DE69024955T3

DE69024955T3 - Ermittlung und quantifizierung mehrerer analyten unter verwendung von markierungstechniken

Info

Publication number: DE69024955T3
Application number: DE69024955T
Authority: DE
Inventors: Shariar Batmanghelich; James Stuart Woodhead; Ian Weeks
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1989-06-24
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2010-06-22
Also published as: EP0478626B2; DE69024955T2; JPH04506403A; JP3021038B2; ES2081991T3; GB8914563D0; DE69024955D1; GB2233450B; DK0478626T3; GB2233450A; EP0478626A1; EP0478626B1; WO1991000511A1; ATE133257T1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zur Prüfung, zum Nachweis, zur quantitativen Bestimmung, zum Auffinden oder zur Analyse jeder einzelnen von mehreren interessierenden Substanzen ("Analyten") in einer Probe, in der jede Substanz mit einem anderen Molekül oder Molekülen, die an einer Chemilumineszenz-Reaktion teilnehmen können, verbunden ("markiert") ist.
In vorliegender Beschreibung wird eine Chemilumineszenz-Reaktion dahingehend definiert, dass sie eine chemische Reaktion darstellt, die zur Emission von elektromagnetischer Strahlung führt. Die Lumineszenz ist eindeutig von der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz zu unterscheiden. Die Lumineszenz, genauer gesagt die Chemilumineszenz, umfasst ebenso die Lichtemission aus biologischen Reaktionen (Biolumineszenz-Reaktionen).
Eine Lumineszenzreaktion geschieht normalerweise zwischen mindestens zwei Molekülen (S und L) mit oder ohne anderen Reagenzien, Cofaktoren oder einem Katalysator (D) oder unter Einwirkung eines physikalischen Auslösers. L ist die Substanz, die Licht erzeugt, wie Luminol. S ist die Substanz, die mit L reagiert und damit die Anregung verursacht, wie beispielsweise Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid. D (falls vorhanden) ist ein Cofaktor und/oder ein Katalysator oder ein Auslöser, wie ein Enzym, eine Luziferase oder Kaliumhexacyanoferrat. Die Reaktion zwischen L und S führt zur Umwandlung von L in ein angeregtes Molekül L*, und der Übergang dieses angeregten Moleküls in einen nicht angeregten Zustand führt zur Emission eines Photons. Die Reaktion zwischen L und S und der Zerfall von L* in den nicht angeregten Zustand können spontan stattfinden oder die Gegenwart eines Cofaktors oder eines Katalysators D oder eines physikalischen Auslösers, wie die Temperatur, erfordern. Ein Beispiel für diese Reaktion ist die Oxidation von Luminol durch H₂O₂. Die Katalysatoren und Cofaktoren sind oftmals, wie auch vorliegend verwendet, anorganische Verbindungen, sie können allerdings auch aus biologischem Material extrahiert sein, wie die Enzymperoxidase, die die Lumineszenz-Reaktion mit Luminol katalysiert.
Die oben beschriebenen Verfahren und Reagenzien können in einer großen Vielzahl von Techniken, wie Immunoassays, Proteinbindungsassays, Hybridisierungsassays mit Nukleinsäuren, Bindungsassays mit Zellrezeptoren und andere analoge Techniken, verwendet werden, in denen die interessierende Substanz mit einem spezifischen Bindungspartner oder -reagenz gebunden werden soll. Diese Bindungs- bzw. Verbindungsarten werden vorliegend in der Weise bezeichnet, dass sie "verbinden oder auf andere Weise mit (etwas) binden".
Die interessierenden Substanzen könnten Peptide, Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren und andere biologisch interessierende Substanzen sein.
Bindungsassays werden bereits seit vielen Jahren bei der quantitativen Bestimmung von Molekülen von biologischem Interesse verwendet. Es sind bereits viele Beispiele beschrieben worden, in denen der Bindungsschritt eine Immunreaktion, eine Proteinbindungsreaktion, eine Reaktion mit einem Zellrezeptor oder eine Hybridisierungsreaktion mit komplementärer Nukleinsäure darstellt. Empfindliche Assays auf der Grundlage dieser Reaktionen erfordern die Verwendung einer Markierung, die an einen der Bindungspartner dieser Reaktion in der Weise angebracht bzw. in diesen einverleibt sein kann, dass der Bindungsgrad und damit die Konzentration oder Masse des anderen Bestandteils der Reaktion – die interessierende Substanz – bestimmt werden kann. Es sind bereits viele Variationen dieser grundlegenden Bindungsreaktionen beschrieben worden und auch viele verschiedene Markierungen verwendet worden, zu denen Radioisotope, Enzyme, Fluoreszenzmoleküle und Chemilumineszenz-Moleküle zählen.
Verschiedene Kombinationen daraus sind bereits der Reihe nach zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung einer großen Bandbreite von Analyten, angefangen von kleinen Molekülen, wie Hormone und Arzneimittel bzw. Arzneistoffe, bis zu großen Molekülen, wie Nukleotide, verwendet worden.
Im allgemeinen sind diese Techniken nur für die Untersuchung eines einzelnen Analyten in einer Testreaktion eingesetzt worden, jedoch gab es auch schon eine begrenzte Anzahl von Beispielen, in denen zwei Analyten in hauptsächlich einem einzigen Testverfahren bestimmt worden sind. Am bekanntesten sind die gleichzeitig durchgeführten Immunoassays und/oder Proteinbindungsassays für Vitamin B12 und Folsäure sowie ebenfalls für Thyroxin und Thyrotrophin. In diesen Fällen werden die beiden unterschiedlichen Reaktionen unter Verwendung eines für jeden unterschiedlichen radioaktiven Isotops voneinander unabhängig überwacht. Hierbei werden Kobalt-57 und Jod-125 verwendet, deren radioaktive Emissionen mit einem geeigneten Gammazähler voneinander unterscheidbar sind. Ähnliche Verfahrensweisen sind ebenfalls für die gleichzeitige Bestimmung von Lutrophin und Follitrophin verwendet worden.
Wians et al., Clin. Chemistry, Band 32, Nr. 5, 1986, beziehen sich auf einen Radioimmunoassay, wobei Lutropin (LH) und das follikeistimulierende Hormon (FSH) simultan quantifiziert werden und der Assay-Kit die unterschiedlichen Scintillationsenergien nutzt, die durch die mit ⁵⁷Co und ¹²⁵I markierten Indikatoren entstehen.
Radioaktive Reagenzien haben drei Hauptnachteile. Erstens, bei dem Markierungsverfahren werden hochradioaktive Substanzen verwendet, die somit zu potentiell gefährlichen Reagenzien zählen. Zweitens, die Lebensdauer der radioaktiv markierten Substanz ist oftmals relativ kurz, da nicht nur die Radioaktivität des radioaktiven Isotops ohnehin kontinuierlich abnimmt, sondern zudem radioaktiv markierte Proteine oft auch unstabil sind. Drittens, es ist oftmals schwierig, Proteine ausreichend zu markieren, um auf diese Weise ein empfindliches und schnell nachweisbares Reagenz herzustellen. Die Messung der Lumineszenz ist hochempfindlich und sehr schnell, wobei die Messdauer eher im Bereich von Sekunden als von mehreren Minuten, wie es normalerweise bei der Messung von Radioaktivität der Fall ist, liegt. Die Bindung, sei sie kovalent oder nicht kovalent, an Substanzen, die normalerweise nicht an einer Lumineszenz-Reaktion einer Substanz, die an einer Lumineszenz-Reaktion teilnehmen kann, teilnehmen können, erzeugt ein Reagenz, das selbst in sehr kleinen Mengen schnell gemessen werden kann.
Weeks et al., Clin. Chemistry, Band 29, Nr. 8, 1983 berichten über die Synthese eines (1) stabilen chemilumineszenten Acridiniumesterderivats, das fähig ist, kovalent an einen Antikörper zu binden. Derart markierte Proteine können in niedrigeren Konzentrationen als die entsprechenden ¹²⁵I-Derivate nachgewiesen werden. Es wird darauf hingewiesen, dass chemilumineszente Marker aufgrund ihrer allgemeinen Anwendung in Bezug auf Immunoassays eine logische Alternative zu den Radioisotopen sind.
Es ist eine Arbeit beschrieben worden, die die Verwendung von verschiedenen Fluoreszenzmolekülen in sog. "dualen Markierungssystemen" betrifft. Markierungssysteme unter Verwendung von Fluoreszenz eignen sich jedoch in der Regel nur für eine Grobanalyse der Substanzen und im allgemeinen nicht für empfindliche Analysen. In Fluoreszenzsystemen wird die Probe weiterhin zur Messung der Fluoreszenz mit UV-Strahlung belichtet, wodurch schwerwiegende Probleme aufgrund von Photoausbleichen auftreten können. Etliche Immunoassays mit Analyten unter Verwendung von Fluorophoren sind bereits beschrieben worden, in denen die verschiedenen Markierungen Chelatverbindungen mit unterschiedlichen Lanthanidmetallen eingegangen sind, die bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren. Es sind hier Grenzen gesetzt, da gewisse verwendete Fluorophore niedrige Quantenausbeuten aufweisen, und im allgemeinen alle Assays auf der Grundlage dieser Materialien eine komplexe instrumentelle Ausrüstung und Chemie erfordern, damit die hohe Leistung, die für viele Chemilumineszenzsysteme charakteristisch ist, erreicht wird (Ref. 1).
Allgemein ausgedrückt, wird gemäß einem Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zur Prüfung, zum Nachweis, zur quantitativen Bestimmung, zum Auffinden oder zur Analyse jeder einzelnen von mehreren interessierenden Substanzen, die in einer Probe enthalten sind, bereitgestellt, das darin besteht, jede der Substanzen mit einem oder mehreren Bestandteil(en) zu markieren, der bzw. die an einer entsprechenden unterscheidbaren Chemilumineszenz-Reaktion teilnehmen kann bzw. können.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Untersuchung, zum Nachweis, zur Quantifizierung, zum Auffinden oder zur Analyse einer Probe, die mindestens zwei Substanzen von Interesse enthält, umfassend die Schritte:

i) Zur-Reaktion-bringen der Probe mit einem Gemisch, das mindestens ein erstes Reagenz und ein zweites Reagenz umfasst, die mindestens einen ersten und einen zweiten Komplex bilden, wobei der erste Komplex eine der Substanzen oder eine entsprechende damit verbundene Substanz und das erste Reagenz umfasst, und wobei der zweite Komplex eine andere Substanz und das zweite Reagenz umfasst, wobei mindestens das erste Reagenz und das zweite Reagenz jeweils umfassen a) einen Bindungspartner für die Bindung oder eine andere Art der Kopplung mit einer oder mehreren der Substanzen, und b) ein anderes chemilumineszentes Molekül, das unterscheidbare Emissionsmerkmale aufweist, wobei das chemilumineszente Molekül chemisch oder physikalisch an den Bindungspartner gekoppelt ist; ii) anschließende Behandlung der den ersten und zweiten Komplex umfassenden Probe zum Hervorrufen einer ersten und zweiten chemilumineszenten Reaktion, wobei die chemilumineszenten Reaktionen gleichzeitig ausgelöst werden, und iii) Beobachten, Erfassen, Messen und/oder Aufzeichnen der Emissionen jeder der chemilumineszenten Reaktionen.

In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung ein luminiszentes Reagenz bereit, das ein Gemisch von mindestens zwei Reagenzien umfasst, wobei die Reagenzien jeweils umfassen:

a) einen Bindungspartner für die Bindung oder eine andere Art der Kopplung mit einer oder mehreren der Substanzen von Interesse, und
b) ein anderes chemilumineszentes Molekül, das unterscheidbare Emissionsmerkmale aufweist, wobei das chemilumineszente Molekül chemisch oder physikalisch an den Bindungspartner gekoppelt ist.

Es ist festgestellt worden, dass verschiedene Chemilumineszenz-Markierungen hergestellt werden können, die durch geeignete chemische Manipulation verschiedene Eigenschaften im Hinblick auf die Geschwindigkeit und die Wellenlänge der Lichtemission besitzen und dass diese verschiedenen Markierungen vorteilhafterweise in Bindungssystemen für Analyten verwendet werden können, um die im wesentlichen gleichzeitige quantitative Bestimmung von zwei oder mehreren voneinander unterschiedlichen Analyten in einem einzelnen Testverfahren zu ermöglichen.
Es ist bekannt, dass gewisse Veränderungen in der Struktur der Chemilumineszenz-Moleküle Veränderungen im Spektrum des emittierten Lichts verursachen. Es ist kürzlich vorgeschlagen worden, dass herkömmliche Enzymimmunoassays mit lichtemittierenden Endpunkten für Assays mit mehreren Analyten verwendet werden können (Ref. 2), obgleich nicht gesagt worden ist, wie dieses erreicht werden kann oder wie diese Assays offensichtlicherweise durchgeführt werden können. Es gibt keine Daten zur Untermauerung dieses Vorschlages. Es wurden keine vergleichbaren Vorschläge für Fälle dargestellt, in denen die Lumineszenzmoleküle selbst mit Substanzen von biologischem Interesse verbunden sind und demgegenüber Immunoassays mit Lumineszenz-Endpunktenzymen verwendet werden. Die Vorteile der Verwendung der direkten Markierung im Gegensatz zur enzymatischen Modulation sind bereits gut bekannt und zeigen Vorteile im Hinblick auf die Einfachheit, Robustheit und Empfindlichkeit. Es gibt keine Lehren darüber, wie die Vorteile dieser Systeme für Assays mit mehreren Analyten übertragen werden können; des weiteren ist nicht offensichtlich, welche Arten von Instrumenten und dergleichen zur Durchführung dieser Assays erforderlich sein würden. In jüngster Zeit ist gezeigt worden, dass die Modifikation des Luziferasebestandteils von Biolumineszenz-Reaktionen durch genetische Manipulation (Ref. 3) ein weiteres Mittel zur Veränderung der Wellenlänge der Emission aus diesen Reaktionen als Alternative zur Veränderung der chemischen Struktur des entsprechenden Luziferins darstellt.
Es ist des weiteren bekannt, dass im allgemeinen Veränderungen in den chemischen Reaktionsbedingungen oder Strukturänderungen innerhalb der reagierenden Moleküle selbst die Geschwindigkeiten ihrer verschiedenen möglichen Reaktionen beeinflussen können. So werden insbesondere die Kinetiken von Chemilumineszenz-Reaktionen durch das Chemilumineszenzmolekül oftmals beeinflusst. Es ist beispielsweise vorgeschlagen worden (Ref. 4, 5), dass die Geschwindigkeiten von Chemilumineszenz-Reaktionen von Acridiniumsalzen von bestimmten Strukturmerkmalen abhängig sind. So ist auch berichtet worden, dass enzymgesteuerte Chemilumineszenz-Reaktionen durch die Struktur der Substrate (Ref. 6) beeinflusst sein können. Dass diese kinetischen Wirkungen bei der Entwicklung von Assays mit mehreren Analyten auf der Grundlage dieser kinetischen Unterschiede ausgenutzt werden können, ist noch nicht beschrieben worden. Des Weiteren lässt sich aus keinem verwandten Stand der Technik herleiten, wie diese Assays aufgebaut und angewendet werden können.
Es folgt nun eine Diskussion der nicht einschränkenden Ausführungsformen der Erfindung zusammen mit einem spezifischen Beispiel für ein Assayverfahren, wobei auf die anliegenden Zeichnungen Bezug genommen wird, die in den Figuren dargestellt sind:
1 zeigt ein typisches erfindungsgemäßes Testverfahren anhand eines Diagramms, bei dem die Emissionsintensität gegen die Zeit aufgetragen ist; und
2 zeigt ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Verfahren für den Immunochemilumineszenzassay für humanes Gonadotrophin und humanes alpha-Fötoprotein anhand eines Diagramms, bei dem die Emissionsintensität gegen die Zeit aufgetragen ist.
Allgemeines Schema
A und B sind die interessierenden Analyten, die jeweils mehr als ein Antikörpermolekül binden können, so dass parallel Immunoassays mit Bildung eines Immunkomplexes an zwei Stellen durchgeführt werden können. Eine Mischung aus Antikörpern, die A und B binden können, wird in Form einer Schicht auf die Wände eines Teströhrchens aufgebracht. Die Analysenprobe, die unbekannte Mengen an A und B enthält, wird zusammen mit einer Mischung aus löslichen komplementären Antikörpern, die an anderen Stellen auf A und B binden können, in das Röhrchen gegeben. Die für A und B spezifischen löslichen Antikörper werden mit Chemilumineszenzmolekülen markiert, die unterscheidbare Eigenschaften, z.B. eine schnelle oder langsame Lichtemission, aufweisen. Nach einer geeigneten Inkubationszeit bilden sich Immunkomplexe mit zwei Stellen auf den Wänden des Röhrchens, wobei das Ausmaß der Immunkomplexbildung von der Menge von A und B abhängt. Nach der Entfernung der ungebundenen Substanzen durch Absaugen der löslichen Bestandteile aus dem Röhrchen, wird die verbleibende Lumineszenzemission ausgelöst und dann in einem Luminometer gemessen. Die Gesamtzahl der emittierten Photonen ist proportional zur Gesamtmenge an A und B. In diesem Beispiel ist die Chemilumineszenzemission von den für A spezifischen markierten Antikörpern allerdings schnell und innerhalb einer Sekunde beendet, währenddessen die Emission von den für B spezifischen markierten Antikörpern viel langsamer ist und einen Peak nach der Initiierung vor dem Zerfall während der nächsten 19 Sekunden (siehe 1) erreicht. Die Messung der Photonen, die zu zwei verschiedenen Zeitfenstern von 1 und 19 Sekunden innerhalb einer gesamten Messdauer von 20 Sekunden emittiert werden, ermöglicht daher die unabhängige quantitative Bestimmung von A und B bei der Kalibrierung des Systems.
Assaytechniken und Analyten
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können die Spezies von biologischem Interesse quantitativ bestimmt werden, die auch mit Techniken zur quantitativen Bestimmung einzelner Analyten identifiziert werden können. Die folgenden Beispiele werden im Hinblick auf die Art der angewandten Bindungsreaktion gezeigt. Die Liste hat jedoch nur beispielhaften Charakter und ist nicht geeignet, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken:

1. Immunoassay: Arzneistoffe, Vitamine, Steroide, Thyroidhormone, Peptide, Polypeptide, Proteine, Immunglobuline, Viren, Bakterien, Protozoen.
2. Proteinbindungsassays: Vitamine, Cofaktoren, Enzyminhibitoren.
3. Hybridisierungsassays mit Nukleinsäuren: Oligonukleotide, Polynukleotide, DNA, RNA, Oncogene, Mikroorganismen.
4. Rezeptorbindungsassays: Progestogenrezeptoren, Ostrogenrezeptoren, Thyrotrophinrezeptoren, Thyroidhormonrezeptoren.

Bestimmte Paare von Gruppen von Analyten werden oftmals gemessen, um ein vollständigeres Bild des biologischen Systems zu erhalten oder die Testgüte des biologischen Systems zu verbessern. In diesen Fällen ist die durch die Erfindung gebotene Verfügbarkeit einer Messung von gleichzeitig anwesenden mehreren Analyten einzigartig vorteilhaft. Beispiele für Gruppen von Analyten sind unten gezeigt, auf die die vorliegende Erfindung allerdings nicht beschränkt ist.

1. Hormone: Thyroxin/Thyrotrophin, Lutrophin/Follitropin, Adrenocorticortrophin/Hydrocortison.
2. Vitamine und Cofaktoren: Vitamin B12/Folsäure, 1,25-Dihydroxycholicalciferol/25-Hydroxycholecalciferol.
3. Nukleinsäuren (aus Viren und Mikroorganismen): Neisseria gonorrhoea/Chlamydia trachomatis.
4. Tumormarker: Prostata-spezifisches Antigen/prostatische saure Phosphatase, alpha-Fötoprotein/carcinoembryonisches Antigen/Choriongonadotropin.

Markierungen
Der bevorzugte Weg zur Verknüpfung von Chemilumineszenzaktivität mit der geeigneten Bindungsreaktion liegt darin, einen Bestandteil, wie ein Chemilumineszenzmolekül, das an einer Chemilumineszenz-Reaktion teilnehmen kann, an einen der Bestandteile dieser Bindungsreaktion chemisch oder physikalisch zu binden, um somit ein spezifisches markiertes Reagenz herzustellen. Die erfindungsgemäßen Lumineszenzreagenzien umfassen daher zwei oder mehrere dieser markierten Reagenzien, wobei jedes eine Markierung mit verschiedenen Eigenschaften im Hinblick auf die kinetischen und/oder spektroskopischen Eigenschaften trägt. Jedes markierte Reagenz hat eine besondere Spezifität zur Teilnahme an einer gegebenen Bindungsreaktion, so dass demzufolge jede gegebene Bindungsreaktion voneinander unabhängig überwacht werden kann, obwohl zwei oder mehrere dieser Reaktionen gleichzeitig stattfinden. Es ist daher möglich, die Analyten, die an diesen parallelen Bindungsreaktionen teilnehmen, voneinander unabhängig und gleichzeitig quantitativ zu bestimmen.
Verschiedene Mitglieder einer Anzahl von Klassen von Chemilumineszenzmolekülen sind in der Lage, unterschiedliche kinetische und/oder spektroskopische Eigenschaften aufzuweisen und können demzufolge in der Erfindung verwendet werden. Dazu zählen Acridinium und verwandte Verbindungen (z.B. Phenanthridiniumverbindungen), Phthalhydrazide und verwandte Verbindungen (z.B. Naphthalhydrazide), Oxalatester und verwandte Verbindungen sowie stabilisierte Dioxetane und Dioxetanone. Die Veränderungen innerhalb der Gruppen dieser Verbindungen sind dem Fachmann im Allgemeinen gut bekannt; es ist ebenso bekannt, dass die Quantenausbeute, die Kinetiken und Emissionswellenlängen der Chemilumineszenz-Reaktionen durch ihre Struktur beeinflusst werden (siehe oben und ebenfalls Ref. 7-11). Die Strukturen einer Vielzahl von Verbindungen, die sich hinsichtlich ihrer Kinetik- oder Emissionswellenlängenparameter unterscheiden und erfindungsgemäß geeignet sind, können im einzelnen leicht vom Fachmann hergestellt werden. Aus der vorhandenen Literatur wird der Fachmann beispielsweise entnehmen, solche Verbindungen mit hohen Quantenausbeuten und solche Verbindungen, die im Bezug zueinander wesentliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Reaktionsgeschwindigkeit oder ihrer Emissionswellenlängen besitzen, auszuwählen, um somit die Unterscheidung des Nachweises dieser Substanzen zu vergrößern. Acrylacridiniumester können als Markierungen verwendet werden, wobei geeignete chemische Modifikationen durchgeführt werden, um die gewünschten kinetischen und spektroskopischen Parameter herzustellen. Einige Beispiele für diese Verbindungen sind unten angegeben, wobei diese die vorliegende Erfindung in keiner Weise einschränken.
1. Kinetische Veränderung

a.
b.
Im Acrdiniumphenylester von 1a. ist die Phenyleinheit mit F-Gruppen, die die Elektronen abziehen, substituiert, wodurch der Acridiniumphenylester in der Weise modifiziert wird, daß die Lichtemission über einen relativ kurzen Zeitraum erfolgt. Im Acridiniumphenylester von 1b. ist die Phenyleinheit mit CH₃-Gruppen, die Elektronen geben, substituiert, so daß die Lichtemission über einen relativ langen Zeitraum erfolgt. Andere Elektronen gebende oder abziehende Gruppen können ebenfalls verwendet werden.
c.
d.

Tabelle 1 zeigt weitere Beispiele für die Serie.

R₁	R₂	R₃	R₄	R₅	R₆	t½ (Zerfallsphase; Halbwertszeit)
CH₃	H	H	H	H	H	0,6 s
CH₃	CH₃O	H	H	CH₃O	H	7 s
C₆H₅CH₂	H	H	H	H	H	0,5 s
CH₃	CH	H	H	H	H	11 s
CH₃	NO₂	H	H	NO₂	H	< 0,4 s
CH₃	H	CH₃	CH₃	H	H	0,7 s
CH₄	CH₃	H	H	CH₃	CH₃	4 s
CH₃	Br	H	H	Br	H	< 0,4 s

2. Spektroskopische Veränderung
In 2b ist die Elektronenkonjugation des Kerns erhöht, so dass die Emissionsstrahlung eine relativ lange Wellenlänge aufweist.
In jeder der oben gezeigten Acridiniumverbindungen ist R so gewählt, dass eine kovalente Verknüpfung mit einem Bestandteil der geeigneten Bindungsreaktion erfolgen kann. Geeignete Verknüpfungsgruppen sind bereits hinreichend beschrieben, jedoch sind sie in diesem Beispiel so gewählt, dass die gewünschten kinetischen und/oder spektroskopischen Eigenschaften des Moleküls erhalten bleiben und das endgültig markierte Reagenz ebenso noch aktiv ist im Hinblick auf seine Fähigkeit, an der Bindungsreaktion teilzunehmen. Zu solchen Gruppen zählen N-Hydroxysuccinimidester, Imidatester, Isothiocyanate und andere bekannte aktive Gruppen oder Gruppen, die aktive Gruppen bilden können, um die Verknüpfung an Moleküle von biologischem Interesse zu erleichtern. Diese Gruppen sind vorzugsweise an die Chemilumineszenzeinheit durch eine aliphatische Kette von geeigneter Länge gebunden.
Es ist weiterhin möglich, Chemilumineszenz-Reaktionen durchzuführen, bei denen eine Energieübertragung auf ein Fluoreszenz-Akzeptormolekül stattfindet. So ist es beispielsweise möglich, einen Antikörper mit einer Spezifität mit Fluorescein und einen Antikörper mit einer anderen Spezifität mit Rhodamin zu markieren. Diese Antikörper können in gleichzeitig verlaufenden Immunoassays mit Bildung eines Immunkomplexes an zwei Stellen verwendet werden und die Endpunkte durch Einführung eines Peroxyoxalat-Chemilumineszenzsystems (Wasserstoffperoxid/Bis-2,4-Dinitrophenyloxalat) bestimmt werden. Es findet ein strahlungsloser Energieübergang statt, der zur Emission von Licht bei zwei verschiedenen Wellenlängen (grün-gelb von Fluorescein/rot von Rhodamin) führt, wobei die Intensitäten der Emissionen direkt proportional zur Menge des relevanten markierten Antikörpers sind, der in den immunochemischen Reaktionen gebunden ist.
Bindungspartner für Analyten (Reagenzien) und Bindungsreaktionen
Die folgenden Schemata sind Beispiele für Bindungspartner oder Bindungsreaktionen, mit denen es möglich ist, die Konzentrationen von einzelnen Analyten zu bestimmen. Gegenwärtig wird folgendes verwendet: Schlüssel:
Ia. Zwei Stellen Immunoassays:
Antikörper mit einer gegebenen Spezifität für den Analyten erkennen verschiedene Teile der gegebenen Analysesubstanz und können somit einen Immunkomplex mit zwei Stellen bilden. In zwei Stellen-Systemen werden Überschusskonzentrationen des Reagenz gegenüber der Analyten verwendet. 1b. Konkurrierende Bindungsimmunassays (markiertes Antigen)
1c. Zwei Stellen/kompetitive Bindung (markiertes Antigen)-Kombination
Id. Zwei Stellen/kompetitive Bindung (markierter Antikörper)-Kombination
Es wird festgestellt, dass Grenzkonzentrationen für das Reagenz in den kompetitiven Bindungssystemen verwendet werden. 2. Hybridisierungsassays für Oligonukleotide
Das oben gezeigte sind Beispiele für heterogene Assaysysteme, in denen der Komplex aus Analyt-Bindungspartner vom nichtkomplexisierten Material isoliert ist. Es ist außerdem möglich, die beschriebenen Systeme in homogenen Assays anzuwenden.
Instrumente
Für die Messung der Lichtintensität wird ein Photonenzählgerät verwendet. Das Abtastgerät sollte in der Lage sein, die Emissionen aus den unterscheidbaren Chemilumineszenz-Reaktionen zu unterscheiden.
1. Kinetische Unterscheidung
Wie bereits in einem früheren Beispiel beschrieben, sollte das Gerät in der Lage sein, Messungen der Lichtintensität (vorzugsweise als Photonencounts pro Zeiteinheit) innerhalb von mindestens zwei Zeitrahmen aufzeichnen zu können, um eine unabhängige Messung der Intensität aus den langsamen und schnellen Reaktionen zu ermöglichen. In vielen Fällen ergibt sich eine Überschneidung zwischen den beiden Signalen, die sich durch eine geeignete Wahl der Zeitrahmen oder durch mathematische Schätzung der Überschneidung korrigieren lässt.
2. Spektroskopische Unterscheidung
Hier ist es notwendig, die Intensität von zwei oder mehr Wellenlängen gleichzeitig zu messen. Dies kann beispielsweise durch Verwendung einer geeigneten Anzahl von Photovervielfacherröhren, die mit einem Bandpass-Interferenzfilter versehen sind, erreicht werden, um auf diese Weise ein Signal unter Ausschluss der anderen messen zu können. Alternativ kann eine einzelne Photovervielfacherröhre in der Weise verwendet werden, dass das von der Reaktion emittierte Licht zunächst durch ein schnelles Abtastspektrometer oder ein Filter/Unterbrechersystem geführt wird. Die Synchronisierung des Ausstoßes von der Photovervielfacherröhre mit der Abtast- oder Unterbrecherfrequenz ermöglicht daher die unabhängige quantitative Bestimmung von verschiedenen Wellenlängen.
SPEZIFISCHES BEISPIEL
1. Herstellung von markierten Antikörpern:
a. Mit 4-(2-Carbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorosulphonat markierter Antikörper gegenüber menschlichem Choriongonadotropin (hCG).
Die Acridiniummarkierung wurde folgendermaßen synthetisiert: Es wurde Acridinium-9-carbonsäure (5 g) mit Thionylchlorid (15 ml) während drei Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt in wasserfreiem Pyridin (35 ml) suspendiert. Es wurde Benzyl-4-hydroxyphenylpropanoat (9 nMol) hinzugegeben und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde anschließend in eine Mischung aus zerstoßenem Eis/1 M Chlorwasserstoffsäure (250 ml) gegossen und der erhaltene Niederschlag filtriert, der dann mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet wurde. Das auf diese Weise erhaltene 4-(2-Benzyloxycarbonylethyl)phenyl-9-acridincarboxylat wurde aus Benzol/Cyclohexan umkristallisiert. Es wurden 0,46 g davon in einer Mischung aus Bromwasserstoff/Essigsäure (45/55 G/G, 10 ml) gelöst und die Lösung während zwei Stunden bei 50 bis 55°C gerührt. Die Lösung wurde in Wasser (100 ml) gegossen und der entstandene gelbe Feststoff wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, dann aus Acetonitril/-Chloroform umkristallisiert unter Bildung von 4-(2-Carboxylethyl)phenyl-9-acridincarboxylat. Es wurde N-Hydroxysuccinimid (62 mg) in Dimethylformamid (5 ml) zusammen mit 200 mg des obigen Acridincarboxylats gelöst. Die Mischung wurde auf –20°C abgekühlt und Dicyclohexylcarbodiimid (123 mg) hinzugegeben, wonach während zwei Stunden bei –20°C, dann über Nacht beim Raumtemperatur gerührt wurde. Ein Tropfen Eisessig wurde dann hinzugegeben und die Mischung für weitere 30 Minuten stehen gelassen. Der Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und das durch Verdampfung der Flüssigkeit erhaltene Material wurde aus Benzol/Cyclohexan umkristallisiert unter Bildung von 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-9-acridincarboxylat. Das Produkt (234 mg) wurde in wasserfreiem Chloroform (25 ml) gelöst und Methylfluorosulphonat (0,5 ml) dazugegeben. Der Niederschlag, der sich nach dem Rühren bei Raumtemperatur während 18 Stunden gebildet hatte, wurde filtriert und mit wasserfreiem Benzol unter Bildung von 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorosulphonat gewaschen. Monoclonale Antikörper der Maus (50 μg), die gegenüber menschlichem Choriongonadotropin gezüchtet wurden, wurden in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,1 M, 200 μl), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, gelöst. Es wurde eine Vorratslösung des Acridiniumsuccinimidylesters in Acetonitril (0,5 mg/ml) hergestellt und 10 μl wurden unter Rühren zu der Antikörperlösung hinzugefügt. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur während 15 Minuten im Dunklen, wurde eine Lösung aus Lysinmonohydrochlorid (100 μl, 10 mg/ml) im obigen Puffer hinzugegeben, und die Mischung wurde für weitere fünf Minuten stehengelassen. Die Mischung wurde auf einer Säule mit Sephadex G25-M von Pharmacia (30 cm × 0,6 cm) gereinigt, equilibriert und mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (pH 6,3, 0,1 M, 0,15 M NaCl), die 0,1% (G/V) Rinderserumalbumin und 0,05% (G/V) Natriumazid enthielt, eluiert. Es wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt und die Hohlraumvolumenfraktionen vereint und bei 4°C gelagert.
b. Mit 4-(2-Imidylethyl)-2,6-dimethyl-10-methylacridinium-9-carboxylatdichlorid markierte Antikörper gegen menschliches alpha-Fötoprotein (AFP).
Die Acridiniummarkierung wurde wie folgt synthetisiert: Es wurde Acridinium-9-carbonsäure (2,5 g) mit Thionylchlorid (10 ml) während drei Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt in wasserfreiem Pyridin (0,25 ml) suspendiert. Es wurde 2,6-Dimethyl-4-hydroxyphenylpropionitril (1,3 g) hinzugegeben und die Lösung unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Mischung wurde dann in eine Mischung aus gestoßenem Eis/1 M Chlorwasserstoffsäure (250 ml) gegossen, und der entstandene Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene 4-(2-Cyanoethyl)-2, 6-dimethylphenylacridiniumcarboxylat wurde in wasserfreiem Chloroform (15 ml) gelöst, wonach Methyltrifluoromethylsulphonat (0,5 ml) hinzugegeben wurde. Der Niederschlag, der sich nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur und durch die Zugabe von Diethylether gebildet hatte, wurde abfiltriert und mit wasserfreiem Benzol unter Bildung von 4-(2-Cyanoethyl)-2,6-dimethylphenyl-10-methyl-9-acridiniumcarboxylat-trifluormethylsuphonat gewaschen, das anschließend in wasserfreiem Methanol (69 mg, 10 ml) gelöst wurde. Es wurde HCl-Gas durch die Lösung unter Stickstoff geleitet, bei Eistemperatur während zwei Stunden gehalten und für eine weitere Stunde stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden in einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff filtriert und mit wasserfreiem Methanol unter Bildung von 4-(2-Methyloxyimidylethyl)-2,6-dimethylphenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatdichlorid gewaschen. Es wurden monoclonale Antikörper der Maus (50 μg), die gegen alpha-Fötoprotein gezüchtet worden waren, in Natriumboratpuffer (pH 9,5, 0,1 M, 200 μl), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, gelöst. Es wurde eine Vorratslösung aus Acridiniumimidoester in Acetonitril (0,5 mg/ml) hergestellt und 190 μl zu der Antikörperlösung unter Vermischen hinzugegeben. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur während 30 Minuten in der Dunkelheit, wurde eine Lösung aus Lysinmonohydrochlorid (100 μl, 10 mg/ml) im obigen Puffer hinzugefügt und die Mischung während weiteren 15 Minuten stehengelassen. Die Mischung wurde, wie oben beschrieben, gereinigt.
2. Herstellung von Festphasen-Antikörpern
Monoclonale Antikörper gegen menschliches Choriongonadotropin und alpha-Fötoprotein, die unterschiedliche Epitope erkennen gegenüber denjenigen, die durch die markierten Antikörper erkannt werden, wurden unter Verwendung bekannter Verfahren an paramagnetische Teilchen gebunden.
3. "Gleichzeitiger" immunochemiluminometrischer Assay für menschliches Choriongonadotropin und menschliches alpha-Fötoprotein.
Festphase-Antikörper-Suspensionen (800 μg/ml) wurden zu gleichen Volumen vermischt. Markierte Antikörperlösungen (10 ng/ml Anti-hCG, 50 ng/ml Anti-AFP) wurden in gleichen Volumen vermischt. Der Verdünnungspuffer war derselbe wie der Antikörperreinigungspuffer (siehe oben). Die Standardmischungen für die Kalibrierung bestanden aus Mischungen, die bekannte Konzentrationen von hCG und AFP in Pferdeserum enthalten. 50 μl einer Serumprobe eines Patienten wurden in zweifacher Ausführung in Teströhrchen aus Polystyrol mit den Ausmaßen 12 × 75 mm gegeben. Die Standardröhrchen wurden in zweifacher Ausführung unter Verwendung von 50 μl des geeigneten Standards befüllt. 100 μl der markierten Antikörpermischung wurden hinzugefügt, wonach 100 μl der Festphase-Antikörpermischung zugegeben wurden. Die Röhrchen wurden gemischt und für eine Stunde bei Raumtemperatur zur Seite gestellt. 1 ml einer Waschlösung (1,76 g/l Natriumdihydrogenorthophosphat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,5% (G/V) Natriumazid, 0,5% Rinderserumalbumin, 1% (V/V) Triton X-100) wurden hinzugefügt, und die Röhrchen wurden in ein magnetisches Gestell eingesetzt, um somit die Sedimentation der Festphase zu erleichtern. Die Überstände wurden dekantiert und verworfen, und weitere 1 ml des Waschpuffers hinzugefügt, wonach die Röhrcheninhalte vermischt wurden. Es wurde ein weiterer Schritt zur Sedimentation/Dekantierung durchgeführt und die Proben in ein Luminometer eingesetzt.
4. Messung der Lichtintensität

Die Messungen der Lichtemission wurden in einem Analysiergerät der Ciba Corning Magic Lite nach den durch den Hersteller empfohlenen Vorschriften durchgeführt. Durch Manipulation der Software konnte eine distinkte integrierte Folge der Lichtintensität im Hinblick auf die Zeit durchgeführt werden. Getrennte Integrationen wurden im Bereich von 0-1 und 1-2 Sekunden, die der Lichtemission aus den hCG- und AFP-Antikörpern entsprechen, durchgeführt, die somit proportional zu den Konzentrationen von hCG und AFP in der Probe ist. Da eine gewisse Überschneidung aufgrund der Überlagerung des hCG-Signals durch das AFP-Signal bestand, war eine Korrektur notwendig. Diese wurde erreicht durch Bestimmung des AFP-Beitrags zur 0-1 Sekunden-Integration, indem, wie aus 2 zu entnehmen ist, das vorher bestimmte Verhältnis der Lichtintensität bei 2 Sekunden zum Integral zwischen 1-2 Sekunden verwendet wurde.

[hCG] U/L	Photonencounts	[AFP] kU/L	Photonencounts	Überschneidung	korrigierte hCG-Photonencounts
250	1,22 × 10⁶	250	1,14 × 10⁴	3,35 × 10⁴	1,19 × 10⁶
125	8,11 × 10⁵	125	7,4 × 10⁴	2,18 × 10⁴	7,89 × 10⁵
62,5	4,66 × 10⁵	62,5	4,2 × 10⁴	1,24 × 10⁴	4,54 × 10⁵
31,3	2,63 × 10⁵	31,3	2,3 × 10⁴	6,76 × 10³	2,56 × 10⁵
15,6	1,33 × 10⁵	15,6	1,3 × 10⁴	3,82 × 10³	1,29 × 10⁵
0	3,37 × 10⁵	0	6,6 × 10²	1,94 × 10²	3,18 × 10³
	r = 3,40

Bei [hCG] » [AFP] lieferte das verbleibende hCG-Signal während des zweiten Zeitfensters einen beträchtlichen Beitrag, so dass dabei die Messung von x gestört wurde. Dieses war in der Praxis kein Problem und konnte durch relative Assay-Optimierung, z.B. durch Veränderung der spezifischen Aktivitäten der markierten Antikörper, auf ein Minimum herabgesetzt werden.
In Situationen, in denen Genauigkeit sogar bei extrem relativen Konzentrationen erforderlich ist, wird die gegenseitige Überschneidung korrigiert, indem eine komplexere Software verwendet wird, die iterative oder simultane Gleichungen berechnen kann.
Wenn die Überschneidung ein ernstes Problem darstellt, muss nach alternativen Markierungen gesucht werden, die größere Unterschiede hinsichtlich ihrer relativen kinetischen Eigenschaften aufweisen.
REFERENZEN

1. I. Hemmilä, S. Holttinen, K. Pettersson, T. Lövgren, Clinical Chemistry 33, (1987), 2281.
2. B. Edwards, A. Sparks, J.C. Voyta, I. Bronstein, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 5, (1990), 1.
3. K.V. Wood, Y.A. Lam, W.D. McElroy, H.H. Seliger, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 4, (1989), 31.
4. F. McCapra, Accounts of Chemical Research, 9, (1976), 201.
5. F. McCapra, et al., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescerice, 4, (1989), 51.
6. B. Edwards, A. Sparks, J.C. Voyta, I. Bronstein, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 5, (1990), 1.
7. M.M. Rauhut, L.J. Bollyky, B.G. Roberts, et al., Journal of the American Chemical Society, 89, (1967), 6515.
8. K.D. Gundermann, Topics in Current Chemistry, 46, (1974), 61.
9. U.S. Patent Nr. 3689391 (Ullman).
10. U.S. Patent Nr. 4277437 (Maggio).
11. U.S. Patent Nr. 3817837 (Rubenstein).

Claims

Verfahren zur Untersuchung, zum Nachweis, zur Quantifizierung, zum Auffinden oder zur Analyse einer Probe, die mindestens zwei Substanzen von Interesse enthält, umfassend die Schritte: i) Zur-Reaktion-bringen der Probe mit einem Gemisch, das mindestens ein erstes Reagenz und ein zweites Reagenz umfasst, die mindestens einen ersten und einen zweiten Komplex bilden, wobei der erste Komplex eine der Substanzen oder eine entsprechende damit verbundene Substanz und das erste Reagenz umfasst, und wobei der zweite Komplex eine andere Substanz und das zweite Reagenz umfasst, wobei mindestens das erste Reagenz und das zweite Reagenz umfassen a. einen Bindungspartner für die Bindung oder eine andere Art der Kopplung mit einer oder mehreren der Substanzen, und b. ein anderes chemilumineszentes Molekül, das unterscheidbare Emissionsmerkmale aufweist, wobei das chemilumineszente Molekül chemisch oder physikalisch an den Bindungspartner gekoppelt ist; ii) anschließende Behandlung der den ersten und zweiten Komplex umfassenden Probe zum Hervorrufen einer ersten und zweiten chemilumineszenten Reaktion, wobei die chemilumineszenten Reaktionen gleichzeitig ausgelöst werden, und iii) Beobachten, Erfassen, Messen und/oder Aufzeichnen der Emissionen jeder der chemilumineszenten Reaktionen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Emissionsmerkmale jeder der chemilumineszenten Reaktionen auf Grund der Änderungen der Intensität der Lichtemission oder der Intensität der Strahlung mit der Emissionszeit unterscheidbar sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Intensität der von der Probe emittierten Strahlung über zwei unterschiedliche Zeitintervalle, die sich überlappen können, beobachtet, erfasst, gemessen und/oder aufgezeichnet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede einzelne chemilumineszente Reaktion eine Strahlung in einem jeweils unterschiedlichen Spektralbereich emittiert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem wenigstens drei chemilumineszente Reaktionen auftreten, von denen wenigstens zwei der chemilumineszenten Reaktionen hinsichtlich der spektralen Emissionsmerkmale und wenigstens zwei auf Grund der Änderung der Intensität des Lichtes oder der Intensität der Strahlung mit der Zeit unterscheidbar sind.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem die Emissionen mittels entsprechender Filter gefiltert werden, die auf die Strahlung in den verschiedenen Spektralbereichen ansprechen, und die gefilterten Intensitäten der Emissionen beobachtet, erfasst, gemessen und/oder aufgezeichnet werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem von diesem abhängigen Anspruch, bei dem wenigstens einer der ersten und zweiten Komplexe aus einem Reagenz besteht, das an eine Substanz durch eine Immunoassay-Bindungsreaktion, eine Protein-Bindungsreaktion, eine Nucleinsäure-Hybridisierungs- und eine Rezeptorreaktion gebunden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem jede einzelne chemilumineszente Reaktion eine entsprechende Komponente oder ein Reagenz enthält, das eine strukturelle Variante des oder jedes Bestandteiles oder Reagenzes ist, das der oder jeder anderen chemilumineszenten Reaktion zugeordnet ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem eine der Komponenten in wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen auf Acridinium-Verbindungen oder deren strukturellen Varianten basiert.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem eine der Komponenten in wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen ein Acridiniumsalz ist, das am Ringstickstoff alkyliert ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem eine der Komponenten in wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen ein Acridiniumphenylester ist, wobei der Ester an Position 9 des Acridinkerns gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei eine der chemilumineszenten Reaktionen einen Acridiniumphenylester einschließt, dessen Phenylanteil mit Elektronen abziehenden Gruppen substituiert ist, um eine chemilumineszente Reaktion hervorzurufen, deren Lichtemission über einen verhältnismäßig kurzen Zeitraum auftritt, und eine andere chemilumineszente Reaktion einen Acridiniumphenylester umfasst, dessen Phenylanteil mit Elektronen abgebenden Gruppen substituiert ist, um eine chemilumineszente Reaktion zu ergeben, deren Lichtemission über einen verhältnismäßig langen Zeitraum auftritt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem eine der chemilumineszenten Reaktionen ein Acridiniumsalz einschließt, das beim Einleiten der Reaktion eine Strahlung mit einer verhältnismäßig kurzen Wellenlänge ausstrahlt, und bei dem eine andere chemilumineszente Reaktion ein Acridiniumsalz einschließt, beidem die elektronische Konjugation des Acridinkerns vergrößert ist, wobei beim Einleiten dieser anderen Reaktion das Acridiniumsalz eine Strahlung mit einer verhältnismäßig langen Wellenlänge emittiert.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die eine chemilumineszente Reaktion eine Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 400 bis 500 nm und die andere chemilumineszente Reaktion eine Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 500 bis 700 nm ausstrahlt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder einem von diesem abhängigen Anspruch, bei dem die Acridiniumverbindung modifiziert oder weiter derivatisiert ist, um kovalente Bindungen an ein Molekül von biologischem Interesse zu ermöglichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem eine der Verbindungen in wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen auf einer der folgenden Verbindungen basiert: i) Phthalhydrazide und verwandte Verbindungen, ii) Dioxetane, Dioxetanone und verwandte Verbindungen; und iii) Bis-oxalsäureester, verwandte Verbindungen und falls erforderlich, assoziierte Akzeptorpartner.
Lumineszentes Reagenz, das ein Gemisch von wenigstens zwei Reagenzien umfasst, wobei jedes der Reagenzien umfasst a) einen Bindungspartner für die Bindung oder sonstige Kopplung an entsprechende Substanzen von Interesse; und b) ein anderes chemilumineszentes Molekül, das unterscheidbare Emissionsmerkmale aufweist, wobei das chemilumineszente Molekül chemisch oder physikalisch an den Bindungspartner gekoppelt ist.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 17, bei dem jede der chemilumineszenten Emissionen von jeder anderen auf Grund der Änderung der Lichtintensität mit der Emissionszeit unterscheidbar ist.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 17, bei dem jede der chemilumineszenten Emissionen eine Strahlung in einem unterschiedlichen Spektralbereich emittiert.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 17 oder 18, bei dem wenigstens eine der Reagenzien in der Lage ist, durch eine Reaktion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Immunoassay-Bindungsreaktion, einer Proteinbindungsreaktion, einer Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktion und einer Rezeptor-Bindungsreaktion zu binden oder in anderer Weise zu verknüpfen.
Lumineszentes Reagenz nach einem der Ansprüche 17, 18, 19 und 20, bei dem die chemilumineszenten Moleküle strukturelle Varianten des oder jedes anderen chemilumineszenten Moleküls sind.
Lumineszentes Reagenz nach einem der Ansprüche 17, 18, 19 und 20, bei dem eines der chemilumineszenten Moleküle, das in der Lage ist, an wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen teilzunehmen, auf Acridiniumverbindungen oder deren strukturellen Varianten basiert.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 22, bei dem eines der chemilumineszenten Moleküle in wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen ein Acridiniumsalz ist, das am Ringstickstoff alkyliert ist.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 22, bei dem eines der chemilumineszenten Moleküle in wenigstens einer der chemilumineszenten Reaktionen ein Acridiniumphenylester ist, wobei der Ester an Position 9 des Acridinkerns gebildet wird.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 24, bei dem eine der chemilumineszenten Reaktionen einen Acridiniumphenylester einschließt, dessen Phenylanteil mit Elektronen abziehenden Gruppen substituiert ist, um eine chemilumineszente Reaktion zu erzielen, deren Lichtemission über einen relativ kurzen Zeitraum auftritt, und eine andere chemilumineszente Reaktion einen Acridiumphenylester umfasst, dessen Phenylanteil mit Elektronen abgebenden Gruppen substituiert ist, um eine chemilumineszente Reaktion zu erzielen, deren Lichtemission über einen relativ langen Zeitraum auftritt.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 22, bei dem eine der chemilumineszenten Reaktionen ein Acridiniumsalz einschließt, das beim Einleiten der Reaktion eine Strahlung mit einer verhältnismäßig kurzen Wellenlänge ausstrahlt, und bei dem eine andere chemilumineszente Reaktion ein Acridiniumsalz einschließt, bei dem die elektronische Konjugation des Acridinkerns vergrößert ist, wobei beim Einleiten dieser anderen Reaktion das Acridiniumsalz eine Strahlung mit verhältnismäßig langer Wellenlänge emittiert.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 26, bei dem die eine chemilumineszente Reaktion eine Strahlung mit einer Wellenlänge im Bereich von 400 nm bis 500 nm und die andere chemilumineszente Reaktion eine Strahlung im Bereich von 500 nm bis 700 nm emittiert.
Lumineszentes Reagenz nach Anspruch 22 oder einem von diesem abhängigen Anspruch, bei dem die Acridiniumverbindung modifiziert oder weiter derivatisiert ist, um kovalente Bindungen an ein Molekül von biologischem Interesse zu ermöglichen.
Lumineszentes Reagenz nach einem der Ansprüche 17, 18, 19 und 20, wobei die chemilumineszenten Moleküle in der Lage sind, an den chemilumineszenten Reaktionen teilzunehmen, wobei wenigstens eine der chemilumineszenten Reaktionen auf einer der folgenden Verbindungen basiert: i) Phthalhydrazide und verwandte Verbindungen, ii) Dioxetane, Dioxetanone und verwandte Verbindungen; und iii) Bis-oxalsäureester, verwandte Verbindungen und, falls erforderlich, assoziierte Akzeptorpartner.