DE10214719A1

DE10214719A1 - Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren, Analyseverfahren hierzu sowie Verfahren zur Herstellung des Sensors

Info

Publication number: DE10214719A1
Application number: DE2002114719
Authority: DE
Inventors: Christian Paulus; Roland Thewes; Alexander Frey
Original assignee: Infineon Technologies AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2002-04-03
Publication date: 2003-11-20
Also published as: WO2003083134A1

Abstract

Es sind mindestens eine Detektionselektrode vorgesehen, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio)organischen Oligomeren und Polymeren immobilisiert sind sowie mindestens zwei Attraktionselektroden, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden. Die Detektionselektrode ist zwischen dnm zweiten Elektroden angeordnet, derart, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu erfassenden chemischen Verbindungen möglicherweise enthaltender, auf die Sensor-Anordnung aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird.

Description

Die Erfindung betrifft einen Sensor und ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio organischen Oligomeren und Polymeren in Lösungen, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Sensors. Die Erfindung betrifft insbesondere einen solchen Sensor und ein solches Verfahren, die zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Biopolymeren auf elektronische Weise geeignet sind.
In der medizinischen Analytik müssen Stoffe nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden, die nur in sehr niedriger Konzentration in einer Lösung enthalten sind. Ein Beispiel hierfür ist die DNA-Analyse. Es sind einige optische Verfahren bekannt, bei denen Fluoreszenzlabel verwendet werden, welche an die zu detektierende DNA gebunden werden. Nach Hybridisierung dieser markierten Makromoleküle mit dazu passenden, auf einer Sensoroberfläche gebundenen Fänger- oder Sondenmolekülen kann durch Einstrahlung kurzwelligen Lichts und Messung der Fluoreszenzintensität die Konzentration des Stoffes im Analyten bestimmt werden.
Aus [2] ist eine weitere Methode zur Analyse eines Elektrolyten auf existierende DNA-Stränge mit vorgegebener Sequenz bekannt. Hierbei werden die DNA-Stränge mit der gewünschten Sequenz markiert und aufgrund der Fluoreszenzeigenschaften der markierten Moleküle wird deren Existenz bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden DNA-Strang, emittierte Licht erfasst. Aufgrund dieses Fluoreszenzverhaltens wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz im Elektrolyten enthalten ist oder nicht. Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, zumal eine sehr genaue Kenntnis des Fluoreszenzverhaltens des entsprechenden markierten DNA- Strangs und eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der emittierten Lichtstrahlen erforderlich ist. Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.
Alternativ zu optischen Verfahren wird an elektrischen Verfahren gearbeitet, bei denen die Konzentration des Analyten direkt über ein elektrisches Signal gemessen werden kann.
Ein Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von Biopolymeren mittels einer Elektrodenanordnung ist aus [1] bekannt. Fig. 1a und Fig. 1b zeigen einen in [1] beschriebenen Sensor. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201, 202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die planaren Elektroden 201, 202 sind Elektroden-Anschlüsse 204, 205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201, 202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Auf jeder Elektrode 201, 202 befinden sich gemäß der sogenannten Gold-Schwefel-Kopplung immobilisierte DNA-Sondenmoleküle 206 (vgl. Fig. 1a). Auf den Elektroden 201, 202 ist der zu untersuchende Analyt 207, aufgebracht, der beispielsweise aus einer elektrolytischen Lösung der zu detektierenden Biopolymeren besteht. Sind im Analyten 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementär ist, hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA- Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig. 1b).
An die Pyrimidinbasen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T), oder Cytosin (C), können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d. h. Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T bzw. zwischen C und G, hybridisieren.
Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Somit ist ein DNA- Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage, einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d. h. zu hybridisieren.
Die zu detektierende Substanz hybridisiert somit mit immobilisierten Fängermolekülen und verändert so die elektrische Umgebung in der Nähe der Sensoroberfläche. Diese Änderung kann durch Impedanzmessungen ausgewertet werden und stellt ein Maß für die Konzentration des Stoffes im Analyten dar.
Der elektrische Parameter, der gemäß dem aus [1] bekannten Verfahren ausgewertet wird, ist die Kapazität zwischen den Elektroden bzw. die Impedanz der beiden Elektroden. Hierbei wird die Impedanz bzw. die Kapazität in ihrer Veränderung erfasst, wenn nur DNA-Sondenmoleküle vorhanden sind gegenüber dem Fall, dass DNA-Sondenmoleküle mit den zu erfassenden DNA- Strängen hybridisiert sind.
Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich der Wert der Impedanz zwischen den Elektroden 201 und 202. Diese veränderte Impedanz wird durch Anlegen einer Wechselspannung mit einer Amplitude von ungefähr 50 mV an die Elektroden- Anschlüsse 204, 205 und dem dadurch resultierenden Strom mittels eines angeschlossenen Messgeräts (nicht dargestellt) bestimmt.
Im Falle einer Hybridisierung verringert sich der kapazitive Anteil der Impedanz zwischen den Elektroden 201, 202. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sowohl die DNA-Sondenmoleküle 206 als auch die DNA-Stränge 208, die eventuell mit den DNA- Sondenmolekülen 206 hybridisieren, nicht-leitend sind und somit die jeweiligen Elektrode 201, 202 in gewissem Maße elektrisch abschirmen.
Zur Verbesserung der Messgenauigkeit ist es aus [4] bekannt, eine Vielzahl von Elektrodenpaaren 201, 202 zu verwenden und diese parallel zu schalten, wobei diese miteinander verzahnt angeordnet sind und sich eine sogenannte Interdigitalelektrode ergibt. Die Abmessung der Elektroden und der Abstände zwischen den Elektroden liegen in der Größenordnung der Länge der zu detektierenden Moleküle, d. h. der DNA-Stränge 208 oder darunter, beispielsweise im Bereich von 200 nm und darunter.
Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie ([3]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z. B. Enzyme, im Analyten spezifisch zu binden.
Bei diesen optischen und elektrischen Verfahren ist die Hybridisierung der zu untersuchenden Stoffe an immobilisierte Fängermoleküle auf einer Sensoroberfläche notwendig. Da die Konzentration der DNA im Analyten sehr gering ist, dauert es unter Umständen sehr lange, bis alle DNA-Moleküle in der Lösung allein durch Diffusionsprozessse an passende Fängermoleküle hybridisiert haben. Um diese Stoffe durch Verwendung von Mikrosensoren in kurzer Zeit zu charakterisieren, ist daher eine Aufkonzentrierung des zu analysierenden Stoffes im Bereich der Sensoroberfläche notwendig.
Ein bekanntes derartiges Verfahren ist die Elektrophorese. Hierbei wird der Analyt einem geeigneten, gegebenenfalls elektrischen Feld ausgesetzt, das eine gerichtete Bewegung der zu untersuchenden Stoffe im Lösungsmittel ermöglicht. Dies kann entweder aufgrund einer permanenten elektrischen Ladung der Stoffe (Ionenwanderung) oder aufgrund von Polarisationseffekten (Wanderung von induzierten oder permanenten Dipolen im inhomogenen elektrischen Feld) erfolgen. Durch die Elektrodengeometrie und die Wahl der angelegten Spannungen bzw. Ströme und deren Frequenzen können geeignete Konzentrationsgradienten innerhalb der Lösung erzeugt werden, vorzugsweise derart, dass sich die Konzentration des zu analysierenden Stoffes in der Nähe der Sensoroberfläche erhöht.
Im Falle der Wanderung von ungeladenen, dielektrischen Teilchen im inhomogenen elektrischen Feld durch Induktion von Dipolmomenten spricht man von Dielektrophorese.
Bei der Di-/Elektrophorese liegt der Analyt üblicherweise in wässriger Lösung vor. Die Elektroden zur Erzeugung des elektrischen Feldes müssen mit dem Analyten in direktem elektrischen Kontakt stehen, da anderenfalls wegen der hohen Dielektrizitätskonstante von Wasser und seiner hohen elektrischen Leitfähigkeit das elektrische Feld innerhalb der wässrigen Lösung sehr klein wäre.
Wegen des direkten Kontaktes der Elektroden zum elektrisch leitfähigen Medium findet Elektrolyse statt, die den pH-Wert in Nähe der Elektroden verändert und bei hoher Stromdichte auch zu Gasbildung führen kann. Dieser Effekt kann durch Anlegen von Wechselspannung reduziert werden. Da aber insbesondere Biopolymere (Bio-Makromoleküle) wie DNA empfindlich auf Änderungen des pH-Wertes ins basische reagieren ist in der WO 99/38612 die Verwendung einer sogenannten "permeation layer" als Schutzschicht über den Elektroden vorgeschlagen. Diese semipermeable Schicht ist für kleine Moleküle bzw. Ionen wie H₂O, NaCl, usw. durchlässig, so dass weiterhin Stromfluss möglich ist, wohingegen Makromoleküle wie DNA nicht bis zur Elektrodenoberfläche vordringen können.
Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren bereitzustellen, welcher diese Bestimmungen mit größerer Nachweisempfindlichkeit und/oder Geschwindigkeit erlaubt. Aufgabe der Erfindung war außerdem die Bereitstellung eines Verfahrens zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren unter Verwendung dieses Sensors.
Demgemäß wurde der Sensor, das Verfahren zu seiner Herstellung (Herstellungsverfahren) und das Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren (Analyseverfahren) nach den unabhängigen Ansprüchen bereitgestellt.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren in Lösung, umfassend eine Elektrodenanordnung

- A) mit mindestens einer ersten Elektrode, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio)organischen Oligomeren und Polymeren ("chemische Verbindungen) immobilisiert sind (Detektionselektroden),
- B) mit mindestens zwei zweiten Elektroden, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden (Attraktionselektroden),
- wobei die erste Elektrode zwischen den zweiten Elektroden angeordnet ist, derart, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu erfassenden chemischen Verbindungen, insbesondere Biopolymeren, möglicherweise enthaltender, auf den Sensor aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird, so dass in dem Analyten enthaltene, qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende (bio)organische Oligomere und Polymere mit den Fängermolekülen hybridisieren können.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Sensors, wobei

a) dieser Sensor, der eine Elektrodenanordnung umfasst, bei der Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) vorhanden sind, mit einer die zu analysierende Substanz enthaltenden Lösung kontaktiert wird, wobei
b) an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt wird, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen, die bewirkt, das die zu analysierende Substanz mindestens einmal über die Detektionselektrode(n) (A) hinwegwandern, so dass mindestens ein Teil davon mit den Fängermolekülen auf der oder den Detektionselektrode(n) hybridisieren, und
c) die zu bestimmenden (bio)organischen Oligomeren oder Polymeren auf optische oder elektronische Weise nachgewiesen werden.

Da mit dem erfindungsgemäßen Sensor sehr verschiedenartige (bio)organische Oligomere und Polymere qualitativ und quantitativ bestimmt werden können, wird im folgenden eine allgemeine Anleitung für den Aufbau des erfindungsgemäßen Sensors und die Durchführung des erfindungsgemäßen (Analyse)Verfahrens gegeben. Hierzu werden die unterschiedlichen elektrischen Felder und deren Einfluss auf die Aufkonzentrierung der Moleküle in Elektrodennähe in Abhängigkeit von der Elektrodengeometrie betrachtet.
Zur Erzeugung eines inhomogenen elektrischen Feldes zur Dielektrophorese können Elektroden mit kleinem Krümmungsradius verwendet werden. Dadurch treten aufgrund des Spitzeneffektes bei Anlegen einer Spannung sehr große Feldgradienten innerhalb der Lösung auf, womit auch bei ungeladenen Teilchen ein Konzentrationsgradient innerhalb der Lösung aufgebaut werden kann.
Bei der Di-/Elektrophorese können zwei unabhängige, konkurrierende Prozesse beobachtet werden. Dies ist zum einen die Diffusion der Moleküle, die zu deren Gleichverteilung innerhalb der Lösung führt. Zum anderen die Migration aufgrund der elektrischen Kraft auf die geladenen Teilchen und den permanenten sowie induzierten Dipol des Makromoleküls. Der Einfluss des Schwerefelds bei Dichteunterschieden, der zum Teilchentransport durch Konvektion führt, sei hier vernachlässigt.
Die elektrische Kraft ≙_elauf ein Teilchen mit der Ladung q, einem permanenten Dipolmoment ≙_o und einer Polarisierbarkeit α im elektrischen Feld beträgt bei Vernachlässigung des Schwerefeldes:

≙_el = (q + ( ≙_o + α ≙) ≙) ≙. (1)
Dieser elektrischen Kraft wirkt die Reibungskraft des bewegten Moleküls (z. B. eines Biopolymeren wie DNA) im Lösungsmittel entgegen. Die Trägheitskraft sowie die Gravitationskraft werden hier vernachlässigt. Für ein kugelförmiges Teilchen mit dem Radius r_p gilt für die Reibungskraft ≙_fr:

≙fr = 6pηrp ≙, (2)

η ist die Viskosität des umgebenden Mediums und ≙ die Geschwindigkeit des Teilchens (Moleküls) im Feld. Nach dem Einschalten des Feldes stellt sich ein Gleichgewicht zwischen elektrischer Kraft und Reibungskraft ein, so dass sich eine Driftgeschwindigkeit ≙_d wie folgt ergibt:
Ein Konzentrationsgradient führt zu einem sogenannten Diffusionsdruck, der die Teilchen in Bereiche niedrigerer Konzentration treibt. Die elektrische Kraft wirkt dieser Diffusionskraft entgegen. Für den Teilchenfluss durch eine beliebige Fläche gilt dann im Gleichgewicht von elektrischer Kraft und Diffusionsdruck:

-D ≙c = c ≙_d, (4)

c ist die Konzentration des zu analysierenden Stoffes im Lösungsmittel und D seine Diffusionskonstante. Die Diffusionskonstante hängt in folgender Weise mit der Viskosität η der Lösung zusammen:

D = kT/(6πηr_p). (5)
Zusammengefasst ergibt sich folgende Differentialgleichung für die Beschreibung der räumlichen Konzentrationsverteilung c:
Im folgenden soll das sich einstellende Konzentrationsprofil in Abhängigkeit von den Eigenschaften der gelösten Moleküle und der Geometrie des elektrischen Feldes berechnet werden. Zweckmäßigerweise wird im folgenden lediglich der Fall elektrisch geladener Teilchen diskutiert, da die Wirkung eines inhomogenen elektrischen Feldes auf permanente bzw. induzierte Dipole um mehrere Größenordnungen kleiner ist als dessen Wirkung auf geladene Teilchen. DNA liegt in wässriger Lösung als Polyanion vor, wobei die Ladungszahl q der effektiven Ladung mit der Anzahl der in ihr enthaltenen Nukleotide steigt.

a) Homogenes elektrisches Feld E

Die Lösung dieser Differentialgleichung hängt von der Art des vorliegenden elektrischen Feldes ab. Bei der klassischen Elektrophorese werden konstante Felder verwendet, d. h. es gilt:

für ein Feld zwischen zwei Elektroden im Abstand d und der Spannung U. In diesem Fall reduziert sich die Differentialgleichung zu:
Eine Lösung dieser Differentialgleichung ist:
Dies bedeutet, dass die Konzentration des zu analysierenden Stoffes in einer Entfernung
von der einen Elektrodenfläche auf den 1/e-ten Teil abgefallen ist, also eine nutzbare Aufkonzentrierung in einer Schicht der Dicke ρ um die Elektrode erfolgt. Ein homogenes Feld hat lediglich eine Wirkung auf geladene Teilchen, wie z. B. DNA als Polyanion. Weisen die Teilchen lediglich ein Dipolmoment auf, so werden sie im homogenen Feld zwar ausgerichtet, erfahren jedoch keine translatorische Kraft.

b) Radialsymmetrisches elektrisches Feld E

Im Falle von Elektroden mit Zylindergeometrie weist das elektrische Feld folgende Abhängigkeit vom Abstand r zur Mittelelektrode auf:

U ist die angelegte Spannung an den Kondensator, r₁ und r₂ die Radien der inneren bzw. äußeren Elektrode des Zylinders. Bei Einsetzen dieses Feldes in die Differentialgleichung kann keine analytische Lösung mehr gefunden werden. Für den Spezialfall eines geladenen Teilchens ohne Dipolmoment ( ≙ = 0, α = 0) ergibt sich folgende Lösung:
Die Konzentration ist hierbei in einer Entfernung

auf den 1/e-ten Teil abgefallen.

c) Kugelsymmetrisches elektrisches Feld E

Ein kugelsymmetrisches elektrisches Feld nimmt mit dem Quadrat des Abstandes zum Kugelmittelpunkt ab:

r_o ist hierbei der Krümmungsradius der Kugeloberfläche und U die anliegende Spannung. Auch hier kann keine allgemeine Lösung gefunden werden. Für den Spezialfall eines geladenen Teilchen ohne Dipolmoment ( ≙ = 0, α = 0) ergibt sich folgende Lösung:
Damit ist die Konzentration in einer Entfernung von

auf den 1/e-ten Teil abgefallen.
In Abhängigkeit von der Elektrodengeometrie, den elektrischen Eigenschaften des gelösten Stoffes und des Lösungsmittels sowie der angelegten Spannung kann es somit zu einer starken Aufkonzentrierung der zu analysierenden Substanz in der Nähe der Elektrode kommen. Da die Detektionselektroden den Attraktionselektroden üblicherweise benachbart sind und damit räumlich getrennt sind, kann die Aufkonzentrierung auch dazu führen, dass beispielsweise die DNA nicht in die Nähe der Fängermoleküle kommt, um mit ihnen zu hybridisieren. Andererseits begünstigt jedoch ein starkes elektrisches Feld eine schnelle Aufkonzentrierung des Analyten auf der Sensoroberfläche und ist damit für eine Beschleunigung der Messung vorteilhaft. Fig. 2 zeigt den typischen Verlauf der lokalen Konzentration des Analyten in Abhängigkeit von der Entfernung zur Elektrodenoberfläche bei der Elektrophorese. Die zuvor beschriebenen möglichen Elektrodengeometrien wurden für ein typisches hochintegriertes System untersucht (d = r_o = r₁ = 1 µm, r₂ = 2 µm). Die Spannung wurde zu 1 V gewählt, die Ausgangskonzentration zu 1 pM (in Fig. 2 dargestellt durch: •-•-•-•-•-•), die Temperatur zu 37°C und als Ladungszahl der Teilchen 20 angenommen. In Fig. 2 ist die Aufkonzentrierung des Analyten in unmittelbarer Nähe zur Elektrodenoberfläche zu erkennen. Typischerweise fällt die Konzentration des Stoffs bereits nach 10 nm auf den Wert der Ausgangskonzentration ab. An der Elektrodenoberfläche kann eine Aufkonzentrierung über mehrere Größenordnungen beobachtet werden. Die Aufkonzentrierung fällt stärker aus, wenn anstelle paralleler Elektroden (homogenes Feld) Elektroden mit kleinem Krümmungsradius verwendet werden (Spitzeneffekt). In Fig. 2 bedeuten die verschieden markierten Linien den Konzentrationsverlauf vor der Elektroden in Abhängigkeit von der Elektrodensymmetrie:
. . .: Kugelsymmetrie
---: Zylindersymmetrie
.--.--.--.: Homogenes Feld
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung ist der Sensor in einem Chip monolithisch integriert.
In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist/sind in dem Chip eine oder mehrere elektronische Schaltungen integriert, welche Schaltungen elektronische Funktionen für den Betrieb der Attraktionselektroden in dem Chip bereitstellen.
Im folgenden werden die Merkmale des erfindungsgemäßen Sensors anhand der Figuren näher beschrieben.
Fig. 1 zeigt einen in [1] beschriebenen Sensor, mit einer Elektrodenanordnung, mit der insbesondere Biopolymere qualitativ und quantitativ bestimmt werden können.
Fig. 2 zeigt für Elektroden mit unterschiedlicher Geometrie berechnete Konzentrationsprofile für zu bestimmende Moleküle.
Fig. 3 zeigt einen erfindungsgemäßen Sensor mit einer Elektrodenanordnung, bei der räumlich abwechselnd Elektroden (A) (im folgenden auch Detektionselektroden genannt) und Elektroden (B) (im folgenden auch Attraktionselektroden genannt) benachbart auf der Sensoroberfläche angeordnet sind. Die kleineren Attraktionselektroden 1, 2 unterscheiden sich durch das an ihnen angelegte elektrische Feld voneinander. Auf den größeren Detektionselektroden befinden sich Fängermoleküle.
Fig. 4 zeigt den erfindungsgemäßen Sensor von Fig. 3, wobei das nachzuweisende Molekül (z. B. DNA) im Bereich der Attraktionselektroden 2 angereichert ist.
Fig. 5 zeigt den Sensor von Fig. 4 nach dem Abschalten der Attraktionselektroden (2). Die Teilchenwolken bewegen sich zu den Attraktionselektroden (1) und passieren dabei die größeren Detektionselektroden, auf denen Fängermoleküle immobilisiert sind.
Fig. 6 zeigt den Sensor von Fig. 5 nach dem Abschalten der Attraktionselektroden (2) und längerem Betrieb der Attraktionselektroden (1). Nicht dargestellt ist hierbei, dass beim Passieren der Teilchenwolke über den Detektionselektroden einige (DNA-)Moleküle hybridisiert wurden und somit die Anzahl der Teilchen für eine erneute Wanderung zur Attraktionselektrode (1) abgenommen hat.
Fig. 7 zeigt eine Draufsicht einer Elektrodenanordnung eines erfindungsgemäßen Sensors mit punktförmigen Elektroden 1 und 2.
Fig. 8 zeigt eine Draufsicht einer Elektrodenanordnung mit streifenförmigen Elektroden 1 und 2.
Bei der Elektrodenanordnung des erfindungsgemäßen Sensors ist mindestens eine erste Elektrode (A) vorhanden, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio)organischen Oligomeren und Polymeren immobilisiert sind (Detektionselektroden).
Die Elektroden (A) sind somit erfindungsgemäß mit sogenannten Fängermolekülen für die zu bestimmenden (bio)organischen Oligomere und Polymere beschichtet.
Die Natur des zu bestimmenden Oligomeren oder Polymeren bestimmt die Natur der Fängermoleküle und über die Beschichtung der Detektionselektroden mit den immobilisierten Fängermolekülen den Aufbau der erfindungsgemäßen Sensoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die (bio)organischen Oligomere und Polymere Biopolymere. Unter Biopolymeren sind insbesondere Proteine, Peptide und DNA- Stränge einer jeweils vorgegebenen Sequenz zu verstehen.
Die (bio)organischen Oligomere und Polymere liegen zur Bestimmung in Lösung und nicht in einem Gel wie einem Polyacrylamidgel vor. Bevorzugt ist eine wässrige Lösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors sind mindestens zwei Detektionselektroden (A) mit Fängermolekülen beschichtet, die sich hinsichtlich ihrer Fangcharakteristika für unterschiedliche, zu bestimmende Moleküle unterscheiden.
Für den Fall, dass mit dem erfindungsgemäßen Sensor Biopolymere und hierbei insbesondere Proteine oder Peptide bestimmt werden sollen, werden als erste Moleküle (erste Fängermoleküle) und als zweite Moleküle (zweite Fängermoleküle, wobei sich die ersten und zweiten Fängermoleküle in ihre Binde- bzw. Fangcharakteristik unterscheiden) Liganden verwendet, beispielsweise Wirkstoffe mit einer möglichen Bindungsaktivität, welche die zu erfassenden Proteine oder Peptide an die jeweilige Elektrode binden, auf der die entsprechenden Liganden angeordnet sind.
Als Liganden kommen aber ganz allgemein Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder ein sonstiges Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.
Im Rahmen dieser Beschreibung ist unter einem Sonden- bzw. Fängermolekül sowohl ein Ligand als auch ein DNA- Sondenmolekül zu verstehen.
Werden hierbei als Biopolymere DNA-Stränge einer vorgegebenen Sequenz verwendet, die mittels der Elektrodenanordnung erfasst werden sollen, so können mittels der Elektrodenanordnung DNA-Stränge einer vorgegebenen ersten Sequenz mit DNA-Fänger(Sonden)molekülen mit der zu der ersten Sequenz komplementären Sequenz als erste Moleküle auf der ersten Elektrode hybridisiert werden. Zum Erfassen eines DNA- Strangs einer vorgegebenen zweiten Sequenz mittels zweiter Moleküle auf der zweiten Elektrode werden DNA- (Fänger)Sondenmoleküle als zweite Moleküle eingesetzt, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär ist zu der zweiten Sequenz des DNA-Strangs.
Der erfindungsgemäße Sensor weist zusätzlich zu der mindestens einen Elektrode (A) mindestens zwei zweite Elektroden (B) auf, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden (Attraktionselektroden).
Im erfindungsgemäßen Sensor ist die erste Elektrode (A) zwischen den zweiten Elektroden (B) derart angeordnet, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu bestimmenden Moleküle (z. B. Biopolymere) möglicherweise enthaltender, auf den Sensor aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird, so dass in dem Analyten enthaltene, qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende (bio)organische Oligomere und Polymere mit den Fängermolekülen hybridisieren können.
Hierzu befinden sich eine erste Elektrode (A) im allgemeinen direkt zwischen den zwei zweiten Elektroden (B), vorzugsweise auf halbem Weg. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mehrere erste und zweite Elektroden eingesetzt. Hierbei sind die Attraktions- und Detektionselektroden im allgemeinen abwechselnd auf der Sensoroberfläche angeordnet, wobei der Abstand zwischen den Elektroden vorzugsweise im wesentlichen gleichgroß ist (vgl. Fig. 3). Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) der Elektrodenanordnung sind somit vorzugsweise im wesentlichen in gleichem Abstand voneinander angeordnet.
Im erfindungsgemäßen Sensor wird eine Elektrodenanordnung verwendet, die vorzugsweise mindestens 1 Detektionselektrode (A) und vorzugsweise mindestens 2 Attraktionselektroden (B) aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Anzahl der Attraktionselektroden (B) von 100 bis 1000 und die Anzahl der Detektionselektroden (A) von 100 bis 1000.
Die Detektionselektroden (A) haben vorzugsweise jeweils eine Fläche von 100 bis 10000 µm². Die Attraktionselektroden (B) haben vorzugsweise jeweils eine Fläche von 0,1 bis 100 µm². Die Elektroden (A) und (B) können gleiche oder verschieden große Oberflächen haben. Vorzugsweise haben die Elektroden (A) eine größere Oberfläche als die Elektroden (B). Es sollten möglichst viele kleinflächige bzw. möglichst schmale Attraktionselektroden eingesetzt werden, um große elektrische Felder aufbauen zu können. Die minimalen Dimensionen der Elektroden wiederum ergeben sich aus den Eigenschaften des zu deren Herstellung verwendeten Halbleiterprozesses. Übliche minimale Breiten metallischer Strukturen liegen derzeit im Bereich von 100 nm bis 1 µm.
Grundsätzlich ist eine möglichst kleine Fläche der Detektionselektroden wünschenswert, da dann eine große Anzahl von Detektionseinheiten auf einer vorgegebenen Chipfläche integriert werden kann. Die Fläche der Detektionselektroden resultiert zum einen aus der Nachweisempfindlichkeit der Messvorrichtung, das heißt je empfindlicher der Nachweis erfolgen kann (elektrisch oder optisch) desto kleiner kann die Detektionselektrode sein. Eine weitere Randbedingung ist die Technologie zum Aufbringen der Fängermoleküle. Wird die dem Stand der Technik entsprechende Microspotting-Technologie (Verfahren ähnlich dem Tintenstrahldruck) angewandt, ergibt sich die minimale Fläche der Detektionselektroden aus dem Durchmesser des Spots. In diesem Falle liegt der Spotdurchmesser in der Größenordnung von 100 µm, woraus sich die minimale Fläche der Detektionselektrode ergibt.
Alternativ zum Spotting können auch elektrochemische Methoden zur Immobilisierung der Fängermoleküle angewandt werden, wie beispielsweise von der Firma Nanogen™ vorgeschlagen. In diesem Falle ist die Größe der Detektionselektroden nur durch die prozessbedingten minimalen Strukturbreiten beziehungsweise die Nachweisgrenzen der Detektionsmethode gegeben.
Für die erfindungsgemäßen Sensoren bzw. für die diese umfassenden Elektrodenanordnungen kommen verschiedene Geometrien in Frage.
Die in den Elektrodenanordnungen verwendeten Elektroden (A) und (B) können verschiedene zwei- oder dreidimensionale Strukturen aufweisen.
Beispielsweise sind als Elektroden (A) und/oder (B) punktförmige/runde Elektroden (Knopfelektroden) (vgl. Fig. 7) geeignet. Unter punktförmigen Elektroden sind hierbei solche zu verstehen, die entsprechend des Herstellungsprozesses minimale Dimensionen aufweisen. (In einem aktuellen Prozess sind dies beispielsweise Elektroden mit Abmessungen von 1 µm × 1 µm).
Des weiteren können die Elektroden (A) und/oder (B) als planare Elektroden in Form von Streifen (vgl. Fig. 8), Ringen oder sonstigen planaren Flächen, oder aber als dreidimensionale Elektroden, beispielsweise in Form von Zylindern, Halbkugeln etc. eingesetzt werden, wobei diese symmetrisch oder asymmetrisch gestaltet sein können.
Die Elektrodengeometrie ist von besonderer Bedeutung für die qualitative und quantitative Bestimmung von ungeladenen Teilchen. Da bei ungeladenen Molekülen nur bei einem inhomogenen elektrischen Feld eine Kraft auf die permanenten bzw. induzierten Dipole ausgeübt werden kann, sollten für deren Bestimmung bevorzugt Elektroden mit kleinem Krümmungsradius eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sensors, die insbesondere zur Bestimmung von ungeladenen oder wenig geladenen Oligomeren oder Polymeren geeignet ist, weisen daher die Elektroden (B) einen kleineren Krümmungskreisradius auf als die Elektroden (A). Bevorzugt ist hierbei, wenn die Elektroden (A) planar und die Elektroden (B) spitz oder rund geformt sind.
Zur Bestimmung von geladenen Oligomeren oder Polymeren ist es dagegen vorteilhaft, wenn die Elektroden (A) und (B) planar sind.
Unabhängig von der Art des Moleküls ist es bevorzugt, dass die Detektionselektroden (A) planar sind.
Die Detektionselektroden müssen nicht notwendigerweise elektrisch leitfähige Strukturen sein, wenn optische Nachweisverfahren angewandt werden. In diesem Falle genügt eine Oberfläche aus einem Material, das sich zur Immobilisierung von Fängermolekülen eignet. Weiterhin können elektrisch leitfähige Elektroden als Detektionselektroden eingesetzt werden, die mit einem (nichtleitenden) Dielektrikum überzogen sind.
Die Attraktionselektroden werden in allen genannten Ausführungsformen der Detektionselektroden und Meßmethoden erfindungsgemäß zur Aufkonzentration der zu analysierenden Stoffe auf der Sensoroberfläche verwendet und somit zur Beschleunigung des Messvorganges.
Die Elektrodenanordnung kann eine Plattenelektrodenanordnung sein oder eine Interdigitalelektrodenanordnung, wie aus [1] bekannt.
Ferner können verschiedene Anordnungen der Parallelschaltung von Elektroden in der Elektrodenanordnung vorgesehen sein, beispielsweise können die Elektroden als zylindrische Elemente ausgestaltet sein, die jeweils konzentrisch umeinander angeordnet sind und elektrisch voneinander beispielsweise mittels eines geeigneten Dielektrikums voneinander isoliert sind, so dass sich ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden ausbildet.
Der erfindungsgemäße Sensor liegt im allgemeinen in der Form eines Chips als sogenannter Sensorchip vor, der im wesentlichen aus Silizium besteht.
Die Detektionselektroden (A) und Attraktionselektroden (B) bestehen vorzugsweise aus chemisch inerten, elektrisch leitfähigen Stoffen, wie Gold, Platin, Palladium oder Legierungen daraus. Grundsätzlich eignet sich jedoch jeder elektrisch leitfähige Stoff als Elektrodenmaterial.
Wenn die Elektroden aus Gold hergestellt sind, werden vorzugsweise kovalente Verbindungen zwischen den Elektroden und den Sondenmolekülen hergestellt, wobei der Schwefel zum Bilden einer Gold-Schwefel-Kopplung in Form eines Sulfids oder eines Thiols vorhanden ist.
Für den Fall, dass als Sondenmoleküle DNA-Sondenmoleküle verwendet werden, sind solche Schwefelfunktionalitäten Teil eines modifizierten Nukleotids, das mittels der Phosphoramiditchemie während eines automatisierten DNA- Syntheseverfahrens am 3'-Ende oder am 5'-Ende des zu immobilisierenden DNA-Strangs eingebaut wird. Das DNA- Sondenmolekül wird somit an seinem 3'-Ende oder an seinem 5'- Ende immobilisiert.
Für den Fall, dass als Sondenmoleküle Liganden verwendet werden, werden die Schwefelfunktionalitäten durch ein Ende eines Alkyllinkers oder eines Alkylenlinkers gebildet, dessen anderes Ende eine für die kovalente Verbindung des Liganden geeignete chemische Funktionalität aufweist, beispielsweise einen Hydroxylrest, einen Acetoxyrest oder einen Succinimidylesterrest.
Alternativ können diese Elektroden auch aus Siliziumoxid hergestellt sein. Diese können mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, die Sondenmoleküle darauf zu immobilisieren.
Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie

- 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
- 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
- 3-Aminopropyltriethoxysilan,
- 4-(Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
- 3-N,N-bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan,

Reagiert ein zu immobilisierendes Sondenmolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Elektrode immobilisiert.
Die Elektroden (A) und/oder (B) sind im allgemeinen auf einem Siliziumchip angeordnet.
Die Elektrodenanordnung bzw. diese ergänzenden elektrischen Schaltkreise können beispielsweise durch Photolithographie und verschiedene Abscheidungstechniken (z. B. "Vapor Deposition") hergestellt werden.
So kann auf einem Siliziumsubstrat, wie es für bekannte CMOS- Prozesse hergestellt wird, in dem sich bereits integrierte Schaltungen und/oder elektrische Anschlüsse für die zu bildenden Elektroden befinden, eine Isolatorschicht, die auch als Passivierungsschicht dient, in ausreichender Dicke, beispielsweise in einer Dicke von 500 nm, mittels eines CVD- Verfahrens aufgebracht werden. Die Isolatorschicht kann aus Siliziumoxid SiO₂ oder Siliziumnitrid Si₃N₄ hergestellt sein.
Ferner werden zur elektrischen Kontaktierung elektrischer Komponenten durch die Isolatorschicht hindurch Wolfram- Durchkontaktierungen (mit Wolfram gefüllte Kontaktlöcher) gebildet.
Die Elektrodenanordnung des Biosensors wird mittels Photolithographie auf der Isolatorschicht definiert. Anschließend werden mittels eines Trockenätzverfahrens, z. B. dem Reactive Ion Etching (RIE), in der Isolatorschicht Stufen erzeugt, d. h. geätzt, beispielsweise in einer Mindesthöhe von ungefähr 100 nm. Die Höhe der Stufen muss ausreichend groß sein für einen anschließenden selbstjustierenden Prozess zum Bilden der Metallelektrode.
Zum Auftragen der Isolatorschicht kann alternativ auch ein Aufdampfverfahren oder ein Sputterverfahren eingesetzt werden.
In einem weiteren Schritt wird eine Hilfsschicht, z. B. einer Dicke von 10 nm, aus Titan auf die stufenförmige Isolatorschicht aufgebracht. Die Hilfsschicht kann Wolfram, und/oder Nickel-Chrom, und/oder Molybdän aufweisen.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird eine Goldschicht mit einer Dicke von ca. 500 bis ca. 2000 nm aufgebracht. Die Dicke der Goldschicht sollte ausreichend sein, dass die Goldschicht porös kolumnar aufwächst.
In einem weiteren Schritt werden Öffnungen in die Goldschicht geätzt, so dass sich Spalten ausbilden. Zum Nassätzen der Öffnungen kann eine Ätzlösung aus 7,5 g Super Strip 100™ (Markenname der Firma Lea Ronal GmbH, Deutschland) und 20 g KCN in 1000 ml Wasser H₂O verwendet werden.
Durch das kolumnare Wachstum des Goldes, allgemein des Metalls, während des Aufdampfens auf die Haftschicht wird ein anisotroper Ätzangriff erzielt, so dass der Oberflächenabtrag des Goldes ungefähr im Verhältnis 1 : 3 erfolgt. Durch das Ätzen der Goldschicht werden die Spalten abhängig von der Zeitdauer des Ätzvorgangs gebildet. Dies bedeutet, dass die Zeitdauer des Ätzprozesses die Basisbreite, d. h. den Abstand zwischen den sich ausbildenden Goldelektroden bestimmt.
Nachdem die Metallelektroden eine ausreichende Breite aufweisen und der Abstand zwischen den sich bildenden Goldelektroden erreicht ist, wird das Nassätzen beendet.
Üblicherweise erfolgt aufgrund des porösen Aufdampfens das Ätzen in zu der Oberfläche der Isolatorschicht parallelen Richtung wesentlich schneller als in zu der Oberfläche der Isolatorschicht senkrechten Richtung.
Anstelle einer Goldschicht können auch andere Edelmetalle, wie beispielsweise Platin, Titan oder Silber verwendet werden, da diese Materialien ebenfalls Haltebereiche aufweisen bzw. mit einem geeigneten Material beschichtet werden können zum Halten von immobilisierten DNA- Sondenmolekülen oder allgemein zum Halten von Sondenmolekülen, und ein kolumnares Wachstum beim Aufdampfen aufweisen.
Für den Fall, dass die Haftschicht in den geöffneten Spalten zwischen den Metallelektroden entfernt werden soll, erfolgt dies ebenfalls selbstjustierend, indem die Goldelektroden als Ätzmaske verwendet werden.
Gegenüber den bekannten Interdigitalelektroden weist die Struktur gemäß diesem Ausführungsbeispiel insbesondere den Vorteil auf, dass durch das selbstjustierende Öffnen der Goldschicht über den Kanten der Abstand zwischen den Elektroden nicht an eine minimale Auflösung des Herstellungsprozesses gebunden ist, d. h. der Abstand zwischen den Elektroden kann sehr schmal gehalten werden.
In anderen Herstellungsverfahren für den erfindungsgemäßen Sensor wird von einem Substrat ausgegangen, beispielsweise von einem Silizium-Substrat-Wafer, auf dem bereits eine Metallisierung als elektrischer Anschluss vorgesehen ist, wobei auf dem Substrat schon eine Ätzstoppschicht aus Siliziumnitrid Si₃N₄ aufgebracht ist. Auf dem Substrat wird eine Metallschicht, z. B. eine Goldschicht, aufgebracht mittels eines Aufdampfverfahrens. Alternativ kann ein Sputterverfahren oder ein CVD-Verfahren zum Aufbringen der Goldschicht auf die Ätzstoppschicht eingesetzt werden. Allgemein weist die Metallschicht das Metall auf, aus dem die zu bildende Elektrode gebildet werden soll. Auf der Goldschicht wird eine elektrisch isolierende Hilfsschicht aus Siliziumoxid SiO₂ mittels eines CVD-Verfahrens (alternativ mittels eines Aufdampfverfahrens oder eines Sputterverfahrens) aufgebracht.
Durch Einsatz der Photolithographie-Technologie wird eine Lackstruktur aus einer Lackschicht gebildet, beispielsweise eine quaderförmige Struktur, welche Lackstruktur der Form der zu bildenden Elektrode entspricht.
Soll ein im weiteren beschriebenes Biosensor-Array mit einer Vielzahl von Elektroden erzeugt werden, wird mittels der Photolithographie eine Lackstruktur erzeugt, die in ihrer Form der zu bildenden Elektroden entsprechen, die den Sensor bilden. Die lateralen Abmessungen der gebildeten Lackstruktur entsprechen somit den Abmessungen der zu erzeugenden Sensorelektrode.
Die Dicke der Lackstruktur, d. h. der Lackschicht, entspricht im wesentlichen der Höhe der zu erzeugenden Elektroden.
Nach Aufbringen der Lackschicht und Belichtung, welche die entsprechenden Lackstrukturen vorgibt, wird die Lackschicht in den nicht "entwickelten", d. h. nicht belichteten Bereichen beispielsweise mittels Veraschen oder nasschemisch entfernt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren oder Polymeren unter Verwendung der Elektrodenanordnung des erfindungsgemäßen Sensors wird der Sensor mit einer die zu analysierende Substanz enthaltenden Lösung kontaktiert, wobei der Sensor eine Elektrodenanordnung umfasst, bei der Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) vorhanden sind, an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt wird, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen, die bewirkt, dass die zu analysierende Substanz mindestens einmal über die Detektionselektrode(n) (A) hinweg wandert, d. h. den Bereich der Detektionselektrode passiert, so dass zumindest ein Teil der zu analysierenden Substanz von den Fängermolekülen auf den Detektionselektroden festgehalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist mit mindestens zwei zweiten Elektroden eine Spannungsquelle gekoppelt, mit der eine umpolbare Spannung an die zweiten Elektroden anlegbar ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Schritt b), der auch als "Aufkonzentrationsschritt" bezeichnet werden kann, zunächst an jede zweite Attraktionselektrode (B) ein geeignetes Potential gelegt, sodass sich der zu untersuchende Stoff dort anreichert (vgl. Fig. 4). Die restlichen Attraktionselektroden (B) sind hierbei nicht angeschlossen, womit sich ihr Potential aus der Badspannung ergibt und keine Anziehung auf den Analyten ausgeübt wird. Anschließend werden die zuvor benutzten Attraktionselektroden abgeschaltet und die zuvor unbenutzten angeschaltet. Der Analyt, der sich bereits in der Nähe der einen Elektroden befindet, wird nun von den anderen Elektroden angezogen und passiert hierbei die Detektionselektroden des Sensors (vgl. Fig. 5 und 6).
Im erfindungsgemäßen Analyseverfahren wird an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen. Die elektrische Spannung kann sich hierbei im Vorzeichen, Höhe der Spannung und Zeitdauer unterscheiden. Geeignet ist auch die Anwendung von Wechselspannung zwischen den Attraktionselektroden (B). Wird eine geeignete Wechselspannung an die Elektroden angelegt, so nimmt die Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Analyten in der Nähe der Detektionselektroden zu und die Messdauer verringert sich entsprechend.
Zum Aufbau eines geschlossenen Stromkreises ist natürlich eine Gegenelektrode zu den Attraktionselektroden notwendig, die mit dem Analyten in Kontakt stehen muss. Diese Gegenelektrode ist vorzugsweise als einzelne große Flächenelektrode ausgeführt, die nur einmal pro Sensorarray vorhanden sein muss, aber auch in Form mehrerer Teilelektroden ausgeführt sein kann.
Abhängig von der Meßmethode ist es gegebenenfalls auch notwendig, auf dem Sensor eine Referenzelektrode vorzusehen. Dies ist insbesondere bei Detektionsarten notwendig, die auf elektrochemischen Methoden basieren (z. B. Redox-Recycling).
Anstelle die Elektroden wechselweise ein- bzw. auszuschalten, kann bei Teilchen mit permanenter Ladung wie z. B. DNA auch die Polarität der Elektroden umgeschaltet werden. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kommt zu der anziehenden Wirkung des Potentials der neuen Elektroden noch die abstoßende Wirkung der alten Elektroden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass die Attraktionselektroden (B) zunächst derart betrieben werden, dass sich die zu analysierende Substanz in deren Nähe aufkonzentriert. Anschließend wird die Spannung abgeschaltet, wodurch die angezogenen Moleküle in die umliegenden, mit Fängermolekülen besetzten Bereiche der Detektionselektroden (A) diffundieren und bei chemischer Übereinstimmung hybridisieren können.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Elektroden unabhängig von der Form der einzelnen Elektroden jeweils wechselweise angeschaltet bzw. deren Polarität vertauscht.
Erfindungsgemäß können nicht nur zwei Elektrodengruppen mit Attraktionselektroden (B) wechselweise betrieben werden, sondern das Verfahren kann auch mit Hilfe mehrerer Elektrodengruppen durchgeführt werden, die geeignet zugeschaltet werden bzw. an die Wechselsignale mit geeigneter Phasenlage angelegt werden.
Im Teilschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit bewirkt, dass der Analyt bzw. die nachzuweisende Spezies gezielt über aktive Sensorflächen (Detektionselektroden (A)) hin- und herbewegt werden. Dies wird durch mehrere benachbarte Attraktionselektroden (B) erreicht, die geeignet elektrisch betrieben werden. Zudem ergeben sich hierdurch wesentlich verkürzte Messdauern für derartige Sensoren, wenn beispielsweise DNA bestimmt werden soll.
Die Attraktionselektroden können entweder als passive Elektroden ausgeführt sein, das heißt, sie können am Rande des Substrates kontaktiert und mittels einer externen Spannungsversorgung betrieben werden, oder sie werden als aktive Elektroden ausgeführt.
Diese bevorzugte aktive Ausführungsform beinhaltet insbesondere die monolithische Integration elektronischer Bauelemente und damit einer oder mehrerer elektronischer Schaltungen in den Chip, welche Schaltungen elektronische Funktionen für den Betrieb der Attraktionselektroden in dem Chip bereitstellen.
Die Funktionen weisen insbesondere die Schaltfunktionen für das Anlegen der benötigten elektrischen Potentiale zur Attraktion oder Repulsion der geladenen Partikel, sowie die Zeitsteuerung zum Umschalten der Potentiale und zur Umschaltung vom Attraktionsbetrieb in den Messbetrieb auf.
Eine Integration dieser Funktionen ist neben der vereinfachten Ansteuerung des Chips insbesondere deshalb vorteilhaft, da gemäß dieser Ausführungsform eine hohe Integrationsdichte realisierbar ist.
Üblicherweise sind mehrere Sensoreinheiten, die mit verschiedenen Fängersequenzen ausgerüstet wurden, auf einem Chip integriert. Innerhalb jeder dieser Sensoreinheiten ist die beschriebene Struktur aus Attraktions- und Detektionselektroden enthalten.
Sind die Ansteuerschaltungen auf dem Chip integriert, kann jeder Sensor unabhängig von den umgebenden, d. h. benachbarten, Sensoren betrieben werden und so die elektrischen Randbedingungen wie die angelegten Attraktionspotentiale, die zeitliche Abfolge der Impulse, sowie die Umschaltung zwischen Attraktions- und Detektionsbetrieb auf die jeweiligen biologischen Spezies individuell eingestellt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden nach einem Waschvorgang, der alle nicht gebundenen (bio)organischen Oligomere oder Polymere entfernt, im Schritt c) die auf den Detektionselektroden (A) befindlichen hybridisierten, zu bestimmenden (bio)organischen Oligomere oder Polymere auf optischem oder elektronischen Wege auf an sich bekannte Weise nachgewiesen. Bevorzugt erfolgt dieser Nachweis elektronisch durch Impedanzmessungen.
Zum empfindlicheren Nachweis werden nach beendetem Anreicherungsschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens optional nicht gebundene (bio)organische Oligomere und Polymere, insbesondere Biopolymere, von der jeweiligen Elektrode, auf der sie sich befinden, entfernt.
Die folgenden Angaben erfolgen beispielhaft für Biopolymere als zu analysierende Substanzen.
Für den Fall, dass die Sondenmoleküle DNA-Stränge sind, erfolgt dies beispielsweise enzymatisch mittels eines Enzyms, das selektiv einzelsträngige DNA abbaut. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau nicht- hybridisierter DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende, hybridisierte doppelsträngige DNA unerwünscht mit abgebaut.
Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease P1 oder die Nuklease S1 verwendet werden. Die DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5' → 3' Exonukleaseaktivität oder ihrer 3' → 5' Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, können ebenfalls verwendet werden.
Für den Fall, dass die Sondenmoleküle niedermolekulare Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen.
Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare Verbindung kovalent mit der Elektrode verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.
In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterverbindung zwischen der Elektrode und dem jeweiligen Ligandenmolekül, das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dahingegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Elektrode und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die molekulare Masse des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt.
Üblicherweise wird zunächst optional eine erste Messung ohne immobilisierte Fängermoleküle durchgeführt.
Eine anschließende zweite Messung erfolgt nach der Immobilisierung der Fängermoleküle, eine darauffolgende dritte Messung nach erfolgter Hybridisierung und einem durchgeführten Waschvorgang. Eine vierte Messung wird nach enzymatischer Entfernung ungebunderer Fängermoleküle (falls zutreffend) durchgeführt. Eine abschließende fünfte Messung wird durchgeführt nach vollständiger Entfernung aller Fängermoleküle. Es ist anzumerken, dass auch die fünfte Messung optional ist.
Die ermittelten Werte aus den elektrischen Messungen werden dann im allgemeinen miteinander verglichen. Wenn die Differenz bestimmter Messwerte (z. B. gemessene Kapazitätswerte) größer ist als ein vorgegebener Schwellenwert, so wird angenommen, dass sich Biopolymere mit Sondenmolekülen gebunden haben, wodurch die Veränderung des elektrischen Signals an den Elektroden verursacht worden ist.
Ist die Differenz zwischen den Werten einer ersten elektrischen Messung und einer zweiten elektrischen Messung größer als der vorgegebene Schwellenwert, so wird als Ergebnis ausgegeben, dass die entsprechenden, die ersten Moleküle bzw. zweiten Moleküle spezifisch bindenden Biopolymere gebunden worden sind und die entsprechenden Biopolymere somit in dem Medium enthalten waren.
Die erste elektrische Messung und die zweite elektrische Messung können realisiert werden, indem die Kapazität zwischen den Elektroden gemessen wird. Alternativ können auch der elektrische Widerstand zwischen einzelnen Elektroden ermittelt werden.
Allgemein kann als erste elektrische Messung und als zweite elektrische Messung eine Impedanzmessung durchgeführt werden, in dessen Rahmen sowohl die Kapazität zwischen den Elektroden als auch die elektrischen Widerstände gemessen werden.
Im Rahmen der ersten Kapazitätsmessung wird üblicherweise ein Referenz-Kapazitätswert ermittelt und in einem Speicher gespeichert. Eine zweite Kapazitätsmessung erfolgt, nachdem die einsträngigen DNA-Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode entfernt worden sind. Mittels der zweiten Kapazitätsmessung wird ein Kapazitätswert ermittelt, der mit dem Referenz-Kapazitätswert verglichen wird.
Ist der Differenzwert zwischen diesen Kapazitätswerten größer als ein vorgegebener Schwellenwert, so bedeutet dies, dass in dem Elektrolyt DNA-Stränge enthalten waren, die entweder mit den DNA-Sondenmolekülen hybridisiert sind. In diesem Fall wird ein entsprechendes Ausgangssignal von dem Messgerät dem Benutzer des Messgeräts ausgegeben.
Erfindungsgemäß kann mit dem Sensor anstelle der Kapazitätsmessung eine Impedanzmessung durchgeführt werden. Für jede Detektionselektrode ist hierbei üblicherweise eine Referenzelektrode vorgesehen, derart, dass die DNA- Sondenmoleküle nicht an diesen Referenzelektroden haften. Dies kann dadurch gewährleistet werden, dass ein Material für die Referenzelektroden gewählt wird, das keine Schwefelbindung ermöglicht.
Alternativ kann eine unerwünschte Haftung der DNA- Sondenmoleküle auf der Referenzelektrode dadurch verhindert werden, dass das zur Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle geeignete Beschichtungsmaterial (s. oben) im Voraus nicht auf die Referenzelektrode aufgebracht wird. Somit entstehen keine chemisch reaktiven Gruppen auf der Referenzelektrode, die sonst eine kovalente Bindung mit den DNA-Sondenmolekülen eingehen, und somit diese dort immobilisieren würden.
Alternativ kann dies durch Anlegen eines ausreichend großen negativen elektrischen Feldes gewährleistet werden, wodurch sichergestellt wird, dass die negativ geladenen DNA- Sondenmoleküle nicht an den Referenzelektroden haften. Jede Referenzelektrode ist mit einem elektrischen Referenzanschluss gekoppelt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel erfolgt eine erste Impedanzmessung im unbelegten Zustand, d. h. beispielsweise in einem Zustand ohne Sondenmoleküle auf den späteren Detektionselektroden oder mit nicht hybridisierten DNA- Sondenmolekülen.
Nach Entfernung der einsträngigen DNA-Sondenmoleküle nach eventueller Hybridisierung der passenden DNA-Sondenmoleküle mit einem DNA-Strang der vorgegebenen, zu dem jeweiligen DNA- Sondenmolekül komplementären Sequenz wird eine zweite Impedanzmessung in bekannter Weise durchgeführt. Aufgrund der möglicherweise veränderten Impedanzwerte wird dann ermittelt, ob eine Hybridisierung von Sondenmolekülen und DNA-Strängen mit jeweils komplementärer Sequenz stattgefunden hat.
Neben der bisher beschriebenen, rein qualitativen Analyse des Stoffgemisches im Analyten, eignet sich die erfindungsgemäße Meßmethode auch zur quantitativen Messung der Konzentration bestimmter Spezies im Analyten. Die Genauigkeit der Messung hängt hierbei von der eingesetzten Meßmethode ab. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Aufkonzentration des Analyten in der Nähe der Detektionselektroden führt in jedem Falle zu einer Beschleunigung des gesamten Messvorganges sowie zu einer Erhöhung der Messempfindlichkeit, da mittels der Aufkonzentrierung der zu detektierenden Spezies auf der Sensoroberfläche und die elektrisch getriebene Bewegung über die Detektionselektroden hinweg, potentiell alle im Analyten vorhandenen zu detektierenden Moleküle Bindungspartner finden und somit der zu messende Effekt maximal ausfällt.
Ein Vorteil von erfindungsgemäßem Sensor und Verfahren ist, dass hierdurch eine rasche qualitative und quantitative Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren, insbesondere von DNA, bei erhöhter Nachweisempfindlichkeit möglich ist. Ein weiterer Vorteil von erfindungsgemäßem Sensor und Verfahren ist es, dass auch bei starken elektrischen Feldern und somit großen Konzentrationsgradienten sichergestellt ist, dass die zu analysierende Substanz in die Nähe der Fängermoleküle gelangt. Bezugszeichenliste 200 Sensor
201 Elektrode
202 Elektrode
203 Isolatorschicht.
204 Elektroden-Anschluss
205 Elektroden-Anschluss
206 immobilisierte DNA-Sondenmoleküle
207 Analyt
208 DNA-Stränge
(A) erste Elektrode
(B) zweite Elektrode
1 Elektrode
2 Elektrode

Claims

1. Sensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren und Polymeren in Lösung, umfassend eine Elektrodenanordnung

- mit mindestens einer ersten Elektrode, auf der Fängermoleküle zum Hybridisieren mit zu bestimmenden (bio)organischen Oligomeren und Polymeren ("chemische Verbindungen") immobilisiert sind (Detektionselektroden (A)),

- mit mindestens zwei zweiten Elektroden, auf denen sich keine Fängermoleküle befinden (Attraktionselektroden (B)),

- wobei die erste Elektrode zwischen den zweiten Elektroden angeordnet ist, derart, dass durch Änderung der elektrischen Felder an den zweiten Elektroden ein die zu erfassenden chemischen Verbindungen möglicherweise enthaltender, auf die Sensor-Anordnung aufgebrachter Analyt abhängig von Art und Größe der elektrischen Felder über die erste Elektrode hinwegbewegt wird, so dass in dem Analyten enthaltene, qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmende (bio)organische Oligomeren und Polymere mit den Fängermolekülen hybridisieren können.

2. Sensor nach Anspruch 1, bei dem die (bio)organischen Oligomere und Polymere Biopolymere sind.

3. Sensor nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Detektionselektrode(n) (A) einen größeren Krümmungskreisradius haben als die Attraktionselektroden (B).

4. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem mindestens zwei Detektionselektroden (A) mit Fängermolekülen beschichtet sind, die sich hinsichtlich ihrer Fangcharakteristika für unterschiedliche, zu bestimmende Moleküle unterscheiden.

5. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Anzahl Attraktionselektroden (B) von 100 bis 1000 beträgt und die Anzahl der Detektionselektroden (A) von 100 bis 1000 beträgt.

6. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Detektionselektroden (A) planar sind.

7. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Detektionselektroden (A) eine jeweils gleiche Oberfläche von 100 bis 10000 µm² aufweisen.

8. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Attraktionselektroden (A) eine jeweils gleiche Oberfläche von 0,1 bis 100 µm² aufweisen.

9. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) der Elektrodenanordnung im wesentlichen in gleichem Abstand voneinander angeordnet sind.

10. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Elektroden aus Gold bestehen oder Gold enthalten und auf einem Siliziumchip angeordnet sind.

11. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, integriert in einem Chip.

12. Sensor nach Anspruch 11, mit einer oder mehrerer elektronischer Schaltungen in dem Chip, welche Schaltungen elektronische Funktionen für den Betrieb der Attraktionselektroden in dem Chip bereitstellen.

13. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (bio)organischen Oligomeren oder Polymeren in Lösung unter Verwendung einer Elektrodenanordnung gemäß Anspruch 1, wobei

a) ein Sensor mit einer die zu analysierende Substanz enthaltenden Lösung kontaktiert wird, wobei der Sensor eine Elektrodenanordnung umfasst, bei der Attraktionselektroden (B) und Detektionselektroden (A) vorhanden sind,

b) an zumindest einen Teil der Attraktionselektroden (B) derart eine sich zeitlich ändernde elektrische Spannung angelegt wird, dass mindestens zwei Gruppen von Attraktionselektroden (B) zumindest zeitweise eine unterschiedliche Spannung aufweisen, die bewirkt, das die zu analysierende Substanz mindestens einmal über die Detektionselektrode(n) (A) hinwegwandern, so dass mindestens ein Teil der zu analysierenden Substanz mit den Fängermolekülen auf der oder den Detektionselektrode(n) (A) hybridisiert, und

c) die zu bestimmenden (bio)organischen Oligomere oder Polymere auf optische oder elektronische Weise nachgewiesen werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem mit den zwei zweiten Elektroden eine Spannungsquelle gekoppelt ist, mit der eine umpolbare Spannung an die zweiten Elektroden anlegbar ist.