DE3617946C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Kon­ zentration von Antigen mit Hilfe des Immunoassays, insbeson­ dere eine Methode, die zur Messung mit hoher Empfindlich­ keit durch Bestimmung der Fluoreszenz geeignet ist.

Seit über ein Verfahren zur Bestimmung von kleinen Mengen an Insulin unter Anwendung eines mit einem Radioisotop markierten spezifischen Antikörper berichtet worden ist, hat diese als "Radioimmunoassay" bezeichnete Bestimmungs­ methode zum quantitativen Nachweis von verschiedenen bio­ logischen Substanzen und Arzneimitteln Anwendung gefunden. Sie ist jedoch nachteilig insofern, als Radioisotope ange­ wendet werden, so daß zu deren Handhabung spezielle Vor­ sichtsmaßnahmen angewendet werden müssen. Daher wurden verschiedene Arten von Immunoassay-Methoden untersucht, für die nicht-radioaktive Markierungssubstanzen wie Enzyme, Substrate, fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen und dergleichen angewendet werden und unter diesen Methoden haben solche, bei denen die Markierung mit Hilfe eines Enzyms oder einer fluoreszierenden Substanz erfolgt, die Stufe der praktischen Anwendung erreicht. So erlaubt insbesondere die fluorometrische Methode unter Verwendung eines fluoreszierenden Markers die Bestimmung in kurzer Zeit. Diese Methode ist jedoch schwierig zu auto­ matisieren, weil das Gesamtverfahren viel Arbeits- und Zeit­ aufwand erfordert. Um das Gesamtverfahren zu vereinfachen, hat man in der DE-OS 34 29 377 bzw. JP-OS 57 257/85 einen rasch ablaufenden Immunoassay zur Messung der Konzen­ tration von Antigen in einer Probe vorgeschlagen, bei dem der Antikörper in einer membranförmigen Matrix immobilisiert wird, senk­ recht zu der Oberfläche der Membran ein Gradient einer elek­ trischen Spannung angelegt wird und auf diese Weise das Antigen in der zu analysierenden Probe durch Elektrophorese in dieser Richtung bewegt wird, das Antigen einer Antigen- Antikörper-Reaktion mit dem vorerwähnten immobilisierten Antikörper unterworfen wird, um es zu immobilisieren, eine Markierungssubstanz in der membranförmigen Matrix immobili­ siert wird, indem man entweder markierten Antikörper durch Elektrophorese zu dem nach dem vorstehenden Verfahren immo­ bilisierten Antigen bewegt, um das immobilisierte Antigen zu markieren, oder indem man markiertes Antigen durch Elektrophorese zu dem nicht umgesetzten Anteil des in der membranförmigen Matrix immobilisierten Antikörpers bewegt, um den nicht umgesetzten immobilisierten Antikörper zu markieren, und danach die Konzentration der immobilisierten Markierungssubstanz mißt und daraus die des immobilisierten Antigens errechnet.

Gemäß dieser Methode steht die Elektrophorese-Matrix, in der das Antigen oder der Antikörper immobilisiert ist, jeweils auf der Kathodenseite und auf der Anodenseite mit der Elektrolytlösung in Kontakt, so daß die zur Durchführung der Antigen-Antikörper-Reaktion erforderliche Zeit, die bei gebräuchlichen Immunoassay-Verfahren drei Stunden bis einen Tag dauert, auf eine Stunde oder weniger vermindert werden kann. Außerdem kann das übliche Immunoassay-Verfahren ver­ einfacht werden. Da die nicht umgesetzten Substanzen und überschüssiger markierter Antikörper durch die Reaktions­ membran durchtreten und sich zu der unteren Elektrolyt­ lösung bewegen, wird das Verfahren des Auswaschens mit Wasser, das bei dem Immunoassay auf Basis einer üblichen Festphasenreaktion notwendig ist, unnötig.

Obwohl jedoch das vorstehend erwähnte Immunoassay-Verfahren unter Anwendung der Elektrophorese eine Vereinfachung des gesamten Verfahrens ermöglicht und sich zur Anwendung einer automatischen Vorrichtung eignet, ist es dann nachteilig, wenn die Konzentration des Antigens in einer Probe durch Fluorimetrie gemessen werden soll, indem mit einer fluores­ zierenden Substanz markierter Antikörper oder markiertes Antigen angewendet werden, weil schwere Störungen durch Streulicht und störende Fluoreszenz auftreten.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine hoch­ empfindliche Methode zur Fluoreszenzmessung beim Immuno­ assay, bei dem eine Antigen-Antikörper-Reaktion durchge­ führt wird, durch Elektrophorese in einer membranförmigen Matrix, in der Antikörper immobilisiert ist, zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Immunoassay-Verfahren, bei dem ein Antikörper im gesamten Bereich einer Matrix für die Elektrophorese immobilisiert wird, das in der zu analysierenden Probe vorhandene Antigen durch Elektrophorese transportiert wird und mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem vorstehend erwähnten immobilisierten Antikörper immobilisiert wird, entweder markierter Antikörper durch Elektrophorese zu dem immobilisierten Antigen transportiert und mit diesem umgesetzt wird oder markiertes Antigen zu dem nicht um­ gesetzten Anteil des vorstehend erwähnten immobilisierten Antikörpers durch Elektrophorese transportiert und mit diesem umgesetzt wird und dadurch die Konzentration des Antigens in der Probe gemessen wird, das dadurch gekenn­ zeichnet ist, daß als Markierungssubstanz ein Enzym ver­ wendet wird, das befähigt ist, ein Substrat in eine fluo­ reszierende Substanz umzuwandeln, das Substrat durch Elektropphorese transportiert und mit dem markierten Anti­ körper bzw. Antigen umgesetzt und dadurch in eine fluo­ reszierende Substanz umgewandelt wird, die gebildete fluoreszierende Substanz aus der Matrix für die Elektro­ phorese in die Elektrolytlösung überführt und danach deren Konzentration bestimmt wird.

Die hierbei gemessene Konzentration der fluoreszierenden Substanz ist der Konzentration des Marker-Enzyms und damit der Konzentration des Antigens in der Probe proportional. Bei diesem Verfahren ist kein Verfahrensschritt des Waschens mit Wasser erforderlich und es treten kaum Störungen durch Streulicht und interferierende Fluoreszenz auf.

In den Zeichnungen bedeutet

Fig. 1 ein Aufbauschema einer gemäß einem Beispiel dieser Erfindung verwendeten Vorrichtung und

Fig. 2 ist ein Teil-Aufbauschema gemäß einem Beispiel der Erfindung.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher anhand bevor­ zugter Auswführungsformen beschrieben.

Wenn die Fluoreszenz bestimmt werden soll, die von einer fluoreszierenden Substanz in einer Membran emittiert wird, ist es im allgemeinen schwierig, die Stärke der Fluoreszenz mit hoher Empfindlichkeit zu messen, weil die Einflüsse von Streulicht durch die Membran oder Hintergrundfluoreszenz aus die Membran bildenden Substanzen auftreten. Anderer­ seits kann jedoch bei der Bestimmung der Fluoreszenz, die durch eine fluoreszierende Substanz in wäßriger Lösung emittiert wird, eine hochempfindliche Fluoreszenzmessung verwirklicht werden, weil die vorstehend genannten störenden Lumineszenzen nur geringfügig auftreten.

Erfindungsgemäß wird nun anstelle der direkten Messung einer fluoreszierenden Markersubstanz in einer Membran die Stärke der Fluoreszenz einer fluoreszierenden Substanz in einer Elektrolytlösung gemessen, indem als Marker ein Enzym eingesetzt wird, welches zur Umwandlung eines Sub­ strats in eine fluoreszierende Substanz befähigt ist, das erwähnte Enzym, das durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Membran, d. h. einer Matrix für die Elektrophorese, immobilisiert ist, mit einem Substrat umgesetzt wird, welches durch Elektrophorese in diese Membran eingewandert ist, so daß das Substrat in eine fluoreszierende Substanz übergeführt wird, und indem die fluoreszierende Substanz in die Elektrolytlösung transportiert wird.

Aus dem vorstehend beschriebenen Grund kann die Stärke der Fluoreszenz der fluoreszierenden Substanz in der Elektrolytlösung mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Darüber hinaus können gemäß der Erfindung zahlreiche Substratmoleküle pro Molekül des Marker-Enzyms in eine fluoreszierende Substanz umgewandelt werden, indem man eine große Menge an Substratmolekülen in die Membran eindringen läßt, so daß mehr Moleküle der fluoreszierenden Substanz erhalten werden können, als markierte Antikörper- oder Antigen-Moleküle im immobilisierten Zustand in der Membran vorhanden sind. Auch aufgrund dieser Tatsache kann eine hochempfindliche Fluoreszenzmessung verwirklicht werden.

Als ein solches Enzym sind verschiedene Enzyme bekannt, wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, Esterase und der­ gleichen. Durch Peroxidase werden die Substrate 3-p-Hydroxy­ phenylpropionsäure und p-Hydroxyphenylessigsäure in fluores­ zierende Substanzen umgewandelt. Alkalische Phosphatase wandelt 4-Methyl-umbelliferyl-phosphat als Substrat in eine fluoreszierende Substanz um. Esterase wandelt als Substrat Fluoresceindiacetat in eine fluoreszierende Substanz um. Als Methode zum Immobilisieren eines Enzyms an dem Antigen oder Antikörper eignet sich die gut bekannte Glutaraldehyd- Methode oder dergleichen. Diese Methode wird beispielsweise in Immunochemistry, 6, 43 (1969) beschrieben.

Um die Konzentration der fluoreszierenden Substanz, die bei dem vorstehend erwähnten Verfahren in die Elektrolyt­ lösung übergeht, zu erhöhen, wird bevorzugt, die Menge der Elektrolytlösung, die sich in dem Elektrolytbad befindet, klein zu halten. Wenn andererseits jedoch die Menge der Elektrolytlösung zu klein ist, besteht die Möglichkeit, daß die Bestandteile der Elektrolytlösung während der Elektrolyse verändert werden, so daß keine geeignete Elektrophorese durchgeführt werden kann. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist daher ein Verfahren, bei dem das Elektrolytbad auf der Seite, auf der die fluores­ zierende Substanz austritt, mit Hilfe einer Membran in zwei Abschnitte unterteilt ist, die für die Elektrolyt­ bestandteile in der Elektrolytlösung durchlässig, jedoch für die fluoreszierende Substanz undurchlässig ist, so daß es ermöglicht wird, die fluoreszierende Substanz in einem Abschnitt mit kleinem Volumen zu konzentrieren, ohne die Zusammensetzung der Elektrolytbestandteile in der Elektro­ lytlösung zu verändern. Als derartige Membran kann jede beliebige Membran eingesetzt werden, welche die folgende Struktur hat: Sie ist in Richtung ihrer Dicke von zahl­ reichen Poren durchsetzt und der Durchmesser dieser Poren ist so klein, daß die Poren nur für kleine Ionen des Elektrolyten durchlässig sind, jedoch undurchlässig für relativ große Ionen sind. Zu diesem Zweck werden beispiels­ weise poröse dünne Glasplatten, poröse Celluloseacetat­ folien, poröse Polyhydroxyethylmethacrylat-Folien und der gleichen verwendet. Das Volumen des Abschnitts mit kleinem Fassungsvermögen, in welchem die fluoreszierende Substanz konzentriert wird, beträgt vorzugsweise 1 cm³ oder weniger. Das bevozugte Volumen läßt sich aus der Konzntration von etwa 10^-13 Mol/Liter oder darüber errechnen, bei der die Bestimmung der fluoreszierenden Substanz leicht vor sich geht.

Ein erfindungsgemäßes Beispiel wird nachstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 erläutert. Die Reaktionsmembran 1, die eine Matrix für die Elekrophorese darstellt, ist ein etwa 300 µm dicker Film aus Polyacrylamidgel und in dieser Matrix wurde anti-human Albuminantikörper (aus Kaninchen) immobilisiert. Der Reaktionsfilm kann in der nachstehend erläuterten Weise hergestellt werden. Zunächst wurden 25 µl einer 2,5-prozentigen wäßrigen Acrolein­ lösung zu 0,5 ml einer IgG-Fraktion (enthaltend 2,4 mg/ml des aktiven Antikörpers) aus anti-human Albumin­ antiserum gegeben und das gebildete Gemisch wurde unter Eiskühlung 30 Minuten stehen gelassen und wurde danach ausreichend gegen PBS dialysiert. Zu dem dialysierten Ge­ misch wurden 1,5 ml einer wäßrigen Acrylamidlösung mit einer Konzentration von 0,32 g/ml, 1,5 ml einer wäßrigen Lösung von N,N′-Methylenbisacrylamid einer Konzentration von 0,016 g/ml, 1,25 ml einer wäßrigen Lösung von N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin einer Konzentration von 4,6 µl/ml und 5,75 ml einer wäßrigen Lösung von Ammonium­ persulfat einer Konzentration von 1,2 mg/ml gegeben. Das gebildete Gemisch wurde ausreichend gerührt, in ein Glas­ gefäß für die Ausbildung eines Gelfilms gegossen und durch Stehenlassen gelatiniert, so daß ein Film bzw. eine Folie gebildet wurde. Aus der so gebildeten Folie wurde eine Kreisfolie mit einem Durchmesser von 9 mm ausgeschnitten und diese wurde mit Hilfe eines aus Acrylharz bestehenden Folienhalters 2 festgehalten. Wegen der Sprödigkeit der Polyacrylamid-Folie, in der der Antikörper immobilisiert vorliegt, wurde rund um die Reaktionsmembran ein Abstands­ ring 3 aus Polyester mit einer Dicke von 200 µm eingefügt.

Ein Gemisch aus einer menschlichen Albumin-Standardprobe und Saccharose wurde in die Elektrolytlösung 5 in dem oberen Elektrolytbad 4 gegossen, wonach die Elektrophorese 30 Minuten lang unter Anlegen einer Spannung von 250 V zwischen einer Platinelektrode 8 in der oberen Elektrolyt­ lösung und einer Platinelektrode 8′ in dem unteren Elektro­ lytbad 6 mit Hilfe einer Gleichstromquelle 9 durchgeführt wurde.

Außerdem wurde anti-human Albumin-Antiserum (Kaninchen), das mit Esterase markiert war, in gleicher Weise in die Elektrolytlösung 5 in das obere Elektrolytbad 4 eingegossen, wonach die Elektrophorese bei einer angelegten Spannung von 250 V 20 Minuten in der vorstehend beschriebenen Weise durch­ geführt wurde.

Schließlich wurde FDA (Fluoresceindiacetat), ein Substrat für das Markierungs-Enzym Esterase, in gleicher Weise in die Elektrolytlösung 5 in das obere Elektrolytbad 4 gegos­ sen und danach wurde die Elektrophorese bei einer angeleg­ ten Spannung von 250 V 30 Minuten lang durchgeführt.

Die Fluoreszenzintensität der fluoreszierenden Substanz Fluorescein, das mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise in die Elektrolytlösung 7 in dem unteren Elektrolytbad 6 freigesetzt worden war, wurde mit Hilfe einer Xenonlampe 10 als anregende Lichtquelle gemessen. Licht einer Wellenlänge von 490 nm wurde mit Hilfe eines Interferenzfilters ausgesondert und mit Hilfe der Linsen 12 und 13 durch ein optisches Fenster 21 geleitet, um die fluoreszierende Substanz in der unteren Elektrolytlösung 7 anzuregen. Das Fluoreszenzlicht passierte ein optisches Fenster 22, die Linsen 16 und 17, ein Interferenzfilter 15 und ein Ausblendfilter 14 in einer Richtung senkrecht zu der des anregenden Lichtes und Licht einer Wellenlänge in der Nähe von 510 nm wurde selektiv mit Hilfe einer Photoverstärkerröhre 18 nachgewiesen. Das von der unteren Elektrolytlösung 7 durch Anregung emittier­ te Licht wurde durch ein optisches Fenster 23 nach außen geleitet. Mit Hilfe des vorstehend erläuterten optischen Systems konnten Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden, die praktisch nicht durch Streulicht beeinflußt wurden. Der Ausgangswert der Photoverstärkerröhre 18 wurde mit Hilfe eines Schreibers 20 aufgezeichnet. Mit Hilfe einer Vorrich­ tung mit dem in Fig. 1 gezeigten Aufbau konnte die Bestim­ mung der menschlichen Albumin-Standardprobe mit guter quantitativer Übereinstimmung und hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

Ein weiteres Beispiel gemäß der Erfindung wird unter Bezug­ nahme auf Fig. 2 beschrieben. Die Methode zur Herstellung der Reaktionsmembran 24, der Aufbau der Elektrolyt-Bäder und die Antigen-Antikörper-Reaktion und die enzymatische Reaktion unter Elektrophorese waren die gleichen wie in dem in Fig. 1 gezeigten Beispiel. In diesem Beispiel wurde ein Elektrolytbad 28 mit kleinem Fassungsvermögen hergestellt, indem eine poröse Glasplatte 27, die in einem aus Acryl­ harz bestehenden Plattenhalter 26 befestigt war, zwischen der Reaktionsmembran 24 und einer unteren Elektrolytlösung 25 angeordnet wurde. Die vorstehend angegebene poröse Glasplatte wurde durch Umsetzen von Tetramethoxysilan mit Methanol in einem wäßrigen Lösungsmittel mit Hilfe einer Sol-Gel-Methode hergestellt und bestand aus Quarzglas, welches für die Elektrolyte in der Elektrolytlösung durch­ lässig war, jedoch undurchlässig für die fluoreszierende Substanz war. Daher wurde das Substrat, welches durch das in der Reaktionsmembran 24 immobilisierte Enzym in eine fluoreszierende Substanz umgewandelt wurde, in dem Elektro­ lytbad 28 angereichert. Im vorliegenden Beispiel wurde die Elektrolytlösung, welche die nach der vorstehenden Verfah­ rensweise angereicherte fluoreszierende Substanz enthielt, mit Hilfe einer Pipette 30 durch eine Führungsöffnung 29 geleitet und in eine Fluoreszenzküvette 31 eingefüllt. Die Pipette wurde von einer drehbaren auf- und abbewegbaren Vorrichtung 32 festgehalten. Die fluoreszierende Substanz in der Fluoreszenzküvette 31 wurde mit Hilfe des in Fig. 1 erläuterten optischen Systems einer Fluoreszenzmessung unterworfen. In dem erfindungsgemäßen Beispiel konnte eine empfindlichere Messung der Konzentration von Antigen in einer Probe durchgeführt werden.

Gemäß der Erfindung kann bei einem zur Automation geeigneten Immunoassay, bei dem die Konzentration von Antigen in einer Probe mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Membran, die eine Matrix für die Elektrophorese darstellt, gemessen wird, die Fluoreszenzmessung in wäßriger Lösung ermöglicht werden, indem eine große Menge der Substratmole­ küle mit Hilfe eines Markierungs-Enzyms, welches in der Membran immobilisiert ist und dessen Konzentration der Konzentration des Antigens proportional ist, in eine fluores­ zierende Substanz umgewandelt werden, und darüber hinaus kann eine Möglichkeit zum Konzentrieren der fluoreszierenden Substanz in einem Abschnitt mit kleinem Fassungsvermögen vorgesehen werden. Erfindungsgemäß wird daher eine hoch­ empfindliche Messung der Konzentration des Antigens möglich.

Claims (2)

1. Immunoassay-Verfahren, bei dem ein Antikörper im gesamten Bereich einer Matrix für die Elektrophorese immobilisiert wird, das in der zu analysierenden Probe vorhandene Antigen durch Elektrophorese transportiert wird und mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem vorstehend erwähnten immobilisierten Antikörper immobilisiert wird, entweder markierter Antikörper durch Elektrophorese zu dem immobilisierten Antigen transportiert und mit diesem umgesetzt wird oder markiertes Antigen zu dem nicht um­ gesetzten Anteil des vorstehend erwähnten immobilisierten Antikörpers durch Elektrophorese transportiert und mit diesem umgesetzt wird und dadurch die Konzentration des Antigens in der Probe ge­ messen wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungssubstanz ein Enzym verwendet wird, das befähigt ist, ein Substrat in eine fluoreszierende Substanz umzuwandeln, das Substrat durch Elektrophorese trans­ portiert und mit dem markierten Antikörper bzw. Antigen umgesetzt und dadurch in eine fluoreszierende Substanz umgewandelt wird, die gebildete fluoreszierende Substanz aus der Matrix für die Elektrophorese in die Elektrolytlösung überführt und danach deren Konzentration bestimmt wird.

2. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrolytbad, in welches die fluoreszierende Substanz aus der Matrix für die Elektro­ phorese übergeführt wird, mit Hilfe einer Membran, die für die Elektrolytbestandteile durchlässig ist, jedoch für die fluoreszierende Substanz undurchlässig ist, in zwei Ab­ schnitte unterteilt ist.