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WO2009132667A1 - Verfahren zum nachweisen und/oder bestimmen der konzentration eines liganden - Google Patents

Verfahren zum nachweisen und/oder bestimmen der konzentration eines liganden Download PDF

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Publication number
WO2009132667A1
WO2009132667A1 PCT/EP2008/003496 EP2008003496W WO2009132667A1 WO 2009132667 A1 WO2009132667 A1 WO 2009132667A1 EP 2008003496 W EP2008003496 W EP 2008003496W WO 2009132667 A1 WO2009132667 A1 WO 2009132667A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
receptor
solution
ligand
sensor
ligands
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/003496
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Holger Klapproth
Sonja Mohry
Johannes Baader
Ingo Freund
Original Assignee
Micronas Gmbh
Micronas Holding Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Micronas Gmbh, Micronas Holding Gmbh filed Critical Micronas Gmbh
Priority to PCT/EP2008/003496 priority Critical patent/WO2009132667A1/de
Publication of WO2009132667A1 publication Critical patent/WO2009132667A1/de

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting and / or determining the concentration of at least one ligand contained in a solution to be analyzed, which has a charge or is bound to one, a) wherein a carrier surface is provided on which at least one of the ligands b) wherein at least one sensor is provided, c) wherein the solution for binding at least one ligand to the receptor is brought into contact with the latter, d) during which the solution is in contact with the receptor, between an electrode and applying to a counter electrode an electrical voltage through the electric field of which the ligands are moved relative to the receptor in the solution, e) after which ligands which are not bound to a receptor are removed from the detection range of the sensor, f) and with the help of the sensor dependent on the binding of the receptor to the ligand s measuring signal is detected.
  • a measuring chamber which has an interior cavity serving as a sample receiving space having a bottom, a ceiling and side boundary walls.
  • the bottom has a carrier surface; are immobilized on the receptors that are specific for a DNA ligand to be detected.
  • An electrode is inserted in the bottom underneath the receptors, and a counter electrode is inserted in a wall area of the ceiling opposite this.
  • the electrode and the counter electrode each consist of a transparent, electrically conductive material and are each spaced from the inner cavity by an insulating layer.
  • a solution containing the ligands to be detected is filled in the inner cavity of the measuring chamber in such a way that it comes into contact with the receptors.
  • an electrical is applied between the electrode and the back electrode, which generates an electric field in the solution.
  • the field exerts Coulomb forces on the ligands which move the ligands toward the electrode.
  • the ligands come into contact with the receptors and bind to them.
  • the inner cavity of the measuring chamber is rinsed with a rinsing agent to remove ligands not bound to a receptor from the inner cavity.
  • the binding of the ligands to the receptors is detected by means of an optical marker with which the ligands are labeled.
  • the receptor-ligand-marker complexes remaining in the measuring chamber are irradiated with excitation radiation, which excites the markers to emit fluorescence radiation. This is detected with the help of the provided sensor.
  • the method has the disadvantage that it requires a relatively large amount of equipment.
  • the at least one sensor is arranged on the carrier surface and has at least one electrically conductive region, and that the at least one electrically conductive region of the sensor is used as the electrode.
  • the sensor thus fulfills a dual function and, in addition to detecting the measurement signal, is also used as an electrode for generating an electrical field causing a migration movement of the ligands.
  • the process according to the invention can thereby be carried out in a simple manner.
  • the at least one receptor may be a nucleic acid or a derivative thereof (DNA, RNA, PNA, LNA, oligonucleotides, plasmids, chromosomes), a peptide, a protein (enzyme, protein, oligopeptides, cellular receptor protein and its complexes, peptide hormone, antibodies and its Fragments), a carbohydrate and its derivatives, in particular a glycosylated protein and a ⁇ -glycoside, a fat, a fatty acid and / or a lipid.
  • the electrode and / or the counterelectrode are spaced from the solution to be analyzed by an electrical insulation layer become. This avoids that the solution is electrolytically decomposed by the application of electrical voltage.
  • the senor is a semiconductor sensor having at least a first semiconductor zone and a second semiconductor zone cooperating therewith, the first semiconductor zone being used as the electrode. It is even possible that the second semiconductor zone is used as the counter electrode. The electric field can then be generated without an additional electrode in the solution.
  • an optical radiation is generated, wherein a photodiode sensitive to the optical radiation is used as the semiconductor sensor.
  • the electrical voltage is chosen smaller than the breakdown voltage of the photodiode. Since the photodiode is arranged close to the receptor, it can capture the optical radiation in a correspondingly large space segment. In this case, it is possible to dispense with a collecting lens arranged upstream of the photodiode.
  • an ion-selective field effect transistor is used as the semiconductor sensor.
  • the binding of the ligand to the receptor can therefore also be detected capacitively.
  • the polarity of the voltage present between the electrode and the counterelectrode is changed at least once prior to the detection of the measuring signal. This allows a more even distribution of the ligands in the solution to be achieved.
  • the voltage is applied between the electrode and the counter electrode in such a way that ligands which are not bound to a receptor are removed from the receptor
  • Detection range of the sensor are removed. This can be achieved, in particular, by applying a voltage of opposite polarity between the electrode and the counterelectrode after binding the ligand to the receptor for a sufficient period of time. This can be an eventual Sp ⁇ lvorg ⁇ ng to remove the unbound Lig ⁇ nden shortened or even completely saved.
  • the ligands exhibit a concentration difference at at least two spaced-apart locations of the solution, and if the spatial distribution of the field strength of the electric field in the solution is chosen such that the ligands are bound by the electric field in the sense of a
  • This procedure can be applied even in a method in which the electrode (s) and the counter electrode (s) are provided in addition to the sensor.
  • the spatial distribution of the field strength is preferably produced by applying different electrical potential profiles to at least two electrodes spaced apart from one another and / or to at least two counter-electrodes spaced apart from one another.
  • the field strength pattern of the electric field located between the electrodes and the counterelectrodes can be selected as a function of measurement and / or estimated values for the respectively present ligand concentration. If, during the execution of the method, the solution is delimited laterally by walls, for example, of a measuring chamber, a greater field strength can be generated at locations adjacent to the walls, in particular in corner regions of the measuring chamber, than at locations which are further away from the walls , As a result, a uniform concentration distribution of the ligands is made possible in the measuring chamber.
  • the potential curves are chosen such that the electric field moves relative to the receptor in the solution.
  • This can be achieved in particular by successively applying an electrical voltage to electrode arrangements arranged in a row, each consisting of an electrode and a counterelectrode assigned to it, in order to generate an electrical traveling field progressing in the direction of extension of the row.
  • the ligand is labeled with an electrically charged molecule before and / or during the contacting of the solution with the receptor, which is bound directly and / or indirectly via at least one other molecule to the ligand.
  • This can be done, for example, by first binding an antibody that is specific for the ligand to the strongly charged molecule, and then binding the antibody-molecule complex thus formed to the ligand.
  • the pH of the solution is preferably adjusted so that the majority of the molecules in the solution have a polarity opposite to the polarity of the molecule with which the ligand is labeled.
  • the migration of the ligand to the receptor can be accelerated or the field strength of the electric field applied between the electrode and the counter electrode can be reduced.
  • the latter is particularly advantageous if the anode is used as the electrode and the cathode of a reverse biased photodiode is used as the opposite electrode.
  • the voltage can then be chosen smaller than the breakdown voltage of the photodiode.
  • the electrically charged molecule is an acid, in particular polyacrylic acid.
  • an acid in particular polyacrylic acid.
  • FIG. 1 shows a partial cross section through a biochip having a carrier, on the surface of which receptors are immobilized, wherein a ligand-containing solution is arranged on the carrier,
  • FIG 3 shows a partial cross section through a measuring chamber whose inner cavity is filled with a ligand-containing solution, wherein at the bottom of the inner cavity receptors are immobilized, and
  • a measuring device 3 which has a carrier with a carrier surface 4.
  • a plurality of laterally spaced test sites 5 are provided on the carrier surface 4, on which receptors ⁇ are immobilized, which are binding-specific for the ligands 2.
  • the carrier has a semiconductor substrate 7 of a first charge carrier type; on which a first electrical insulation layer 8 is arranged, whose surface facing away from the substrate 7 forms the support surface 4.
  • sensors 9 are inserted under the test sites, which are each configured as photodiodes in the embodiments shown in Fig. 1-3.
  • FIG. 2 shows that the photodiodes each have an approximately trough-shaped first semiconductor zone 10 and a second semiconductor zone cooperating therewith, which is formed by the substrate 7 and adjoins the first semiconductor zone 10.
  • ⁇ renz Scheme between the first semiconductor zone 10 and the substrate
  • Substrate 7 are electrically connected via metallizations 12 with inputs of a Messsignalerfas- sungs Rhein 13 and with a voltage source 14 or connectable.
  • the carrier forms part of a boundary wall of a measuring chamber only partially shown in the drawing, which has an inlet and a drain and is filled with a buffer and / or Spülfiüsstechnik.
  • a buffer and / or Spülfiüsstechnik To analyze the solution 1, it is introduced through the feed into the measuring chamber such that the solution 1 comes into contact with the carrier surface 4 and the receptors immobil immobilized thereon.
  • the ligands 2 contained in the solution 1 each have an electrical charge of a first polarity.
  • the solution contains 1 more, partially charged, partially uncharged molecules 15.
  • the pH of the solution 1 is adjusted so that at least ⁇ %, in particular at least 75% and preferably at least 90% of the molecules 15 each no electric charge or electrical Have charge of a second polarity.
  • an electrical voltage is applied between the first semiconductor zone 10 and the substrate 7 with the aid of the voltage source 14, which generates an electric field in the solution 1 in Fig. 1 and 3 is indicated schematically by dashed lines.
  • the polarity of the voltage source 14 is chosen so that the photodiodes are reverse-connected. In this case, a charge carrier depletion occurs in the space charge zone 11
  • FIG. 1 shows that the field lines of the electric field at the test sites 5 extend approximately orthogonally to the carrier surface 4.
  • the electric field causes 2 Coulomb forces on the charges of the ligands, which move the ligands 2 in the solution 1 to the receptors ⁇ . This considerably shortens the time during which the solution 1 must be in contact with the receptors, so that the ligands 5 bind to the receptors ⁇ .
  • molecules 15 having a charge of the second polarity are moved away from the receptorsteur by Coulomb forces acting in the reverse direction.
  • the electrical voltage is applied longer to the first semiconductor zone 10 of the photodiode located at the relevant test site 5 than to a photodiode connected to a test point 5 is arranged, which has a smaller distance to the line or is arranged on the line.
  • the electrical voltages between the individual first semiconductor zones 10 and the substrate 7 can also be reversed one or more times in order to redistribute the ligands 2 and / or the molecules 15 in the solution.
  • a rinsing liquid is passed through the measuring chamber to remove ligands 2 which are not bound to a receptor aus from the measuring chamber. Then, a luminescence radiation is generated at the test sites 5 as a function of the binding of the ligand 2 to the receptor ⁇ .
  • the Lumi The fluorescence can be excited by an excitation radiation and / or a chemiluminescent substrate on the ligand 2 itself and / or a marker which is directly and / or indirectly bound thereto and not shown in detail in the drawing.
  • the photocurrent is measured at the individual photodiodes using the measuring signal detection device 13 in each case. This is a measure of the concentration of ligands in solution 1.
  • the voltages for generating the electric field in the solution 1 located in the measuring chamber are respectively applied between the first semiconductor zone 10 of the sensor 9 located at the relevant test site 5 and a counterelectrode 16 at one of the test site 5 opposite wall region of the boundary wall of the measuring chamber is arranged. Between the ⁇ egenelektroden l ⁇ and the solution 1, a second electrical insulation layer 17 is arranged in each case.
  • the counterelectrodes 1 are positioned relative to the test sites 5 in such a way that the field lines of the electric field respectively arranged between the counterelectrode 1 and the first semiconductor zone 10 associated therewith extend normal to the carrier surface 4.
  • the counter electrodes 1 ' are laterally spaced from one another and can be connected to a first connection of the voltage source 14 independently of one another via a switch 18 assigned to them.
  • a second terminal of the voltage source 14 is connected via the Meßsignalerfdssungs Rheinen 13 with the first semiconductor regions 10.
  • the photodiodes are biased in the reverse direction by means of a second voltage source 19.
  • the counterelectrodes 1 ' are connected to the first terminal of the voltage source 14 by corresponding actuation of the switches 18 in order to apply the voltage.
  • the switches 18 are again actuated to disconnect the counterelectrodes l ⁇ from the first terminal of the voltage source 14. Then any, remaining in the measuring chamber free ligand 2 by a Rinsing step removed from the measuring chamber and it is the luminescence radiation generated as a function of the binding of the ligands 2 to the receptors ⁇ . The luminescence radiation is detected by means of the sensors 9.
  • the photodiodes can be used as sensors 9 and ion-selective field effect transistors.
  • the ion-selective field-effect transistors have a first semiconductor zone 10 serving as a source, a second semiconductor zone formed by the substrate 7, and a third semiconductor zone 20 serving as a drain on the first semiconductor zone 10 and the third semiconductor zone 20 are each Tannenfömig embedded in the substrate 7 and laterally spaced from each other by a channel region 21.
  • the first semiconductor zone 10 and the second semiconductor zone 20 are connected to metallizations 12.
  • the metallizations 12, the semiconductor zones 10, 20 and the substrate 7 are spaced from the solution by an electrical insulation layer.
  • receptors ⁇ are immobilized.
  • an electrical voltage can be applied between at least two of the semiconductor zones 7, 10, 20 and / or between at least one of the semiconductor zones 7, 10, 20 and at least one metallic outer electrode 16 spaced therefrom ,
  • the measurement signal measured is an electric current between the drain and the source dependent on the binding of the ligand 2 to the receptor ⁇ .
  • the following steps are carried out - provision of a carrier surface 4 on which at least one ligand 2 binding-specific receptor ⁇ is immobilized,

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Abstract

Bei einem Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines in einer zu analysierenden Lösung (1) enthaltenen Liganden (2), der eine Ladung aufweist oder an eine solche gebunden ist, werden folgende Schritte durchgeführt: Bereitstellen einer Trägeroberfläche (4), auf der wenigstens ein für die Liganden (2) bindungsspezifischer Rezeptor (6) immobilisiert ist, Bereitstellen zumindest eines, mindestens einen elektrisch leitfähigen Bereich aufweisenden Sensors (9) an der Trägeroberfläche (4), in Kontakt bringen der Lösung (1) mit dem Rezeptor (6), um den Ligand (2) an den Rezeptor (6) zu binden, Anlegen einer elektrischen Spannung zwischen einem elektrisch leitfähigen Bereich des Sensors (9) und einer Θegenelektrode, während die Lösung (1) mit dem Rezeptor (6) in Kontakt steht, derart, dass die Liganden (2) in einem elektrischen Feld relativ zum Rezeptor (6) in der Lösung bewegt werden, Entfernen von Liganden (2), die nicht an einen Rezeptor (6) gebunden sind, aus dem Detektionsbereich des Sensors (9), Erfassen eines von der Bindung des Rezeptors (6) an den Liganden (2) abhängiges Messsignals mit Hilfe des Sensors (9).

Description

Verfahren zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Konzentration eines Liganden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines in einer zu analysierenden Lösung enthaltenen Liganden, der eine Ladung aufweist oder an eine solche gebunden ist, a) wobei eine Trägeroberfläche bereitgestellt wird, auf der wenigstens ein für die Liganden bindungsspezifischer Rezeptor immobilisiert ist, b) wobei zumindest ein Sensor bereitgestellt wird, c) wobei die Lösung zum Binden mindestens eines Liganden an den Rezeptor mit diesem in Kontakt gebracht wird, d) wobei während die Lösung mit dem Rezeptor in Kontakt steht, zwischen eine Elektrode und eine θegenelektrode eine elektrische Spannung angelegt wird, durch deren elektrisches Feld die Liganden relativ zum Rezeptor in der Lösung bewegt werden, e) wobei danach Liganden, die nicht an einen Rezeptor gebunden sind, aus dem Detektionsbereich des Sensors entfernt werden, f) und wobei mit Hilfe des Sensors ein von der Bindung des Rezeptors an den Liganden abhängiges Messsignal erfasst wird.
Ein derartiges Verfahren ist aus US 2005/01 12548 AI bekannt. Bei dem Verfahren wird eine Messkammer bereitgestellt, die eine als Probenaufhahmeraum dienende Innenhöhlung hat, die einen Boden, eine Decke und Seitenbegrenzungswände hat. Der Boden weist eine Trägeroberfläche auf; auf der Rezeptoren immobilisiert sind, der für eine nachzuweisende DNA-Liganden bindungsspezifisch sind. In den Boden ist unter den Rezeptoren eine Elektrode und in einen dieser gegenüberliegenden Wandungsbereich der Decke eine θegenelektrode eingelassen. Elektrode und θegenelektrode bestehen jeweils aus einem transparenten, elektrisch leitfähigen Werkstoff und sind jeweils durch eine Isolationsschicht von der Innenhöh- lung beabstandet. Nachdem die Messkammer und ein Sensor zum Detektieren einer Fluoreszenzstrahlung bereitgestellt wurden, wird eine Lösung, welche die nachzuweisenden Liganden enthält, derart in die Innenhöhlung der Messkammer eingefüllt, das sie mit den Rezeptoren in Kontakt gerät. Zwischen die Elektrode und die Θegenelektrode wird eine elektrische Wechselspαnnung angelegt, die in der Lösung ein elektrisches Feld erzeugt. Durch das Feld werden auf die Liganden Coulomb-Kräfte ausgeübt, welche die Liganden in Richtung auf die Elektrode zu bewegen. Dabei geraten die Liganden mit den Rezeptoren in Kontakt und binden an diese. Danach wird die Innenhöhlung der Messkammer mit einem Spülmittel gespült, um nicht an einen Rezeptor gebundene Liganden aus der Innenhöhlung zu entfernen. Der Nachweis der Bindung der Liganden an die Rezeptoren erfolgt mit Hilfe eines optischen Markers, mit dem die Liganden markiert sind. Die in der Messkammer verbliebenen Rezeptor-Liganden-Marker-Komplexe werden mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt, welche die Marker zur Aussendung einer Fluoreszenzstrahlung anregen. Diese wird mit Hilfe des bereitgestellten Sensors detektiert. Das Verfahren hat den Nachteil, dass es einen relativ großen apparativen Aufwand erfordert.
Es besteht deshalb die Aufgabe, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, das auf einfache Weise durchführbar ist.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass der zumindest eine Sensor an der Trägeroberfläche angeordnet ist und mindestens einen elektrisch leitfähigen Bereich aufweist, und dass als Elektrode der mindestens eine elektrisch leitfähige Bereich des Sensors verwendet wird.
Der Sensor erfüllt also eine Doppelfunktion und wird außer zum Erfassen des Messsignals auch als Elektrode zum Erzeugen eines eine Migrationsbewegung der Liganden bewirkenden elektrischen Felds verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch auf einfache Weise durchfuhrbar. Der wenigstens eine Rezeptor kann eine Nukleinsäure oder ein Derivate davon (DNA, RNA, PNA, LNA, Oligonukleotide, Plasmide, Chromosomen), ein Peptid, ein Protein (Enzym, Protein, Oligopeptide, zelluläres Rezeptorprotein und dessen Komplexe, Peptidhormon, Antikörper und dessen Fragmente), ein Kohlenhydrat und dessen Derivate, insbesondere ein glykosyliertes Protein und ein θlycosid, ein Fett, eine Fettsäure und/oder ein Lipid umfassen.
Vorteilhaft ist, wenn die Elektrode und/oder die Θegenelektrode durch eine elektrische Isolationsschicht von der zu analysierenden Lösung beabstandet werden. Dadurch wird vermieden, dass die Lösung durch das Anlegen der elektrischen Spannung elektrolytisch zersetzt wird.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist der Sensor ein Halbleitersen- sor, der zumindest eine erste Halbleiterzone und eine damit zusammenwirkende zweite Halbleiterzone aufweist, wobei als Elektrode die erste Halbleiterzone verwendet wird. Dabei ist es sogar möglich, dass als θegenelektrode die zweite Halbleiterzone verwendet wird. Das elektrische Feld kann dann ohne eine zusätzliche Elektrode in der Lösung erzeugt werden.
Bei einer vorteilhaften Ausfuhrungsform der Erfindung wird in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor eine optische Strahlung erzeugt, wobei als Halbleitersensor eine für die optische Strahlung empfindliche Fotodiode verwendet wird. Die elektrische Spannung wird dabei kleiner gewählt als die Durchbruchs- Spannung der Fotodiode. Da die Fotodiode dicht benachbart zum Rezeptor angeordnet ist, kann sie in einem entsprechend großen Raumsegment die optische Strahlung einfangen. Dabei kann auf eine der Fotodiode vorgeschaltete Sammellinse verzichtet werden.
Bei einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird als Halbleitersensor ein ionenselektiver Feldeffekttransistor verwendet. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor kann also auch kapazitiv nachgewiesen werden.
Vorteilhaft ist, wenn die Polarität der zwischen Elektrode und θegenelektrode anliegenden Spannung vor dem Erfassen des Messsignals mindestens einmal geändert wird. Dadurch kann eine gleichmäßigere Verteilung der Liganden in der Lösung erreicht werden.
Zweckmäßigerweise wird nach dem Binden des mindestens einen Liganden an den Rezeptor die Spannung derart zwischen Elektrode und θegenelektrode angelegt, dass Liganden, die die nicht an einen Rezeptor gebunden sind, aus dem
Detektionsbereich des Sensors entfernt werden. Dies kann insbesondere dadurch erreicht werden, dass nach dem Binden des Liganden an den Rezeptor für eine ausreichende Zeitdauer eine Spannung mit umgekehrter Polarität zwischen Elektrode und θegenelektrode angelegt wird. Dadurch kann ein eventueller Spϋlvorgαng zum Entfernen der noch ungebundenen Ligαnden verkürzt oder sogar ganz eingespart werden.
Besonders vorteilhaft ist, wenn die Liganden an mindestens zwei voneinander beabstandeten Stellen der Lösung einen Konzentrationsunterschied aulweisen, und wenn die räumliche Verteilung der Feldstärke des elektrischen Felds in der Lösung derart gewählt wird, dass die Liganden durch das elektrische Feld im Sinne einer
Reduzierung des Konzentrationsunterschieds in der Lösung umverteilt werden.
Diese Vorgehensweise kann sogar bei einem Verfahren angelegt werden, bei dem die Elektrode(n) und die θegenelektrode(n) zusätzlich zum Sensor vorhanden sind.
Vorzugsweise wird die räumliche Verteilung der Feldstärke dadurch erzeugt, dass an mindestens zwei voneinander beabstandete Elektroden und/oder an mindes- tens zwei voneinander beabstandete Gegenelektroden unterschiedliche elektrische Potentialverläufe angelegt werden. Dabei kann das Feldstärkemuster des zwischen den Elektroden und den Gegenelektroden befindlichen elektrischen Felds in Abhängigkeit von Mess- und/oder Schätzwerten für die jeweils vorhandene Ligandenkozentration gewählt werden. Wenn die Lösung während der Durchfüh- rung des Verfahrens seitlich durch Wandungen beispielsweise einer Messkammer begrenzt wird, kann an zu den Wandungen benachbarten Stellen, insbesondere in Eckbereichen der Messkammer, eine größere Feldstärke erzeugt werden, als an Stellen, die weiter von den Wandungen entfernt sind. Dadurch wird in der Messkammer eine gleichmäßiger Konzentrationsverteilung der Liganden ermöglicht.
Gegebenenfalls ist es sogar möglich, dass die Potentialverläufe derart gewählt werden, dass sich das elektrische Feld relativ zum Rezeptor in der Lösung bewegt. Das kann insbesondere dadurch erreicht werden, dass an in einer Reihe befindliche Elektrodenanordnungen, jeweils bestehend aus einer Elektrode und einer dieser zugeordneten Gegenelektrode, nacheinander eine elektrische Spannung angelegt wird, um ein in Erstreckungsrichtung der Reihe fortschreitendes elektrisches Wanderfeld zu erzeugen.
Vorteilhaft ist, wenn der Ligand vor und/oder während dem in Kontakt bringen der Lösung mit dem Rezeptor mit einem elektrisch geladenen Molekül markiert wird, das direkt und/oder indirekt über wenigstens ein weiteres Molekül an den Ligand gebunden wird. Dies kann z.B. in der Weise erfolgen, dass zunächst ein Antikörper, der für den Ligand bindungsspezifisch ist, an das stark geladene Molekül gebunden wird und der so gebildete Antikörper-Molekül-Komplex danach an den Liganden gebunden wird. Der pH-Wert der Lösung wird dabei bevorzugt so eingestellt, dass der Großteil der Moleküle in der Lösung eine zu der Polarität des Moleküls, mit dem der Ligand markiert wird, entgegengesetzte Polarität aufweist. Durch die an den Ligand gebundene Ladung kann die Migration des Liganden zum Rezeptor beschleunigt werden bzw. die Feldstärke des zwischen Elektrode und θegenelektrode anliegenden elektrischen Felds reduziert werden. Letzteres ist insbesondere von Vorteil, wenn als Elektrode die Anode und als Θegenelektrode die Kathode einer in Sperrrichtung vorgespannten Fotodiode verwendet wird. Die Spannung kann dann kleiner gewählt werden als die Durchbruchspannung der Fotodiode.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das elektrisch geladene Molekül eine Säure, insbesondere Polyacrylsäure. Dadurch kann eine besonders hohe elektrische Ladung an den Ligand gebunden werden.
Nachfolgend sind Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt
Fig. 1 einen Teilquerschnitt durch einen Biochip, der einen Träger aufweist, auf dessen Oberfläche Rezeptoren immobilisiert sind, wobei auf dem Träger eine Liganden enthaltende Lösung angeordnet ist,
Fig. 2 einen Teilquerschnitt durch eine in den Träger integrierte Fotodiode,
Fig. 3 einen Teilquerschnitt durch eine Messkammer, deren Innenhöhlung mit einer Liganden enthaltenden Lösung befüllt ist, wobei am Boden der Innenhöhlung Rezeptoren immobilisiert sind, und
Fig. 4 einen Teilquerschnitt durch einen ISFET. Bei einem Verfahren zum Nachweisen von in einer zu analysierenden Lösung 1 enthaltenen Liganden 2 und/oder zum Bestimmen der Konzentration der Liganden 2 wird eine Messeinrichtung 3 bereitgestellt, die einen Träger mit einer Trägeroberfläche 4 aufweist. Wie in Fig. 1 erkennbar ist, sind auf der Trägeroberfläche 4 mehrere seitlich voneinander beabstandete Teststellen 5 vorgesehen, an denen Rezeptoren ό immobilisiert sind, die für die Liganden 2 bindungsspezifisch sind.
Der Träger weist ein Halbleiter-Substrat 7 eines ersten Ladungsträgertyps auf; auf dem eine erste elektrische Isolationsschicht 8 angeordnet ist, deren dem Substrat 7 abgewandte Oberfläche die Trägeroberfläche 4 bildet. In das Substrat 7 sind unter den Teststellen 5 Sensoren 9 eingelassen, die bei den in Fig. 1 -3 gezeigten Ausführungsbeispielen jeweils als Fotodioden ausgestaltet sind.
In Fig. 2 ist erkennbar, dass die Fotodioden jeweils eine etwa wannenförmige erste Halbleiterzone 10 und eine damit zusammenwirkende zweite Halbleiterzone aufweist, die durch das Substrat 7 gebildet ist und an die erste Halbleiterzone 10 angrenzt. Im θrenzbereich zwischen der ersten Halbleiterzone 10 und dem Substrat
7 ist eine Raumladungszone 1 1 gebildet. Die ersten Halbleiterzonen 10 und das
Substrat 7 sind über Metallisierungen 12 mit Eingängen einer Messsignalerfas- sungseinrichtung 13 und mit einer Spannungsquelle 14 elektrisch verbunden bzw. verbindbar.
Der Träger bildet einen Teil einer Begrenzungswand einer in der Zeichnung nur teilweise dargestellten Messkammer, die einen Zulauf und einen Ablauf aufweist und mit einer Puffer- und/oder Spülfiüssigkeit befüllt ist. Zum Analysieren der Lösung 1 wird diese durch den Zulauf derart in die Messkammer eingebracht, dass die Lösung 1 mit der Trägeroberfläche 4 und den darauf immobilisierten Rezeptoren ό in Kontakt gerät.
In Fig. 1 ist erkennbar, dass die in der Lösung 1 enthaltenen Liganden 2 jeweils eine elektrische Ladung einer ersten Polarität aufweisen. Außerdem enthält die Lösung 1 weitere, teils geladene, teils ungeladene Moleküle 15. Der pH-Wert der Lösung 1 wird so eingestellt, dass mindestens όθ%, insbesondere mindestens 75% und bevorzugt mindestens 90% der Moleküle 15 jeweils keine elektrische Ladung oder eine elektrische Ladung einer zweiten Polarität aufweisen. Während die Lösung 1 mit den Rezeptoren ό in Kontakt steht, wird bei dem in Fig. 1 gezeigten Ausfuhrungsbeispiel mit Hilfe der Spannungsquelle 14 zwischen die erste Halbleiterzone 10 und das Substrat 7 eine elektrische Spannung angelegt die in der Lösung 1 ein elektrisches Feld erzeugt, das in Fig. 1 und 3 schematisch durch strichlinierte Feldlinien angedeutet ist. Die Polarität der Spannungsquelle 14 wird so gewählt, das die Fotodioden in Sperrrichtung geschaltet sind. Dabei tritt in der Raumladungszone 1 1 eine Ladungsträgerverarmung auf
In Fig. 1 ist erkennbar, dass die die Feldlinien des elektrischen Felds an den Teststellen 5 etwa orthogonal zur Trägeroberfläche 4 verlaufen. Das elektrische Feld bewirkt an den Ladungen der Liganden 2 Coulomb-Kräfte, welche die Liganden 2 in der Lösung 1 auf die Rezeptoren ό zu bewegen. Dadurch verkürzt sich die Zeitdauer, während der die Lösung 1 mit den Rezeptoren ό in Kontakt stehen muss, damit die Liganden 5 an die Rezeptoren ό binden, erheblich. Gleichzeitig werden Moleküle 15, die eine Ladung der zweiten Polarität aufweisen, durch in umgekehrte Richtung wirkende Coulomb-Kräfte von den Rezeptoren ό weg bewegt.
An einer Teststelle 5, die von einer den Zulauf und den Ablauf miteinander verbin- denden, geraden Linie weiter beabstandet sind, wird die elektrische Spannung länger an die erste Halbleiterzone 10 der an der betreffenden Teststelle 5 befindlichen Fotodiode angelegt als bei einer Fotodiode, die an einer Teststelle 5 angeordnet ist, die einen geringeren Abstand zu der Linie hat oder auf der Linie angeordnet ist. Dadurch werden eventuelle, nach dem Befüllen der Messkammer mit der Lösung 1 in dieser vorhandene Konzentrationsunterschiede der Liganden 2 abgeschwächt oder sogar ganz ausgeglichen. Bei Bedarf können die elektrischen Spannungen zwischen den einzelnen erste Halbleiterzonen 10 und dem Substrat 7 auch ein oder mehrmals umgepolt werden, um die Liganden 2 und/oder die Moleküle 15 in der Lösung umzuverteilen bzw. zu durchmischen.
Nachdem die Lösung 1 für eine vorbestimmte Zeitdauer mit den Rezeptoren ό in Kontakt gebracht wurde, wird eine Spülflüssigkeit durch die Messkammer geleitet, um Liganden 2, die nicht an einen Rezeptor ό gebunden sind, aus der Messkammer zu entfernen. Dann wird an den Teststellen 5 in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden 2 an den Rezeptor ό eine Lumineszenzstrahlung erzeugt. Die Lumi- neszenzstrαhlung kann durch eine Anregungsstrahlung und/oder ein Chemilumi- neszenzsubstrat an dem Ligand 2 selbst und/oder einem daran direkt und/oder indirekt gebundenen, in der Zeichnung nicht näher dargestellten Marker, angeregt werden.
Zum Detektieren der Lumineszenzstrahlung wird an den einzelnen Fotodioden jeweils mit Hilfe der Messsignalerfassungseinrichtung 13 der Fotostrom gemessen. Dieser ist ein Maß für die Konzentration der Liganden in der Lösung 1.
Bei dem in Fig. 3 gezeigten Ausführungsbeispiel werden die Spannungen zum Erzeugen des elektrischen Felds in der in der Messkammer befindlichen Lösung 1 jeweils zwischen der ersten Halbleiterzone 10 des an der betreffenden Teststelle 5 befindlichen Sensors 9 und einer Θegenelektrode 16 angelegt die an einem der Teststelle 5 gegenüberliegenden Wandungsbereich der Begrenzungswand der Messkammer angeordnet ist. Zwischen den θegenelektroden lό und der Lösung 1 ist jeweils eine zweite elektrische Isolationsschicht 17 angeordnet. Die Gegenelektroden lό sind derart relativ zu den Teststellen 5 positioniert, dass die Feldlinien des jeweils zwischen der Θegenelektrode lό und der dieser zugeordneten ersten Halbleiterzone 10 angeordneten elektrischen Felds eiwa normal zur Trägeroberflä- che 4 verlaufen.
In Fig. 3 ist erkennbar, dass die θegenelektroden lό seitlich zueinander beabstandet und jeweils über einen ihnen zugeordneten Schalter 18 unabhängig voneinander mit einem ersten Anschluss der Spannungsquelle 14 verbindbar sind. Ein zweiter Anschluss der Spannungsquelle 14 ist über die Messsignalerfdssungseinrichtungen 13 mit den ersten Halbleiterzonen 10 verbunden. Die Fotodioden sind mit Hilfe einer zweiten Spannungsquelle 19 in Sperrrichtung vorgespannt. Nach dem Einbringen Lösung 1 in die Messkammer werden zum Anlegen der Spannung die Θegenelektroden l ό durch entspre- chendes Betätigen der Schalter 18 mit dem ersten Anschluss der Spannungsquelle 14 verbunden.
Nachdem die Lösung 1 eine vorbestimmte Zeitdauer mit den Rezeptoren ό in Kontakt gestanden hat, werden die Schalter 18 erneut betätigt, um die Θegenelektroden lό vom ersten Anschluss der Spannungsquelle 14 zu trennen. Dann werden eventuelle, in der Messkammer noch vorhandene freie Liganden 2 durch einen Spülschritt aus der Messkammer entfernt und es wird die Lumineszenzstrahlung in Abhängigkeit von der Bindung der Liganden 2 an die Rezeptoren ό erzeugt. Die Lumineszenzstrahlung wird mit Hilfe der Sensoren 9 detektiert.
Anstelle der Fotodioden können als Sensoren 9 auch ionenselektive Feldeffekttransistoren verwendet werden. Wie in Fig. 4 erkennbar ist, weisen die ionenselektive Feldeffekttransistoren eine erste, als Source dienende Halbleiterzone 10, eine zweite, durch das Substrat 7 gebildete Halbleiterzone, und eine dritte, als Drain dienende Halbleiterzone 20 auf Die erste Halbleiterzone 10 und die dritte Halbleiterzone 20 sind jeweils wannenfömig in das Substrat 7 eingelassen und durch einen Kanalbereich 21 seitlich voneinander beabstandet. Die erste Halbleiterzone 10 und die zweite Halbleiterzone 20 sind mit Metallisierungen 12 verbunden. Die Metallisierungen 12, die Halbleiterzonen 10, 20 und das Substrat 7 sind durch eine elektrische Isolationsschicht von der Lösung beabstandet.
Auf dem Kanalbereich 21 sind Rezeptoren ό immobilisiert. Zum Erzeugen des elektrischen Felds in der Lösung 1 kann eine elektrische Spannung zwischen wenigstens zwei der Halbleiterzonen 7, 1 0, 20 und/oder zwischen mindestens einer der Halbeiterzonen 7, 1 0, 20 und mindestens einer davon beabstandeten metalli- sehe θegenelektrode 16 angelegt werden. Als Messsignal wird ein von der Bindung des Liganden 2 an den Rezeptor ό abhängiger elektrischer Strom zwischen Drain und Source gemessen.
Bei dem Verfahren werden also folgende Schritte durchgeführt - Bereitstellen einer Trägeroberfläche 4, auf der wenigstens ein für die Liganden 2 bindungsspezifischer Rezeptor ό immobilisiert ist,
Bereitstellen zumindest eines, mindestens einen elektrisch leitfahigen Bereich aufweisenden Sensors 9 an der Trägeroberfläche 4, in Kontakt bringen der Lösung 1 mit dem Rezeptor ό, um den Ligand 2 an den Rezeptor ό zu binden,
Anlegen einer elektrischen Spannung zwischen einem elektrisch leitfähigen Bereich des Sensors 9 und einer θegenelektrode, während die Lösung 1 mit dem Rezeptor ό in Kontakt steht, derart, dass die Liganden 2 in einem elektrischen Feld relativ zum Rezeptor ό in der Lösung bewegt werden, Entfernen von Ligαnden 2, die nicht an einen Rezeptor ό gebunden sind, aus dem Detektionsbereich des Sensors 9,
Erfassen eines von der Bindung des Rezeptors 6 an den Liganden 2 abhängiges Messsignals mit Hilfe des Sensors 9.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines in einer zu analysierenden Lösung (1 ) enthaltenen Ligan-
5 den (2), der eine Ladung aulweist oder an eine solche gebunden ist, a) wobei eine Trägeroberfläche (4) bereitgestellt wird, auf der wenigstens ein für die Liganden (2) bindungsspezifischer Rezeptor (ό) immobilisiert ist, b) wobei zumindest ein Sensor (9) bereitgestellt wird, c) wobei die Lösung (1 ) zum Binden mindestens eines Liganden (2) an den l o Rezeptor (ό) mit diesem in Kontakt gebracht wird, d) wobei während die Lösung (1 ) mit dem Rezeptor (ό) in Kontakt steht, zwischen eine Elektrode und eine θegenelektrode eine elektrische Spannung angelegt wird, durch deren elektrisches Feld die Liganden (2) relativ zum Rezeptor (ό) in der Lösung bewegt werden,
15 e) wobei danach Liganden (2), die nicht an einen Rezeptor (ό) gebunden sind, aus dem Detektionsbereich des Sensors (9) entfernt werden, f) und wobei mit Hilfe des Sensors (9) ein von der Bindung des Rezeptors (ό) an den Liganden (2) abhängiges Messsignal erfasst wird., dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Sensor (9) an der Träger- 20 Oberfläche (4) angeordnet ist und mindestens einen elektrisch leitfähigen Bereich aufweist, und dass als Elektrode der mindestens eine elektrisch leitfähige Bereich des Sensors (9) verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrode 25 und/oder die Θegenelektrode durch eine elektrische Isolationsschicht (1 7) von der zu analysierenden Lösung (1 ) beabstandet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor (9) ein Halbleitersensor ist, der zumindest eine erste Halbleiterzone (1 0)
30 und eine damit zusammenwirkende zweite Halbleiterzone aufweist, und dass als Elektrode die erste Halbleiterzone (1 0) verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Θegenelektrode die zweite Halbleiterzone verwendet wird.
35
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (ό) eine optische Strahlung erzeugt wird, und dass als Halbleitersensor eine für die optische Strahlung empfindliche Fotodiode verwendet wird.
ό. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Halbleitersensor ein ionenselektiver Feldeffekttransistor verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis ό, dadurch gekennzeichnet, dass die Polarität der zwischen Elektrode und Θegenelektrode anliegenden Spannung vor dem Erfassen des Messsignals mindestens einmal geändert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Binden des mindestens einen Liganden (2) an den Rezeptor (ό) die Spannung derart zwischen Elektrode und θegenelektrode angelegt wird, dass Liganden (2), die die nicht an einen Rezeptor (ό) gebunden sind, aus dem Detektionsbereich des Sensors (9) entfernt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Liganden (2) an mindestens zwei voneinander beabstandeten Stellen der Lösung (1 ) einen Konzentrationsunterschied aufweisen, und dass die räumliche Verteilung der Feldstärke des elektrischen Felds in der Lösung (1 ) derart gewählt wird, dass die Liganden (2) durch das elektrische Feld im Sinne einer Reduzierung des Konzentrationsunterschieds in der Lösung (1 ) umverteilt werden.
1 0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die räumliche Verteilung der Feldstärke dadurch erzeugt wird, dass an mindestens zwei voneinander beabstandete Elektroden und/oder an mindestens zwei voneinander beabstandete Gegenelektroden unterschiedliche elektrische Potentialverläufe angelegt werden.
1 1. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Potentialverläufe derart gewählt werden, dass sich das elektrische Feld relativ zum Rezeptor (ό) in der Lösung bewegt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand (2) vor und/oder während dem in Kontakt bringen der Lösung (1) mit dem Rezeptor (ό) mit einem elektrisch geladenen Molekül (15) markiert wird, das direkt und/oder indirekt über wenigstens ein weiteres Molekül (15) an den Ligand gebunden wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrisch geladene Molekül (15) eine Säure, insbesondere Polyac- rylsäure ist.
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