DE19620636A1 - Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biochemischer Affinitätsverfahren und Verfahren zum Betreiben der Vorrichtung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchfüh­ rung chemischer oder biochemischer Affinitätsverfah­ ren sowie ein Verfahren zum Betreiben einer derarti­ gen Vorrichtung. Bei Affinitätsverfahren nutzt man die spezifische Affinität eines Reaktionspartners, der auf der Oberfläche einer festen Phase (Träger) fixiert (immobilisiert) ist, um aus einem Substanzge­ misch die spezifisch passende Komponente selektiv zu binden. Die übrigen Stoffe können anschließend leicht z. B. durch Waschen abgetrennt werden. Zu den ver­ breitetsten Affinitätsverfahren zählen Immunoassay und Affinitätschromatographie.

In der Affinitätschromatographie wird nach dem Ent­ fernen der nicht gebundenen Substanzen der Wertstoff gezielt abgelöst (eluiert) und im Idealfall als Rein­ stoff gewonnen. In der Regel hat gleichzeitig eine Aufkonzentrierung stattgefunden.

Der Immunoassay ist eine Technik zum Nachweis von Substanzen (z. B. Proteine, Bakterien, Viren, Toxine usw.) auf der Basis einer Antigen-Antikörperreaktion. Antikörper sind Proteine, die selektiv ihr entspre­ chendes Antigen (Substanzen, die eine Immunantwort auslösen) binden.

Für Immunoassays und affinitätschromatographische Anwendungen existiert eine Reihe von unterschiedli­ chen Trägermaterialien (Festphasen). Während in der Affinitätschromatographie anorganische und organische Trägermaterialien wie Agarose oder Silikagel in Form von Kugeln oder unregelmäßig geformten Partikeln als Säulenmaterialien eingesetzt werden, ist bei Immuno­ assays die Mikrotiterplatte aus Polystyrol als feste Phase am weitesten verbreitet. In manchen Fällen kom­ men auch Immunoassays auf der Basis von Membranen (z. B. aus Nylon oder Nitrocellulose), Glasplättchen, poröse Glas- oder Silikagelpartikel sowie Latexkügel­ chen zur Anwendung.

Nachteilig beim Stand der Technik ist die Tatsache, daß die zumeist planare Anordnung des Trägers insbe­ sondere bei Immunoassays keine effektive - insbeson­ dere automatische - Betriebsweise der Vorrichtungen gestattet und daß das Verhältnis zwischen aktiver Oberfläche und Probenvolumen zu niedrig ist.

In der Affinitätschromatographie werden säulenförmige Vorrichtungen verwendet, welche mit porösen Träger­ substanzen (Säulenmaterialien), beispielsweise in Kugelform, gefüllt sind. Derartige Vorrichtungen haben allerdings den Nachteil, daß die Diffusionswege aufgrund der inneren Oberfläche der Trägersubstanzen sehr lang sind. Dadurch wird in der Regel nur ein Teil der tatsächlich vorhandenen Oberfläche zur An­ bindung des Wertstoffes genutzt.

Ein weiterer Nachteil von gepackten Säulen ist der hohe Druckabfall in der Schüttung. Deshalb werden zum Betreiben solcher Vorrichtungen leistungsfähige Pum­ pen benötigt, die hohe Investitions- und Betriebskos­ ten verursachen. Aufgrund der Strömungsführung in der gepackten Säule ist zusätzlich eine breite Verweil­ zeitverteilung gegeben. Die zur Verfügung stehende Oberfläche ist bei gepackten Säulen geometrisch nicht genau definiert. Abweichungen in der Anreicherungs­ leistung können deshalb auch bei formal gleichen Säu­ len auftreten. Außerdem ist oft eine hohe unspezifi­ sche Adsorption zu beobachten.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung chemi­ scher oder biochemischer Affinitätsverfahren zu schaffen, die ein günstiges Verhältnis zwischen Trä­ geroberfläche und Probenvolumen sowie eine enge Ver­ weilzeitverteilung gewährleistet, mit geringen Pump­ leistungen auskommt und reproduzierbare Charakteris­ tika aufweist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren für einen effektiven und automati­ sierbaren Betrieb dieser Vorrichtung zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit den kennzeichnenden Merkmalen des An­ spruchs 1 sowie hinsichtlich des Verfahrens für einen vorteilhaften Betrieb der Vorrichtung durch die kenn­ zeichnenden Merkmale des Anspruchs 9. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird gemäß Anspruch 1 als Träger­ material für eine Vorrichtung zur Durchführung chemi­ scher oder biochemischer Affinitätsverfahren ein rohrförmig ausgestalteter Träger mit auf der Träger­ innenwand immobilisiertem Affinitätssorbens verwen­ det. Eine derartige Vorrichtung eignet sich bei­ spielsweise als Festphase für die Durchführung von Immunoassays oder affinitätschromatographischen An­ wendungen.

Die erfindungsgemäße Rohrform erlaubt einen vorteil­ haften Betrieb der Vorrichtung im Durchflußverfahren. Dies erleichtert eine Automatisierung von Immunoas­ says.

Das rohrförmige Trägermaterial gewährleistet darüber hinaus ein optimales Verhältnis zwischen Trägerober­ fläche und Probenvolumen. Insbesondere kann der Trä­ gerdurchmesser frei gewählt werden, wodurch das Ver­ hältnis zwischen aktiver Oberfläche und benötigtem Probenvolumen vorteilhaft eingestellt werden kann. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von kapil­ laren Trägern, welche sich durch ihr äußerst günsti­ ges Verhältnis zwischen aktiver Oberfläche und Pro­ benvolumen auszeichnen. Zur Steigerung des Durchsat­ zes kann der Rohrdurchmesser aber auch vergrößert werden.

Da das Affinitätssorbens erfindungsgemäß auf der Trä­ gerinnenwand immobilisiert ist, werden keine Säulen­ materialien benötigt. Aus diesem Grund wird die Strö­ mung durch den rohrförmigen Träger hindurch nicht durch Säulenmaterialien beeinflußt und der Druckwi­ derstand ist gering. Die Folge sind eine enge Ver­ weilzeitverteilung sowie geringe benötigte Probenvo­ lumina. Zudem werden die Diffusionswege zwischen den Affinitätspartnern, im Vergleich zu porösen Säulen­ materialien, kurz und man erhält eine geometrisch gut definierte Oberfläche. Letztere gewährleistet eine gute Reproduzierbarkeit von Immunoassys.

Bevorzugt sind erfindungsgemäße rohrförmige Träger aus Glas. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Träger aus aufgeschmolzenem Siliziumdioxid (Fused Si­ lica). Fused Silica zeichnet sich durch eine sehr hohe Reinheit aus. Ein Vorteil von kommerziell er­ hältlichen, ummantelten Kapillaren aus Fused Silica ist ihre hohe Biegsamkeit und mechanische Stabilität.

Zur Verbesserung der Immobilisierung des Affinitäts­ sorbens ist es äußerst vorteilhaft, das Glas oder Fused Silica erfindungsgemäß in einem vorgeschalteten Aufschlußverfahren zu aktivieren. Infolge des Auf­ schlußverfahrens weist die behandelte Oberfläche eine hohe Dichte an funktionellen Gruppen auf.

Eine Aktivierung kann beispielsweise dadurch erfol­ gen, daß die Oberflächen des Fused Silica hydroxy­ liert werden. Dies kann mit einer guten Reproduzier­ barkeit bevorzugt durch einen hydrothermalen alkali­ schen Aufschluß geschehen. Durch die Schaffung freier Hydroxylgruppen auf der Oberfläche können beispiels­ weise Proteine kovalent immobilisiert werden. Außer­ dem ist überraschenderweise eine starke Verminderung von unspezifischen Absorptionen zu beobachten.

Neben Gläsern könnten auch andere Stoffe, beispiels­ weise Polymere wie Polystyrol, als erfindungsgemäßes rohrförmiges Trägermaterial eingesetzt werden. Die Trägerinnenwand kann zur Vorbereitung auf die Immobi­ lisierung eines Affinitätssorbens vorbehandelt sein.

Als immobilisiertes Affinitätssorbens eignet sich beispielsweise eine Komponente eines biochemischen Affinitätspaares, z. B. ein Partner der Systeme Anti­ gen/Antikörper, Enzym/Substrat, Rezeptor/Hormon, Koh­ lenhydrat/Lectin oder Nucleinsäure/komplementäre Nu­ cleinsäure. Weitere geeignete immobilisierte Affini­ tätssorbensien sind Komplexliganden, die selektiv bestimmte Metallionen binden oder Wirtskomplexe, die Gastmoleküle aufnehmen können. Die Immobilisierung des Affinitätssorbens kann adsorptiv oder kovalent erfolgen.

Vorteilhafterweise können mehrere rohrförmige Träger parallel nebeneinander angeordnet werden. Eine der­ artige Bündelanordnung erlaubt die gleichzeitige Durchführung mehrerer Affinitätsverfahren. Der Durch­ satz kann auf diese Weise gesteigert werden. Außerdem lassen sich beispielsweise gleichzeitig unterschied­ liche Immunoassays durchführen, und so innerhalb kur­ zer Zeit verschiedene Komponenten einer Lösung iden­ tifizieren. Je nach Anwendung sind auf den Trägerin­ nenwänden gleiche oder unterschiedliche Affinitäts­ sorbensien immobilisiert.

Das Betreiben einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Durchflußverfahren stellt eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung dieser Erfindung dar. So können Pipet­ tierroboter, welche zur automatischen Durchführung von beispielsweise Immunoassays weit verbreitet sind, durch einfache und kostengünstige Durchflußsys­ teme ersetzt werden.

Ein erfindungsgemäßes Durchflußverfahren zum Betrei­ ben einer rohrförmigen Vorrichtung mit an der Innen­ wand immobilisiertem Affinitätssorbens umfaßt zu­ nächst einen Schritt der Inkubation einer Probelö­ sung. Unter Inkubation versteht man sowohl den Kon­ takt des fließenden wie auch des stehenden Mediums mit dem erfindungsgemäßen Träger. Anschließend kann ein Schritt der Inkubation einer Reagenzlösung fol­ gen. Die Reagenzlösung enthält bei einem Immunoassay beispielsweise einen enzym-markierten Antikörper, welcher in der nachfolgend zugesetzten Substratlösung eine spezifische Indikatorreaktion katalysiert. Die Reaktionsprodukte dieser Reaktion werden anschlie­ ßend, z. B. als Indiz für die Anwesenheit der zu ana­ lysierenden Substanz in der Probelösung, nachgewiesen (Enzyme linked immunosorbent assay-Test, ELISA-Test).

Abschließend kann ein Regenerationsschritt erfolgen, durch welchen die immobilisierte Komponente des Af­ finitätssystems erneuert wird. Bei affinitätschroma­ tographischen Anwendungen besteht der Regenerations­ schritt in der Elution des gebundenen Affinitätspart­ ners.

Nach einem Regenerationsschritt kann ein neuer Ver­ fahrenszyklus begonnen werden. Somit können aufeinan­ derfolgend mehrere Verfahrenszyklen durchgeführt wer­ den. Dies ist insbesondere auch auf automatische Weise möglich. Vorteilhafterweise wird nach mindes­ tens einem, bevorzugt nach jedem, der Verfahrens­ schritte ein Waschschritt durchgeführt.

Mit Hilfe mehrerer, nebeneinander angeordneter rohr­ förmiger Träger lassen sich mehrere Affinitätsverfah­ ren gleichzeitig durchführen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines ausge­ wählten Ausführungsbeispiels näher illustriert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der Oberflä­ che einer Fused Silica Kapillare vor der Behandlung mit einem Aufschlußverfahren,

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Oberflä­ che einer Fused Silica Kapillare nach der Behandlung mit einem Aufschlußverfahren, und

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines auf der Oberfläche einer Fused Silica Kapillare immobilisierten Affinitätssorbens.

Kapillaren aus Fused Silica, wie sie aus der Gas­ chromatographie bekannt sind, können durch ein Auf­ schlußverfahren reproduzierbar aktiviert werden, so daß sie als Festphase in Immunoassays oder in der Affinitätschromatographie eingesetzt werden können. Die immunologisch wirksame Rezeptorschicht wird durch kovalente Bindung auf die innere Oberfläche der Ka­ pillare aufgebracht. Kommerziell erhältliche Fused Silica Kapillaren bestehen aus reinem SiO₂ und werden bei 2000°C aus der Schmelze gezogen. Durch die Umhül­ lung der Kapillaren mit einem Mantel aus Polyimid werden sie biegsam. Aufgrund der extremen Herstel­ lungsbedingungen befinden sich auf der Oberfläche der Kapillaren keine bzw. nur wenige freie Hydroxylgrup­ pen (Fig. 1). Um Proteine (z. B. Antikörper) besser kovalent auf der inneren Oberfläche fixieren (immobi­ lisieren) zu können, werden die Kapillaren zunächst hydroxyliert, d. h. es werden freie Hydroxylgruppen auf der Oberfläche geschaffen (Fig. 2). Über diese Hydroxylgruppen können durch Umsetzung mit Organosi­ lanen organofunktionelle Gruppen eingeführt werden, an welche Proteine gekoppelt werden (Fig. 3).

Zur Kopplung von Proteinen an organofunktionelle Gruppen auf anorganischen Oberflächen sind in der Literatur verschiedene Verfahren beschrieben worden, die prinzipiell alle auch auf aktivierte Fused Silica Kapillaren übertragen werden können.

Das Aufschlußverfahren sollte so optimiert sein, daß einerseits eine ausreichende Dichte an Hydroxylgrup­ pen auf der inneren Oberfläche der Kapillare ge­ schaffen wird, andererseits aber die Biegsamkeit und die mechanische Stabilität der Kapillaren erhalten bleibt. Nachfolgend wird ein geeignetes Aufschlußver­ fahren näher beschrieben.

Durch einen hydrothermalen alkalischen Aufschluß las­ sen sich Fused Silica Kapillaren reproduzierbar hy­ droxylieren, ohne daß sie an Flexibilität oder mecha­ nischer Stabilität einbüßen. Ein Stück Fused Silica Kapillare wird zu 75% mit einer 0,01 molaren Kalium­ hydroxidlösung gefüllt und an beiden Enden mit einen Acetylenschweißbrenner abgeschmolzen. Die Kapillare wird 10 Stunden bei 200°C getempert, auf Raumtempera­ tur abgekühlt und 5 Minuten im Durchfluß mit destil­ liertem Wasser gespült. Die hydroxylierte Kapillare kann - mit Wasser gefüllt - unbegrenzt gelagert wer­ den.

Im folgenden wird eine mögliche Vorgehensweise be­ schrieben, um ein Protein auf der Oberfläche der hy­ droxylierten Fused Silica Kapillare kovalent zu immo­ bilisieren.

Die hydroxylierte Kapillare wird mit einer 5-%igen wäßrigen 3-2-(Aminoethylamino)-propyltrimethoxysilan­ lösung (12 Stunden bei 85°C) silanisiert und an­ schließend mit Wasser im Durchfluß gespült. Nach Ak­ tivierung mit einer 2,5-%igen Glutardialdehydlösung (1 Stunde bei Raumtemperatur) wird die mit PBS (phos­ phat buffered saline) gespülte Kapillare beispiels­ weise für die immunologische Detektion von T-2 Toxin mit einer Lösung aus T-2 Toxin-BSA-Konjugat in PBS (200 µg/ml) gefüllt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend muß die Kapillare noch 30 Minuten mit einem Blocking-Protein behandelt wer­ den, um noch vorhandene freie Bindungsstellen abzu­ sättigen.

Nachfolgend soll ein Verfahren zum Betreiben einer derart präparierten Kapillare für die Fließinjek­ tionsanalyse (Durchflußverfahren) näher ausgeführt werden. Das Prinzip beruht auf einem indirekt kompe­ titiven ELISA-Test zum Nachweis von T-2 Toxin.

Die zu analysierende Probelösung ist mit anti-T-2 Toxin Antikörpern und anti-Maus-IgG-Urease-Konjugat zu versetzen. Die Lösung wird nach 20 Minuten für 5 Minuten mit der Kapillare in Kontakt gebracht. Ent­ hält die Probe kein Toxin, bindet der Komplex aus anti-T-2 Toxin Antikörper und anti-Maus-IgG-Urease- Konjugat an die auf der Oberfläche der Kapillare im­ mobilisierten Toxinmoleküle an. Enthält die Probe Toxin, werden die Bindungsstellen der anti-T-2 Toxin Antikörper mit freiem Toxin abgesättigt. Der Komplex aus anti-T-2 Toxin Antikörpern und anti-Maus-IgG-Ure­ ase-Konjugat kann nun nicht mehr an der Kapillarober­ fläche anbinden und wird im nachfolgenden Wasch­ schritt (Dauer 1,5 Min.) ausgespült. Anschließend erfolgt die Inkubation der Substratlösung für 20 Min. Die Substratlösung enthält Natriumchlorid, Kalium­ chlorid, Harnstoff und sauer reagierende BSA (bovine serum albumin), so daß sich reproduzierbar ein pH- Wert zwischen 5,4 und 5,6 einstellt. Enthält die Pro­ be kein Toxin, spaltet die an die Kappilaroberfläche gebundene Urease den Harnstoffin NH₃ und CO₂, wo­ durch der pH-Wert der Substratlösung ansteigt. Dieser Anstieg des pH-Wertes kann als Indiz dafür gelten, daß Toxin nicht vorhanden ist und z. B. durch ein Ar­ ray aus zwei ionensensitiven Feldeffekttransistoren nachgewiesen werden. Nach einem erneuten Waschschritt folgt die Inkubation der Regenerationslösung zur Vor­ bereitung der Kapillare für den nächsten Analysezyk­ lus. Ein derartiger Analysezyklus dauert einschließ­ lich der Regeneration der Rezeptorschicht ungefähr 40 Minuten.

Claims (13)

1. Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biochemischer Affinitätsverfahren bestehend aus Träger und darauf immobilisiertem Affinitätssor­ bens, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger rohrförmig ausgestaltet ist und das Affinitätssorbens auf der Innenwand des Trä­ gers immobilisiert ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Träger als Kapillare ausgestaltet ist.

3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Glas besteht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Träger aus aufgeschmolzenem Quarzglas (Fused Silica) besteht.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in einem Aufschlußverfahren ak­ tiviert ist und nach der Aktivierung freie Hy­ droxylgruppen aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Affinitätssorbens eine Komponente der Systeme Antigen/Antikörper, Enzym/Substrat, Rezeptor/Hormon, Kohlenhydrat/ Lectin, Nucleinsäure/komplementäre Nucleinsäure, Metallion-Komplexligand oder Wirtsmolekül-Gast­ molekül-Komplex ist.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Träger parallel nebeneinan­ der angeordnet sind und auf den Trägerinnenwän­ den entweder unterschiedliche oder zumindest teilweise gleiche Affinitätssorbensien immobili­ siert sind.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Vorrichtung zur Durch­ führung eines Immunoassays oder einer Affini­ tätschromatographie ist.

9. Verfahren zum Betreiben einer Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biochemischer Af­ finitätsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein rohrförmiger Träger mit an der Träger­ innenwand immobilisiertem Affinitätssorbens im Durchflußverfahren betrieben wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, daß das Durchflußverfahren einen Schritt der Inkubation einer Probelösung sowie mindestens einen der Schritte Inkubation einer Reagenzlö­ sung und/oder Inkubation einer Substratlösung und/oder Inkubation einer Regenerationslösung umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich­ net, daß im Anschluß an mindestens einen der Verfah­ rensschritte ein Waschschritt folgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Verfahrenszyklen in automatisierter Weise hintereinander durchgeführt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe mehrerer nebeneinander angeordne­ ter rohrförmiger Träger, die entweder unter­ schiedliche oder zumindest teilweise gleiche Af­ finitätssorbensien aufweisen, mehrere Affini­ tätsverfahren gleichzeitig durchgeführt werden.