DE4216696C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Empfindlichkeits- und Selektivitätssteigerung bei Immuno-Assays, Molekül-Rezeptor-, DNA-komplementär-DNA- und Gast-Wirtsmolekül-Wechselwirkungs-Assays - Google Patents

Description

Die Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Empfindlichkeits- und Selektivitätssteigerung bei Immuno-Assays, Molekül-Rezeptor-, DNA-kom­ plementär-DNA- und Gast-Wirtsmolekül-Wechselwirkungs-Assays nach Anspruch 1 und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung nach Anspruch 17.

Die quantitative Analyse komplexer Stoffgemische unter Ausnutzung der sehr selektiven Antikörper-Antigen-Bindung (Schlüssel-Schloß-Prinzip) und der DNA-Paarbildung bei den sogenannten DNA-Sonden ist in der Bio­ chemie und klinischen Chemie eine etablierte Analysenmethode und, dement­ sprechend weit verbreitet. Meist werden kompetitive Tests mit markierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Molekülen benutzt. Beim Radio-Immuno-As­ say (RIA) ist das der Meßlösung zugesetzte Antigen (bzw. das Antikörper­ molekül bei der Sandwich-Methode) radioaktiv markiert. Beim Enzym-Immu­ no-Assay (EIA oder das heterogene Enzym-Linked-Adsorbend-Assay, ELISA) ist an den betreffenden Markermolekülen ein sogenanntes Marker-Enzym ge­ bunden. Diese markierten Moleküle konkurrieren mit den zu messenden, un­ markierten Molekülen (zu bestimmender Stoff = Analyt) um die Bindung an den meist trägergebundenen Antikörper (bzw. DNA-Sequenz), so daß sich die unbekannte Menge Antigen (DNA-Art und Menge) bestimmen läßt, wenn zum Vergleich ein Test mit einem Antigen (DNA-Molekül) bekannter Konzen­ tration durchgeführt wird. Die Meßsignale sind bei dieser Methode umge­ kehrt proportional zur Konzentration. Bei den sog. Sandwichtests werden markierte Antikörper benutzt. Diese binden sandwichartig an Antigenmole­ küle an, die ihrerseits zuvor konzentrationsabhängig an trägergebundene Antikörper gebunden sind.

Die sehr spezifische Bindung zweier komplementärer Moleküle erlaubt na­ türlich auch umgekehrt die quantitative Bestimmung des größeren Partners (Antikörper-, Rezeptor-Analyse resp. des komplementären DNA-Moleküls (oder Bio-Oberfläche), welches mindestens in einem Teilbereich eine kom­ plementäre DNA-Sequenz zur markierten Sequenz aufweist) und sind daher die wichtigsten biochemischen Analysenverfahren. Nachdem es inzwischen möglich ist, auch für kleinere Moleküle (Haptene) monoklonale Antikörper in beliebigen Mengen zu produzieren, werden diese immunologischen Metho­ den auch für die Umweltanalytik zunehmend bedeutsam. Beispielsweise kann man unter Verwendung monoklonaler Antikörper für die verschiedenen Di­ oxine die gesamten Analysenkosten dadurch erheblich senken, daß nur bei positivem Ergebnis des immunologischen Tests die sehr teuere GC-MS Ana­ lyse durchgeführt werden muß (Screening).

Die inzwischen traditionellen immunologischen Bestimmungsverfahren (RIA und EIA bzw. ELISA) weisen erhebliche Nachteile auf, die hinlänglich be­ kannt sind. Entweder treten wegen der Verwendung radioaktiven Materials Entsorgungs-, Versand- und Lagerprobleme auf oder man muß mit einer Be­ einflussung der immunologischen Reaktion durch das meist, verglichen zum relativ kleinen Antigenmolekül, voluminöse Enzymmolekül rechnen. Enzym­ markierte Antigen- oder Antikörpermoleküle (bzw. eines der Partner von Molekül -Rezeptor-, Gast-Wirtsmolekül -, DNA-komplementär DNA-Wechselwir­ kungsmethoden) weisen alle Nachteile enzymatischer Verfahren auf. Die Lebensdauer des Enzyms ist begrenzt und die enzymatische Reaktion (Bio­ katalyse) kann bei unbekannten Umweltmatrices durch Inhibitoren oder En­ zymgifte (z. B. Schwermetalle) empfindlich gestört werden, so daß falsche Ergebnisse auftreten. Meist muß die enzymmarkierte Verbindung aus Stabi­ litätsgründen kühl gelagert werden. Wegen dieser abnehmenden Aktivität sind zusätzliche Kalibrierschritte erforderlich und die GLP-Richtlinien (Gute Labor Praxis), die bei quantitativen Analysen eingehalten werden müssen, erfordern durch Rückstellproben eine Menge der teureren enzym­ markierten Verbindungen. Auch ist eine Phasentrennung erforderlich, ein Substrat muß zugegeben werden, wodurch die Handhabung sehr kompliziert wird. Die erforderlichen Arbeitsschritte benötigen in der Regel einige Stunden. Ohne Phasentrennung laufen die sog. homogenen Enzym-Immuno-As­ says (EMIT) ab, die kompetitiv arbeiten und sich nur für kleine Antigen­ moleküle eignen.

Die bekannten Verfahren sind u. a. in S. Wüst, U. Doht, Th. Giersch, Ch. Wittmann, B. Hock, GIT, Fachz. Lab. 2 (1990), Seiten 99 bis 106 [1] und B. Hock, Z. Wasser-Abwasser-Forsch. 22 (1989), Seiten 78 bis 84 [2] beschrieben.

Über eine einfache und allgemein anwendbare analytisch-chemische Ausnut­ zung selektiver Molekül-Rezeptor-Wechselwirkungskräfte, DNA-Paarbil­ dungsreaktionen sowie der gleichermaßen selektiven Gast-Wirtsbeziehungen der supramolekularen Chemie zum Zwecke einer quantitativen Bestimmung oder gar zum Aufbau von entsprechenden Sensoren existieren nur wenige Vorarbeiten.

Der vorteilhafte Aufbau eines einfachen und preiswerten elektrochemi­ schen Meßsystems, das in Form der Potentiometrie oder Amperometrie den geringsten apparativen Aufwand erfordert, scheitert in der Regel daran, daß der zu bestimmende Stoff (Analyt) nicht als potentialbestimmendes Ion, sondern als neutrales Molekül vorliegt bzw. nicht elektrochemisch selektiv umgesetzt werden kann. Die Verwendung optischer Methoden (Spek­ tralphotometrie, Fluoreszenzmessung, Ellipsometrie, Surface Plasmon Re­ sonance Spektroskopie, Methode der evaneszenten Welle, usw.) zur Erfas­ sung der oben erwähnten spezifischen Molekül-Wechselwirkungen ist be­ schrieben worden. Einige können die immunologische Reaktion auch ohne markierten Partner aufgrund der Änderung des Brechungsindexes an einer Phasengrenze erfassen, haben aber große Probleme bei kleinen Analytmole­ külen (wie in der Umweltanalytik üblich) im Spurenbereich (< 1 ppm), da die nichtspezifische Bindung von störenden Begleitstoffen, die sogar meist in einem großen Oberschuß neben dem Analyten in einer realen Probe mitanwesend sind, empfindlichkeitslimitierend ist.

Optische Verfahren mit den üblichen Fluoreszenzmarkern, die eine Anre­ gungswellenlänge im UV oder sichtbaren Bereich erfordern, benötigen ei­ nen hohen apparativen Aufwand, der einer weitverbreiteten Routineanwen­ dung im Wege steht. Der Aufwand zur Stabilisierung der Lichtquelle, zur Monochromatisierung mittels eines streulichtfreien Monochromators, zur Vermeidung von Fremdlichteinflüssen, zur Empfindlichkeitssteigerung etc. erfordert apparative Aufbauten, die sehr komplex und damit teuer sind. Außerdem werden neben den fluoreszierenden Molekülgruppen des Markers auch viele Stoffe in typisch biologischen Matrices mitangeregt (z. B. Tryptophan u. a.), so daß ihre Fluoreszenz nicht von der des Markermole­ küls unterschieden werden kann, was die Nachweisgrenze extrem ver­ schlechtert. Lediglich die Markierung mittels spezieller Fluoreszenzmar­ ker, die nach der Methode der zeitverzögerten Fluoreszenz arbeiten, kann diese Probleme umgehen. Diese Methode benötigt aber teurere Geräte und wird praktisch nur mittels sog. Enhancement-Schritte zur Steigerung der Empfindlichkeit durchgeführt, was aber einen zusätzlichen Arbeitsgang bedeutet.

In der deutschen Patentanmeldung DE 39 16 432 A1 von 1990 wird ein po­ tentiometrisches Verfahren zur Detektion einer Immuno-Reaktion zwischen unmarkierten komplementären Partnern beschrieben, welches aber ebenfalls bei kleineren Analytmolekülen in einem Bereich unter 1 ppm anwendbar ist.

Bei Immuno-Assays, die wie die Affinitätschromatographie betrieben wer­ den und bei denen eine Verdrängungsreaktion mit einem markierten Analyt­ molekül ausgenutzt wird, beschreibt der Stand der Technik bisher nur Messungen mittels Durchflußmeßzellen, bei denen die Wechselwirkungzeit (= reine Meßzeit) mit den messenden Größen (Licht, Strom etc.), durch die Strömungsgeschwindigkeit vorgegeben, relativ kurz (nur wenige Sekunden) ist. Eine derartig kurze Meßzeit erlaubt vor allem bei Durchflußmessun­ gen keine hohe elektronische Dämpfung. Daher sind der elektronischen oder optoelektronischen Verstärkungstechnik durch das in den empfind­ lichsten Bereichen stark abfallende Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/R-Verhältnis) Grenzen gesetzt. Ebenfalls unmöglich sind bei dem schnellen Durchströmen der markierten Substanz durch den Durchfluß-De­ tektor Wiederholmessungen, die sich bei Mittelwertbildung ähnlich posi­ tiv auf das S/R-Verhältnis auswirken. Darüberhinaus benötigen Wiederhol­ messungen einen Bezugspunkt, d. h. eine Untergrundmessung (Blindwertmes­ sung oder engl. blanc value), die eine entsprechende Vorrichtung verlangt.

Über eine einfache und quasi automatische Abtrennung der ebenfalls aus der immunologischen Reaktionszone austretenden Probenmatrix mit stören­ den Komponenten wird außer im Zusammenhang mit den heterogenen ELISA-Techniken, die einen zusätzlichen Abtrennungsschritt vorschreiben, im Stand der Technik nichts berichtet. Dies ist aber für richtige Mes­ sungen von zentraler Bedeutung und unabdingbare Voraussetzung bei repe­ titiven Messungen, bei denen sich natürlich Fehlmessungen ebenfalls ad­ dieren.

Eine Gleichstellung von Immunoreaktionen mit Rezeptorreaktionen bzw. DNA-Paarbildung und molekülerkennenden Gast-/Wirtsmolekül-Einlagerungen bezüglich der erfindungsgemäßen, allgemein gültigen, sensorisch ausnutz­ baren Anordnung wurde bisher nicht beschrieben, da die Markierung mit einem voluminösen Enzym diese selektiven Bindungsreaktionen sehr stark behindert (sterische Behinderung). Dies ist bei den relativ kleinen Re­ dox-Systemen oder IR-fluoreszierenden Molekülen nicht der Fall.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren, das die bekannten Nachteile der direkt anzeigenden und auch der mit markierten Partnern ablaufenden Verfah­ ren vermeidet, und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens anzugeben.

Diese Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 17 gelöst.

Zur Erzielung der geforderten extrem niedrigen Nachweisgrenze im Spuren­ analysenbereich werden erfindungsgemäß anstelle der anfälligen und unge­ nauen enzymatischen Signal-Verstärkungsmethoden repetitierbare elektro­ chemische und optische Meßmethoden zusammen mit einer speziellen elek­ tronischen Signalaufbereitung (Signal-Mittelwertsbildung) und entspre­ chenden Meßanordnungen angewandt.

Der zu bestimmende Immuno-Partner (Antigen oder Antikörper, Molekül oder dazugehöriger Rezeptor, Gastmolekül oder dazugehöriges Wirtsmolekül, DNA-Strang und dazugehörige komplementäre Sequenz) wird bei dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren entweder mit einem stabilen Redox-System oder ei­ ner stabilen, im Infrarotbereich (< 700 nm) fluoreszierenden Verbindung haltbar (z. B. kovalent gebunden) verbunden. Die Auswahl dieser beiden Marker-Molekülsorten erfolgte nach umfangreichen Vorversuchen und an Hand bestimmter Kriterien, die hiermit offenbart werden. Als Redox-Sy­ steme eignen sich vorzugsweise anorganische oder organische Systeme mit hohen Standardaustauschstromdichten an inerten Metallelektroden. Bei den Fluoreszenz-Markern sind Moleküle, die mit preiswerten Laserdioden zur Fluoreszenz im fernen Infrarot (< 800 nm) angeregt werden können, die vorteilhaftesten Markermoleküle.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfacher, empfindlicher, schneller, richtiger und daher letztendlich auch preiswerter als alle bisher be­ schriebenen Immuno-Assays. Vorteilhafter ist auch die direkte, extrem empfindliche und schnelle Erfassung von kleineren Antigenen, die nach den oben erwähnten Schriften mit den dort beschriebenen Ver­ fahren nur mangelhaft oder überhaupt nicht möglich ist. Gerade hier existiert aber ein großer Anwendungsbereich für die neue Molekülanalytik (Schadstoffanalytik) vor allem im Bereich des Umweltschutzes oder der Überwachung von maximalen Arbeitsplatzkonzentrationen sowie der klini­ schen Chemie (medizinischen Diagnose, Pathologie, Gerichtsmedizin).

Das erfindungsgemäße Verfahren kann gemäß den Beispielen unterschiedlich durchgeführt werden:

In einer vorteilhaften Version wird das markierte Analytmolekül zuvor an dem immobilisierten Partner gebunden. Das unmarkierte Analytmolekül in der Probe verdrängt bei Kontakt mit den gebundenen, markierten Partnern sein markiertes Gegenstück (redox- oder fluoreszenzmarkiertes Anti­ gen- oder Antikörpermolekül = markiertes Analytmolekül) aus der Oberflä­ chenbindung, welches dann durch eine Flüssigkeitsströmung wegtranspor­ tiert wird.

In einer anderen Version wird der Probe das markierte Analytmolekül in einem bekannten Verhältnis zugesetzt und man läßt die Mischung mit den immobilisierten Immuno-Partnern (worunter alle oben erwähnten komplemen­ tären Systeme zu verstehen sind) in Wechselwirkung treten. Je nach der Konzentration des Analyten werden unterschiedliche Mengen des markierten Analytmoleküls kompetitiv gebunden, wobei eine umgekehrte Relation be­ steht. Bei beiden Versionen werden die nichtgebundenen oder freigesetz­ ten markierten Analytmoleküle auf kleinstem Raum wieder mittels des be­ treffenden immunologischen (komplementären) Partners, der immobilisiert oder örtlich begrenzt und fixiert vorliegt, gesammelt, aufkonzentriert und durch Spülen von anhaftender Probenmatrix gereinigt.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der eine elektrochemisch und optisch zugängliche Oberfläche vorliegt, kann aber auch der Teil vermes­ sen werden, der nicht der Eluatsammlung entspricht. Beim kompetitiven Test, bei dem die Oberfläche der Vorrichtung vor Kontakt mit der Probe mit immobilisierten Partnermolekülen bedeckt ist, die mit ihrem markier­ ten Komplementärmolekül abgesättigt sind, kann auch die Abnahme der In­ tensität der Markierung gemessen werden, die der Analytmenge proportio­ nal ist. Bei dem anderen kompetitiven Test, bei dem markierte und unmar­ kierte Analytmoleküle zusammen zu den immobilisierten Komplementärmole­ külen, die freie Bindungsstellen haben, zugesetzt werden, ist die Zunah­ me an markierten Molekülen in diesem Oberflächenbereich der Konzentra­ tion des Analyten umgekehrt proportional. Hier ist die Menge der mar­ kierten Moleküle, die die immunogene Zone ungebunden passieren, der Analytmenge direkt proportional. Bei der Messung zugänglichen Oberflä­ chen kann man also bei einer derartigen immunologisch-analytischen Vor­ richtung das Analysenergebnis doppelt (redundant) erhalten. Diese zwei­ fache Bestimmungsmöglichkeit ist neu und verbessert die Zuverlässigkeit des gesamten Immuno-Assays erheblich. Fehler und Störungen können durch die mangelnde Obereinstimmung dieser beiden Meßwerte sofort erkannt wer­ den.

Das erfindungsgemäße Verfahren läuft auf eine Doppelbestimmung des Ana­ lyten hinaus. Die Abnahme der über die immunogene Zone integrierten Sig­ nalintensität (konzentrationsproportional) muß bei einem Verdrängungs­ assay der betreffenden Zunahme in der "Molekülfänger"-Zone entsprechen (siehe Abb. 2). Analoges gilt auch für die Methode, bei der das markier­ te Analytmolekül vor jeder Analyse der Probe in einem bekannten Verhält­ nis beigemischt wird. Durch ein Auffangen der nichtgebundenen markierten und unmarkierten Analytmoleküle In einer speziellen Fängerzone läßt sich aus der dort meßbaren Konzentration an markierten Analytmolkülen direkt auf die Konzentration der unmarkierten Analytmoleküle, die in der Probe vorliegen, schließen. Je höher die Konzentration an markierten Analytmo­ lekülen nach dem Durchströmen der immunogenen Zone, desto höher die Ana­ lytkonzentration in der Probe.

Eine weiterer Vorteil (empfindlicher und ungestörter als bisherige Ver­ fahren auf nicht-enzymatischer Basis) der Erfindung ist die Abtrennung der nicht spezifisch gebundenen Matrixsubstanzen vor der eigentlichen Messung sowie die Sammlung oder Anreicherung der markierten Moleküle auf einer flachen Oberfläche, auf der unmarkierte Partnermoleküle mit freien Bindungsstellen fest angebunden sind, so daß sie die markierten Partner, die den anderen immunologischen Bindungsbereich ungebunden durchlaufen haben oder dort durch den unmarkierten Analyten freigesetzt (aus der Bindung verdrängt) wurden, spezifisch anbinden. Die auf einer flachen Oberfläche angebundenen markierten Analytmoleküle, deren Menge nach Ka­ libration eine Information über die in der Probe vorliegenden (unmar­ kierten) Analytmoleküle erlaubt, können dann, je nach Art der Markie­ rung, elektrochemisch oder optisch bestimmt werden, wobei sowohl lange Meßzeiten mit hoher Dämpfung als auch zyklische oder repetitive Messun­ gen mit elektronischer (oder rechnergestützter) Mittelwertbildung mög­ lich sind. Nach den Gesetzen der Statistik läßt sich durch N Messungen das Signal-zu-Rausch-Verhältnis um den Faktor Wurzel-N verbessern.

Anstelle der spezifisch bindenden Immuno-Partner-Moleküle mit freien Bindungsplätzen als selektive "Molekülfänger" nach der primären kompeti­ tiven Immuno-Reaktion können auch andere Sammelphasen verwendet werden. Bei lipophilen Analytmolekülen reicht dazu eine zu durchströmende Zone, die mit Öl oder Wachs (oder PVC plus Weichmacher o. ä.) getränkt ist, aus. Alternativ kann dafür auch ein Material verwendet werden, daß in der reversed phase Chromatographie üblich ist (z. B. RP-18 stationäre Phase). Das letztere bietet sich insbesondere an, wenn ionisch vorlie­ gende Analytmoleküle festgehalten werden sollen. Hier gibt man der Fließlösung ein entsprechend geladenes, lipophiles Gegenion zu. Dadurch kommt es zu einer Ionenpaarbindung im Öl oder Fett, welche eine Er­ schwerung der Passage der markierten Analytmoleküle durch diese Molekül­ fängerzone bewirkt. Sie werden sich bei einer strömenden Trägerlösung gegen Ende der lipohilen Zone anreichern und können so der empfindlichen Messung zugänglich gemacht werden.

Eine besonders einfache und elegante Vorrichtung stellt in diesem Zusam­ menhang mit der Erfindung die Verwendung von teststreifenähnlichem chro­ matographischen Material dar. Hier kann sowohl die Papierchromatographie (erweitert um die Membranfiltermaterialien auf Celluloseacetat, -nitrat o. ä. Basis) als auch die Dünnschichtchromatographie Material-Lieferant sein (s. Abb. 2). Die Produktion der erfindungsgemäßen Vorrichtungen ge­ schieht denkbar einfach und rationell. Im Bereich der umweltanalytischen Anwendung des hier offenbarten Verfahrens werden die entsprechenden po­ ly- oder monoklonalen Antikörper bzw. F_ab-Fragmente mit Hilfe bekann­ ter Bindungstechniken (kovalente Immobilisierung mittels Spacermoleküle und F_c-Teil bindenden Komponenten) richtig orientiert (Bindungsstellen nach außen) auf über 75% der Teststreifenfläche aufgebracht. Nach Fi­ xierung dieser analyterkennenden Makromoleküle auf der Teststreifenober­ fläche wird der Anfangsbereich in eine Lösung getaucht, die nur markier­ te Analytmoleküle enthält. Dadurch werden alle Bindungsstellen mit die­ sem markierten Analytmolekül abgesättigt. Die Länge dieser immunogenen Zone entspricht dabei der Größe des Meßbereichs. Danach wird gründlich gespült, um rein adsorptiv gebundene, markierte Analytmoleküle zu ent­ fernen. Der Rest des Teststreifens enthält nunmehr die analyterkennenden Antikörpermoleküle (oder bei den anderen analogen Reaktionen, die ent­ sprechenden DNA′s oder Wirtsmoleküle) mit freien Bindungsstellen und dient als Molekülfänger für die spätere Messung. Zum Abschluß dieser Sammelzone kann vorteilhafterweise eine dünne Zone mit Dialysier-Eigen­ schaften verwendet werden.

Dadurch wird erreicht, daß der fließende Grundelektrolyt (durch die Art der Antikörpermoleküle bestimmt) zwar diese Zone passieren kann, die größeren markierten Analytmoleküle aber zurückgehalten werden und da­ durch in einer extrem kleinen Zone auch angereichert werden. Diese An­ ordnung kann auch in durchsichtigen Glasröhren oder preiswerteren Pla­ stikröhren, gefüllt mit dem betreffenden chromatographischen Material, durchgeführt werden. Falls diese Röhre mit der Dialysiermembran abge­ schlossen wird, kann man auch auf andere Sammelzonen verzichten. Hier muß nur der ungehinderte Zugang der optischen Strahlengänge garantiert werden, die hier vorzugsweise nicht seitlich der Röhre sondern axial an­ gebracht werden. Bei redoxmarkierten Analytmolekülen wird diese Dialy­ sierfolie demontierbar angebracht, so daß deren Innenseite mit den auf­ gesammelten, markierten Analytmolekülen, die in der primären Immunozone analytproportional freigesetzt worden sind, der planaren elektrochemi­ schen Zelle zugänglich gemacht werden. Selbstverständlich kann letztere auch zuvor durch mikroelektronische Methoden fest auf die Innenseite der Dialysierfolie aufgebracht sein.

Die Elektrodenflächen sind miniaturisiert und erfordern nur minimale Edelmetallmengen, so daß auch in diesem Fall die Prüfröhrchen-ähnlichen Gebilde nach einer Messung verworfen werden können. Die Röhrenanordnung erfaßt wegen der größeren Menge an immobilisierten analyterkennenden und -bindenden Antikörpermolekülen einen größeren Konzentrationsbereich des Analyten, d. h. die Kalibrierkurve geht später als bei den planaren An­ ordnungen in einen Sättigungsbereich über. Die Auswertung kann auch über die verdrängten Strecken (oder integriert davon) erfolgen (s. Abb. 2). Dazu kann ein preiswerter Laserdioden-Scanner verwendet werden.

Zur Anreicherung der freigesetzten oder nicht gebundenen markierten Ana­ lytmoleküle kann sowohl bei der Verdrängungsmethode als auch beim kompe­ titiven Verfahren (jeweiliger Zusatz von markierten Analytmolekülen zu Beginn des Assays) auch eine freie Endzone der oben erläuterten Anord­ nungen dienen, bei der aber das Lösungsmittel verdampft. Die ausgewähl­ ten, stabilen Redox-Marker-Moleküle sowie die IR-Fluoreszenzmoleküle vertragen dabei auch Temperaturerhöhungen. Bei Antikörperverträglichkeit lassen sich auch leichter verdampfbare Lösungsmittel zu Effizienzsteige­ rung verwenden, wobei auch eine Zudosierung nach der primären immunoge­ nen Zone möglich wird. Wichtig ist, daß die Verdampfung zur Konzentrie­ rung der Markermoleküle auf eine kleine Zone (Bereich) beschränkt wird. Weil dadurch das Lösungsmittel die zu detektierenden Moleküle dorthin transportiert bevor es verdampft und seine Transportfracht dort zurück läßt. Die Abb. 1 bis 2 verdeutlichen anhand von Skizzen die verschiede­ nen Anordnungsmöglichkeiten.

Die erfindungsgemäße optimierte elektrochemische Methode stellt eine zyklische Voltammetrie In Verbindung mit einem stabilen Redoxsystem dar, wobei sich letzteres von allen möglichen dadurch auszeichnet, daß es ei­ ne besonders hohe Standardaustauschstromdichte besitzt. Die zyklische Voltammetrie garantiert bei Dünnschicht-Meßzellen, daß nettomäßig keine Meßsubstanz elektrochemisch umgesetzt, d. h. verbraucht wird. Hierbei wird stets nur oxidiert und reduziert. Die höchste Meßempfindlichkeit wird erfindungsgemäß dann erzielt, wenn der Potentialbereich, in dem die Arbeitselektrode(n) zyklisch betrieben wird, das Halbstufenpotential des Redoxmarkers einschließt (± 200-600 mV). Bei hohen Potentialänderungs­ geschwindigkeiten (» 500 mV/sec Scanrate) entstehen bei Arbeitselektro­ den < 10 µm anodische und kathodische Stromspitzen, die der Konzentra­ tion des Redoxsystems proportional sind. Je höher die Scanrate desto größer werden die Stromspitzen, was einer Empfindlichkeitssteigerung gleichkommt. Werden als Redox-Marker, Systeme mit den höchsten Standard­ austauschstromdichten (z. B. Ferrocenverbindungen, Rutheniumkomplexe, Hexacyanoferrat II/III, J⁻/J u. a.) verwendet, dann stören nicht voll­ ständig abgetrennte Redoxsysteme aus der Probenmatrix wesentlich weniger, wenn mit kurzen Zykluszeiten (schnelle Spannungsrampen) gearbeitet wird. Die besten, reversiblen Redoxsysteme lassen hierbei durchaus über 1000 zyklische Voltammogramme pro Sekunde (1000 Hz !) zu. Restbestände von weniger reversiblen, eventuell störenden Redoxsystemen aus der Pro­ benmatrix lassen sich elektrochemisch nicht so schnell umsetzen und er­ zeugen daher auch kein Meßsignal (Stromfluß).

Alternativ können andere elektrochemische Methoden angewandt werden, die zu keinem Verbrauch oder Netto-Umsatz des reagierenden Systems führen, d. h. auch die Methode der Pulsvoltammetrie oder der differentiellen Pulsvoltammetrie oder der Square-wave Voltammetrie sind hierzu geeignet, lassen sich aber aus prinzipiellen Gründen nicht so schnell zyklisch be­ treiben.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Verfahrensschritt, der vorteilhafterweise zur gewünschten extremen Empfindlichkeitssteigerung führt, liegt in ei­ ner speziellen Kompensationsmethode für den bei schnellen Arbeitselek­ trodenpotential-Scanraten zunehmenden kapazitiven Strom, der den Signal­ untergrund bildet. Dazu wird ein computergesteuertes Auswertsystem ver­ wendet, das mittels eines schnellen AD-Wandlers wie ein Scanrecorder ar­ beitet. Die Kompensation des nicht-faradayschen Untergrundstromes, die ebenfalls zur Empfindlichkeitsteigerung einen entscheidenden Anteil bei­ trägt, kann auf zwei Arten erfolgen, die für sich allein oder zusammen verwendet werden können. Bei Arbeitselektroden mit Durchmessern über 10 µm wird die Kanalzuordnung des Scanrecorders bei Erreichen des Poten­ tialumkehrpunktes ebenfalls umgekehrt, als ob mit einem X-Y-Schreiber die Spannung an der Arbeitselektrode gegen den fließenden Strom (engl. C-V Diagram) aufgezeichnet würde. Da dies einer einfachen Signaladdition gleichkommt, kompensieren sich pro Meßkanal (Zeitfenster oder Potential) gleich große anodische und kathodische Ströme. Lediglich bei den um ca. 60 mV auseinanderliegenden Stromspitzen ist das nicht der Fall.

Ein weiterer Schritt, der für das Ziel dieser Erfindung wesentlich von Vorteil ist, ist die erst durch schnelle Wiederholmessungen ohne Ver­ brauch der gemessenen Substanz mögliche elektronische Mittelwertbildung. Mit einem Signalmittelwertbildner läßt sich zusätzlich dabei auch noch das Signal/Rauschverhältnis (S/R) drastisch steigern, weil man mehrere Tausend Zyklen mitteln kann. Da man bei reversiblen Redoxsystemen leicht weit über 100 Potentialzyklen pro Sekunde (» 100 Hz) durchscannen kann, ergibt sich hier beispielsweise schon in einer Sekunde eine Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses um den Faktor 10. Bei Meßzeiten, die denen der Immuno-Assay-Verfahren mit Enzymmarkern entsprechen, ergeben sich Verbesserungen dieses die Nachweisgrenze bestimmenden S/R-Verhält­ nisses um mehrere Größenordnungen, ohne daß die Nachteile der empfindli­ chen Eiweißmoleküle (Enzyme) hier stören. Das zweite Verfahren zur Un­ terdrückung des störenden kapazitiven Stromuntergrundes bei der zykli­ schen Voltammetrie verwendet als Arbeitselektrode ein Ultramikroelektro­ den-Array mit Einzelelektrodendurchmessern von unter 10 µm. Hier ent­ stehen keine anodischen und kathodischen Stromspitzen mehr sondern eine Stromstufe mit gut ausgeprägten Plateaus. Die Stufenhöhe ist ähnlich wie bei der Polarographie der Konzentration des elektrochemisch umgesetzten Redoxsystems (Markermoleküls) proportional. Die erfindungsgemäße Vor­ richtung verwendet hierzu eine planare Array-Anordnung von ca. 2000 Ein­ zelelektroden mit 3 µm Durchmesser, bei der die Bezugs- und Gegenelek­ trode bereits optimiert in die Oberfläche integriert vorliegt. Hier hat sich nur eine von vielen möglichen geometrischen Anordnungen als geeig­ net erwiesen (siehe Abb. 3).

Die neue Anwendung der zyklischen Voltammetrie zur Erzielung extremer Meßempfindlichkeiten bei Redoxsystemen oder Markermolekülen mit Redox­ gruppen ist dadurch möglich, weil durch die abwechselnde Oxydation und Reduktion kein Verbrauch des Meßstoffes auftritt. Eine Wegdiffusion des Redoxsystems wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Dünnschicht­ zellen-Anordnung gewählt wird. Hierbei werden die Arbeitselektrode(n) sowie die Gegen- und Referenzelektrode gegen die mit Grundelektrolyt be­ feuchtete Oberfläche mit den redoxmarkierten Partnermolekülen gedrückt. Gegebenenfalls können die unmarkierten Partnermoleküle, die die redox­ markierten Moleküle binden, auch direkt auf oder unmittelbar neben der Elektrodenoberfläche immobilisiert sein. Die Zyklisierung ist bei Nach­ weisgrenzen unter 1 ppb (Redox-System) notwendig, denn bei solch extrem kleinen Konzentrationen müssen möglichst alle Moleküle elektrochemisch erfaßt werden. Dann entspricht eine Stromstärke von einem µA einer um­ gesetzten Substanzmenge von ca. 10^-10 mol/sec. Derzeitig erlauben gute elektrochemische Meßzellen auch noch zuverlässige Strommessungen im nA-Bereich, was einer tausendfach kleineren Umsatzrate entspricht. Durch die Signalmittelwertbildung werden nunmehr Pico- und Femto-Amperströme meßbar, was zu Umsatzraten von 10^-16 resp. 10^-19 mol/sec führt.

Bei der optischen Detektion erhält man die gewünschte Empfindlichkeits­ steigerung durch die Kombination von mehreren, mindestens zwei Verfah­ rensmaßnahmen. Als erste Maßnahme verwendet man Markermoleküle, die im IR stark absorbieren, und im noch ferneren Infrarot fluoreszieren, weil dadurch der störende Fluoreszenzuntergrund von einigen Eiweißmolekülen (z. B. bei biologischen Matrices) nicht auftritt und die preiswerten La­ serdioden als Anregungsquelle hoher spektraler Leuchtdichte besonders vorteilhaft sind. Das emittierte Laserlicht erlaubt durch seine geringe Strahlkonvergenz besonders exakte Abgrenzungen des Meßfensters. Als wei­ tere Methode verwendet man Fluoreszenzmarkermoleküle, deren Fluoreszenz besonders langsam abklingt, so daß man diese Fluoreszenz gut von der schnell abklingenden der störenden Moleküle in der Probenmatrix abtren­ nen kann. Im Gegensatz zu einer kommerziell erhältlichen Anordnung, bei der einfach das Anregungslicht durch einen Shutter unterbunden wird, und die eigentliche Messung des Fluoreszenzlichtes erst nach einigen Milli­ sekunden (nach völligem Abklingen der Störfluoreszenzstrahlung) beginnt und über eine gewisse Zeit integriert wird, geschieht die Auswertung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren über eine direkt und schneller messende elektronische Berücksichtigung der langsameren Abklingzeit. Hierzu wird ein Lock-In Verstärker benutzt, der eine frequenz- und phasenselektive Verstärkung ermöglicht. Die Unterdrückung der störenden Fluoreszenz mit der schnellen Abklingzeit geschieht hier durch eine geeignete Wahl des Phasenwinkels am Meßgerät. Vorteil dieser Methode gegenüber der Zählra­ tenmethode (Photonenzählung) der kommerziellen Version ist die höhere Empfindlichkeit, weil die frequenzselektive Verstärkung nur einen Bruch­ teil des meist weißen elektronischen Rauschens des Photo-Empfängers ver­ stärkt und weil bei höheren Licht-Chopper Frequenzen gearbeitet werden kann, was die Anzeigegeschwindigkeit drastisch erhöht, so daß auch Durchflußmessungen, wie bei der FIA üblich, noch entsprechend sensitiv durchgeführt werden können.

Die folgenden Vorteile werden bei der Erfindung erhalten:

• A) eine Art Affinitätschromatographischer Säule oder auch eine offene oder der optischen und elektrochemischen Messung zugänglichen Ober­ fläche eines beliebigen Trägermaterials mit Immobilisierten Partner­ molekülen zu dem zu bestimmenden Molekül (Analyt);
• B) eine gleichartige der Messung zugängliche "Sammeloberfläche" für freigesetzte markierte Analytmoleküle (im Falle einer Verdrängungs­ reaktion auf obiger Säule oder Oberfläche, die möglichst vollständig mit markierten immunogen gebundenen Analytmolekülen belegt ist, durch unmarkierte Analytmoleküle);
• C) eine erfindungsgemäße flache elektrochemische Meßzelle in einer aus zwei oder drei Elektroden bestehenden potentiostatischen Schaltung mit einer oder mehreren Arbeitselektroden, die eine Zyklovoltamme­ trie im elektroaktiven Bereich des betreffenden Redoxsystems (repe­ titive Oxidation und Reduktion) durchführt und die in unmittelbaren Kontakt mit der "Sammeloberfläche" oder der unter A) genannten ge­ bracht werden kann;
• D) eine Fluoreszenzanordnung, die mittels Laserdioden zur Fluoreszenz bei Emissionswellenlängen < 700 nm anregt und die schnell zwischen einem unmarkierten Untergrund und den Stellen, wo die optisch mar­ kierten Analytmoleküle auf den betreffenden Oberflächen festgehalten werden hin und her oszilliert (alternativ können auch Fluoreszenz­ marker verwendet werden, die die Methode der zeitverzögerten Fluoreszenz ermöglichen, wobei aber hier die direkte und schnelle Messung mittels eines elektronischen phasenselektiven Verstärkers erfolgt, die ebenfalls mit Hilfe von Lichtleitern schnell zwischen einem unmarkierten und markierten Untergrund hin und her oszillieren kann).
• E) einen elektronischen Signalmittelwertbildner oder eine computerge­ stütze Aufaddition von Signal-Zeit-Kurven (Zeit proportional zur Spannung bei der elektrochemischen Detektion oder zum Meßort beim optischen Verfahren). Dabei mittelt sich ein statistisches elektro­ nisches Rauschen in den höchsten Empfindlichkeitsbereichen zu Null.
• F) Falls bei der auswertenden Messung sowohl die Änderung der markier­ ten Analytmoleküle in der primären Immunogenen Zone als auch die in der Sammelzone erfaßt wird, kann man neben einer Doppelmessung auch durch Quotientenbildung eine Art innere Standardisierung durchfüh­ ren. Dies verbessert die Zuverlässigkeit der Messungen ähnlich wie bei der internen Standardisierung von emissionsspektroskopischen Methoden.

Die Oberfläche mit dem immobilisierten immunologischen Partnermolekül zum Analyten sollte im Interesse eines großen Meßbereichs hoch beladen sein. Auch muß das betreffende Molekül mit einer richtigen Orientierung (Epitop-Bereich außen) dort immobilisiert sein. Dies läßt sich u. a. auch unter Zuhilfenahme eines geeignet gewählten elektrischen Feldes (oder Stromes) an der Phasengrenze Trägeroberfläche/Meßlösung bewerkstelligen. Dadurch kommt es zu einer gerichteten Immobilisierung dieser Partner, ohne daß teure Spezialsubstanzen (als übliche Spacermoleküle) dafür be­ nötigt werden. Die gerichtete Immobilisierung ergibt zusammen mit einer hohen Immobilisierungsdichte eine hohe Meßempfindlichkeit und einen großen Meßbereich. Alternativ können die immobilisierten Partnermoleküle aber auch durch die bekannten Techniken mittels F_c-Teil bindender Spacermoleküle (bei der im Umweltanalytikbereich üblichen Immobilisle­ rung von Antikörpern) an Trägeroberflächen (z. B. Glas-Beads, chromato­ graphische stationiäre Phasen, Mikrotiterplatten etc.) angebunden werden.

Als besondere Variante der Ausführungsbeispiele bietet sich auch Papier als preiswerter Träger an. Hier kann sowohl laborübliches Filterpapier als auch Membranfilter auf der Basis von Cellulose oder anderer Materia­ lien dienen. Auch chromatographische Dünnschicht-Träger sind hierfür hervorragend geeignet, da sie oberflächlich leicht zu modifizieren sind. Eine bevorzugte Art sind in diesem Zusammenhang Dünnschichtplatten mit oder ohne Fluoreszenzgrundmarkierung, die schon in ein sog. Reversed Phase (RP-Material) modifiziert wurden. Hier gelingt die gerichtete Im­ mobilisierung der Partner-Molekülsorte (d. h. des jeweils nicht den Ana­ lyt darstellenden Partners dieser sich gegenseitig bindenden komplemen­ tären Moleküle) dann besonders gut, wenn man diesen Molekülen gezielt gegenüber dem Epitopbereich eine oder mehrere langkettige aliphatische Reste (C₆-C₂₅) ansynthetisiert oder bei Antikörpern die gentechnisch erzeugten F_ab-Fragmente mit den spezifischen Bindungsstellen lipophile Molekülgruppen an der gegenüberliegenden Molekülstelle erzeugen läßt. Die lipophilen Reste der zu immobilislerenden Moleküle tauchen dann in die aliphatische Molekülbürste der Trägeroberfläche ein und werden so bei höchster Dichte ohne Beeinträchtigung des Bindungsverhaltens fixiert. Sie können aber bei Denaturierung oder Desaktivierung wie in der Chromatographie üblich eluiert werden, so daß der Träger für eine Immobilislerung mit frischen Molekülen zur Verfügung steht. Bei Verwen­ dung von Dünnschichtplatten auf Basis einer Aluminiumfolie läßt sich letztere auch elegant bei der elektrochemischen Detektionsmethode als Gegenelektrode verwenden.

Dieser Prozeß kann auch dynamisch im Rahmen einer Fließinjektionsanalyse automatisiert werden, d. h. auf die unbeladene RP-Oberfläche werden zu­ nächst die zu immobilisierenden Moleküle (ohne gebundenes Analytmolekül mit Marker, aber auch mit) gegeben bevor nach einer Spülung zum Entfernen des Überschusses im Fall der unbeladenen Moleküle die markierten Analyt­ moleküle bis zur Absättigung über die Oberfläche geleitet werden. Nach einer erneuten Spülung kann dann die Probe aufgegeben werden. Die Ver­ wendung von zugänglichen flachen Oberflächen für die Immobilisierung der Partnermoleküle kann einen Verfahrensschritt ersparen, denn man kann die Menge der dort gebundenen markierten Analytmoleküle bei beiden Versionen (Vorimmobilisierung mit markierten Analytmolekülen und Konkurrenzbindung von-der mit der Probe zugesetzten markierten Analytmolekülen) sowohl mit der planaren elektrochemischen Meßzelle (durch einfaches Aufpressen auf die Oberfläche) als auch mit der optischen Fluoreszenzmethode leicht be­ stimmen ohne eine zusätzliche Sammeloberfläche zu benutzen.

Bei beiden Detektionsmethoden ist es wichtig, daß störende Stoffe aus der Probenmatrix vor den eigentlichen Messungen fortgespült werden. Dies erfolgt durch reine, gepufferte Elektrolytlösung, die sowohl die Stabi­ lität der Biomoleküle unterstützt als auch den Grundelektrolyt für die elektrochemische oder optische Detektionsart darstellt.

Als Redox-Systeme werden bei der Erfindung diejenigen angewählt, die an dem verwendeten Arbeitselektrodenmaterial (Platin, Gold, anderes Edelme­ tall) die höchsten Standardaustauschstromdichten zeigen. Hierzu zählen von allen möglichen Redoxsystemen vorzugsweise nur die besonders rever­ siblen Systeme, wie die auf der Basis von Ferrocen, Rutheniumkomplexen, Hexacyanoferrat (II/III), Jod/Jodid etc. Besonders vorteilhafte Redoxsy­ steme haben ein Redoxpotential in der Nähe desjenigen von Sauerstoff, so daß sie von letzterem nicht gestört werden und man in diesem Fall die zyklische Voltammetrie auch ohne Inertgasspülung durchführen kann.

Bei der elektrochemischen Zelle läßt sich besonders vorteilhaft auch ei­ ne planare Mikroelektroden-Array-Anordnung einsetzen) weil bei Einzel­ elektrodendurchmessern < 10 µm die Vorteile von Ultramikroelektroden auftreten. Letztere sind: Redox-Stufen statt Peaks im Voltammogramm, Verminderung des Verhältnisses von kapazitiven zu Faradayschen Strom, Rührunabhängigkeit, quasi-verbrauchslose Messung schon ohne die Spannung zu zyklisieren u. a.

Als besonders vorteilhafte Molekülklasse für die Fluoreszenzmarkierung bieten sich z. B. an Bis-isothiocyanat-Derivat von 2-[4′-chloro-7′(3′′-ethyl-2′′-benzothiazolinyliden)-3′,5′-(1′′′-prop-anediyl) -1′,3′,5′-heptatrien-1′-yl]-3-ethylbenzothiazoliumbromid, große Porphy­ rinringe oder geeignete Phthalocyanine an (siehe Abb. 4). Sie lassen sich durch die preiswerten langwelligen monochromatischen und fremd­ lichtfreien Laserlichtquellen anregen und erzeugen eine Fluoreszenz in einem Wellenlängenbereich, wo kaum andere Moleküle stören. Die Verwen­ dung von Laserdioden mit entsprechenden IR-empfindlichen Halbleiterde­ tektoren erlaubt besonders kleine Meßaufbauten (z. B. Handmeßgeräte).

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Arbeitsweisen werden anhand von Beispielen noch näher erläutert.

Beispiel 1 Verdrängung des markierten Analytmoleküls vom immunologisch präparierten Oberflächenbereich durch das unmarkierte Analytmolekül in der Probe

Eine vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung und des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf einer kompetitiven Reaktion zwischen markiertem und unmarkiertem Analytmolekül. Hier kompensieren sich nichtspezifische Anbindungen, da sie in beiden Fällen im gleichen Ausmaß auftreten. Wünschenswert ist ferner, daß das unmarkierte Analyt­ molekül eine etwas geringere Bindungskonstante als das markierte auf­ weist, um es effektiver verdrängen zu können. Dies ist in der Regel der Fall, da die kovalente Verknüpfung mit einem relativ großen Markermole­ kül die Antikörper-Antigen- (bzw. allgemein: Molekül-Komplementärmole­ kül-) Bindung schwächt, weil sich beide Moleküle nicht mehr optimal nä­ hern können.

Als Modellanalyt wurde in diesem Beispiel Humanserumalbumin (HSA) ge­ wählt. Als immobilisiertes Partnermolekül wurde der dazugehörige Anti­ körper (anti-HSA) verwendet. Die anti-HSA Antikörper wurden mit den be­ kannten Immobilisierungstechniken an die Oberfläche von Sepharose-Mate­ rial kleiner Korngröße (150 µm) angebunden und mit fluoreszenzmarkier­ tem HSA belegt. Als Fluoreszenzmolekül wurde ein Europiumchelat (BCPDA) gewählt. An ein HSA Makromolekül konnten mehrere fluoreszierende Chelat­ komplexe kovalent angebunden werden (20-30). Die Europiumchelatverbin­ dung wurde in diesem Beispiel anstelle des IR-Licht emittierenden Mar­ kers genommen, weil die hier auftretende Fluoreszenz wesentlich langsa­ mer abklingt als die der störenden Probenmatrix (Eiweißmoleküle bei bio­ logischen Proben). Gemessen wurde am Ende einer kleinen Säule, die mit den Sepharose-Material und dem markierten Immunkomplex beladen war. Bei Zugabe von unmarkierten HSA wurde das mit dem Fluoreszenzmarker versehe­ ne von der Oberfläche der mit HSA-Antikörpern beladenen Sepharose-Parti­ kel verdrängte HSA Molekül in einer Durchflußmeßzelle vermessen. Dazu wurde Licht der Wellenlänge 350 nm verwendet, dessen Strahlengang durch einen optischen Chopper mit einer Frequenz von 140 Hz zerhackt wurde. Im rechten Winkel zum Anregungslicht wurde das Fluoreszenzlicht gemessen. Als Lichtdetektor wurde ein Photomultiplier verwendet und am Lock-In- Verstärker ein Phasenwinkel von 0° eingestellt. Die Abb. 5 zeigt die Signale, die durch die Zugabe von unmarkiertem HSA gemessen werden kön­ nen. Sie sind der HSA-Konzentration der auf die Säule aufgegebenen Probe proportional. Durch diese Meßtechnik lassen sich pro Zeiteinheit wesent­ lich mehr Proben analysieren, als mit der Photonenzählung, die auch der FIA-Technik verschlossen bleibt. Neben HSA könnten durch die Immobili­ slerung entsprechender mono- und polyklonaler Antikörper auch andere Analyte, wie Atrazin oder andere Schadstoffe sehr empfindlich im sub ppm-Bereich mit hoher Genauigkeit bestimmt werden.

Beispiel 2 Elektrochemische Detektion von Redox-markierten Analytmolekülen

Als Analyt wurde das umweltrelevante Atrazin gewählt. Letzteres wurde durch Standardmethoden der organischen Synthese in 6 Stufen mit einem modifizierten Ferrocen-Molekül kovalent verknüpft. Das ausgewählte, sehr reversible Redox-System mußte zuvor in eine wasserlösliche Form durch Anfügen stark polarer Seitenketten überführt werden. Die einzelnen che­ mischen Syntheseschritte, die - ausgehend vom kommerziell erhältlichen Ausgangsprodukt - notwendig waren sind in Abb. 5 aufgeführt.

Die letzte Verbindung, das redoxmarkierte Atrazin wurde nach Reinigung sowohl für die Verdrängungsmethode als auch für die kompetitive Methode in einem Atrazin-Assay eingesetzt. Die entsprechenden Antikörper wurden von Hock et al. in der Literatur beschrieben [1,2]. Die Abb. 7 zeigt zy­ klische Voltammogramme dieses redoxmarkierten Atrazins in extrem hoher Verdünnung auf einer Trägeroberfläche. Bedingt durch den unmittelbaren Kontakt des Redoxsystems mit der Arbeitelektrodenoberfläche und dem Nichtvorhandensein von andiffundierenden oder abdiffundierenden Redoxmo­ lekülen ergeben sich im zyklischen Voltammogramm schärfere Peaks als üb­ lich. Dieser Effekt wirkt auch empfindlichkeitssteigernd.

Beispiel 3 Steigerung der Nachweisgrenze durch repetitive elektrochemische Oxida­ tion mit anschließender Reduktion

Als reversibles Redox-System wurde Hexacyanoferrat (II/III) in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 gewählt. Die typische Nachweisgrenze für dieses System bei der klassischen zyklischen Voltametrie liegt im millimolaren Konzentrationsbereich. Durch die Methode der elektronischen Signalmit­ telwertbildung, die hier wegen der verbrauchslosen Meßtechnik angewandt werden kann, lassen sich, wie Abb. 8 zeigt, noch extrem geringe Redox­ konzentrationen weit unterhalb des mikromolaren (µmol/L) Bereiches mit einem sehr guten Signal/Rauschverhältnis quantitativ bestimmen. Bei ei­ ner Zyklusfrequenz von ca. 1000 Hz können beispielsweise in einer Sekun­ de 1000 Oxidations- und Reduktionsreaktionen durchgeführt werden, was bezüglich des elektrochemischen Signals gleichbedeutend mit einer zehn­ tausendfach höheren Redoxmittelkonzentration (verglichen zur üblichen 0,1 Hz Arbeitsweise) ist oder einer entsprechend erhöhten Elektronen­ transferzahl entspricht, was gleichbedeutend wäre mit einem Analytmole­ kül, an dem eine entsprechende Anzahl von Ein-Elektronen-Redoxmolekülen angebunden wären.

Beispiel 4 Unterdrückung des kapazitiven Stromanteils bei schnellen zyklischen Voltammogrammen durch Anwendung der zyklischen Mittelwertbildung

Bekanntlich tritt bei schnellen Potentialänderungsgeschwindigkeiten we­ gen der entsprechenden Umladung der Doppelschichtkapazität an der Ar­ beitelektroden-Grenzfläche ein sog. kapazitiver Strom auf, dessen Größe leider proportional zur Änderungsgeschwindigkeit ist, so daß eigentlich eine extrem schnelle Zyklusgeschwindigkeit bei der zyklischen Voltamme­ trie ausgeschlossen sein sollte, weil dieser Anteil den des betreffenden Redox-Peaks (faradayscher Strom) bei weitem übersteigt und zu Voltammo­ grammen führt, wie sie in Abb. 9 dargestellt werden. Führt man hingegen bei Makro-Arbeitselektroden die Spannungskoordinatenwerte ähnlich wie bei einem X-Y-Schreiber rückwärts zählend auf die einzelnen Digitalkanä­ le des Mittelwertbildners oder Scan-Recorders mit dieser Vorrichtung, so führt die Umkehrung des Vorzeichens der Stromstärke bei der Aufaddition In ein und denselben Kanal (der einem genau bestimmten Arbeitselektro­ denpotential zugeordnet ist) zu einer Kompensation des kapazitiven Stromanteils. Dies geschieht nahezu vollständig, da der Kapazitätsstrom bei konstanter Doppelschichtkapazität (bei gleichem Arbeitselektrodenpo­ tential) bis auf das Vorzeichen der Potentialänderungsgeschwindigkeit dU/dt proportional ist. Lediglich die faradayschen Strompeaks, die pro­ portional der Konzentration des Redoxsystems sind, werden durch diesen Schaltungstrick nicht kompensiert, da sie bei unterschiedlichen Potentia­ len ablaufen. Man erhält also ein rauscharmes, gemitteltes zyklisches Voltammogramm, das wie in Abb. 8e gezeigt, aussieht. Erst durch diese schaltungstechnische und elektronische Vorrichtung ist es möglich, mit Potentialzyklusraten von weit über 100 Hz zu arbeiten.

Beispiel 5 Unterdrückung des kapazitiven Stromanteils durch Anwendung eines Ul­ tra-Mikroelektroden-Arrays

Wird die Oberfläche der Arbeitselektrode verkleinert, so verringert sich die zugehörige Doppelschichtkapazität wesentlich stärker als die fara­ daysche Stromdichte, d. h. das Verhältnis von faradayschem Strom (der analytproportional ist) zu kapazitivem wird extrem verbessert, so daß extrem schnelle Potentialänderungsgeschwindigkelten von < 500 V/sec mög­ lich werden. Zusätzlich sorgen die veränderten Diffusionsbedingungen für die elektroaktive Species zu einer anderen Signalform. Ultra-Mikroelek­ troden (Durchmesser < 10 µm) erlauben zum Unterschied zu einer plana­ ren Diffusion bei Makroelektroden sphärische Diffusionsbedingungen und setzen so wenig Substanz um, daß es zu keiner in die Lösung hineinwach­ senden Verarmungsschicht kommt, was sich im Voltammogramm durch eine klare Stufe und ein stabiles Grenzstromplateau zeigt. Die Abb. 10 zeigt den Unterschied zwischen einem zyklischen Voltammogramm einer Spur eines Redoxsystems bei einer Makroelektrode und einem Ultra-Mikroelektro­ den-Array der in Abb. 3 offenbarten geometrischen Anordnung. Das Array hat genau die gleichen Eigenschaften wie eine einzelne Ultra-Mikroelek­ trode, hat jedoch den Vorzug, daß die Stromstärke entsprechend der An­ zahl der Elektroden vergrößert ist.

Beispiel 6 Anordnung für eine besonders einfache Ausführungsform

Anstelle der erzwungenen Strömung bei der Fließinjektionsanalyse können vorzugsweise auch Kapillarkräfte herangezogen werden. Neben dem Prinzip der Papier- und Dünnschichtchromatographie können auch andere Träger für die immobilisierten Partnermoleküle verwendet werden. Ein Beispiel dafür kann ein Stück einer säulenförmigen Kreide (oder Sinterglas/keramik) darstellen. Hier werden bei haptenähnlichen Analyten die Antikörpermole­ küle schon vor der Immobilisierung an der Kreideoberfläche mit den mar­ kierten Analytmolekülen abgesättigt. Die Immobilisierung kann durch ein­ faches Eintauchen in dieser Lösung geschehen, wobei man die Laufstrecke beobachten kann. Die Molekül-Assoziate werden mittels bifunktioneller Reagenzien quervernetzt bzw. an der Oberfläche fixiert. Von dieser pri­ mären immunologischen Zone wird, getrennt durch eine unbehandelte Fließ­ strecke, eine zweite Molekül-Sammelzone errichtet. Aus Gründen einer ho­ hen Empfindlichkeit genügt hierbei ein schmaler Bereich unmittelbar am Ende des Kreideträgers. Im Beispiel wird die Endoberfläche mit den glei­ chen Antikörpern versehen, die auch in der primären immunologischen Zone verwendet wurden, nur mit dem Unterschied, daß hier die analytselektiven Bindungsstellen frei sind, so daß sie die durch den unmarkierten Analy­ ten in der Probe freigesetzten markierten Analytmolküle wieder aufsam­ meln und auf kleinstem Raum konzentrieren. Die elektrochemische oder fluorimetrische Messung erfolgt dann auf der polierten Endfläche der Kreidesäule. Die Strömung eines Trägerelektrolyten oder der Probe durch die Kapillarkräfte wird durch Aufsetzen eines saugfähigen Pfropfens auf diese Endfläche aufrechterhalten. Die vermessene Probemenge muß aus der Abnahme des Probenvolumens ermittelt werden.

Wird bei der Erfindung ein Träger (z. B. Durchfluß-Säule, Fließpapier, Membranfilter etc.) verwendet, an dem ein Partner gebunden ist, wird dieser mittels einer kompetitiven Reaktion durch den unmarkierten Analy­ ten verdrängt. Er wird jedoch am Ausgang der Säule noch vor der Messung erneut von immobolisierten Komplementmolekülen gebunden und dadurch zur eigentlichen Messung angereichert, wobei gleichzeitig auch störende Be­ gleitstoffe durch Spülen entfernt werden können bevor die extrem emp­ findliche elektrochemische oder optische Messung repetitiv durchgeführt wird und durch Signalmittelwertbildung das Signal-zu-Rausch-Verhältnis beliebig gesteigert wird.

Claims (31)

1. Verfahren zur Empfindlichkeits- und Selektivitätssteigerung bei Immuno-Assays, Molekül-Rezeptor-, DNA-komplementär-DNA- und Gast-Wirts­ molekül-Wechselwirkungs-Assays, bei dem eine elektrochemische oder opti­ sche Messung zur Erfassung von Analyten in Proben an der Messung zugäng­ lichen Oberflächen erfolgt, wobei
ein zu bestimmender Analyt im Austausch oder in Konkurrenz mit ei­ ner markierten Form des Analyten wenigstens in einer ersten Zone an der Oberflache an den dort immobilisierten, komplementären Partner gebunden wird,
der verdrängte oder nicht gebundene markierte Analyt in wenigstens einer zweiten Zone aufgefangen und angereichert wird,
die Messung in beiden Zonen oder ausschließlich in der zweiten Auf­ fang- und Anreicherungszone durchgeführt wird, die Messung repetitiv erfolgt
und wobei zur Markierung ein Redox- oder IR-Fluoreszenzmarker verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zum Analyten komplementäre Partnermolekül an einem stationären Träger an zwei getrennten Zonen immobilisiert wird, wobei die Moleküle der ersten Zone zu Beginn einer Analyse mit dem redox- oder fluoreszensmarkierten Analytmolekül abgesättigt werden, so daß dadurch alle Bindungsstellen blockiert sind und bei Kontakt mit dem nicht markierten Analytmolekül aus der Probe eine Verdrängung der markierten Analytmoleküle stattfindet und letztere in der zweiten Zone wieder gesammelt und elektrochemisch oder optisch repetitiv bis zum gewünschten Signal/Rauschverhältnis ver­ messen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Auffangen und Anreichern in der zweiten Zone dadurch erzielt wird, daß dort das Lösungsmittel durch Anwendung von Hitze und Transportgas verdampft wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß man jeder Probe redox- oder fluoreszenzmarkierten Analyt zu­ gibt und neben der Verdrängungsreaktion auch eine kompetitive Bindungs­ reaktion zwischen dem unmarkierten Analyt in der Probe und dem re­ dox- oder fluoreszenzmarkierten Analyt an trägergebundene Partnermolekü­ le ablaufen läßt und nach Spülung der nicht gebundenen Moleküle und Ent­ fernen der Probenmatrix die repetitive elektrochemische oder optische Messung durchführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß ein zyklisches Voltammogramm mit einer hohen Repetitionsrate im Bereich 1 bis » 100 Hz auf einem elektronischen Mittelwertbildner registriert wird, der so geschaltet ist, daß die digitalisierten Strom­ signale in beiden Potentialrichtungen auf ein und denselben Spannungs­ proportionalen Kanal addiert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß als Redox-Marker Redox-Systeme mit besonders hoher Standard­ austauschstromdichte verwendet werden, die sich im betreffenden Lösungs­ mittel oder in der Probenmatrix lösen, und die mit dem Analytmolekül ko­ valent verknüpft werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Re­ dox-Systeme wasserlösliche, stabile und lagerfähige Ferrocenderivate, Rutheniumkomplexe, Hydrochinone, Hexacyanoferrat (II/III), Jod/Jodid verwendet werden, die über Spacermoleküle mit dem Analytmolekül verbun­ den werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß als Markermoleküle für die repetitive optische Messung stabi­ le, lagerfähige Moleküle verwendet werden, die Licht der Wellenlänge < 700 nm absorbieren und im langwelligeren Bereich wieder als Fluoreszenz­ licht emittieren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß für die IR-Fluoreszenzmarkierung das Bis-isothiocyanat-Derivat von 2-(4′-chlo­ ro-7′(3′′-ethyl-2′′-benzothiazolinyliden)-3′,5′-(1′′′-propanedyl)-1′-, 3′,5′-heptatrien-1′-yl)-3-ethylbenzothiazoliumbromid, Porphyrinderiva­ te mit großen 2n+1 Pi-Elektronensystemen oder Phthalocyanine verwendet werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß bei der repetitiven optischen Messung abwechselnd an der zu messenden fluoreszierenden Oberflächenzone und dem Trägerun­ tergrund an einer nicht bedeckten Stelle gemessen wird, was durch eine Relativbewegung des optischen Strahles erreicht wird, und daß die Meß­ werte einem elektronischen Mittelwertbildner zugeführt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur optischen Anregung eine weiße Lichtquelle und ein Monochromator oder eine intermittierend betriebene Laserdiode im IR-Wellenlängenbereich mit hoher Strahlungsdichte, Monochromasie und Streulichtfreiheit zusammen mit einer Lock-in-Verstärkungstechnik verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß bei der Messung eine Mittelwertbildung durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß bei der Messung in zwei Zonen ein Vergleich oder eine Quotientenbildung erfolgt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zur optischen oder elektrochemischen Messung ein Scanner verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur elektrochemischen Messung walzenförmige Arbeitselektroden verwendet wer­ den.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Meßvorgang automatisch computergesteuert in der Weise abfolgt, daß sowohl die von der Anordnung aufgenommene Probemenge als auch die Meßzeit reproduzierbar eingehalten werden und die repetiti­ ve elektrochemische Messung jeweils mit gleicher Zahl an Additionszyklen durchgeführt wird.

17. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, be­ stehend aus einem Träger,

• - auf dessen Oberfläche in wenigstens einer ersten Zone analyterkennende Moleküle oder Molekülassoziationen immobilisiert sind, an welche eine markierte Form des Analyten gebunden ist,
• - der wenigstens eine zweite Zone aufweist, die zum Auffangen und Anrei­ chern der markierten Form des Analyten befähigt ist,
• - und dessen Oberfläche eine elektrochemische Messung oder die Messung von IR-Fluoreszenzlicht in den einzelnen Zonen erlaubt.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß als analyterkennende Moleküle oder Molekülassoziationen die jeweiligen Partner der sich extrem selektiv verbindenden Molekül-Paare: Antikörper (Antikörperfragment mit Bindungsstelle) - Antigen, Molekül-Rezeptor, DNA-Abschnitt - komplementärer DNA-Abschnitt sowie Gastmolekül-Wirts­ molekül an der Oberfläche in der ersten und/oder der zweiten Zone ver­ teilt immobilisiert sind.

19. Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die betreffenden analyterkennenden Komplementmoleküle auf Träger­ oberflächen immobilisiert sind, die den innigen Kontakt mit einer plana­ ren elektrochemischen Drei-Elektroden-Meßzelle erlauben oder die Messung des IR-Fluoreszenzlichtes ermöglichen.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß eine Probenlaufstrecke mit wenigstens einer ersten, ana­ lytspezifisch bindenden Zone zusammen mit wenigstens einer zweiten, Auf­ fang- und Anreicherungszone vorhanden ist.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Träger für die an bestimmten Stellen fixierten ana­ lyterkennenden und selektiv bindenden Komplementmoleküle neben dem typi­ schen Mikrotitermaterial Polystyrol vorzugsweise chromatographische sta­ tionäre Phasen, wie adsorbentiengefüllte Säulen, RP-18 ähnliche Materia­ lien, Fließpapierstreifen, Membranfilterstreifen, die Kapillarflußeigen­ schaften haben, verwendet werden.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekenn­ zeichnet, daß eine planare elektrochemische Drei-Elektroden-Meßkette ungehinderten Kontakt mit den unterschiedlichen Oberflächen der Zonen finden kann oder die optische Messung alternativ zwischen einem Träger­ untergrund und den Meßzonen oszillieren kann.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Auffang- und Anreicherungszone eng begrenzte Zonen in der Proben-Fließrichtung hinter der ersten, analytspezifisch bindenden Zone angelegt sind, die aus den betreffenden analyterkennenden und -bin­ denden Komplementmolekülen bestehen, die freie Bindungsstellen haben und die redox- oder fluoreszenzmarkierten Analytmoleküle binden und der re­ petitiven Messung zuführen.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Auffang- und Anreicherungszone eine lipophile Zone mit öl- oder wachsgetränkter Oberfläche oder RP-18 Material verwendet wird, wobei bei ionalen Analyten dieser Phase noch ein lipophiles Gegen­ ion zur Ionenpaarbildung zugefügt ist.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Auffang- und Anreicherungszone für die in der ersten analytspezifisch bindenden Zone verdrängten markierten Analytmoleküle durch eine entsprechend der Molmasse des markierten Analytmoleküls ge­ wählten Dialysemembran gegeben ist, die in einem gewissen Abstand zu der ersten Zone angebracht ist, und die sowohl stationär mittels aufgedampfter Elektroden wie auch demontiert elektrochemisch vermessen werden kann.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die­ se Dialysiermembran zusätzlich an der in Fließrichtung an erster Stelle liegenden Oberfläche die analytbindenden Komplementärmoleküle immobili­ siert enthält.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die erste analyterkennende und -bindende Zone und die da­ von getrennte Auffang- und Anreicherungszone innerhalb eines teststrei­ fenähnlichen Trägers mit Kapillarkräften liegt.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 27, dadurch gekenn­ zeichnet, daß diese eine planare Drei-Elektrodenmeßzelle, die zusammen mit einem geeigneten Grundelektrolyten auf diese Stellen gepreßt ist, enthält.

29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Drei-Elektroden-Meßzelle ein Ultra-Mikroelektroden-Array aus einem Edel­ metall mit Einzelelektrodendurchmessern < 10 µm aufweist.

30. Vorrichtung nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode oder das dazu benutzte Ultra-Mikroelektro­ den-Array in die unterschiedlichen Meßzonen integriert ist.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Bezugs- und Gegenelektrode in die Oberfläche eines Wafers integriert sind.