DE68928171T2

DE68928171T2 - Gesteigerte elektrochemilumineszenz

Info

Publication number: DE68928171T2
Application number: DE68928171T
Authority: DE
Inventors: Haresh Shah; Surendera Tyagi; Borstel Reid Von
Original assignee: IGEN Inc
Current assignee: Bioveris Corp
Priority date: 1988-11-03
Filing date: 1989-11-03
Publication date: 1997-10-30
Anticipated expiration: 2009-11-04
Also published as: ATE155248T1; AU4620089A; EP0441875A1; EP0441875B1; DE68928171D1; WO1990005302A1; AU644779B2; CA2002083C; CA2002083A1; JPH04502208A; EP0441875A4

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Elektrochemolumineszenzreaktionen (ECL) und insbesondere solche zum Nachweis der Anwesenheit eines interessierenden Analyten sowie, falls gewünscht, die Quantifizierung der vorhandenen Menge durch Messung elektrochemischer Strahlung, die durch das untersuchte System emittiert wird. Der Leser wird hierzu auf die WO 87/06 706, EP-A-0 339 086, EP-A-0 417 140 und EP-A-0 446 245 verwiesen.

Stand der Technik

Frühe ECL-Reaktionen involvierten die gegenseitige Neutralisation gegensätzlich geladener Radikalionen, die durch sequentielle Oxidation und Reduktion an einer Elektrode unter Anwendung einen Doppelpotentialschritts erzeugt worden sind (vgl. L.R. Faulkner et al., Electroanalytical Chemistry, A.J.Bard (Hrsg.), Bd. 10, Marcel Dekker, N.Y., 1977, Ch.1; N.E. Tokel-Takvoryan et al., Chem. Phys. Lett., 1974, 25, 235; J.C. Velasco et al., Inorg. Chem. 1983, 22, 822; J.C. Luong et al., J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 5790; H.D. Abruna, J. Electrochem. Soc. 1985, 132, 842; und H.D. Abruna, J. Electroanal. Chem. 1984, 175, 321). Bei einem homogenen Elektronentransfer zwischen den ausreichend energetisierten und gegensätzlich geladenen Radikalen kann ein Anregungszustand einer der Vorläufer erzeugt werden, anschließend wird von der Spezies im angeregten Zustand emittiert. Weiterhin wurde über die sogenannten Energiemangel-Mechanismen berichtet, die Triplett-Triplett-Neutralisationen involvieren (vgl. D. Freed et al., J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 2097; W.L. Wallace et al., J. Electrochem. Soc. 1978, 125, 1430).
In einer anderen ECL-Reaktion wurde ein Luminophor mit einer Carbonsäure wie Oxalat oder Pyruvat zum Erzeugen der Elektrochemilumineszenz verwendet. Derartige Oxidations-Reduktions mechanismen umfassen die Oxidation von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; ("bpy" steht hier für "Bipyridyl") sowie die Carbonsäure (vgl. D. Ege et al., J. Anal. Chem. 1984, 56, 2413; I. Rubinstein et al., J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 512; M.M. Chan et al., J. Am. Chem. Soc. 1979,99, 5399). Die den Berichten zufolge notwendige Menge an Luminophor für diese Systeme ist jedoch in manchen Fällen unerwünscht hoch. Es wäre ein erstrebenswerter Vorteil für diese Systeme, bei Verwendung einer kleineren Menge an Luminophor wirksam zu sein, als dies üblicherweise für den Nachweis einer Analytenprobe einer bestimmten Größe der Fall ist. Bei diesen Systemen wäre auch eine höhere Nachweiskapazität wünschenswert, die den Nachweis einer kleineren Menge an Analyten gestattet, als dies für eine bestimmte Menge an Luminophor herkömmlicherweise zutrifft.
Dementsprechend würde die Bereitstellung von Materialien und Verfahren zur Durchführung von ECL-Reaktionen, die günstige Nachweisgrenzen zeigen, einen signifikanten technischen Fortschritt bedeuten.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Möglichkeit zur Steigerung des Ausmaßes an emittierter elektromagnetischer Strahlung zur Verfügung.
Erfindungsgemäß wird die Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel zur Verfügung gestellt,
in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R¹ CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strahlung in einer für die Verwendung in einem ECL-Test geeigneten Zubereitung, die enthält:
(a) eine metallhaltige ECL-Einheit, die, wenn durch Exposition an eine wirksame Menge eklektrochemischer Energie oxidiert, in einen angeregten Zustand überführt werden kann, aus dem bei Exposition der angeregten ECL-Einheit an die Emission induzierende Bedingungen elektromagnetische Strahlung emittiert werden kann,
(b) eine Spezies, die im oxidierten Zustand ein starkes Reduktionsmittel darstellt, und
(c) einen Elektrolyten, der als Medium fungieren kann, in dem die ECL-Einheit und besagte Spezies oxidiert werden können.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann die Zubereitung in Form eines Kits vorliegen, der mindestens eine separate Komponente enthält, welche eines oder mehrere Elemente der aus den Komponenten (a), (b) und (c) sowie der die elektromagnetische Strahlung verstärkenden Verbindung bestehenden Gruppe umfaßt. Der Kit kann eine erste, beliebige zwei der Gruppe einschließende separate Komponente und eine zweite, die restlichen Elemente der Gruppe umfassende Komponente aufweisen. Diese zweite separate Komponente kann weiterhin eines der anderen Elemente der Gruppe aus der ersten Komponente umfassen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Kit vier separate Komponenten enthalten, die jeweils ein anderes der vier Elemente der Gruppe enthalten.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform weist der Kit eine erste Komponente, die alle vier Elemente der Gruppe einschließt, sowie eine zweite separate Komponente auf, die beliebige ein, zwei oder drei Elemente der Gruppe einschließt. Nach einem Aspekt dieser Ausführungsform schließt die die zweite separate Komponente eines der vier Elemente der Gruppe ein und weist der Kit eine dritte separate Komponente, die ein, zwei oder drei Elemente der Gruppe umfaßt, sowie eine vierte separate Komponente auf, die ein oder zwei beliebige Elemente der Gruppe umfaßt.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform weist der Kit eine erste, mindestens zwei Elemente der Gruppe einschließende separate Komponente und eine zweite, die restlichen Elemente der Gruppe enthaltende separate Komponente auf.
Die Erfindung stellt weiterhin zur Verfügung die Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel
in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R¹ CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strahlung in einem Verfahren zur Erzeugung einer Emission elektromagnetischer Strahlung, das die Schritte umfaßt:
(i) Herstellen einer wie oben definierten Zubereitung,
(ii) Exponieren der Zubereitung unter geeigneten Bedingungen an eine Menge elektrochemischer Energie, die wirksam ist, um in der Zubereitung die Emission elektromagnetischer Energie zu induzieren, und
(iii) Nachweis der emittierten elektromagnetischen Strahlung,
wobei die Zubereitung die besagte Verbindung enthält. Bei dem Verfahren kann es sich um ein Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten mittels eines ECL-Tests handeln, bei dem die Zubereitung zusätzlich umfaßt:
(A) eine auf den interessierenden Analyten zu testende Probe und
(B) mindestens eine Substanz, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus:
(i) einen weiteren interessierenden Analyten oder ein Analogon des interessierenden Analyten,
(ii) einen Bindungspartner für den interessierenden Analyten oder dessen Analogon und
(iii) eine reaktive Komponente, die (i) oder (ii) binden kann,
wobei die metallhaltige ECL-Einheit ein Metallchelat darstellt, das eine Bindungsreaktion mit dem interessierenden Analyten oder mit (B)(i), (B)(ii) oder (B)(iii) eingehen kann.
Erfindungsgemäß wird außerdem die Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel
in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R¹ CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strahlung in einem System zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten in einer Probe mittels Elektrochemilumineszenz bereitsgestellt, umfassend:
(A) eine Probe,
(B) eine Substanz, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus:
(i) einen weiteren interessierenden Analyten oder ein Analogon des interessierenden Analyten,
(ii) einen Bindungspartner für den interessierenden Analyten oder dessen Analogon und
(iii) eine reaktive Komponente, die (i) oder (ii) binden kann,
wobei eine der Substanzen direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an eine metallhaltige ECL-Einheit gebunden ist, die in eine angeregten Zustand überführt werden kann, aus dem bei Exposition der ECL-Einheit an Bedingungen, welche zur Induktion der Emission ausreichend sind, elektrochemische Strahlung emittiert wird,
(C) eine Spezies, die in ein starkes Reduktionsmittel umgewandelt werden kann, und einen Elektrolyten,
(D) Mittel zur Induktion der Emission elektromagnetischer Strahlung bei der ECL-Einheit und
(E) Mittel zum Messen der von der Zubereitung emittierten Strahlung, um die Anwesenheit oder die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen.
Die "ECL-Einheit" oder die "metallhaltige ECL-Einheit" wird manchmal auch als "Marker", "Markerverbindung", Markersubstanz" usw. angesprochen. Es liegt im Schutzbereich der Erfindung, daß die "ECL-Einheit", die "metallhaltige ECL-Einheit", das "Organometall", das "Metallchelat", das "Übergangsmetallchelat" und das "Seltenerdmetallchelat" - wenn in bestimmten erfindungsgemäßen Zubereitungen, Reagenzien, Kits, Verfahren oder Systemen als Ausführungsformen verwendet werden - an andere Moleküle wie einen Analyten oder dessen Analogon, einen Bindungspartner des Analyten oder dessen Analogon, weitere Bindungspartner des oben genannten Bindungspartners, eine reaktive Komponente, die an den Analyten binden kann, ein Analogon desselben oder einen Bindungspartner wie oben erwähnt gebunden vorliegt. Die oben angesprochene Spezies kann auch an eine Kombination aus einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einem oder mehreren reaktiven Komponenten gebunden sein. Weiterhin kann die zuvorgenannte Spezies auch an Analyten oder dessen Analogon gebunden sein, der an einen Bindungspartner, eine reaktive komponente oder eine Komination aus einem oder mehreren bindungspartnern und/oder einer oder mehreren reaktiven Komponenten gebunden ist. Ebenfalls von der Erfindung umfaßt ist, daß eine Vielzahl der oben genannten Spezies direkt oder über andere Moleküle, wie angesprochen, an einen Analyten oder dessen Analogon gebunden ist.
Gleichermaßen ist erfindungsgemäß umfaßt, daß die obige "Zubereitung" (im folgenden manchmal als "ECL-Zubereitung" bezeichnet) oder das "System" instabile, metastabile oder andere intermediäre Spezies enthält, die im Verlauf der ECL-Reaktion gebildet werden, wie eine ECL-Einheit im oben genannten, angeregten Zustand und das bereits erwähnte starke Reduktionsmittel.
Obwohl die Emission sichtbaren Lichts ein vorteilhaftes Merkmal bestimmter Ausführungsformen der Erfindung ist, liegt es ebenfalls im Bereich der Erfindung, daß die Zubereitung (oder ECL-Zubereitung) andere Arten elektromagnetischer Strahlung emittiert wie Infrarot- oder UV-Licht, Röntgenstrahlen, Mikrowellen usw.. Die Verwendung der Ausdrücke "Elektrochemilumineszenz", "elektrochemilumineszent", "elektrochemilumineszierend", "Lumineszenz", "lumineszent", "lumineszierend" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erfordert nicht die Lichtemission, sondern erlaubt Emissionen solch anderen Formen elektromagnetischer Strahlung.
Wesentliche Vorteile werden dem Ausführenden der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäßen Materialien und Verfahren stellen eine elegante Technologie zum Nachweis und zur Quantifizierung bis hinab zu sehr geringen Analytkonzentrationen eines interessierenden Analyten über einen weiten Konzentrationsbereich in wäßrigen wie auch in organischen Umgebungen zur Verfügung. Gute Präzision und Reproduzierbarkeit der Nachweise und Quantifizierungen werden erhalten. Kleinere Konzentrationen als anders mit herkömmlichen Systemen nachweisbar lassen sich erfassen. Umgekehrt wird mit der Erfindung, wenn die anderen Umstände gleich bleiben, weniger der metallhaltigen ECL-Einheit zum Nachweis einer Analytenprobe einer bestimmten (insbesondere kleinen) Konzentration benötigt, als dies mit der früheren Technologie erforderlich wäre. Somit läßt sich durch die vorliegende Erfindung eine verbesserte Nachweisgrenze realisieren.
Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung für den Nachweis und die Quantifizierung von zahlreichen und stark unterschiedlicher interessierender Analyten geeignet, wie in der weiteren Beschreibung, die folgt, diskutiert wird.
Die Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung ist auch aus der Tatsache ersichtlich, daß sie nicht nur zur Ausführung hetergoner Tests, sondern auch homogener Tests geeignet ist. In diesem Zusammenhang sind heterogene Tests solche, in denen die direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an den interessierenden Analytn oder dessen Analogon gebundene ECL-Einheit von nicht an den Analyten oder sein Analogon gebundenen ECL-Einheiten abgetrennt wird, bevor diese ECL-Einheit der elektrochemischen Energie ausgesetzt wird. Im Gegensatz dazu sind homogene Tests die, bei denen keine Trennung vor der gemeinsamen Exposition der Materialien an die elektrochemische Energie stattfindet. In der homogenen erfindungsgemäßen Tests unterscheidet sich die bei Bindung der ECL-Einheit an den Analyten oder sein Analogon emittierte elektrochemische Strahlung von derjenigen ohne Bindung der ECL- Einheit an den Analyten oder dessen Analogon. Dies läßt sich erreichen, indem man beispielsweise eine gesteigerte oder verringerte Emission mißt, die der Anwesenheit der an den Analyten oder dessen Analogon gebundenen ECL-Einheit entspricht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Zelle, die für die erfindungsgemäße Induktion der Emission elektrochemischer Strahlung geeignet ist.
Fig.2 ist ein vereinfachtes Diagramm einer Vorrichtung zum Steuern der Spannung, die mit der in Fig. 1 dargestellten Zelle verwendet werden kann.
Fig.3 ist eine Auftragung der ECL-Intensität (Zählrate) gegen die Konzentration (nM) von TAG (Tris-2,2'-bispyridyl)rutheniumchloridhexahydrat).
Fig.4 zeigt graphisch die Ergebnisse eines homogenen ECL-Tests auf Theophyllin.
Fig.5 zeigt graphisch die Ergebnisse eines homogenen Theophyllintests in verschiedenen Seren.
= normales Serum
o = hämolysiertes Serum
= lipämisches Serum
= icterisches Serum
Fig.6 zeigt graphisch die Ergebnisse eines ECL-Theophyllintests im Vergleich zu den Ergebnissen eines Fluoreszenzpolarisationstests auf Theophyllin.
A. normales Serum: n = 4; Steigung = 0,986; r = 1.00
B. hämolysiertes Serum: n = 3; Steigung = 0,878; r = 1.00
C. lipämisches Serum: n = 5; Steigung = 0,872; r = 0,99
D. icterisches Serum: n = 4; Steigung = 2,14; r = 1,00
Fig.7 zeigt graphisch die Ergebnisse eines ECL-Digoxintests.
= Vergleich
= Digoxin

Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen

Die Erfindung sowie auch weitere Aufgaben, Merkmale und Vorzüge derselben lassen sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen besser verstehen.
Die Erfindung ist geeignet, den Nachweis und die Quantifizierung von metallhaltigen Verbindungen wie Metallchelaten und anderer interessierender Analyten, die eine Bindungsreaktion eingehen können, zu ermöglichen. Derartige Bindungsreaktionen schließen beispielsweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, Ligand-Rezeptor-Bindungen, DNS-RNS-Wechselwirkungen und andere bekannte Reaktionen ein. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung verschiedene Materialien und Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis der Anwesenheit eines interessierenden Analyten in einer Mehrkomponentenprobe.
Zusätzlich zu den metallhaltigen ECL-Einheiten handelt es sich bei typischen interessierenden Analyten um eine ganze Zelle oder ein Oberflächeantigen, subzelluläre Partikel, ein Virus, ein Prion, ein Viroid, einen Antikörper, ein Antigen, ein Hapten, eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Polysaccharid, ein Lipopolysacchand, ein Glykoprotein, ein Peptid, ein Polypeptid, einen Zellmetaboliten, ein Hormon, einen pharmakologischen Wirkstoff, ein abiologisches Polymer (vorzugsweise löslich), ein synthetisches organisches Molekül, ein organometallisches Molekül, einen Tranquilizer, ein Barbiturat, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, einen Zucker, Lectin, ein rekombinantes Protein oder ein Proteinderivat, Biotin, Avidin, Streptavidin oder ein anorganisches Molekül, die in der Lösung vorliegen. Gemäß einer Ausführungsform ist die ECL-Einheit an einen Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäure, ein Happten, eine kurze Nukleotidsequenz, ein Oligomer, einen Liganden, ein Enzym oder Biotin, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G oder deren Komplexe oder einen anderen sekundären Bindungspartner konjugiert, der über Proteinwechselwirkungen an einen primären Bindungspartner binden kann.
Bei den ganzen Zellen kann es sich um tierische, pflanzliche oder Bakterienzellen handeln; diese können lebendig oder tot sein. Beispiele schließen Pflanzenpathogene wie Pilze und Nematoden ein. Der Ausdruck "subzelluläre Partikel" soll beispielsweise subzelluläre Organellen, Membranteilchen wie aufgebrochene Zellen, Fragmente oder Zellwände, Ribosomen, Multienzymkomplexe und andere Partikel umfassen, die sich von von lebenden Organismen ableiten lassen. Die Nukleinsäuren schließen beispielsweise chromosomale DNS, Plasmid-DNS, virale DNS und aus verschiedenen Quellen stammende rekombinante DNS ein. Die Nukleinsäuren umfassen auch RNS, beispielsweise Boten-RNS (mRNS), ribosomale RNS (rRNS) und Transfer-RNS (tRNS). Die Polypeptide schließen zum Beispiel Enzyme, Transportproteine, Rezeptorproteine und Strukturproteine wie virale Hüllproteine ein. Bevorzugte Polypeptide sind Enzyme und Antikörper. Besonders bevorzugte Polypeptide sind monoklonale Antikörper. Die Hormone umfassen beispielsweise Insulin und das T4-Thyroidhormon ein. Die pharmazeutischen Wirkstoffe umfassen beispielsweise Herzglykoside. Es liegt selbstverständlich im Rahmen der Erfindung, daß synthetische Substanzen, die chemisch biologischen Materialien ähneln wie synthetische Polypeptide, synthetische Nukleinsäuren und synthetische Membranen, Vesikel und Liposomen umfaßt sind. Die obige Aufzählung soll keine abschließende Liste der für die erfindungsgemäß verwendbaren biologischen Substanzen darstellen, sondern soll lediglich den weiten Rahmen der Erfindung veranschaulichen.
Weiterhin liegt der interessierende Analyt typischerweise in Konzentrationen von 10&supmin;³ Molar oder darunter, beispielsweise mindestens so niedrigen Konzentrationen wie 10&supmin;¹&sup8; Molar vor.
Die möglicherweise den interessierenden Analyten enthaltende Probe kann in fester Form, als Emulsion, Suspension, Flüssigkeit oder Gas vorliegen und kann beispielsweise von Zellen und aus Zellen stammenden Produkten, Wasser, Nahrungsmitteln, Blut, Serum, Haar, Schweiß, Urin, Kot, Gewebe, Speichel, Ölen, organischen Lösungsmitteln oder Luft abgeleitet werden. Die Probe kann weiterhin beispielsweise Wasser, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon oder Alkohole enthalten.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die Verwendung von metallhaltigen ECL-Einheiten. Vorzugsweise läßt sich die ECL-Einheit regenerieren, so daß die Emission elektromagnetischer Strahlung wiederholt induziert werden kann, d.h. daß mehrere Emissionsereignisse pro Molekül auftreten. Dies bedeutet einen bestimmten Vorteil über herkömmliche Ausführungungsformen, in denen kein "Marker" vorhanden ist, der mehr als ein Emissionsereignis pro Molekül hervorbringt. (Achtung: es ist im Rahmen der Erfindung, weitere Marker wie radioaktive Isotope, chemilumineszente Moleküle wie Luminol etc. zu verwenden).
Die erfindungsgemäß verwendeten ECL-Einheiten umfassen organometallische Verbindungen, die in Folge elektrochemischer Stimulation gemäß der Erfindung elektromagnetische Strahlung wie sichtbares Licht emittieren. Beispiele hierfür sind 4,4',5',5- Tetramethylbipyridin-Re(I)(4-ethylpyridin)(CO&sub3;) + CF&sub3;SO&sub3;&supmin; und Pt(2-(2-thienyl)pyridin)&sub2;.
Vorzugsweise ist die metallhaltige ECL-Einheit ein Metallchelat. Das Metall des Chelats ist so gewählt, daß das Chelat elektrochemische Strahlung wie sichtbares Licht in Folge elektrochemischer Stimulation gemäß der Erfindung emittiert. Das Metall eines solchen Metallchelats ist zum Beispiel ein Übergangsmetall (wie ein Übergangsmetall aus dem d-Block des Periodensystems) oder eine seltene Erde. Vorzugsweise ist das Metall Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium, Palladium, Molybdän, Technetium, Kupfer, Chrom oder Wolfram oder auch Lanthan, Neodym, Praseodym oder Samarium. Besonders bevorzugte Metalle sind Ruthenium und Osmium.
Die an das Metall in solchen Chelaten gebundenen Liganden sind üblicherweise heterocyclischer oder organischer Natur und sie spielen eine Rolle bei der Bestimmung der Emissionswellenlänge des Metallchelats sowie ob das Metallchelat in einer wäßrigen Umgebung oder in einer organischen oder anderen nichtwäßrigen Umgebung löslich ist oder nicht. Die Liganden können mehrzähnig sein und Substituenten haben. Geeignete mehrzähnige Liganden schließen aromatische und aliphatische Liganden ein. Solche mehrzähnigen aromatischen Liganden umfassen aromatische heterocyclische Liganden. Bevorzugte aromatische mehrzähnige Liganden sind stickstoffhaltig wie beispielsweise Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl und Phenanthrolyl. Geeignete Substituenten schließen beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxyl, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidinium, Ureid, schwefelhaltige Gruppen, phosphorhaltige Gruppen und die Carboxy latester des N-Hydroxysuccinimids ein. Das Chelat kann einen oder mehrere einzähnige Liganden aufweisen, von denen eine Vielzahl dem Fachmann bekannt ist. Geeignete einzähnige Liganden schließen zum Beispiel Kohlenmonoxid, Cyanide, Isocyanide, Halide und aliphatische, aromatische und heterocyclische Phosphine, Amine, Stilbene und Arsine ein.
Beispiele geeigneter Chelate sind bis[(4,4'-Carbomethoxy)-2,2'-bipyridin] 2-[3-(4- methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium (II); bis(2,2'-Bipyridin)-4- (butan-1-al)-4-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium (II); bis(2,2'-Bipyridin)-4-(4-methyl- 2,2'-bipyridin-4'-yl)-buttersäure]-ruthenium (II); (2,2'-Bipyridin)[bis-bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen]-2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolanosmium(II); bis-(2,2'-Bipyridin)-[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin)-butylamin]-ruthenium (II); bis-(2,2'- Bipyridin)-[1-brom-4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan]-ruthenium(II) und bis-(2,2'- Bipyridin)maleimidohexansäure, 4-Methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamidruthenium (II).
Die erfindungsgemäße Funktion der metallhaltigen ECL-Einheit besteht in der Emission elektromagnetischer Strahlung in Folge der Einführung elektrochemischer Energie in das Reaktionssystem. Um dies zu tun, muß sich die metallhaltige ECL- Einheit in einen angeregten Energiezustand überführen lassen und muß außerdem beim Zurückfallen aus diesem angeregten Zustand elektromagnetische Strahlung wie ein Lichtphoton emittieren können. Ohne durch die theoretische Analyse des Mechanismus' der Beteiligung der metallhaltigen ECL-Einheit festgelegt werden zu wollen, nehmen wir an, daß die ECL-Einheit durch die Einführung elektrochemischer Energie in das Reaktionssytem oxidiert wird und anschließend durch Wechselwirkung mit dem Reduktionsmittel, das von einer Spezies, die ein starkes Reduktionsmittel bilden kann, abgeleitet ist, in den angeregten Zustand überführt wird. Dieser Zustand ist relativ instabil und die metallhaltige ECL-Einheit fällt schnell auf einen stabileren Zustand zurück. Dabei gibt sie elektromagnetische Strahlung wie ein Lichtphoton ab.
Im Testbetrieb ist die ECL-Einheit üblicherweise direkt oder über ein oder mehrere anderer Moleküle an. den interessierenden Analyten oder dessen Analogon gebunden. Analoga des interessierenden Analyten, die natürlich oder synthetisch sein können, sind üblicherweise Verbindungen mit dem Analyten vergleichbaren Bindungseigenschaften; sie können jedoch auch Verbindungen mit höherer oder niedrigerer Bindungsfähigkeit darstellen. Wird die metallhaltige ECL-Einheit über ein oder mehrere andere Moleküle an den Analyten oder dessen Analogon gebunden, stellen diese geeigneterweise eine Kombination von einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einer oder mehrerer reaktiver Komponenten dar. Zur Verwendung gemäß der Erfindung geeignete Bindungspartner sind bekannt. Beispiele sind Antikörper, Enzyme, Nukleinsäuren Cofaktoren und Rezeptoren. Die reaktiven Komponenten, die an den Analyten oder dessen Analogon undl oder einen Bindungspartner binden können, sind passenderweise ein zweiter Antikörper oder ein Protein wie Protein A oder Protein G oder Avidin oder Biotin oder eine andere Komponente, die bekanntermaßen Bindungsreaktionen eingehen kann.
Die erfindungsgemäß eingebrachte Menge an Metalichelat oder anderer metallhaltiger ECL-Einheit unterscheidet sich von System zu System. Im allgemeinen entspricht die verwendete Menge derjenigen Menge, die wirksam zur Emission einer nachweisbaren und, falls gewünscht, quantifizierbaren Menge elektromagnetischer Strahlung aus der oben genannten Zubereitung führt. Der Nachweis und/oder die Quantifizierung des interessierenden Analyten erfolgt typischerweise über den Vergleich (i) der Menge oder Wellenlänge der von der ECL-Zubereitung emittierten Strahlung mit (ii) Daten, die die bei bekannter Konzentration des interessierenden Analyten emittierte elektromagnetischer Strahlung wie in Form einer Kalibrationskurve anzeigen. Dieses setzt selbstverständlich ein homogenes Format voraus. Im heterogenen Modus wird, wie diskutiert, vor der ECL-Analyse eine Trennung durchgeführt.
Wie dem Durchschnittsfachmann ersichtlich, wird sich die Art und Menge an metallhaltiger ECL-Einheit von einem System zum anderen unterscheiden, je nach den vorherrschenden Bedingungen. Die passende metallhaltige ECL-Einheit sowie die zum Erzielen des gewünschten Ergebnisse erforderliche Menge derselben kann vom Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren empirisch bestimmt werden, hat er erst von der hier beschriebenen Lehre Kenntnis erlangt.
Gemäß einer spezifischeren Ausführungsform enthält eine erfindungsgemäße Zubereitung zwei oder mehr verschiedene ECL-Einheiten. Jede der ECL-Einheiten kann zur Emission von elektromagnetischer Strahlung einer Wellenlänge angeregt werden, die sich von der oder den anderen Einheiten unterscheidet. Bei einer anderen Ausführungsform können die ECL-Einheiten Spezies darstellen, die bei Exposition an Energiewerte zur Emission elektromagnetischer Strahlung induziert werden, die sich von den Energiewerten unterscheiden, bei denen die andere(n) Einheit(en) Strahlung emittieren. Auf diese Weise ist es möglich, zwei oder mehr verschiedene interessierende Analyten zu bestimmen, die ggf. in der zu untersuchenden Probe vorhanden sind.
Ein weiteres wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Spezies, die sich oxidieren läßt, um in eine stark reduzierende Spezies überführt zu werden. Nochmals, ohne durch theoretische Erklärungen des Reaktionsmechanismus' gebunden werden zu wollen, wird angenommen, daß diese Spezies wie eine Carbonsäure von der im Reaktionssystem vorliegenden, oxidierten metallhaltigen ECL- Einheit (oder einer anderen oxidierten Substanz) oder durch die elektrochemische Energie oxidiert wird. Handelt es sich zur Veranschaulichung bei der Spezies um Oxalat, verliert dieses ein Elektron und zerfällt dann in CO&sub2; und das Radikalion CO&sub2;&supmin;, wobei das letztere ein starkes Reduktionsmittel darstellt. Dieses Mittel interagiert mit der oxidierten metallhaltigen ECL-Einheit und veranlaßt diese, in den oben besprochenen angeregten Zustand überzugehen. Das aus dieser Spezies abgeleitete Reduktionsmittel stellt so den notwendigen Stimulus zur Überführung der oxidierten metallhaltigen ECL-Einheit in ihren angeregten Zustand dar, aus dem die elektromagnetische Strahlung emittiert wird.
Typische Beispiele für bei der Ausführung der Erfindung verwendbare Spezies sind Carbonsäuren Im allgemeinen sollte die Spezies mit der Umgebung, in der sie während der Analyse funktionieren soll, kompatibel sein, d.h. sie muß jeweils mit einer wäßrigen bzw. einer nichtwäßrigen Umgebung kompatibel sein. Eine weitere Betrachtung geht dahin, daß die gewählte Spezies ein Reduktionsmittel bilden muß, welches unter den herrschenden Bedingungen stark genug ist, die oxidierte metallhaltige ECL-Einheit im System zu reduzieren, was zur Bildung des angeregte Zustands führt.
Vorteihafterweise erfindungsgemäß verwendete Carbonsäuren sind solche der Formel
R--CO--OM,
in der R CnH2n+1, CnH2n+1-yXy, R¹COOH, R²CO oder
ist, wobei X Chlor, Brom, Fluor oder Jod bedeutet, R¹ CnH2n oder CHOH, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; Wasserstoff, CnH2n+1, Phenyl oder substituiertes Phenyl sind, wobei R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; alle gleich sind oder auch nicht alle gleich sind, n 0 bis 20 und y 0 bis 2n ist. Spezifisch kann n 2 bis 10 und noch spezifischer 4 bis 6 sein.
Spezielle Beispiele geeigneter Carbonsäuren sind Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zitronensäure. Milchsäure, Brenztraubensäure und Säuren der folgenden Formeln (wobei das Phenyl wahlweise substituiert ist):
worin R&sup6; H, CH&sub3; oder Phenyl ist. Oxalsäure ("Oxalat") ist besonders bevorzugt.
Zur Umsetzung bestimmter Ausführungsformen der Erfindung in die Praxis sind Ester der oben genannten Säuren ebenfalls geeignet.
Die erfindungsgemäß ein starkes Reduktionsmittel bildenden Spezies arbeiten geeigneterweise gut bei einem pH im Bereich vom 1 bis 7, in einigen Ausführungen bei einem pH im Bereich von 2 - 6 und bei bestimmten Ausführungsformen bei einem pH im Bereich von 3 - 6. Oxalsäure gibt die besten Ergebnisse bei einem pH von 3 - 5.
Typischerweise ist die in der Erfindung verwendete metallhaltige ECL-Einheit der die Reaktion limitierende Bestandteil. Dementsprechend ist es auch typisch, daß die das starke Reduktionsmittel bildende Spezies in bezug auf die ECL-Einheit in stöchiometrischem Überschuß bereitgestellt wird. Zur Veranschaulichung wird diese Spezies in Konzentrationen von 5 - 200 mM, spezifischer 5 - 50 mM und noch spezieller 25 - 40 mM verwendet. Im allgemeinen entspricht die verwendete Menge der ein starkes Reduktionsmittel bildenden Spezies derjenigen, die ausreicht, die Umwandlung der oxidierten metallhaltigen ECL-Einheit in ihren angeregten Zustand zu bewirken, so daß die Emission elektromagnetischer Strahlung auftritt.
In Kenntnis der hier beschriebenen Lehre kann der Fachmann die Identität und/oder Menge der Spezies, die vorteilhafterweise für das spezielle zu untersuchende System verwendet wird, ohne übermäßiges Experimentieren empirisch bestimmen.
Bei der Verbindung, in deren Gegenwart die emittierte elektromagnetische Strahlung vergrößert wird, handelt es sich typischerweise um eine Verbindung der Formel:
in der R Wasserstoff oder CnH2n+1, R' CnH2n, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist. Vorzugsweise ist n von 1 bis 4. Spezielle Beispiele hierfür sind eine im Handel unter der Bezeichnung Triton X-100 erhältliche Substanz der Formel:
in der x 9 - 10 ist, sowie eine im Handel unter der Bezeichnung Triton N-401 (NPE-40) erhältliche Substanz der Formel:
in der X 40 ist. Die Substanz wird im allgemeinen in ausreichender Menge eingesetzt, damit in ihrer Anwesenheit die gewünschte Steigerung der Strahlungsemission auftritt. Typischerweise beträgt die Menge 0,01 bis 5,0 %, genauer 0,1 bis 1,0 % (Vol/Vol).
Wie oben angemerkt, wird bei der erfindungsgemäß eingearbeiteten ECL-Einheit die Emission elektromagnetischer Strahlung induziert, indem man in ihr einen angeregten Zustand stimuliert. Dies wird durch Exposition der Zubereitung, in die die ECL- Einheit eingearbeitet wurde, an elektrochemische Energie erreicht. Das Potential, bei dem die Oxidation der ECL-Einheit abläuft, hängt von deren chemischer Struktur ab, wie auch von Faktoren wie dem pH des Systems und der zur Einführung der elektrochemischen Energie verwendeten Elektrode. Dem Fachmann ist bekannt, wie das optimale Potential und die Lösungsbedingungen für ein ECL-System zu bestimmen sind.
Um in einem System zu arbeiten, in dem eine Elektrode elektrocliemische Energie einführt, ist es selbstredend notwendig, einen Elektrolyten bereitszustellen, in den die Elektrode eingetaucht wird und in dem die ECL Einheit die Spezies, von der das Reduktionsmittel abgeleitet wird, und die Substanz, in deren Anwesenheit die emittierte Strahlung verstärkt wird, enthalten sind. Bei dem Elektrolyten handelt es sich um eine Phase, durch die Ladung mit Hilfe von Ionen transportiert wird.
Im allgemeinen liegt der Elektrolyt in flüssiger Phase vor und stellt eine Lösung von einem oder mehreren Salzen oder anderer Spezies in Wasser, einer organischen Flüssigkeit oder in einer Mischung aus Wasser und einer organischen Flüssigkeit dar. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind jedoch auch andere Elektrolytformen geeignet. Beispielsweise kann der Elektrolyt eine Dispersion einer oder mehrerer Substanzen in einem Fluid - z.B. einer Flüssigkeit, einem Dampf oder einem superkritischen Fluid - oder eine Lösung einer oder mehrerer Substanzen in Dampf, einem Feststoff oder einem superkritischen Fluid sein.
Bei dem oben genannten superkritischen Fluid handelt es sich um ein dichtes Gas, das über seiner kritischen Temperatur gehalten wird, d.h. der Temperatur, über der es bei keinem Druck verflüssigt werden kann. Superkritische Fluide sind weniger viskos und diffundieren leichter als Flüssigkeiten. Beispiele für bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendbare superkritische Fluide sind Kohlendioxid und bestimmte Alkane wie Methan, Ethan und Propan. Die Bedingungen, unter denen superkritisches Verhalten auftritt, sind bekannt (vgl. z.B. die US-A-4 582 731, erteilt an Smith am 15 April 1986). Die Verwendung von superkritschen Fluiden kann von Vorteil sein, beispielsweise läßt sich in bestimmten Ausführungsformen die Löslichkeit verschiedener interessierender Analyten in superkritischen Fluiden erhöhen. Außerdem läßt sich die Löslichkeit der ECL-Einheit sowie der Spezies, aus der das starke Reduktionsmittel abgeleitet wird, in einigen Ausführungsformen in einem superkritischen Fluid leichter steuern. Darüber hinaus kann in einigen Fällen die Empfindlichkeit aufgrund des höheren Diffusionskoeffizienten verschiedener Spezies in diesen Fluiden verbessert werden.
Im Falle wäßriger erfindungsgemäßer Zubereitungen ist der Elektrolyt wäßrig, d.h. eine Lösung eines Salzes in Wasser. Das Salz kann vorzugsweise ein Natrium- oder Kaliumsalz sein, in bestimmten Ausführungsformen ist jedoch auch die Einarbeitung anderer Kationen geeignet, solange dieses Kation die ECL-Wechselwirkungssequenz nicht beeinflußt. Bei dem Salzanion kann es sich beispielsweise um ein Phosphat handeln, doch die Verwendung anderer Anionen ist in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ebenfalls gestattet, wiederum, solange das gewählte Anion die ECL- Wechselwirkungssequenz nicht beeinflußt.
Die Zubereitungen können auch nichtwäßrig sein. Während in einigen Fällen superkritische Fluide, Dämpfe und Feststoffe verwendet werden können, ist die Verwendung von Elektrolyten weit typischer, die eine organische Flüssigkeit in einer nichtwäßrigen Zubereitung enthalten. Wie bei den wäßrigen Elektrolyten stellt auch der nichtwäßrige Elektrolyt eine Phase dar, durch die Ladung mit Hilfe von Ionen transportiert wird. Normaler Weise bedeutet dies, daß ein Salz im flüssigen organischem Medium gelöst wird. Beispiele geeigneter organischer Flüssigkeiten sind Acetonitril, Toluol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Methanol, Etlianol und Gemische von zwei oder mehr der obigen. Zur Veranschaulichung sind Tetraalkylammoniumsalze wie Tetrabutylammoniumtetrafluorborat in organischen Flüssigkeiten löslich und können mit diesen zum Bilden nichtwäßriger Elektrolyte verwendet werden.
Der Elektrolyt ist in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ein gepuffertes System. Phosphatpuffer sind häufig von Vorteil. Beispiele sind eine wäßrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumchlorid und eine wäßrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumfluorid.
Die Formulierung von Elektrolyten, einschließlich eines Puffersystems, sowie die Bestimmung zur Verwendung bei der Ausführung der Erfindung geeigneter Elektrolytmengen liegt im Können des Fachmanns, sobald der Praktiker mit der hiesigen Lehre bekannt gemacht wurde.
Die Verwendung der genannten Materialien in der vorliegenden Erfindung versetzt den Praktiker in die Lage, die Emission elektrochemischer Strahlung aus einer ECL- Zubereitung gemäß den Verfahren der Ausführungsformen der Erfindung zu induzieren.
Der ECL-Test erfolgt, indem man eine oder mehrere ECL-Einheiten, ein oder mehrere Spezies, aus denen ein starkes Reduktionsmittel abgeleitet wird, eine oder mehrere Substanzen, in deren Anwesenheit die emittierte Strahlung verstärkt wird, und einen passenden Elektrolyten miteinander kombiniert, um eine Zubereitung zu bilden, in die elektrochemische Energie mit der Folge eingeführt werden kann, daß elektromagnetische Strahlung emittiert wird. Die Zubereitung wird einer wirksamen Menge elektrochemischer Energie unterworfen, um in der Zubereitung die Emission elektromagnetischer Strahlung zu induzieren.
Damit, daß in der Zubereitung die Emission elektromagnetischer Strahlung induziert wird, meinen wir, daß ein angeregter Zustand der ECL-Einheit in der Zubereitung erzeugt wird, wobei diese angeregte ECL-Einheit elektromagnetische Strahlung abgibt - beispielsweise Lumineszenz bei Wellenlängen von etwa 200 nm bis etwa 900 nm bei Raumtemperatur. Dieser angeregte Zustand wird durch Oxidation der ECL-Einheit erzielt. Wie zuvor angemerkt, hängt das Potential, bei dem die Oxidation der ECL- Einheit abläuft, von deren chemischer Struktur sowie anderen Faktoren wie dem pH der Zubereitung und die Art der verwendeten Elektrode ab. Ist die ECL-Einheit einmal angeregt, emittiert sie bei Wechselwirkung mit dem starken Reduktionsmittel, wie oben diskutiert, elektromagnetische Strahlung. Die Bestimmung des optimalen Potentials und der Emissionswellenlänge für eine ECL-Zubereitung liegt im Können des Fachmanns, sobald er die hiesige Lehre kennt. Die beim Zurückfallen aus dem angeregten Zustand emittierte Menge an elektromagnetischer Strahlung kann direkt als Indikator für die vorliegende Menge an interessierendem Analyten gemessen werden. Alternativ dazu kann die beim Zurückfallen der ECL-Einheit aus dem angeregten Zustand emittierte elektromagnetische Strahlung zum Auslösen eines nachweisbaren Ereignisses (oder eines Schrittes in einer Folge von Schritten, die in einem nachweisbaren Ereignis kulminiert) verwendet werden, das dann anstelle der von der ECL-Einheit emittierten Strahlung selbst gemssen wird.
Die von der ECL-Zubereitung emittierte Strahlung wird unter Einsatz geeigneter Mittel nachgewiesen, um die qualitative oder quantitative Bestimmung des interessierenden Analyten zu ermöglichen.
Diese Bestimmung kann entweder als kontinuierliche, auf eine Rate bezogene Messung oder als Akkumulation des ECL-Signals über eine längere Zeitspanne hinweg erfolgen. Beispielsweise werden Raten-bezogene Messungen mit Photomultiplierröhren, Photodioden oder Phototransistoren, um elektrische Ströme zu erzeugen, die in ihrer Größe der einfallenden Lichtintensität proportional sind, oder mittels ladungsgekoppelter Bauteile durchgeführt, wobei Beispiele für kumulative Methoden die Integration der Raten-bezogenen Daten und die Verwendung eines Photofilms, um direkt kumulative Daten bereitzustellen, sind.
Die Zubereitung wird so formuliert, daß der gewünschte pH, die Konzentration der ECL-Einheit, die Konzentration der Spezies, aus der das starke Reduktionsmittel abgeleitet wird, die Konzentration der Substanz, in deren Anwesenheit die Emission elektromagnetischer Strahlung verstärkt wird, und Elektrolyt erhalten werden. In diesem Zusammenhang sind die metallhaltigen ECL-Einheiten, die Spezies, aus der das starke Reduktionsmittel abgeleitet wird, die Substanzen und Elektrolyten sowie geeignete und bevorzugte Mengen und Konzentrationen derselben, wie an anderer Stelle hierin beschrieben.
Die Zubereitung kann durch Kombinieren der einzelnen Bestandteile hergestellt werden. Es ist jedoch häufig vorteilhafter, ein oder mehrere Reagenzien zu verwenden, die eine Kombination verschiedener Substanzen enthalten, aus denen die Zubereitung hergestellt wird. Diese Maßnahme erleichtert das Halten der Einheitlichkeit in den erfindungsgemäß formulierten Zubereitungen, was zur in der Ausführung der Erfindung erzielten Verläßlichkeit und Wiederholbarkeit beiträgt.
Dementsprechend kann ein zum Formulieren der Zubereitung geeignetes Reagenz die Substanz, in deren Anwesenheit die emittierte Strahlung verstärkt wird, in Kombination mit jedem einzelnen oder mehreren aus ECL-Einheit, der das Reduktionsmittel bildenden Spezies und Elektrolyt enthalten. Welches Reagenz auch immer gewählt wird, so kann dies mit den restlichen, zur Formulierung der Zubereitung notwendigen Bestandteilen kombiniert werden. Einer oder mehrere dieser Bestandteile können auch in einem weiteren Reagenz enthalten sein. Beispielsweise kann das die Substanz, die ECL-Einheit und den Elektrolyten in Kombination enthaltende Reagenz mit einem anderen Reagenz gemischt werden, das die Substanz, die das Reduktions-mittel bildende Spezies und Elektrolyten in Kombination enthält, um die gewünschte Zubereitung zu erhalten.
Die Herstellung wird geeigneter Weise unter Verwendung eines Kits, der ein oder mehrere Reagenzkomponenten enthält, die für den Schritt des Formulierens erforderlich sind, durchgeführt. Dementsprechend enthält der Kit insgesamt (i) eine metallhaltige ECL-Einheit, (ii) das eine Reduktionsmittel bildende Spezies, (iii) einen Elektrolyten und (iv) eine Substanz, in deren Anwesenheit die emittierte Strahlung verstärkt wird (alle wie oben beschrieben). Ein attraktiver Aspekt der Verpackung der zur Formulierung der Zubereitung verwendeten Bestandteile als Kit ist, daß standardisierte Bestandteile, die der Bequemlichkeit halber in Form eines oder mehrerer Reagenzien bereitgestellt werden, verwendet werden können, um die Verläßlichkeit und die Wiederholbarkeit der Ausführung der Erfindung zu verbessern. Die Verwendung von Reagenzien und anderen Materialien in Form eines Kits ist außerdem vorteilhaft, weil die Möglichkeit des Verfalls der Bestandteile vor der Verwendung minimiert wird, da die verwendeten Kitformate so strukturiert werden können, daß Kombinationen vermieden werden, in denen ein Verfall auftreten könnte.
Demnach kann die Zubereitung aus einem Kit formuliert werden, in dem beliebige zwei oder drei Elemente der aus der metallhaltigen ECL-Einheit, der das Reduktionsmittel bildenden Spezies, dem Elektrolyten und der Substanz bestehenden Gruppe in einer ersten separaten Komponente enthalten sein können, während das (die) verbleibende(n) Element(e) der Gruppe in einer zweiten separaten Komponente oder einer Vielzahl verschiedener Komponenten enthalten ist (sind). (Die Komponente(n) des Kits hält man typischerweise getrennt, indem man sie zur Vermeidung von Kreuzverunreinigungen vor der Kombination jeweils in eigenen Gefäßen einschließt.) Eine Alternative ist ein Kit, der eine erste separate Komponente, die beliebige zwei oder drei Elemente der obigen Gruppe enthält, sowie eine zweite separate Komponente aufweist, welche das (die) verbleibende(n) Element(e) und ein oder mehrere in der ersten Gruppe enthaltene(s) Element(e) enthält. Eine weitere Alternative ist ein Kit, der vier separate Komponenten aufweist, die jeweils ein anderes der obigen Gruppenelemente enthalten.
In noch einem anderen Format kann der Kit eine erste separate Komponente aufweisen, die alle vier Elemente der Gruppe umfaßt, und eine zweite Komponente, die ein beliebigers oder zwei oder drei beliebige Elemente der Gruppe umfaßt, wobei der Kit ggf. eine zweite, eines der vier Gruppenelemnet umfassende Komponente sowie zusätzlich eine dritte separate Komponente, die ein, zwei oder drei (vorzugsweise zwei) Gruppenelemente umfaßt, und eine vierte, ein oder zwei Gruppenelemente umfassende separate Komponente aufweist.
Genauer umfaßt in einer vorteilhaften Ausführungsform die erste separate Komponente eines Kits die metallhaltige ECL-Einheit und die zweite separate Komponente die das Reduktionsmittel bildende Spezies, den Elektrolyten und die Substanz, in deren Anwesenheit die emittierte Strahlung verstärkt wird.
Wie oben angegeben, wird mit der vorliegenden Erfindung die Emission elektromagnetischer Energie bewirkt, indem man die oben diskutierte Zubereitung einer zur Induktion dieser Emission wirksamen Menge an elektrochemischer Energie aussetzt. Vorzugsweise wird die Emission durch Exposition der Zubereitung, und damit der darin enthaltenden metallhaltigen ECL-Einheit, an eine voltmetrische Arbeitselektrode induziert. Dementsprechend wird die ECL-Reaktionsmischung steuerbar getriggert, um Licht oder eine andere elektromagnetische Strahlung zu emittieren, und zwar durch eine für bestimmte Zeit und in bestimmter, wirksamer Weise an die Arbeitselektrode angelegte Spannung, um zu einer solchen Lichterzeugung oder einer anderen gewünschten Form elektromagnetischer Strahlung zu führen. Die notwendige Spannung kann von mit der hier gegebenen Lehre ausgerüsteten Fachmann empirisch, ohne übermäßiges Experimentieren abgeleitet werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung soll im Zusammenhang mit der Diskussion der für ihre Ausführung geeigneten Vorrichtung, wie sie in Fig.1 und 2 dargestellt ist, weiter erklärt werden.
Fig. 1 offenbart eine vorteilhafte Vorrichtung zur Erzeugung von Elektrochemilumineszenz. Die vorliegenden Verfahren sind jedoch nicht auf die Anwendung mit der Vorrichtung 10 beschränkt, sondern können mit anderen Vorrichtungstypen installiert werden, die eine Arbeitselektrode oder eine andere triggernde Oberfläche umfassen, um elektrochemische Energie zum Triggern der Elektrochemilumineszenz bereitzustellen. Obwohl die erfindungsgemäßen Verfahren in statischem oder im Durchflußmodus durchgeführt werden können, stellt die Vorrichtung 10 eine Durchflußzelle dar, die viele Vorteile für manche ECL-Operationen bietet, beispielsweise bezüglich der Handhabung vieler Arten von Proben einschließlich von Proben für Bindungstests.
Die Vorrichtung 10 umfaßt eine elektrochemische Zelle 12, eine Vorrichtung zum Nachweis/ zur Messung von Licht 14, bei der es sich vorteilhafterweise um eine Photomultiplierröhre (PMT), eine Photodiode, ein ladungsgekoppeltes Bauteil, einen Photofilm oder -emulsion oder dergleichen handelt, und eine Pumpe 16, die vorteilhafterweise eine peristaltische Pumpe ist, um für den Transport des Fluids durch und von der Zelle weg zu sorgen. Zwischen der Zelle 12 und der PMT 14 ist eine Lichtklappe 18 vorgesehen, die so gesteuert wird, daß sie sich nur soweit öffnet, um die PMT 14 während den Meßperioden der Elektrochemilumineszenz gegenüber der Zelle zu exponieren. Die Lichtklappe 18 kann beispielsweise während des Haltens geschlossen sein. Vorteilhafterweise in der Vorrichtung 10 enthalten, jedoch (aus Gründen der Vereinfachung und Klarheit) nicht in Fig. 1 dargestellt, ist ein lichtdichtes Gehäuse, in dem die verschiedenen Komponenten der Vorrichtung zum Schutz der PMT 14 vor jeglichem externen Licht während der Messung der Elektrochemilumineszenz angeordnet werden können.
Die Zelle 12 selbst umfaßt einen ersten Befestigungsblock 20, durch den eine Einlaß- (22) und eine Auslaßleitung 24 führen, die vorteilhafterweise aus rostfreiem Stahl konstruiert sind. Der Befestigungsblock 20 weist eine erste. äußere Oberfläche 26 und eine zweite, innere Oberfläche 28 auf, die eine Seite eines die Probe enthaltenden Volumens 30 definiert, in dem die Zelle 12 die Reinigungs- und/oder Konditionier- und/oder Meßlösung während der entsprechenden Operationen der Vorrichtung 10 enthält. Die Einlaß- und Auslaßleitung 22, 24 führen durch den Befestigungsblock 20 von der äußeren Oberfläche 26 zur inneren Oberfläche 28 und öffnen sich in das die Probe enthaltende Volumen 30. Ein vorzugsweise aus rostfreiem Stahl konstruierter Befestigungsblock 32 weist ebenfalls eine erste, äußere Oberfläche 34 und eine zweite, innere Oberfläche 36 auf. Der zweite Befesteigungsblock 32 ist von dem ersten Befestigungsblock 20 durch einen ringförmigen Abstandhalter 38 getrennt, der vorteilhafterweise aus Teflon oder einem anderen, nicht kontaminierbaren Material besteht. Somit definiert die äußere Oberfläche 34 des Befestigungsblocks 20 einen Teil der zweiten Seite des die Probe enthaltenden Volumens 30. Der Abstandhalter 38 verfügt über einen äußeren Teil 40 und eine zentrale Öffnung 42, deren Innenkante 44 die Seitenwandung des die Probe enthaltenden Volumens 30 definiert. Der Außenteil 40 dichtet die äußere Oberfläche 34 des zweiten Befestigungsblocks 32 ab, damit keinerlei Lösung aus dem die Probe enthaltenden Volumen 30 zwischen den beiden Oberflächen 28 und 34 hindurch dringt. Der Befestigungsblock 32 weist weiterhin eine zentrale Öffnung 46 auf, in die ein Fenster 48 dicht eingepaßt ist, um den verbleibenden Teil der zweiten Seite des die Probe enthaltenden Volumens 30 als Fortsetzung der äußeren Oberfläche 34 zu definieren. Das Fenster 48 besteht aus einem Material, das bei der Wellenlänge des ECL-Lichts im wesentlichen transparent ist, das vom System im die Probe enthaltenden Volumen 30 erzeugt wird. Das Fenster 48 wird deswegen vorteilhafterweise aus Glas, Plastik, Quartz oder ähnlichem gebildet.
Die Einlaßleitung 22 schneidet das die Probe enthaltende Volumen 30 an einem ersten Ende 50 desselben in der Nähe des Abstandshalters 38; die Auslaßleitung 24 schneidet das die Probe enthaltende Volumen 30 an einem zweiten Ende 52 desselben in der Nähe des Abstandshalters 38. Die Verbindung von Einlaßleitung 22, Probenhaltevolumen 30 und Auslaßleitung 24 stellt so ein kontinuierliches Flußbett für den engen, im wesentlichen laminaren Fluß einer Lösung zu, durch und von der Zelle 12 zur Verfügung.
Auf der inneren Oberfläche 28 des ersten Befestigungsblocks 20 ist ein Arbeitselektrodensystem 54 befestigt, das in der dargestellten Ausführungsform eine erste und eine zweite Arbeitselektrode 56 und 58 umfaßt. Gemäß anderer Ausführungsformen kann vorteilhafterweise eine einzelne Arbeitselektrode bereitgestellt werden oder nur die Elektrode 56 kann eine Arbeitelektrode darstellen. An den Arbeitselektrode 56 und 58 können die elektrochemische und die interessierende ECL-Reaktion stattfinden. Die Arbeitselektroden 56 und 58 sind feste voltmetrische Elektroden und können deswegen vorteilhafterweise aus Platin, Gold, Kohlenstoff oder anderen, für diese Zwecke effektiven Materialien bestehen. Die jeweils mit den Arbeitselektrode 56 und 58 verbundenen Verbindungskabel 60 und 62 führen durch den ersten Befestigungsblock 20.
Die Verbindungskabel 60, 62 sind beide mit einem ersten "Arbeitselektrodenterminal" 64 einer Spannungssteuerung 66, wie in Fig.2 dargestellt, verbunden. Die Spannungssteuerung 66 arbeitet vorzugsweise als Potentiostat, um die Arbeitselektroden 56 und 58 mit Spannungssignalen zu versorgen und ggf. während der Messung der Elektrochemilumineszenz von diesen abfließende Ströme zu messen. Alternativ dazu können die Verbindungskabel 60, 62 mit getrennten Terminals zur Spannungssteuerung 66 für individuellen Betrieb verbunden sein.
Der Betrieb als Potentiostat der Spannungssteuerung 66 wird außerdem durch eine Gegenelektrode 68 und wahlweise vorteilhaft eine Referenzelektrode 70 erreicht. In der dargestellten Ausführungsform besteht der Befestigungsblock 32 aus rostfreiem Stahl und die Gegenelektrode 68 besteht aus den exponierten Oberflächen 72 und 74 des Befestigungsblocks 32. Die Gegenelektroden 72 und 74 und die Arbeitselektroden 56 und 58 stellen die Grenzfläche zum Aufbringen der Spannung auf die Lösung im Probenhaltevolumen 30 bereit, die die Energie für die interessierenden Reaktionen liefert und die Elektrochemilumineszenz in der Probe triggert und/oder stellen die Energie zum Reinigen und Konditionieren der Oberfläche der Zelle 12 zur Verfügung. Die Gegenelektrode 72 und 74 ist über ein Verbindungskabel 76 mit einem zweiten "Gegenelektrodeterminal" 78 der Spannungskontrolle 66 verbunden.
Die Referenzelektrode 70 sorgt für eine Referenzspannung, auf die die von den Arbeitselektroden 56 und 58 aufgebrachte Spannung bezogen ist, beispielsweise 1,2 V vs Referenz. Die Referenzelektrode 70 ist vorteilhafterweise in der Auslaßleitung 24 in einer position 80 mit Abstand von der Zelle 12 angeordnet und ist über ein Verbindungskabel 82 mit einem dritten "Referenzelektrodenterminal" 84 der Spannungssteuerung 66 verbunden. Im "Dreielektrodenmodus" fließt kein Strom durch die Referenzelektrode 70. In einem Dreielektrodenmodus kann die Referenzelektrode 70 zum Bereitstellen einer vergifteten, bekannten und stabilen Spannung eingesetzt werden und ist deswegen vorzugsweise aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) oder ist eine gesättigte Kalomelelektrode (SCE). Die Spannungssteuerung 66 kann auch im Zweielektrodenmodus unter Verwendung der Arbeitselektrode 56 und der Elektrode 58 als Gegen-/Referenzelektrode betrieben werden. Im Zweielektrodenbetriebsmodus ist die Gegen-/Referenzelektrode 58 mit den Spannungssteuerungsterminals 78 und 84 der Spannungssteuerung 66 elektrisch verbunden. In diesem Fall fungiert die Spannungssteuerung 66 im wesentlichen als Batterie. Die Spannungssteuerung 66 bringt Spannungssignale auf die Arbeits- und Gegenelektrode 56 bzw. 58 auf und mißt ggf. die durch die jeweiligen Elektroden fließenden Ströme. Die Referenzelektrode 70 kann alternativ eine sogenannte "Quasireferenzelektrode" aus Platin, Gold, rostfreiem Stahl oder einem anderen Material darstellen, das eine weniger stabile Spannung liefert, aber doch eine, die in bezug auf die kontaktierte Lösung meßbar ist. Sowohl im Drei- als auch im Zweielektrodenbetriebsmodus dient die Referenzelektrode 70 oder 58 dazu, eine Referenz bereitzustellen, gegen die die auf die Arbeitselektrode(n) aufgebrachte Spannung gemessen wird. Die vergiffete Spannungsreferenz wird gegenwärtig als vorteilhafter betrachtet. Im Potentiostatbetrieb steuert die Spannungssteuerung 66 verschiedene Elektroden durch Bereitstellung einer bekannten Spannung an den Arbeitselektroden 56 und 58, bezogen auf die Referenzelektrode 70 während der Stromfluß zwischen den Arbeitselektroden 56 bzw. 58 und den Gegenelektroden 72 und 74 gemessen wird. Potentiostaten für derartige Zwecke sind bekannt; die innere Struktur der Spannungssteuerung 66 entspricht daher geeigneterweise einem beliebigen, herkömmlichen, im Handel erhältlichen Potentiostat, der die obigen Funktionen erzeugt und per se nicht Gegenstand der Erfindung ist. Tatsächlich kann die Vorrichtung 10 alternativ ohne interne Spannungssteuerung 66 konstruiert und an die Verbindung mit einem externen Potentiostat angepaßt werden, der getrennt gesteuert wird zum Bereitstellen der erforderlichen Spannungssignale an die Elektroden 56, 58, 72, 74 und 70. Diese Spannungssignale, die wie unter beschrieben in spizifischer Weise aufgebracht werden, sorgen für wiederholbare Anfangsbedingungen für die Oberflächen der Arbeitselektroden 56 und 58 und vorteilhafterweise der Oberflächen der Zelle 12 insgesamt, ein Merkmal, das signifikant zur verbesserten Verarbeitung bei der Messung der Elektrochemilumineszenz beiträgt.
Die Pumpe 16 ist vorzugsweise an der Auslaßleitung 24 angeordnet, um Lösung aus einem Probenvolumen in Richtung des Pfeils A in die Einlaßleitung 22 "hineinzuziehen". Die Lösung fließt dann durch die Einlaßleitung 22, das Probenhaltevolumen 30 und die Auslaßleitung 24, an der Referenzelektrode 70 vorbei und hinaus in Richtung des Pfeils B. Alternativ kann die Pumpe 16 am Einlaß 22 positioniert sein, um die Lösung durch die Vorrichtung 10 zu "drücken". Vorzugsweise wird dieser selbe Flußweg durch Einlaßleitung 22, Probenhaltevolumen 30 und Auslaßleitung 24 für alle Lösungen und Fluide verwendet, die durch die Zelle 12 gelangen, wodurch jedes Fluid eine hydrodynamische Reinigungsfunktion erfüllt, indem es das vorherige Fluid aus der Zelle 12 drängt. Die Pumpe 16 kann so gesteuert werden, daß eine bestimmte Lösung über beliebige Zeit in der Zelle 12 gehalten wird.
Die Durchflußkonstruktion der Vorrichtung 10 ermöglicht das Aufbringen einer variablen Spannung auf die Arbeitselektroden, damit diese kontinuierlich auf einem vorbetrieblichen Potential gehalten werden, während sie kontinuierlich einer oder mehreren Lösungen ausgesetzt sind, ohne die Arbeitselektroden 56 und 58 (oder die Gegen- und Referenzelektroden 72, 74 und 70) Luft auszusetzen. Die Exposition an Luft, die den Kreislauf zur Referenzelektrode 70 öffnet, ermöglicht eine unbekannte, statistische Spannungsfluktuation, die die Wiederholbarkeit der Oberflächenbedingungen auf den Arbeitselektroden 56 und 58 vernichtet. Die Durchflußkonstruktion gestattet den raschen Wechsel zwischen den Anfangsschritten, in denen das Elektrodensystem 54 gereinigt und konditioniert wird, und den Meßschritten, in denen ein oder mehrere Meßwellenformen oder Pulse die Elektrochemilumineszenz triggern.
Aus dem obigen wird offensichtlich, daß eine erfindungsgemäße, die ECL-Einheit, die Reduktionsmittel bildende Spezies, den Elektrolyten und eine Substanz, in deren Anwesenheit die emittierte Strahlung verstärkt wird, enthaltende Zubereitung in die Zelle 12 eingeführt und elektrochemischer Energie ausgesetzt wird, vorteilhafterweise indem man eine geeignete Spannung auf eine oder mehrere Elektroden des oben beschriebenen Systems (oder eines anderen geeigneten Systems, das vom mit den hier beschriebenen Lehren vertrauten Fachmann leicht abgeleitet werden kann) zur Induktion der gewünschten Elektrochemilumineszenz aufbringt.
Die Menge vom fraglichen System emittierten Lichtes oder anderer elektromagnetischer Strahlung indiziert die An- oder Abwesenheit eines Analyten und, falls dieser anwesend ist, dessen Menge. Somit wird die qualitative und quantitative Analyse einer Probe auf einen interessierenden Analyten ermöglicht. Handelt es sich bei der emittierten elektromagnetischen Strahlung um Licht, kann in diesem Zusammenhang die Emission mit einem Photometer detektiert werden, das mit einem Computer verbunden ist, z.B. einem PC. Im Computer werden die von Photometer empfangenen Signale verarbeitet und können beispielsweise auf einem Bildschirm angezeigt oder über Analogumwandlung auf einem geeigneten Schreiber ausgegeben werden.
Eine Hauptanwendung der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis oder die Quantiüzierung eines interessierenden Analyten in einer gegebenen Probe durch einen ECL- Test. Wie hierin bereits angesprochen, kann der die erfindungsgemäße ECL-Reaktion involvierende Bindungstest in verschiedenen Formen durchgeführt werden.
Gemäß einer ersten Ausführungsform wird eine Probe, die der Praktiker auf die Anoder Abwesenheit eines interessierenden Analyten hin zu testen wünscht, direkt darauf hin untersucht, ob die Emission elektromagnetischer Strahlung gegenüber der von einer vergleichbaren Probe erhaltenen Emission verändert ist (gesenkt oder erhöht), in der die ECL-Einheit nicht, weder direkt noch über ein oder mehrere Moleküle an den interessierenden Analyten oder dessen Analogon gebunden ist. Gemäß einer zweiten Ausführungsform läßt sich der Nachweis, und, falls der interessierende Analyt vorhanden ist, dessen Quantifizierung erzielen, indem man die notwendigen Schritte zur Formulierung einer erfindungsgemäßen ECL-Zubereitung aus der Probe vornimmt, diese Zubereitung elektrochemischer Energie gemäß der Erfindung aussetzt und anschließend die Menge an emittierter elektromagnetischer Strahlung mit den Emissionen elektromagnetischer Strahlung von verschiedenen Systemen vergleicht, die verschiedene bekannte Mengen des interessierenden Analyten enthalten. Eine passende Veränderung der Emission der untersuchten Probe zeigt die Anwesenheit und die Menge des Analyten an.
Die erfindungsgemäße Verwendung kann in einer Vielzahl von Testformaten angewandt werden. So kann die Erfindung in homogenen oder heterogenen Testformaten eingesetzt und in allen dem Stand der Technik bekannten Testverfahren einschließlich direkten oder reversen Tests, kompetitiven Tests, immunologischen Tests, Sandwichtests und zum Screenen von Hybridomen (Hybridomserientests) angewandt werden.
Wie in der EP-A-0 446 245 beschrieben, ist es bei der Durchführung der hier beschriebenen Tests wünschenswert, Teilchen in die Testzubereitung oder das System einzuarbeiten. Die Bindung einer solchen Komponente, die wiederun an die ECL-Einheit gebunden ist, an die Teilchen moduliert die von der ECL-Einheit erzeugten ECL- Signale stark, wodurch ein Hilfsmittel für die Überwachung der Reaktion der spezifischen Bindung der Testzubereitung oder des Systems gegeben ist. Weitere Informationen zu diesem Punkt sind in der oben genannten europäischen Patentoffenlegungsschrift enthalten.
Beispielsweise involviert eine geeignete Klasse von von der Erfindung bereitgestellter homogener Bindungstests die Exposition einer Lösung der ECL-Einheit, die den interessierenden Analyten enthält, an eine Elektrode. Eine ECL-Einheit, die keinen Zugang zur Elektrode erlangt, wird nicht detektiert. Dies kann beispielsweise geschehen, wenn die ECL-Einheit direkt oder indirekt an die Oberfläche des Reaktionsgefäßes gebunden ist, in das die Elektrode eintaucht, oder wenn die ECL-Einheit tief im Inneren eines spezifischen Komplexes wie in einem Antigen-Antikörper-Komplex verborgen ist, oder auch, wenn die Elektrode selbst mit einer Schicht bedeckt ist, durch die die ECL-Einheit hindurch gelangen kann, durch die jedoch eine (direkt oder indirekt) an den interessierenden Analyten oder dessen Analogon gebundene ECL- Einheit nicht hindurch dringt. Weiterhin sollte es möglich sein, die Oberfläche der Elektrode mit Antikörpern zu beschichten, so daß nur Antigen, das direkt oder über ein oder mehrere Moleküle an die ECL-Einheit gebunden ist, Zugang zur Elektrode erhält und dadurch gemessen werden kann.
Kompetitive Bindunsgverfahren können erfindungsgemäß zur Bestimmung der Anwesenheit eines interessierenden Analyten eingesetzt werden. Typischerweise binden der Analyt und die ECL-Einheit kompetitiv an chemisches und biologisches Material. Das Material wird mit der ECL-Einheit und dem Analyten unter geeigneten Bedingungen zum Bilden einer passenden Zubereitung in Kontakt gebracht. In der ECL-Einheit wird anschließend die Emission elektromagnetischer Strahlung durch Exposition der Zubereitung an elektrochemische Energie induziert. Die Anwesenheit des interessierenden Analyten wird durch Detektion der von der Zubereitung emittierten Menge an elektromagnetischer Strahlung bestimmt.
Bei kompetitiven Bindungstests können der interessierende Analyt und dessen Analogon, die direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an die ECL-Einheit gebunden sind, beliebige Substanzen sein, die an einem spezifischen Komplex mit einem komplementären Material partizipieren können, wie beispielsweise ganze Zellen, subzel luläre Partikel, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Proteine, Glycoproteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Peptide, Polypeptide, Zellmetaboliten, Hormone, pharmazeutische Wirkstoffe, Tranquilizer, Barbiturate, Alkabide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Zucker und nichtbiologische Polymere. Von besonderem Interesse sind auf Antigen-Antikörpern beruhende Verfahren. Diese Verfahren sind den bekannten Radioimmuntests analog, in denen ein interessierender Analyt nachgewiesen wird, wenn er ein radioaktives Analogon des Analyten vom Antikörper verdrängt. Die vielen im Stand der Technik bekannten Variationen des Radioimmuntests lassen sich im Prinzip vorteilhaft einsetzen, indem man die erfindungsgemäßen ECL-Einheiten anstelle der radioaktiv markierten Verbindungen einsetzt.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen können auch in im kompetitiven Modus verwendeten Bindungstests eingesetzt werden, in denen die ECL-Einheit direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an zugesetzten interessierenden Analyten gebunden wird. Der Bindungspartner kann spezifisch an den interessierenden Analyten oder den zugesetzten, an die ECL-Einheit gebundenen interessierenden Analyten binden. Bei dem interessierenden Analyten oder dem zugesetzten interessierenden Analyten handelt es sich passend um ein Antigen.
Alternativ dazu ist der Bindungspartner ein primärer Bindungspartner des interessierenden Analyten. Die Testprobe enthält die direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an den interessierenden Analyten gebundene ECL-Einheit. Der Bindungspartner ist an geeignete Teilchen in der Probe gebunden; die Teilchen sind dementsprechend in der Lage, spezifische Bindungen mit den interessierenden Analyten oder dem an die ECL-Einheit gebundenen, zugesetzten interessierenden Analyten einzugehen. Auch hier handelt es sich bei den interessierenden und dem zugesetzten interessierenden Analyten typischerweise um ein Antigen.
Die Erfingung kann auch in einem Test im immunometrischen Modus angewandt werden. Die ECL-Einheit ist an einen Bindungspartner des interessierenden Analyten gebunden. Der Analyt oder dessen Analogon ist an eine Oberfläche gebunden; dementsprechend kann die Oberfläche spezifisch an den Bindungspartner binden. Die Oberfläche kann die Oberfläche eines Teilchens, einer Membran, eines Streifens, einer Röhre usw. sein. Der interessierende Analyt kann ein Antigen sein.
Alternativ ist der Bindungspartner ein primärer Bindungspartner des interessierenden Analyten. Ein Bindungspartner dieses primären Bindungspartner ist eine mit der ECL- Einheit verknüpfte Substanz. Der an die ECL-Einheit gebundene zweite Bindungspartner bindet den primären Bindungspartner. Der Analyt oder dessen Analogon ist an eine Oberfläche gebunden; dementsprechend kann die Oberfläche spezifisch an den primären Bindungspartner binden. Der interessierende Analyt ist typischerweise ein Antigen.
Die Erfindung läßt sich beispielsweise auch in Sandwichtests einsetzen. Der interessierende Analyt kann ein Antigen sein. Die mit der ECL-Einheit verknüpife Substanz ist ein Bindungspartner des interessierenden Analyten. Ein nicht mit der ECL-Einheit verknüpfter Bindungspartner ist an eine Oberfläche gebunden, die dementsprechend an den interessierenden Analyten binden kann.
Alternativ dazu kann der Bindungspartner ein primärer Bindungspartner (BP-1) des interessierenden Analyten sein. Ein sekundärer Bindungspartner des primären Bindungspartners ist ein mit der ECL-Einheit verbundene Substanz. Der interessierende Analyt kann ein Antigen sein. Ein weiterer primärer Bindungspartner (BP-2), der vom sekundären Bindungspartner nicht gebunden wird, wird an die Oberfläche gebunden; dementsprechend kann diese Oberfläche den interessierenden Analyten binden. Die Oberfläche und der primäre Bindungspartner (BP-1) können das Antigen spezifisch binden; der mit der ECL-Einheit verknüpfte Bindungspartner sekundäre Bindungspartner kann wiederum den primären Bindungspartner (BP-1) spezifisch binden. Der Bindungspartner kann auch ein primärer Bindungspartner (BP-1) des interessierenden Analyten sein. BP-1 ist mit der ECL-Einheit verbunden. Ein weiterer primärer Bindungspartner (BP-1'), der sich von BP-1 unterscheidet und den interessierenden Analyten bindet, wird verwendet. Ein sekundärer Bindungspartner des primären Bindungspartners BP-1' wird an eine Oberfläche gebunden; demnach kann die Oberfläche den Komplex aus Analyt, BP-1 und BP-1' binden.
Die Verwendungen der Erfindung lassen sich mit Vorteil in Bindungstests ohne Trennung zum Einsatz in Hybridomserientestformaten einsetzen. Der interessierende Analyt ist ein gegen ein bestimmtes Antigen gerichteter monoklonaler Antikörper. Ein Bindungspartner des interessierenden Analyten ist mit der ECL-Einheit verbunden. Das Antigen ist an eine Oberfläche gebunden, die dementsprechend den Analyten spezifisch binden kann. Der monoklonale Antikörper bindet spezifisch an die Oberfläche und der Bindungspartner, der ein Teil der ECL-Einheit ist, bindet wiederum spezifisch an den monoklonalen Antikörper.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Bindungspartner in der ECL-Einheit mit spezifischen Bindungsvermögen für den monokloalen Antikörper um einen polyklonalen Antikörper, einen monoklonalen Antikörper, Protein A oder Protein G. Darüber hinaus kann der Bindungspartner Avidin sein, das eine Bindungsreaktion mit einem mit Biotin modifizierten Analyten oder Bindungspartner eingehen kann.
Alternativ dazu ist der Bindungspartner ein primärer Bindungspartner des interessierenden Analyten. Ein Bindungspartner des primären Bindungspartner ist mit der ECL-Einheit verknüpft. Der interessierender Analyt ist ein gegen ein Antigen gerichteter monoklonaler Antigkörper. Das Antigen ist an eine Oberfläche gebunden, die demnach spezifisch den monoklonalen Antikörper binden kann. Der monoklonale Antikörper bindet spezifisch an die Oberfläche, der primäre Bindungspartner bindet den monoklonalen Antikörper spezifisch und der sekundäre Bindungspartner in der ECL- Einheit bindet wiederum den primären Bindungspartner spezifisch.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben und veranschaulicht.

Beispiel 1

Elektrochemilumineszenzmessungen wurden mit der folgenden Vorrichtung durchgeführt:
Aus einem schmalen Probenteströhrchen und Elektroden, die in die Probe eingetaucht werden konnten, wurde eine Zelle hergestellt. Ein Berthold-Luminometer (Modell LB9500T; ausgerüstet mit einer Hamamatsu R374 Photomultiplierröhre (PMT) bei 1375 Volt) mit einem Zugabearm für das Chemilumineszenzreagenz, der, wenn abgesenkt, einen lichtdichten Verschluß über dem die Probe enthaltenden schmalen Teströhrchen bildete, wurde zur Lichtsammlung vor dem Photomultiplierröhrchen angeordnet. Der Reagenzzugabearm war so modifiziert, daß er die Elektroden und die Elektrodenkabelverbindungen zum Potentiostat aufnahm, wobei die Elektroden beim Absenken des Arms in die Lösung eintauchten (Potentiostat: Princeton Applied Research - Modell PAR 173 Potentiostat und PAR 175 Programmierer). Die Elektroden bestanden aus zwei parallelen Platingaze-Elektroden (1 cm² geometrische Fläche), die etwa 2 mm voneinander getrennt waren. An Ort und Stelle waren die Flächen der Elektroden parallel der PMT, wobei die der PMT nächste Elektrode die Arbeitselektrode und die andere die Gegenelektrode darstellte. Ein Silberdraht, der als Referenzelektrode diente, war zwischen den beiden Pt-Gazen angeordnet.

Materialien

- Tris-(2,2'-bipyridyl)-rutheniumchloridhexahydrat (Aldrich, Katalog-Nr. 22475- 8) gelöst in Wasser zum Erhalt einer 1 mM Lösung (die "TAG-Lösung")
- kristalline Oxalsäure (Sigma 0-0505), gelöst in Wasser zum Erhalt einer 1 M Lösung
- Phosphatpuffer (0,10 M, pH 6,0)
- Triton-X 100 (Sigma T-6878).

Verfahren

Ein etwa 1 ml Probe enthaltendes Röhrchen wurde in dem modifzierten Berthold- Luminometer angeordnet. Der die Elektrode haltende Arm wurde ganz abgesenkt, so daß die Elektrode nunmehr in der Testlösung angeordnet war. Die Elektrochemilumineszenz wurde mit dem Potentiostaten getriggert, der einen Spannungsschub von +0,7 V bis +1,3 V bei 10 mV/sec aufbrachte. Alle Spannungen wurden auf die Silberreferenzelektrode bezogen. Die erzeugten Photonen wurden auf der Bertholdvorrichtung über 30 sec intergriert. Nach jeder Messung wurde die Elektrode entfernt, mit Wasser gespült, mit einem Kimreiniger abgewischt und für die Messung der nächsten Probe im modifizierten Arm angeordnet.
0,9 ml Phosphatpuffer wurden in Plastikröhrchen (12 x 75 mm; Bertholdröhrchen) pipettiert. Anschließend wurden in einem Fall 20 µl 1 M Oxalsäure dazugegeben In einem anderen Fall wurden 20 µl 1 M Oxalsäure und 10 ml (µl) der 1 mM TAG-Lösung ebenfalls zugefügt. In einem weiteren Fall wurden 20 µl 1 M Oxalsäure, 10 µl der 1 mM TAG-Lösung und 10 µl Triton-X 100 zugefügt. Mit jeder Kombination wurden die Elektrochemilumineszenzmessungen wie oben beschrieben durchgeführt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Tabelle 1
OS = Oxalsäure; TAG = TAG-Lösung; TX = Triton-X 100

Beispiel 2

Weitere Elektrochemilumineszenzmessungen erfolgten in der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung.

Materialien

Ein den Vorläufer eines starken Reduktionsmittels und Triton-X 100 enthaltender Puffer wurde durch Lösen von 15,599 g NaH&sub2;PO&sub4; und 3,12 g Oxalsäure in etwa 900 (90) ml entionisiertem Wasser hergestellt. Durch tropfenweise Zugabe von 50 % NaOH wurde der pH auf 4,0 eingestellt. Anschließend wurden 10 ml Triton-X 100 zum Erhalt von 100 ml einer Lösung mit 0,1 M Phosphat, 40 mM Oxalat und 1,0 % (Vol./Vol.) Triton-X 100 (pH 4,0) zugegeben.
Die folgenden Standardlösungen wurden durch Verdünnen einer 100 nM Stammlösung von Tris-(2,2'-bipyridyl)-rutheniumchloridhexahydrat ("TAG") hergestellt:
a. 100 pM
b. 1,0 nM
c. 10,0 nM

Verfahren (Voltammogramme und Emissionsprofile)

Unter Verwendung des in Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebenen Durchflußsystems erfolgten Messungen der Elektrochemilumineszenz nach folgendem Verfahren:
a. Einführen von Puffer und Festsetzen des Potentials auf 1,1 V,
b. Einführen von 0,5 ml Probe,
c. Durchführung eines Spannungsschubs von 1,1 V bis 2,5 V (wobei ein Voltammogramm und die Elektrochemilumineszenz aufgezeichnet werden), und anschließend auf -1,0 V und zurück auf 1,1 V (100 mV/sec)

Ergebnisse

Die Ablesungen der Elektrochemilumineszenz erfolgten und die Ergebnisse sind in Taue 2 tabellarisch dargestellt. Tabelle 2 (Zählrate während des Schubs)
* Standardabweichung
** Variationskoeffizient (Coeffizient of Variation CV)
Unter Verwendung der fünf Punkte aus den Wiederholungsmessungen, die in der unteren Hälfte der Tabelle 2 dargestellt sind, wurde eine Eichkurve wie in Fig.3 dargestellt erzeugt. Die erhaltene lineare Kurve läßt sich durch Gleichung
y = 17 + 168,9x
beschreiben und die Steigung ist der Abszissenkoeffizient d.h. 168,9. Die untere Nachweisgrenze (Detection limit DL) wurde mittels der folgenden Gleichung bestimmt:
DL = CminTAG = 2,5% CV IBL/100 R,
in der CminTAG die Minimumkonzentration an TAG (hier Tris-(2,2'-bipyridyl)-rutheniumchloridhexahydrat), % CV der prozentuale Variationskoeffizient, IBL die Intensität der Kontrolle (Hintergrund) und R die Steigung der Eichkurve ist. Durch Einsetzen der Werte für die verschiedenen Koeffizienten in die obige Gleichung wurde die unterste Nachweisgrenze zu ungefähr 10,4 µM berechnet. Es sei angemerkt, daß diese Nachweisgrenze um das 1000fache niedriger als die in der Literatur beschriebene Nachweisgrenze liegt (10.000 µM; D.Ege et al., J. Anal. Chem. 1984, 56, 2413).

Beispiel 3

Das in Beispiel 33 der WO 87/06 706 beschriebene Ru(II)-Verbindungskonjugat wurde auf eine Endkonzentration von 150 nM verdünnt unter Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers, pH 6,0, enthaltend 0,35 M Natriumfluorid (PBF-Puffer). Ein für Theophyllin spezifischer monoklonaler Antikörper (Clon Nr.9-49, Ascitescharge WO399, Katalog-Nr.046) wurde von den Kallestad Laboratories, Inc. (Cliaska, MN) bezogen. Der monoklonale Antikörper wurde unter Verwendung des PBF-Puffers auf verschiedene Konzentrationen verdünnt (zwischen 21,9 bis 700 µg Protein pro ml) Ein weiterer monoklonaler Antikörper (Kontroll-MAB), der nicht mit Theophyllin reagierte, wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen und unter Verwendung von PBF- Puffer auf verschiedene Konzentrationen zwischen 21,9 und 700 µg Protein pro ml verdünnt. Unter Verwendung von Theophyllin, das von der Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, Katalog-Nr. 26-140-8, M.W. 180,17) bezogen wurde, wurde eine Theophyllinstandardlösung hergestellt. Das Theophyllin wurde in PBF-Puffer zum Erhalt einer Endkonzentration von 75 µm gelöst und zur Verwendung in den Tests mit PBF-Puffer auf 6 µM verdünnt. Vor den Elektrochemilumineszenzmessungen wurde eine 250 mM Oxalsäure und 5 % (Vol./Vol.) Triton-X 100 enthaltende Lösung (ECL- Lösung) dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Messungen erfolgten unter Einsatz eines Berthold-Luminometers, daß so modifiziert war, daß es die Anordnung von zwei Platingaze-Elektroden im die Reaktionslösung enthaltenen Teströhrchen gestattete. Die Elektroden wurden mit einem Potentiostaten verbunden; die Elektrochemilumineszenzessung erfolgte, indem man das angelegte Potential über die Elektroden von 1,5 V auf 2,5 V mit einer Abtastgeschwindigkeit von 50 mV/Sec führte. Das für die Messungen verwendete Berthold-Luminometer verfügte über eine hoch empfindliche, Rot-sensitive Photomultiplierröhre. Die Ausgabe des Luminometers wurde auf 10&sup5; Zähipunkte pro Volt eingestellt. Die Messungen wurden auf einem X-Y-Y'-Schreiber aufgezeichnet und die Peakhöhe wurde als Maß für die Elektrochemilumineszenz genommen. Zwischen den Messungen wurden die Elektroden durch (a) Spülen mit einem Puffer bei pH 4,2, der 0,1 M Phosphat, 0,1 M Citrat, 0,025 M Oxalsäure und 1 % Triton-X 100 enthielt, (b) Pulsen der Elektroden in dieser Lösung zwischen +2,2 V und -2,2 V für 60 sec und (c) anschließend Aufbringen von +2,2 V für 10 sec gereinigt. Anschließend wurden die Elektroden aus der Lösung genommen, in destilliertem Wasser gewaschen und abgetrocknet. Die Experimente erfolgten wie in Tabelle III dargestellt.
Die Lösung des Kontroll-MAB, des Antikörpers gegen Theophyllin oder PBF-Puffer wurden in ein Set von Teströhrchen gegeben (Schritt 1). Zu diesen Röhrchen wurden eine Theophyllinlösung oder PBF-Puffer zugefügt (Schritt 2). Die Lösungen wurden durch kurzes Schütteln der Teströhrchen gemischt und 25 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Anschließend wurde eine Lösung der Ru(II)konjugats der Verbindung III zu den Teströhrchen zugegeben (Schritt 3). Die Teströhrchen wurden geschüttelt und 15 min bei Raumtemrpatur gehalten. Schließlich wurden zu jedem Röhrchen 100 µl der ECL-Lösung zugefügt und die Elektrochemilumineszenz wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt. Tabelle III Gestaltung des Experiments zur Untersuchung der Auswirkung der Wechselwirkungen von Antikörper mit dem Ru(II)konjugat der Verbindung III auf die Elektrochemilumineszenz Tabelle IV Auswirkung der Wechselwirkungen von Antikörper mit dem Ru(II)konjugat der Verbindung III auf die Elektrochemilumineszenz
* Ru(II)-Verbindung III
Die Elektrochemilumineszenz von Doppeiproben wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Elektrochemilumineszenz des Ru(II)konjugats der Verbindung III betrug im obigen Test bei Messungen in Puffer ohne Zugabe von Antikörper 57.200. Der Hintergrund für das Puffergemisch betrug 5750.
Die Daten zeigen, daß ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch Theophyllin erkennt, die Elektrochemilumineszenz senkt, wenn er mit einem Analogon des Theophyll ins in Kontakt gebracht wird, an das eine Rutheniumverbindung gebunden ist, z.B. die Ru(II)-Verbindung III. Die Elektrochemilumineszenzabnahme ist der Antikörperkonzentration proportional, wenn die Konzentration des Ru(II)-Verbindung III-Konjugats konstant gehalten wird. Wird ein Antikörper verwendet, der Theophyllin nicht erkennt, ist nur eine leichte Abnahme der Elektrochemilumineszenz bei der höchsten Antikörperkonzentration zu sehen.
Die Daten zeigen auch, daß die Elektrochemilumineszenz größer ist, wenn das Theophyllin mit den Anti-Theophyllin-Antikörper in Kontakt gebracht und anschließend das Ru(II)-Verbindung III-Konjugat zur Mischung zugegeben wird. Dies belegt, daß das Theophyllin mit dem Ru(II)-Verbindung III-Konjugat um die Bindung am Antikörper konkurriert, was zu einer größeren Menge an Ru(II)-Verbindung III- Konjugat führt, die die Elektrochemilumineszenz erzeugen kann.

Beispiel 4

Aufbauend auf den in Beispiel 3 beschriebenen Ergebnissen wurde ein homogener Immunassay auf Theophyllin entwickelt unter Verwendung eines Antikörpers gegen Theophyllin und des in Beispiel 3 erwähnten Ru(II)-Verbindung III-Konjugats im Modus der kompetitiven Bindung. Die verwendeten Materialien waren wie in Beispiel 3 mit der Ausnahme, daß es sich bei dem Puffer um einen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend 0, 1 M Natriumfluorid, handelte. Für diesen Test wurde eine spezielle Konzentration des Antikörpers gegen Theophyllin gewählt. Die Antikörperkonzen tration betrug 55 µg/ml. Die Konzentration des Ru(II)-Verbindung III-Konjugats wurde auf 175 nM eingestellt. Theophyllin wurde zu Humanserum zum Erhalt von Endkonzentrationen von 2,5, 5, 10, 20 und 40 µg Theophyllin pro ml Serum zugegeben.
Der Test erfolgte durch Zugabe von 10 µl Serum zu 290 µl Anti-Theophyllin-Antikörper und halten der Lösung auf Raumtemperatur für 25 min. Anschließend wurden in jedes Röhrchen 100 µl des Ru(II)-Verbindung III-Konjugats zum Erhalt einer Endkonzentration von 35 nM zugefügt und diese Lösung 15 min bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wurden 100 µl der in Beispiel 3 beschriebenen ECL-Lösung in jedes Röhrchen gegeben und Elektrochemilumineszenzeigenschaften der Lösungen wie zuvor beschrieben gemessen, wobei ein Schubmodus von 1,5 V auf 2,5 V bei 50 mV/sec verwendet wurde. Die Daten sind in Fig.4 dargestellt und zeigen, daß eine Korrelation zwischen der Theophyllinkonzentration in einer Serumprobe und der vom Reaktionsgemisch emittierten Elektrochemilumineszenz besteht. Diese Beobachtung zeigt, daß es möglich ist, einen Test auf Theophyllin zu entwickeln.
Basierend auf diesen Ergebnissen kann der Fachmann einen homogenen Elektrochemilumineszenz-Immuntest zum Nachweis und zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten in einer biologischen Matrix entwickeln.

Beispiel 5

Unter Anwendung eines homogenen ECL-Immuntests wurde die Theophyllinkonzentration in verschiedenen Serumproben bestimmt. Der Modus des Tests war ein kompetitiver Bindungstest unter Verwendung eines für Theophyllin spezifischen monoklonalen Antikörpers und des in Beispiel 3 beschriebenen Ru(II)-Verbindung III-Konjugats. Die verwendeten Reagenzien und Verfahren waren wie in Beispiel 3 beschrieben.
Zu Vergleichszwecken wurde außerdem ein Fluoreszenzpolarisationstest ausgeführt. Der zur Bestimmung der Theophyllinkonzentration in verschiedenen Serumproben angewandte Fluoreszenzpolarisationstest erfolgte unter Verwendung eines automatisierten TDX-Instrument der Abbott Laboratories (North Chicago, IL). In den Tests wurden hämolysierte, upämische, icterische und normale Sera verwendet; die Daten für die anormalen Sera sind in Tabelle V unten aufgeführt. Tabelle V homogener Theophyllintest Eigenschaften potentiell problematischer Sera
Zu den Serumproben wurden verschiedene Mengen Theophyllin zugesetzt, um Endkonzentrationen zwischen 2,5 und 40 µg Theophyllin pro ml zu erhalten. Die Ergebnisse des homogenen ECL-Tests sind in Fig.5 dargestellt.
Jede Serumprobe wurde auch mittels eines Fluoreszenzpolarisationstest auf ihre Theophyllinkonzentration hin untersucht. Die mittels des homogenen Elektrochemilumineszenz-Immuntests und des Fluoreszenzpolarisationstest gemessenen Theophyllinkonzentrationen wurde verglichen. Die Daten wurden als Punktdiagramm gedruckt und sind in den Fig.6A-D dargestellt. Die Datenpunkte wurden über lineare Regression analysiert und die Korrelationskoeffizienten berechnet. Die Analyse zeigt eine ausgezeichnete Korrelation zwischen beiden Tests. Die Korrelationskoeffizienten (r) lagen zwischen 0,98 und 1,00. Die Steigungen der Kurven für normales, hämolysiertes und lipämisches Serum lagen zwischen 0,8 und 1,2, was die ausgezeichnete Rückgewinnung des Theophyllins aus diesen Serumproben zeigt.
Obwohl die von icterischen, Theophyllin enthaltenden Serumproben emittierte Elektrochemilumineszenz höher als die der anderen Serumproben war, war sie bei jeder Theophyllinkonzentration proportional höher. Dies ist aus Fig.6D ersichtlich. Der Korrelationskoeffizient für die Datenpunkte ist 1,00 im Vergleich von Elektrochemilumineszenz und Fluoreszenzpolarisation; die Steigung beträgt jedoch 2,14, was die höhere Rückgewinnung des Theophyllins in icterischen Serumproben belegt.
Auf Basis dieser Ergebnisse kann die Theophyllinkonzentration in einer icterischen Probe bestimmt werden, indem man eine Standardkurve für diese Probe durch Zugabe bekannter Mengen an Ru(II)-Verbindung III-Konjugat zu Aliquots des icterischen Serums etabliert. Diese Daten zeigen, daß ein homogener ECL-Immuntest zur Messung der Theophyllinkonzentrationen in Serumproben verwendet werden kann, die anormale Mengen an Hämoglobin, Lipid und Bilirubin enthalten.
Ein homogener ECL-Immuntest bietet Vorteile gegenüber dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren aufgrund der Vielseitigkeit des ECL-Nachweises, z.B. der empfindlichere Nachweis bei höheren Konzentrationen an biologischen Molekülen.
Ein homogener ECL-Immuntest bietet außerdem Vorteile gegenüber dem Fluoreszenzpolarisationsverfahren, da keine Quelle für einfallendes Licht benötigt wird und die elektrische Anregung das einzige Erfordernis für eine effiziente Lichterzeugung ist. Dementsprechend wird keine komplizierte Optik benötigt. Da das Meßprinzip nur auf der durch elektrochemische Stimulation induzierten, spezifischen Photonenemission beruht, ist die Empfindlichkeit des Systems potentiell wesentlich höher als bei der Fluoreszenzpolarisation und ein breiterer dynamischer Bereich kann erzielt werden. Auch ist die Messung einer größeren Vielzahl von Analyten mit einem homogenen ECL-Immuntest möglich als mittels der Fluoreszenzpolarisationstechnik, und zwar aufgrund der selektiven Modulation der Elektrochemilumineszenz durch biomolekulare Erkennungsereignisse, z. B. die Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen.
Auf Basis dieser Ergebnisse weiß der Fachmann, daß er homogene ECL-Immuntests zum Nachweis anderer interessierender Analyten in anormalen Serumproben entwickeln kann.

Beispiel 6

10 mg festes Digoxin wurden in 10 ml DMSO:H&sub2;O (8:2) gelöst, um eine Digoxinkonzentration von 1 mg/ml zu erhalten (Stammlösung - Standard).
Aus der Stammlösung wurden Arbeitsstandards in folgenden Konzentrationen in 0,15 M Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,1 % BSA (Rinderserumalbum in) und 0,15 M NaF enthielt (im folgenden ECL-Puffer), hergestellt: 80 ng/ml, 40 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml und 0 ng/ml
75 µl des in der WO 87/06 706 beschriebenen Antidigoxin-Verbindung I-Konjugats (1:90 verdünnt) und 75 µl jedes Standards wurden in ein Glasröhrchen pipettiert, auf einem Vortexmischer gemischt und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
In jedes Röhrchen wurden 50 µl vorgewaschene Oubain-BSA-Biomag-Teilchen gegeben, auf einem Vortexmischer gemischt und bei Raumtemperatur 5 min inkubiert. Die Biomag-Teilchen wurden abgetrennt und der Überstand in ein getrenntes Röhrchen überführt.
100 µl des Überstands wurden mit 400 µl aus 0,125 M Kaliumphosphat, 0,125 M Zitronensäure, 32 mM Oxalsäure, 1,25 % Triton-X 100 gemischt.
Die Probe wurde in einem Bertholdinstrument angeordnet und die Elektrochemilumineszenz wie zuvor beschrieben gemessen, mit der Ausnahme, daß das Verfahren durch stufenweises Festsetzen des aufgebrachten Potentials vom offenen Kreislauf auf 2,2 V und Integrieren der Photonenzählraten über 10 sec modifiziert wurde.
Die Elektrode wurde zwischen den Messungen unter Verwendung eines Phosphat- Citrat-Puffers wie folgt gereinigt:
(a) Pulsen der Elektrode mit 3 sec Intervallen, die für 1 min zwischen -2,2 V und + 2,2 V alternieren,
(b) Vergiften der Elektrode bei +2,2V für 10 sec
(c) Spülen der Elektrode mit entionisiertem Wasser und Trockentupfen.
Die Ergebnisse sind in Fig.7 dargestellt.

Claims

1. Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel

in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R1 CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strahlung in einer für die Verwendung in einem ECL-Test geeigneten Zubereitung, die enthält:

(a) eine metallhaltige ECL-Einheit, die, wenn durch Exposition an eine wirksame Menge elektrochemischer Energie oxidiert, in einen angeregten Zustand überführt werden kann, aus dem bei Exposition der angeregten ECL-Einheit an Emission induzierende Bedingungen elektromagnetische Strahlung emittiert wird,

(b) eine Spezies, die im oxidierten Zustand ein starkes Reduktionsmittel darstellt und

(c) einen Elektrolyten, der als Medium fungieren kann, in dem die ECL-Einheit und besagte Spezies oxidiert werden können.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der die ECL-Einheit ein Metallchelat ist.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2, bei der das Metall des Metallchelats ein Übergangsmetall oder ein Seltenerdmetall darstellt.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, bei der das Metall des Metallchelats Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium, Palladium, Molybdän, Technetium, Kupfer, Chrom oder Wolfram ist.

5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Komponente (b) eine Carbonsäure ist.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Carbonsäure Oxal-, Wein-, Zitronen-, Milch, Malon-, Glucon- oder Brenztraubensäure ist.

7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die ein Reduktionsmittel bildende Spezies bezogen auf die ECL-Einheit in stöchiometrischem Überschuß vorliegt.

8. Verwendung gemäß Anspruch 5, Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei der die Carbonsäure in einer Konzentration von 5 - 50 mM vorliegt.

9. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der der Elektrolyt ein wäßriger Elektrolyt ist.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, die einen Elektrolyten einschließt, der ein in Wasser gelöstes Salz umfaßt.

11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, die einen Wasser und eine damit mischbare organische Flüssigkeit umfassenden Elektrolyten einschließt.

12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der pH 1 bis 7 beträgt.

13. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei der pH 2 bis 6 beträgt.

14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der der Elektrolyt nicht wäßrig ist.

15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, die einen eine organische Flüssigkeit umfassenden Elektrolyten einschließt.

16. Verwendung gemäß Anspruch 15, die einen Elektrolyten involviert, der Acetonitril, DMSO, DMF, Methanol, Ethanol oder eine Mischung aus zwei oder mehr derselben umfaßt.

17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, die einen einen Phosphatpuffer umfassenden Elektrolyten involviert.

18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, bei der in der Formel

x 9 bis 10 ist.

19. Verwendung gemäß Anspruch 4, bei der das Metalichelat ein rutheniumhaltiges Chelat darstellt, die ein starkes Reduktionsmittel bildende Spezies Oxalat ist, der Elektrolyt einen Phosphatpuffer umfaßt und die Verbindung der Formel

Triton-X-100 ist.

20. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der die Verbindung der Formel

in einer Menge von 0,1 bis 1,0 Gew.-%/Vol. eingesetzt wird.

21. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der die Zubereitung in Form eines Kits vorliegt, wobei der Kit mindestens eine separate Komponente enthält, die eine oder mehrere Elemente der aus den Komponenten (a), (b) und (c) sowie die besagte Verbindung bestehenden Gruppe einschließt.

22. Verwendung gemäß Anspruch 21, bei der der Kit eine erste separate Komponente, die zwei beliebige Elemente der Gruppe einschließt, und eine zweite separate Komponente aufweist, die die restlichen Elemente der Gruppe einschließt.

23. Verwendung gemäß Anspruch 22, bei der die erste separate Komponente die ECL-Einheit (a) und den Elektrolyten (c) und die zweite separate Komponente die Spezies (b) und die besagte Ver- bindung enthält.

24. Verwendung gemäß Anspruch 21, bei der der Kit eine erste separate Komponente, die zwei beliebige Elemente der Gruppe ein- schließt, und eine zweite separate Komponente aufweist, die die restlichen Elemente der Gruppe sowie außerdem eines der in der ersten Komponente enthaltenen Elemente der Gruppe einschließt.

25. Verwendung gemäß Anspruch 24, bei der die erste separate Komponente die Spezies (b) und den Elektrolyten (c) und die zweite separate Komponente die ECL-Einheit (a) und die besagte Verbindung enthält.

26. Verwendung gemäß Anspruch 21, die vier separate Komponenten aufweist, wobei jede derselben ein anderes der vier Elemente der Gruppe enthält.

27. Verwendung gemäß Anspruch 21, die eine erste separate Komponente, die alle vier Elemente der Gruppe einschließt, und eine zweite separate Komponente aufweist, die ein, zwei oder drei beliebige Elemente der Gruppe umfaßt.

28. Verwendung gemäß Anspruch 27, bei der die zweite separate Komponente eines der vier Elemente der Gruppe enthält und der Kit darüber hinaus eine dritte separate Komponente, die eines, zwei oder drei Elemente der Gruppe umfaßt, und eine vierte separate Komponente aufweist, die ein oder zwei Elemente der Gruppe einschließt.

29. Verwendung gemäß Anspruch 22, bei der die erste separate Komponente die ECL-Einheit (a) und die Spezies (b) und die zweite separate Komponente den Elektrolyten (c) und die besagte Verbindung umfaßt.

30. Verwendung gemäß Anspruch 22, bei der die erste separate Komponente die ECL-Einheit (a) und die zweite separate Komponente die Spezies (b), den Elektrolyten (c) und die besagte Verbindung umfaßt.

31. Verwendung gemäß Anspruch 21, bei der der Kit eine erste separate Komponente, die mindestens zwei Elemente der Gruppe einschließt, und eine zweite separate Komponente aufweist, die das/die restlichen Elemente der Gruppe einschließt.

32. Verwendung gemaß einem der Ansprüche 22 bis 31, bei der jeweils die zweite Komponente wäßrig ist.

33. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 32, bei der der Kit an den Nachweis oder die Quantifizierung eines interessierenden Analyten mittels ECL angepaßt ist, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine weitere Komponente aufweist, die ausgewählt ist unter (i) einem weiteren interessierenden Analyten oder einem Analogon des interessierenden Analyten, (ii) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder seines Analogons und (iii) einer reaktiven Komponente, die die Substanz (i) oder (ii) binden kann, wobei die zusätzliche Substanz in einer weiteren, zusätzlich im Kit enthaltenen Komponente oder in einer Komponente des Kits enthalten ist, die eines oder mehr der Elemente der Gruppe enthält.

34. Verwendung gemäß Anspruch 33, bei der der Kit an den Nachweis eines Analyten adaptiert ist, der ausgewählt ist unter einer ganzen Zelle oder einem Oberflächeantigen, subzellulären Partikeln, einem Virus, einem Prion, einem Viriod, einem Antikörper, einem Antigen, einem Hapten, einer Fettsäure, einer Nukleinsäure, einem Protein, einem Lipoprotein, einem Polysaccharid, einem Lipopolysaccharid, einem Glykoprotein, einem Peptid, einem Polypeptid, einem Zeilmetaboliten, einem Hormon, einem pharmakologischen Wirkstoff, einem abiologischen Polymeren, einem synthetischen organischen Molekül, einem organometallischen Molekül, einem Tranquilizer, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, einer Aminosäure, einem Zucker, Lectin, einem rekombinanten Protein oder Proteinderivat, Biotin, Avidin, Streptavidin oder einem anorganischen Molekül.

35. Verwendung gemaß Anspruch 33 oder 34, bei der der Kit an den Nachweis einer Probe des Analyten in einer Konzentration von 10-3 bis 10-18 Mol adaptiert ist.

36. Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel

in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R1 CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strah- lung in einem Verfahren zur Erzeugung einer Emission elektromagnetischer Strahlung, das die Schritte umfaßt:

(i) Herstellen einer Zubereitung gemaß einem der Ansprüche 1 bis 20,

(ii) Exponieren der Zubereitung unter geeigneten Bedingungen an eine Menge elektrochemischer Energie, die wirksam ist, um in der Zubereitung die Emission elektromagnetischer Energie zu induzieren, und

(iii) Nachweis der emittierten elektromagnetischen Strahlung,

wobei die Zubereitung die besagte Verbindung enthält.

37. Verwendung gemaß Anspruch 36, bei der die Zubereitung aus einem Kit gemäß einem der Ansprüche 21 bis 32 hergestellt wird.

38. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 36 oder 37, bei der die Zubereitung während der Exposition an die elektrochemische Energie einen pH von 1 bis 7 aufweist.

39. Verwendung gemäß Anspruch 38, bei der der pH 2 - 6 beträgt.

40. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 36 bis 39, bei der der Schritt (iii) den Nachweis und die Messung der emittierten Strahlung umfaßt.

41. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 36 bis 40, bei der das Verfahren ein Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten mittels eines ECL-Tests der kompetitiven spezifischen Bindung ist und bei der die Zubereitung zusätzlich umfaßt:

(A) eine auf den interessierenden Analyten zu testende Probe und

(B) (i) einen weiteren interessierenden Analyten oder ein Analogon des interessierenden Analyten,

(ii) eine reaktive Komponente, die (i) binden kann,

und wobei die metallhaltige ECL-Einheit ein Metalichelat darstellt, das eine Bindungsreaktion mit dem interessierenden Analyten oder mit (B)(i) oder (B)(ii) eingehen kann.

42. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 36 bis 40, bei der das Verfahren ein Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten mittels eines ECL-Sandwichtests spezifischer Bindung ist und bei der die Zubereitung zusätzlich umfaßt:

(A) eine auf den interessierenden Analyten zu testende Probe und

(B) (i) einen Bindungspartner des interessierenden Analyten,

(ii) eine reaktive Komponente, die (i) binden kann,

und wobei die metallhaltige ECL-Einheit ein Metallchelat darstellt, das eine Bindungsreaktion mit dem interessierenden Analyten oder mit (B)(i) oder (B)(ii) eingehen kann.

43. Verwendung gemäß Anspruch 41 oder 42, wobei das Verfahren an den Nachweis eines Analyten adaptiert ist, der ausgewählt ist unter einer ganzen Zelle oder einem Oberflächeantigen, subzellulären Partikeln, einem Virus, einem Prion, einem Viriod, einem Antikörper, einem Antigen, einem Hapten, einer Fettsäure, einer Nukleinsäure, einem Protein, einem Lipoprotein, einem Polysaccharid, einem Lipopolysaccharid, einem Glykoprotein, einem Pep- tid, einem Polypeptid, einem Zellmetaboliten, einem Hormon, einem pharmakologischen Wirkstoff, einem abiologischen Polymeren (vorzugsweise lösliche), einem synthetischen organischen Molekül, einem organometallischen Molekül, einem Tranquilizer, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, einer Aminosäure, einem Zucker, Lectin, einem rekombinanten Protein oder Proteinderivat, Biotin, Avidin, Streptavidin oder einem anorganischen Molekül, die in der Probe vorliegen.

44. Verwendung gemäß Anspruch 41, 42 oder 43, bei der die Zubereitung aus eine Kit gemäß enem der Ansprüche 33 bis 35 hergestellt wird.

45. Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel

in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R1 CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strahlung in einem System zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten in einer Probe mittels kompetitiver spezifischer Bindung basierend auf elektrochemischer Lumineszenz, umfassend:

(A) eine Probe,

(B) (i) zugesetzten interessierenden Analyten oder ein Analogon des interessierenden Analyten,

(ii) eine zur Bindung an (i) befahigte reaktive Komponente,

wobei jede der Substanzen direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an eine metallhaltige ECL-Einheit gebunden ist, die in eine angeregten Zustand überführt werden kann, aus dem bei Exposition der ECL-Einheit an Bedingungen, welche zur Induktion der Emission ausreichend sind, elektrochemische Strahlung emittiert wird,

(C) eine Spezies, die md ein starkes Reduktionsmittel umgewandelt werden kann, und einen Elektrolyten,

(D) Mittel zur Induktion der Emission elektromagnetischer Strahlung bei der ECL-Einheit und

(E) Mittel zum Messen der von der Zubereitung emittierten Strahlung, um die Anwesenheit oder die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen.

46. Verwendung einer Verbindung oder von Verbindungen der Formel

in der R Wasserstoff oder CnH2n+1 und R1 CnH2n bedeutet, x 0 bis 70 und n 1 bis 20 ist, als Verstärker elektromagnetischer Strahlung in einem System zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines interessierenden Analyten in einer Probe mittels Sandwichspezifischer Bindung basierend auf elektrochemischer Lumineszenz, umfassend:

(A) eine Probe,

(B) (i) einen Bindungspartner für den interessierenden Analyten,

(ii) eine zur Bindung an (i) befähigte reaktive Komponente,

wobei eine der Substanzen direkt oder über ein oder mehrere andere Moleküle an eine metallhaltige ECL-Einheit gebunden ist, die in eine angeregten Zustand überführt werden kann, aus dem bei Expqsition der ECL-Einheit an Bedingungen, welche zur Induktion der Emission ausreichend sind, elektrochemische Strahlung emittiert wird,

(C) eine Spezies, die in ein starkes Reduktionsmittel umgewandelt werden kann, und einen Elektrolyten,

47. Verwendung gemäß Anspruch 45 oder 46, bei der die metallhaltige ECL-Einheit gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 ist.

48. Verwendung gemäß Anspruch 45, 46 oder 47, bei der die Spezies (c) gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 ist.

49. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 48, bei der der Elektrolyt gemäß einem der Ansprüche 9 bis 17 ist.

50. Verwendung gemäß einem der Ansrpüche 45 bis 49, bei der die Verbindung der Formel

einem der Ansprüche 18 bis 19 entspricht.