyse die Purin-Basen frei gesetzt. Die freigesetzten Purin-Basen bilden mit Quecksilber unlösliche Komplexe. Derartige Komple xe können in geringsten Konzentrationen z. B. an einer "Han ging Mercury Drop Electrode" (HMDE) oder anderen Quecksilber haltigen Elektroden mittels geeigneter elektrochemischer Ver fahren nachgewiesen werden.

Des weiteren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, beim Schritt lit. d ein magnetisches oder elektrisches Feld anzu legen, so daß die Mikropartikel bzw. der Analyt in die Nähe einer Elektrode bewegt werden. Die Mikropartikel können an die Elektrode gebunden oder in deren Nähe gehalten werden. Die vorgenannten Merkmale tragen auch zu einer Beschleunigung des Verfahrens bei.

Zweckmäßig ist es, für einen vorgegebenen Zeitabschnitt ein magnetisches oder elektrisches Gegenfeld anzulegen, so daß die elektrochemische Detektion störende Moleküle oder Mikro partikel von der Elektrode wegbewegt werden. Das Anlegen des Feldes und des Gegenfeldes kann zyklisch erfolgen. Dadurch wird nochmals die Sensitivität des Verfahrens erhöht.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal enthält die Elek trode mindestens eines der folgenden Materialien: Elektrisch leitfähigen Kunststoff und/oder Polymere, Quecksilber, Gold, Kohlenstoff oder Indium-Zinnoxid. Die vorgenannten Materiali en haben sich als besonders geeignet zur Durchführung einer sensitiven Messung erwiesen.

Auf oder vor der Oberfläche der Elektrode und/oder vor einer die Elektrode enthaltenden Meßzelle kann eine Schicht oder eine Membran zum Zurückhalten von Molekülen einer vorgegebe nen Größe vorgesehen sein. Das Vorsehen einer solchen Schicht bzw. Membran ist insbesondere dann von Vorteil, wenn der Ana lyt durch Säurebehandlung oder durch Zugabe eines Enzyms in kleine Fragmente oder durch Säurebehandlung in Purin-Basen aufgespalten wird. In diesem Fall können große die elektro chemische Detektion störende Moleküle von der Oberfläche mit tels der Schicht oder der Membran ferngehalten werden, wäh rend z. B. die Purin-Basen durch die Schicht bzw. die Membran hindurch treten und bis zur Oberfläche der Elektrode gelan gen. Damit kann nochmals die Sensitivität des Verfahrens er höht werden. Eine engmaschig ausgebildete Membran oder Schicht kann auch dazu dienen, den Analyten von der Elektro denoberfläche wegzuhalten und ihn damit vor Schädigungen durch an der Elektrode gebildete naszierende Gase, wie z. B. Sauerstoff und Wasserstoff zu schützen.

Als elektrochemisches Nachweisverfahren hat sich die Cathodic Stripping Voltammetry (CSV) als besonders vorteilhaft erwie sen. Damit gelingt es z. B. Purin-Basen in einem Konzentrati onsbereich von unter 10^-8 M nachzuweisen.

Es ist auch zweckmäßig, mit dem elektrochemischen Nachweis verfahren Hydrolyseprodukte des Analyten mittels ihres spezi fischen Redoxverhaltens zu identifizieren. So kann z. B. Adenin als Bestandteil eines hydrolysierten Analyten eindeu tig anhand seines spezifischen Redoxsignals nachgewiesen wer den. Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann der Analyt mittels eines kompetetiven Assay angereichert oder auf gereinigt werden. Auch diese Maßnahme trägt zur Erhöhung der Sensitivität des Verfahrens bei.

Allgemeine Beschreibung verschiedener Verfahrensvarianten A. Detektion einer DNA durch Nachweis der Purin-Basen mit tels cathodic stripping voltammetry (CSV)

Aus einer Ziel-DNA können durch Behandlung mit Säure die Pu rin-Basen Adenin und Guanin gelöst werden. Die Purin-Basen bilden mit Quecksilber unlösliche Komplexe. Solche Komplexe können schon in sehr geringen Konzentrationen von unter 10^-8 M an einer "Hanging Mercury Drop Electrode" (HMDE) oder ande ren quecksilberhaltigen Elektroden mittels CSV nachgewiesen werden, ohne die restliche DNA vorher zu entfernen. Wenn die Ziel-DNA eine deutlich größere Länge als die Sonde hat, kann vorteilhafterweise die Anwesenheit der Sonde vernachlässigt wer len.

Falls größere die elektrochemische Detektion der Purin-Basen störende Moleküle im zu untersuchenden biologischen Material vorhanden sind, kann die Elektrode mit einer semipermeablen Membran umgeben werden. Durch die semipermeable Membran werden größere Moleküle zurückgehalten, während die kleineren, wie die Purin-Basen, die Elektrode ungehindert erreichen kön nen.

B. Detektion einer DNA durch chemische Modifikation und nachfolgende elektrochemische Detektion

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Analyt, z. B. eine DNA, zunächst chemisch modifiziert. Es ist jede chemische Modifikation geeignet, die zu einem elektroak tiven Produkt führt. Es ist aber vorteilhaft, wenn das Pro dukt ein katalytisches Signal erzeugt oder den Analyten immu nogen macht. Die chemische Modifikation kann wie folgt ausge bildet sein:

B.1 Modifikation gebundener DNA oder anderer Nukleinsäuren durch Osmium Tetroxid Komplexe

In einzelsträngige DNA (ssDNA) kann als elektroaktiver Marker unter physiologischen Bedingungen ein Osmium-Tetroxid-Komplex (Os,L) eingelagert werden. Es kann sich dabei um Osmium Te troxid, 2,2'-bipyridin handeln. Der eingelagerte Os,L verur sacht ein durch katalytische Wasserstoffentwicklung hervorge rufenes starkes Signal. Das ermöglicht einen Nachweis von ssDNA bis zu einer Konzentration von 500 pg/ml.

Os,L kann sowohl als basenspezifischer Marker, speziell für Thymin, als auch als einzelstrangspezifischer Marker einge setzt werden. Weiterhin ist der Einsatz von markierten in ei nem Sekundärprozess an DNA bindenden Sonden ("Reporter Pro bes") möglich. Die Detektion kann neben durch die DNA selbst, die osmiumhaltigen Komplexe oder durch diese katalysierte Prozesse über einen immunologischen Sekundärschritt erfolgen:

B.1.1 Basenspezifischer Marker

Oligonukleotide und Polynukleotide an ihren Enden mit Os,L markiert werden, wenn sie einen T_n-Schwanz besitzen und keine weitere Pyrimidin-Base im restlichen Molekül (R), das eine DNA-Hybridisation eingehen soll, zu finden ist. Befinden sich in R zusätzlich neben den Guanin und Adenin auch noch einige Cytonsine, müssen speziell angepaßte Versuchsbedingungen an gewendet werden.

B.1.2 Einzelstrangspezifischer Marker

Nukleinsäuren können am Ende mit einem Os,L markiert werden. Bei einer doppelsträngigen DNA ist für die Markierung ein einzelsträngiger T_n Überhang oder zumindest ein T-haltiger Überhang notwendig. Die Modifikation muß unter Bedingungen erfolgen, die Stabilität der DNA (oder RNA, PNA, usw.) Dop pelhelix nicht beeinträchtigen, d. h. bei ausreichend hoher Ionenstärke (bei DNA und RNA), einem nahezu neutralen pH- Wert, und einer nicht zu hohen Temperatur (z. B. bei 37°C). Wird eine einzelsträngige Sonde benutzt, muß die dop pelsträngige DNA nach der Modifikation mit Os,L denaturiert und der mit Os,L modifizierte Strang isoliert werden.

Bei den beiden vorerwähnten Markierungsmethoden kann die An zahl der Marker an den Nukleinsäure-Enden sowohl im Sondenmo leküle wie auch im Einzelstrang durch die Menge an Thymin, die an die Molekülenden angebracht sind, kontrolliert werden.

Durch einen T_n-Überhang wird je nach Position des T_n- Überhangs bestimmt, ob am 5- oder 3'-Ende markiert wird. Das Anbringen von Thymin Resten an einem Ende der DNA macht das Molekül elektroaktiv und immunogen. Durch die Thyminüber hänge wird die Hybridisierung des Rests des Moleküls nicht beeinträchtigt.

B.1.3 Reporter Probes

Zur Markierung von nachzuweisender DNA können auch Reporter Probes, d. h. in einem Sekundärprozess an die nachzuweisende DNA bindende, mit Os,L-Komplexen markierte weitere Sonden eingesetzt werden.

Die nachzuweisende DNA weist nach der Hybridisierung mit der Sonde einen einzelsträngigen Überhang auf. Daran können zum Überhang komplementäre kurzkettige DNA-Moleküle hybridisiert werden, die vorzugsweise am poly(dT)-Schwanz mit Os,L- Komplexen versehen sind (Reporter Probe). Nach der Extraktion der die Sonden tragenden beads können die Reporter Proben in einer zweiten Lösung von der Ziel-DNA entfernt und dann die Os,L-Komplexe elektrochemisch nachgewiesen werden.

Durch eine Verlängerung des poly(dT)-Schwanzes der Reporter Proben kann die Sensitivität zusätzlich erhöht werden. In diesem Fall kann gleichzeitig an eine Mehrzahl relevanter Se quenzen der Ziel-DNA hybridisiert werden kann; es können so mit Informationen, z. B. über Punktdefekte oder über eine Mehrzahl von Sequenzen erhalten werden.

B.1.4 Detektion über katalytische Signale und immunologische Reaktionen

Es ist auch möglich, die gebundene Ziel-DNA mit einem Os,L Komplex wie z. B. Os,2,2'-Bipyridin (Os,bipy) zu behandeln und nach einem Waschschritt von den Mikropartikeln zu entfernen. Die elektrochemische Detektion ist direkt mit Hilfe des kata lytischen Signals des DNA-Os,L Komplexes, oder indirekt über spezifische mit einem Enzym markierte Antikörper möglich. Der Antikörper bindet an den DNA-Os,L Komplex und der Komplex wird elektrochemisch über eine enzymatische Reaktion nachge wiesen. Im Unterschied zu dem direkten Nachweis benötigt die indirekte immunochemische Methode keine HMDE sondern kann mit verschiedenen anderen festen Elektroden gemessen werden.

C. Detektion des Analyten mittels markierter ein katalyti sches Signal erzeugenden Sonden

Der Analyt, z. B. eine Nukleinsäure, kann auch mit Cystein markiert werden. Eine solche Markierung wird im Falle von DNA und PNA im folgenden als cys-DNA bzw. cys-PNA bezeichnet. Durch eine solche Markierung wird an quecksilberhaltigen Elektroden ein durch katalytische Wasserstoffentwicklung ein elektrochemisches Signal erzeugt. Das Signal ist hochspezi fisch z. B. für cys-PNA oder cys-DNA; es wird nicht von reinen Nukleinsäuren erzeugt. Die Nachweisgrenze für cys-PNA liegt bei einer Konzentration von weniger als 200 pg/mL. Im Falle von cys-DNA ist von einer ähnlichen Nachweisgrenzen auszuge hen. Wird die Analyse in einen 5 µl Tropfen durchgeführt, kann cys-PNA also schon bei einer Konzentration von 400 atto mol nachgewiesen werden. Die Menge an cys-PNA die mit der Elektrodenoberfläche interagiert, ist noch deutlich geringer. Mit Cystein markierte Sonden können analog zum in B.1.4 be schriebenen Prozess als Reporter Proben eingesetzt werden.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispie len und der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1a und b ein erstes CSV-Voltamogramm,

Fig. 2 den Einfluß der Konzentration von aphorini scher Säure (APA) auf die Bestimmung von Adenin,

Fig. 3a und b ein zweites CSV-Voltamogramm und

Fig. 4 einen Vergleich der Spezifität der Bindung von Poly A und CT ss DNA.

Fig. 1a zeigt ein DPCS Voltammogramm von Adenin bei einer Konzentration von 1,2 und 2,4 × 10^-8 M ohne Grundlinienkor rektur; Fig. 1b zeigt das DPCS Voltammogramm nach Fig. 1a mit Moving Average Grundlinienkorrektur. Die Kurve 1 stellt je weils den Hintergrund des Elektrolyten dar, die Kurve 2 ent spricht 1,2 × 10^-8 M Adenin und die Kurve 3 ist eine Messung an 2,4 × 10^-8 M Adenin; E_i = -0,2 V, t = 5 Min., v = 5 mV/s, A = 50 mV, 0,05 M Boratpuffer.

Fig. 2 zeigt den Einfluß von apurinischer Säure (APA) auf die Bestimmung von Adenin. Nachfolgend wurden zu einer 2,4 × 10^-8 M Adenin Lösung die entsprechenden Aliquots APA hinzugegeben: Säule 1: 2,4 × 10^-8 M Adenin (ohne APA); Säule 2: plus 1,2 × 10^-8 M APA; Säule 3: plus 2,4 × 10^-8 M APA; Säule 4: plus 1,2 × 10^-7 M APA; Säule 5: plus 9,1 × 10^-7 M APA. Die angegebene Konzentra tion von APA ist bezogen auf den Monomergehalt. DPSCV, E_i = 0,15 V, t_A = 5 Min., v = 5 mV/s, A = 50 mV.

Fig. 3a zeigt einen Vergleich äquimolarer Konzentrationen von Guanin und Adenin mit depurinisierter DNA. Die Kurve gibt den Hintergrund des Elektrolyten wieder. Kurve 2: 2: 4,9 × 10^-8 M Adenin (ohne APA); Kurve 3: 4,9 × 10^-8 M Adenin plus 3,7 × 10^-8 M Guanin; Kurve 4: depurinisierte Einzelstrang DNA (ssDNA) (4,3 × 10^-8 M). In Fig. 3b zeigt die Kurve 1 den Hintergrund des Elektrolyten; Kurve 2: depurinisierte ssDNA; Kurve 3: de purinisierte dsDNA (beide Proben 4,3 × 10^-8 M). Die DNA- Konzentrationen sind bezogen auf den Monomergehalt. DPSCV, E_i = 0,15 V, t_A= 5 Min., v = 5 mV/s, A = 50 mV.

Fig. 4 zeigt einen Vergleich von CT ssDNA mit poly(A) RNA. 15 µl 3,1 × 10^-4 M (2) poly (A) oder (3) CT ssDNA wurden mit 15 µl DB in Bindungspuffer hybridisiert. 15 µl DB wurde als Kon trolle in den Bindungspuffer ohne Nukleinsäuren eingesetzt. Die nachfolgende Prozedur wurde dem nachstehenden Ausfüh rungsbeispiel 1 durchgeführt. Im Vergleich zu poly(A) RNA wurde mit CT ssDNA fast kein Adeninsignal erhalten.

1. Ausführungsbeispiel

Das erste Ausführungsbeispiel betrifft die Hybridisierung von poly(A)-ODNs und der Oberfläche von magnetischen Beads und deren Nachweis mittels CSV.

a) Präparation der ersten Testlösung und Hybridisierung

Zur Präparation von poly(A) Proben für die Cathodic Stripping Voltammetry (CSV) wird ein Aliquot von 10 µl Dynabeads Oli go(dT)₂₅ (DB) zwei mal im gleichen Volumen Bindungspuffer ge waschen. Dann werden 10 µl poly(A) (abhängig von der Monomer konzentration) mit bekannter Konzentration zum Bindungspuf fer-DB Ansatz gegeben. Die Mischung wird für 20 min. gerührt. Hierbei erfolgt die Hybridisierung zwischen dem poly(A) und dem Oligo(T) Kette an der Oberfläche der DB.

b) Separation der hybridisierten Partikel, Eluieren und Hy drolyse der poly(A)-Ketten

Nach der Konjugation werden die DB mehrmals mit Waschpuffer gewaschen. Die DB werden weitere 2 min in 100 µl Puffer unter Rühren inkubiert. Anschließend werden die DB viermal für je weils 2 min. in 100 µl Phosphatpuffer (pH = 7,0) und einmal in 100 µl Boratpuffer (pH = 7,7) auf dem Rührer gewaschen. Um die poly(A) Ketten zu eluieren, werden die DB für 2 min. in 10 µl 5 mM Boratpuffer bei 85°C inkubiert. Durch Zugabe von 10 µl 1 M HClO₄ und Inkubation für 30 min. bei 65°C wird das poly(A) hydrolysiert. Das HClO₄ wird anschließend durch Zugabe von 20 µl einer 0,5 M NaOH Lösung neutralisiert.

c) Alternatives Hybridisierungsverfahren

Es kann auch eine dreifache Hybridisierung angewendet werden. Dazu wird nach der Hybridisierung von DB und poly(A), das Bead-poly(A) Gemisch zweimal in 10 µl Bindungspuffer gewa schen. Zu den DB wird poly(A) in der gleichen Konzentration wie poly(T) gegeben, um mit dem gebundenen poly(A) ein Duplex zu bilden, und dieses Gemisch wird für 20 min auf einem Rüh rer inkubiert. Anschließend wird poly(A) in der gleichen Kon zentration wie poly(A) und poly(T) zugegeben, um die freien einzelsträngigen Enden von poly(T) zu binden. Die DB-enthal tende Lösung wird, wie oben beschrieben, mehrmals gewaschen. Die Menge von poly(A) wird durch CSV Messung von Adenin er mittelt.

d) Elektrochemische Detektion der Adeninbasen

Die anschließende Cathodic Stripping Voltammetry von Adenin erfolgt mit Hilfe des Differential Pulse Modus (DPCSV). Als Elektrolyt wird ein 0.05 M Boratpuffer verwendet. Das Voltam mogram von Adenin in geringer Konzentration ist in Fig. 1. gezeigt. Die Kurven wurden bei einem Depositionspotential von -0.2 V und einer Wartezeit von 5 min. erhalten. Die Adenin Peaks befinden sich nahe bei 0 V und wandern mit steigender Adeninkonzentration in den negativen Meßbereich. Eine höhere Symmetrie wurde durch Korrektur der Basislinie mittels der "Moving Average"-Methode erzielt (Fig. 1b).

2. Ausführungsbeispiel Freisetzung von Purin-Basen aus DNA (oder RNA) durch Säurebehandlung

Das zweite Ausführungsbeispiel zeigt eine Möglichkeit des Nachweises von DNA durch Hybridisierung an Partikeln, Depuri nisierung und CSV auf. Weiterhin wird gezeigt, daß die nach der Depurinisierung verbleibende DNA keinen Einfluß auf den Nachweis und die Quantifizierung der Purin-Basen hat.

a) Freisetzung der Purin-Basen, Entstehung von apurinischer Säure

Bei dieser Methode wird die an DB gebundene DNA durch CSV nachgewiesen. Durch Säurebehandlung der DNA werden die Purin- Basen (Adenin und Guanin) freigesetzt. Durch die Entfernung der Purin-Basen aus dem DNA-Gerüst entstehen Brüche in den DNA-Strängen, wodurch apurinische Säure (APA) und freies Adenin und Guanin entsteht. Das durchschnittliche Molekular gewicht von APA beträgt ca. 15 000. Durch die CSV kann Adenin und Guanin in nanomolaren Konzentrationen nachgewiesen wer den. Der Vorteil dieser Methode liegt in einer extrem hohen Sensitivität bei der Bestimmung von DNA.

APA wird durch eine 24-stündige Dialyse von Kalbsthymus DNA gegen 0.1 M HCl erhalten. Adenin und Guanin werden von dem DNA Zucker-Phosphat Rückgrat abgespalten und durch Dialyse vom APA getrennt. Die vollständige Entfernung der Basen wurde voltammetrisch geprüft.

b) Elektrochemischer Nachweis durch CSV, Einfluß von APA

Der Einfluß von APA auf den Adeninnachweis wird mittels CSV getestet, indem APA der Adenin-Lösung zugesetzt wird. Es wird zu einer 1.2 × 10^-8 M Adeninlösung APA in den Konzentrationen von 1.2 × 10^-8 M bis 9.1 × 10^-4 M zugefügt. Erst bei einem 10- fachen Überschuß von APA ist ein leichten Rückgang des Aden inpeaks zu beobachten (Fig. 2). Beim höchsten Überschuß von APA von 10⁴ stieg der Adeninpeak um etwa 12% leicht an, was wahrscheinlich auf Spuren unabgespaltener Purin-Basen in APA zurückzuführen ist.

Die Ergebnisse zeigen, daß DNA in geringsten Konzentrationen nach Entfernen der Purin-Basen mit Hilfe der CSV nachgewiesen werden kann. Der Nachweis basiert auf den CSV-Peaks der Pu rin-Basen in Anwesenheit von APA. Das APA beeinflußt den DNA Nachweis nicht.

Kalbsthymus-DNA enthält ca. 57% Adenin und 43% Guanin. Bei einer Depurinisierung müßte also das gleiche Basenverhältnis erzielt werden. Ein Vergleich der DPCSV Signale, welche nach der Depurinierung der DNA erhalten worden sind, mit dem Si gnal bei einer gleichen Konzentration an Adenin und Guanin, zeigt, daß der Peak bei dem Adenin-Guanin-Gemisch um nur 10% höher als bei depurinisierter DNA in äquimolaren Konzentra tionen ist (Fig. 3a). Die Depurinisierung von einzel- und doppelsträngiger DNA ergibt erwartungsgemäß mit der DPSCV keinen Unterschied (Fig. 3b).

Aufführungsbeispiel 3 Elektrochemischer Nachweis spezifi scher Hybridisierung von Nukleinsäuren an magnetischen Beads

Das dritte Ausführungsbeispiel zeigt die Spezifität der Hy bridisierung auf Partikeloberflächen.

Um die Spezifität der Hybridisierung nachzuprüfen, werden 25 Basen poly(T) ODN an die DB gebunden und mit poly(A) bzw. un spezifischer Kalbsthymus (CT) DNA, hybridisiert. Dazu wird 15 µl 3.1 × 10^-4 M poly(A) und CT DNA in 15 µl BD Bindungspuffer hybridisiert. Nach der Hybridisierung werden die DB aus der Lösung extrahiert und analog zum Ausführungsbeispiel 1 durch Adenin-CSV analysiert.

Eine Analyse der Höhe der Adenin-Peaks beweist die Spezifität der Hybridisierung. Die Hybridisierung mit poly(A) zeigt ei nen klaren Adenin Peak, nur ein geringes Hintergrundsignal kann nach Hybridisierung mit CT DNA gemessen werden obwohl die CT DNA einen hohen Adeninanteil aufweist (Fig. 4).

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und/oder Quantifizierung eines Analyten in einer Flüssigkeit, insbesondere von Nukleinsäu ren, mit folgenden Schritten:

a) Bereitstellen von Mikropartikeln mit einer an deren Oberfläche gebunden Sonde, welche eine spezifische Affinität für den Analyten aufweisen,
b) Herstellen einer den Analyten und die Mikropartikel ent haltenden ersten Lösung unter Bedingungen, unter denen der Analyt an die Sonde bindet,
c) Trennen der Mikropartikel von der ersten Lösung,
d) Nachweis des Analyten mittels eines elektrochemischen Verfahrens.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikropartikel ma gnetisch ausgebildet sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Analyt oder die Sonde mit Osmium, vorzugsweise Osmiumtretroxid, enthal tenden Komplexverbindungen markiert ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Komplexverbindung, vorzugsweise endständig, an den Analyt oder die Sonde gebunden ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sonde mit Cystein markiert ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach der Bindung des Analyten an die Sonde eine mit Cystein oder Osmium-Komplexverbindungen markierte Reporter Probe zu gegeben wird, so daß die Reporter Probe mit einem einzel strängigen Überhang des Analyten hybridisiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Reporter Probe vom Analyten entfernt und nachfolgend elektrochemisch nachgewie sen wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikropartikel zum Nachweis des Analyten in eine zweite Lösung überführt werden.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zweiten Lösung zum Nachweis ein für den Analyten spezifi scher erster Antikörper zugesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zweiten Lösung ein den Analyten oder den ersten Antikör per chemisch modifizierendes Enzym, vorzugsweise Peroxidase, zugesetzt wird.

11. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüche, wobei ein spezifisch an den ersten Antikörper bindender zweiter Anti körper der zweiten Lösung zugesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt in der zweiten Lösung mittels Säure hydrolysiert wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei Verwendung von DNA als Analyt bei der Hydrolyse die Pu rin-Basen freigesetzt werden.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. d ein magnetisches oder elektrisches Feld angelegt wird, so daß die Mikropartikel bzw. der Analyt in die Nähe einer Elektrode bewegt werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikropartikel an die Elektrode gebunden oder in deren Nä he gehalten werden.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei für einen vorgegeben Zeitabschnitt ein magnetisches oder elektrisches Gegenfeld angelegt wird, so daß die elektroche mische Detektion störende Moleküle oder Mikropartikel von der Elektrode wegbewegt werden.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anlegen des Felds und des Gegenfelds zyklisch erfolgt.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektrode mindestens eines der folgenden Materialien ent hält: elektrisch leitfähiger Kunststoff, Polymere, Quecksil ber, Gold, Kohlenstoff, Indium-Zinnoxid.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf oder vor der Oberfläche und/oder vor einer die Elektrode enthaltenden Meßzelle eine Schicht oder eine Membran zum Zu rückhalten von Molekülen einer vorgegebenen Größe vorgesehen ist.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als elektrochemisches Nachweisverfahren die Cathodic Strip ping Voltammetry (CSV) verwendet wird.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mittels des elektrochemischen Nachweisverfahrens der Analyt und/oder dessen Hydrolyseprodukte mittels ihres spezifischen Redoxverhaltens identifiziert werden.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt mittels eines kompetetiven Assay angereichert oder aufgereinigt wird.