DE19621165C1 - Verfahren zur Herstellung einer Probe aus immobilisierten Makromolekülen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Probe aus immobilisierten Makromolekülen und deren Verwendung. Aus Moss, D. A., Ritter, A., Andlauer, W., Ache, H.J. "Optical biosensors based on enzyme-substrate complex formation" in Ab­ stracts of the 3rd World Congress on Biosensors, New Orleans, June 1-3 1994 ist eine Methode zum Nachweis von Analyten in wäßrigen Medien, zum Beispiel Salicylat und Theophyllin in Blutproben, bekannt, welche auf der spezifischen Bindung des Analyts an einem vorgelegten Enzym und den damit einhergehen­ den Spektraländerungen basiert. Dabei muß das Enzym immobili­ siert vorliegen, damit es nicht durch die wäßrige Probe wegge­ spült werden kann.

Eine Vielzahl bekannter Immobilisierungsmethoden ist von F. Scheller und F. Schubert in Biosensoren, 1989, Birkhäuser Ver­ lag Basel beschrieben. Diese Methoden eignen sich für die Her­ stellung einer dünnen Enzymschicht auf einer festen Oberflä­ che. Dünnschichten sind aber für spektroskopische Messungen in Transmissiongeometrie ungeeignet, weil die geringfügige Mate­ rialmenge im Lichtstrahl zu schwachen Meßsignalen führt. An­ dere Geometrien, zum Beispiel Evanescent-Wave-Spektroskopie, haben den Nachteil, daß sie die wellenlängenunabhängige Li­ nearität zwischen Lichtabsorption und Substanzkonzentration im Sinne des Beer-Lambert′schen Gesetzes nicht gewährleisten. Dickere Schichten haben den Nachteil, daß sie die Penetration von Analyten erheblich verlangsamen. Dünnschichten, die eine erhöhte Enzymkonzentration aufweisen, haben den Nachteil, daß die bei der Enzymaufkonzentrierung und Schichtherstellung un­ vermeidlichen Volumenverluste einen erheblichen Enzymverlust darstellen. Zudem müßte bei schwach absorbierenden Enzymen eine Konzentration erreicht werden, bei welcher die Lösung sich nicht mehr pipettieren läßt.

Desweiteren haben Immobilisierungsmethoden, die auf einer Po­ lymerisierungsreaktion basieren, den Nachteil, daß sie nicht als universell einsetzbare Methoden anzusehen sind, da die zur Vermeidung von Enzymbeschädigung notwendigen chemischen Reak­ tionsbedingungen von Enzym zu Enzym verschieden sind bzw. En­ zymbeschädigung sich nicht vermeiden läßt.

Aus der JP 3 269 358 A. In: Patent Abstracts of Japan P-1319 February 28, 1992 Vol. 16/No. 85 ist ein Verfahren zur Herstellung einer Probe aus immobilisierten Makromolekülen bekannt, bei dem eine Lösung der Makromoleküle in eine Hohlfaser gefüllt wird und sich spontan aufkonzentriert. Eine anschließende Wiederverdünnung wird jedoch nicht verhindert.

Desweiteren ist aus der DE 42 16 696 C2 ein Verfahren zur Herstellung einer Probe aus immobilisierten Makromolekülen bekannt, bei dem Makromoleküle auf einer Teststreifenober­ fläche aufgebracht werden.

Die Immobilisierung von Makromolekülen auf einer Polymermem­ bran ist aus der DE 40 27 728 A1 und auf einer Si₃N₄ Ober­ fläche ist aus der DE 44 35 998 C1 und der DE 44 36 001 C2 bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein universell einsetzbares Ver­ fahren zur Herstellung einer Probe aus immobilisierten Makro­ molekülen zur Verfügung zu stellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Patentan­ spruchs 1.

Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens.

Das Verfahren zeichnet sich durch folgende Vorteile aus:
Spektroskopische Messungen können in Transmissionsgeometrie quer durch die Faser erfolgen, wobei die hohe Enzymkonzentra­ tion trotz der kleinen optischen Weglänge von nur 200 µm aus­ geprägte, auch mit bescheidener Meßtechnik leicht zu erfas­ sende Meßsignale gewährleistet.

Die rasche Penetration von Analyten in die Faser wird durch die kurze Diffusionsstrecke gewährleistet, wobei diese Diffu­ sion nicht durch eine nach dem Stand der Technik üblicherweise vorhandene Polymermatrix verhindert wird.

Es handelt sich bei prozeßtechnisch bedingten Volumenverlusten um niedrige Enzymkonzentrationen, da kein weiterer Flüssig­ keitstransfer nach der Aufkonzentrierung benötigt wird.

Es erfolgen keine Enzymbeschädigungen, da die Immobilisie­ rungsmethode keine potentiell schädliche chemische Reaktionen enthält.

Die Methode ist universell einsetzbar, da die bei allen Enzy­ men zutreffenden hohen Molekulargewichte und Wasserlöslichkeit die einzigen Voraussetzungen sind.

Die Erfindung wird im folgenden anhand einiger Ausführungsbei­ spiele mit Hilfe der Figur näher erläutert.

Die Figur zeigt beispielhaft eine Halterung für eine immobili­ sierte Enzymprobe.

Die mit Enzymlösung gefüllte Hohlfaser 1 wird nach der sponta­ nen Aufkonzentrierung zwischen zwei Plättchen aus Plexiglas 2 und 3 eingeklebt, wobei der mit Enzymlösung noch gefüllte Ab­ schnitt 4 in einem dafür vorgesehenen Kanal 5 positioniert ist und die leeren Abschnitte 6 und 7 abgeklemmt sind. Der Kanal 5 wird dabei nur teilweise durch die Hohlfaser gesperrt und dient der Zufuhr von wäßrigen Probelösungen, beispielweise Körperflüssigkeiten. Spektroskopische Messungen erfolgen mit Hilfe handelsüblicher Spektralphotometer bzw. Mikrospektral­ photometer, wobei die Strahlrichtung quer zur Hohlfaser und zum Probenkanal liegt.

Ein wesentlicher Bestandteil des Verfahrens ist die spontane Aufkonzentrierung einer Enzymlösung nach Einfüllung in einer Hohlfaser, wobei die Hohlfaser aus porösem Material besteht und einen Innendurchmesser zwischen 0,05 und 0,5 mm aufweist. Die Porosität der Hohlfaserwand ist so gewählt, daß Enzymmole­ küle zurückgehalten werden und Analytmoleküle passieren.

Die Hohlfaser besteht beispielsweise aus regenerierter Zellu­ lose und weist einen Innendurchmesser von 0,2 mm und eine Wandstärke von 0,02 mm auf. Die Wandstärke kann dabei zwischen 0,005 und 0,1 mm variiert werden. Die Porengrößen sind normal­ verteilt und betragen im Mittel 3 nm. Die Durchlässigkeit für Moleküle wird mit der Angabe eines sog. Molekulargewicht-Cut-Off (MWCO) charakterisiert, bei welchen 90% des Enzyms über 17 Stunden bei 25°C zurückgehalten wird. Die MWCO-Wert der Hohlfaser für das Beispiel beträgt 18.000 Dalton. Die Zurück­ haltung nach unbegrenzter Zeit ist 100%ig für Moleküle, deren Molekulargewicht das 10-fache des MWCO-Wertes beträgt. Die Po­ rengröße muß entsprechend der Größe der Makromoleküle angepaßt sein.

Nach Einfüllung der wäßrigen Probenlösung in die trockene Hohlfaser wird Wasser durch das poröse Wandmaterial der Lösung entzogen und dampft von der Faseroberfläche ab. Die Flüssig­ keitssäule in der Faser schrumpft und das Enzym wird dabei aufkonzentriert. Die Geschwindigkeit der Aufkonzentrierung hängt von der Temperatur, Luftdruck und Luftfeuchtigkeit ab. Im Beispiel wurde unter normalen Raumbedingungen die Schrump­ fung der Flüssigkeitssäule von 10 mm auf 0,2 mm innerhalb einer Minute beobachtet. Dies entspricht einer fünfzigfachen Aufkonzentrierung der Enzymlösung.

Eine vollständige Austrocknung des Enzyms läßt sich durch den Zusatz von Glycerin (maximal 10%) vermeiden. Alternativ könn­ ten z. B. Zuckeralkohole oder Acyllactylate eingesetzt werden.

Anschließend werden die durch Aufkonzentrierung entleerten Ab­ schnitte der Faser abgeklemmt, um eine erneute Aufnahme von Wasser und Verdünnung der Enzymlösung zu verhindern. Die zu messende Probelösung wird mit der Außenoberfläche der Hohlfaser in Kontakt gebracht. Dadurch können kleinmolekuläre Analyten in die Faser hineindiffundieren und am vorgelegten Enzym binden. Spektroskopische Messungen in Transmissiongeome­ trie erfolgen quer durch die Faser.

Beispiel 1

Nach erfindungsgemäße Immobilisierung von Salicylathydroxylase konnte Salicylat in wäßrigen Medien einschließlich Serum und Blut in den Konzentrationsbereich von 0.1 bis 10 mM bestimmt werden. Aus der gemessenen Absorptionswerte und der bekannten Extinktionskoeffizient für Flavoenzyme läßt sich eine Enzym­ konzentration von etwa 1 mM (50 g/l) berechnen

Beispiel 2

Nach erfindungsgemäßer Immobilisierung von Theophyllinoxidase konnte Theophyllin in wäßrigen Lösungen in den Konzentrations­ bereich von 0,05 bis 5 µM bestimmt werden. Aus der gemessenen Absorptionswerte und der bekannten Extinktionskoeffizient für Hämenzyme läßt sich eine Enzymkonzentration von etwa 0,2 mM berechnen.

Beispiel 3

Nach erfindungsgemäßer Immobilisierung von oxidiertem Hämoglo­ bin konnte CN⁻ in wäßrigen Lösungen in den Konzentrationsbe­ reich 0,5 bis 50 nM bestimmt werden. Aus den gemessenen Ab­ sorptionswerten und dem bekannten Extinktionskoeffizient für Hämoglobin läßt sich eine Proteinkonzentration von etwa 0,07 mM (4.5 g/l) berechnen.

Desweiteren ist die Methode auch mit anderen Makromolekülen einsetzbar. Beispielsweise wäre die Methode auch zur Immobili­ sierung eines an einem wasserlöslichen Polymer gebundenen pH-Indikators geeignet, um pH-Bestimmungen durch spektroskopische Messungen durchzuführen.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung einer Probe aus immobilisierten Makromolekülen, wobei eine niedrigkonzentrierte Lösung der Makromoleküle in eine poröse Hohlfaser (1) gefüllt wird und sich spontan aufkonzentriert, wobei die Wiederverdünnung der Lösung durch anschließendes Abklemmen der Hohlfaser (1) verhindert wird und wobei das Hinausdiffundieren der Ma­ kromoleküle durch eine vorgegebene Porengröße der porösen Hohlfaser (1) verhindert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Makromolekül ein Enzym verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Hohlfaser (1) aus Zellulose verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hohl­ faser (1) einen Innendurchmesser von 0,1 bis 0,3 mm, eine Wandstärke von 0,01 bis 0,02 mm aufweist.

5. Verwendung einer Probe hergestellt nach einem Verfahren ge­ mäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Nachweis von kleinmole­ kulären Substanzen die mit dem immobilisierten Makromolekül in Wechselwirkung treten.