DE10242183A1 - Elektrochemischer markierungsfreier Assay für die Detektion der DNA-Hybridisierung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt einen DNA-Hybridisierungs-Assay. Seine Wirkung beruht auf einem neuen Effekt einer elektrokatalytischen Aktivität einer einsträngigen DNA, die auf einer Elektrode immobilisiert wird. Im Gegensatz hierzu zeigt die doppelsträngige DNA keine elektrokatalytische Aktivität. Die unterschiedlichen elektrochemischen Eigenschaften ein- und doppelsträngiger DNA erlauben es, eine DNA mit einem Bereich bestimmter Nukleotidsequenz qualitativ oder quantitativ nachzuweisen.

Description

• Der Nachweis bestimmter Nukleotidensequenzen ist für bioanalytische Anwendungen von großer Bedeutung; in den nachfolgenden Patenten ist eine Reihe solcher Sequenzen beschrieben:
  EP1132398, EP1135510, US6287764, JP8191695, US6271444, US6271016, US6271011, IL103766, IL98941, JP2001128679, WO0155426, WO0155377, WO0155374, US6268549, EP1123976, JP2001103988, US2001011078, EP1122315, JP2001095581, JP2001078788, TW394776, WO0151631, WO0149828, EP1118670, US6262342, US6262244, US6255473, US6255113, US6255077, US6255078, US6255077, US6255064, TW420688, WO0146250, WO0146249, WO0146246, WO0146226, WO0146225, WO0146224, US6252140, US6252136, US6252046, US6251862, US6251664, US6251648, US6251634, US6251607, US6251586, US6251403, US6248589, US6248574, US6248554, US6248333, TW413702, TW402638, EP1112358, CN1300852, WO0144484, WO0144477, EP1110969, WO0142481, WO0142452, WO0142448, WO0142447, US6245515, US6242221, US6242218, US6242193, RU2146705, RU2146292, RU2146290, EP1108784, WO0140301, WO0139797, US6239331, US6238924, US6238918, US6238669, EP1106687, EP1105423, CN1295081, CN1295126, CN1296015, US6235888, US6235514, US6235482, US6235290, US6232110, US6232106, US6231863, CZ287715, CZ287619, WO0136457, WO0136456, WO0136455, WO0136442, US6229005, US6228609, US6225532, WO0132693, US6221849, US6221676, US6221640, IE62261L, IE64966L, IE63126L, CZ20003421, CZ20001874, CZ20000867, CZ287810, AU731347, WO0129200, WO0129188, WO0129082, US6218520, US6218508, US6218107, CZ9903146, CZ9700491, CZ9700490, CZ9700488, CZ9005008, CZ286304, CZ286303, CZ286302, IE370289L, US6215048, US6215042, US6211432, US6210943, US6197500, IE174387L, IE157289L, IE126185L, IE60488L, EP1094069, WO0125441, WO0125417, WO0125278, WO0124832, US6194211, US6187548, US6172186, EP1092773, US6207810, US6207436, EP1076720, NZ287563, JP11290080, NZ314127, EP1043407, JP11192089, CA2063316, EP0978570, US5370998, US5183737, US6054275, FR2768747, EP1132398, NZ208282, AU7156100, EP1132398, IE913456, GR3024963T, WO9206198, EP0551324, CA2091984, AU8656691, AU660945, JP9252787, FR2722509, EP0756006, CA2178526, US5656457, PL344145, CN1291651, EP1096013, WO0100847, JP6046867, NZ229954, NZ260101, JP8116998, JP6169779, FR2768747, US5215917, EP0391319, CA2013581, DK230890. Der Nachweis bestimmter Sequenzen der Nukleinsäuren hat große Zukunftsperspektiven für den Nachweis von Pathognen, der Entschlüsselung von genetischen Faktoren bei Erkrankungen, der Verbesserung der Diagnostik und der Behandlung von Krankheiten, den Nachweis biologischer Kampfstoffe, den Nachweis genetischer Veränderungen, für forensische Untersuchungen usw..
• Zum Nachweis von Nukleotidensequenzen oder deren genetischer Veränderungen sind unterschiedliche Verfahren bekannt. Hierzu zählt auch die Nukleinsäure-Hybridisierung. Unter einer Hybridisierung versteht man allgemein die unter bestimmten Voraussetzungen durch Basenpaarung bewirkte Ausbildung doppelsträngiger Nukleinsäuren aus zwei vollständig von einander getrennten, einsträngigen Nukleinsäuremolekülen. Dabei wird zwischen DNA-DNA-Hybridisierung, DNA-RNA-Hybridisierung, PNA-DNA-Hybridisierung, PNA-RNA-Hybridisierung und PNA-PNA-Hybridisierung unterschieden. Die Hybridisierungsassays sind beispielsweise in nachfolgenden Patenten beschrieben: US5653939, EP0402917, WO9951778, US6087100, US6090933, US6071699, US6096273, DE 20111754 , DE20111754, WO2001068913, JP2001299393, US2001046678, JP2000124771, US6300058, WO9315221, WO2001073121, WO2001073118, WO2001068916, WO2001025759, WO2001009388, WO9902730, WO9704129, EP286195, WO9102981, WO2001075166, WO2001021635, WO2001009378, JP2001033456, WO2000075276, WO2000062047, US6060237, JP2000125865, WO9606946, EP295965, WO8702066, US6054274, DE19946296.
• Die Hochdurchsatz-DNA-Assay, die auf der DNA-Chip Technologie basierenden, haben sich als ein Hauptwerkzeug der weltweiten Forschung durchgesetzt. Diese Systeme basieren auf Fluoreszenz-Methoden. Dennoch sind die heutigen Untersuchungssysteme durch die Kosten, Bedienbarkeit und ihre Flexibilität beschränkt. Die Elektrochemie kann als Alternative zu den auf Fluoreszenz basierenden DNA-Chips, eine neue Technologie anbieten. Überdies haben die elektrochemischen Systemen den Vorteil der geringen Kosten, leichter Bauweise; ferner ist es möglich sie zu miniaturisieren ohne Verluste bei der Empfindlichkeit in Kauf zu nehmen. In den letzten Jahren konnte eine intensive Entwicklung vieler neuer elektrochemischer DNA-Analyse- bzw. Sensoring-Systemen beobachtet werden. Eine ausführlichere Abhandlung dieser Methoden bzw. Systeme wurde kürzlich von Kuhr und Palecek verfaßt [Nature Biotechnol., 2000, 18, 1042.; Anal. Chem., 2001, 73, 75A.2].
• Das Prinzip des elektrochemischen Nachweises der DNA-Sequenz beruht im Allgemeinen auf der Messung der Bindevorgänge, d.h. der Hybridisierung zwischen der ssDNA, gebunden an die Elektrodenoberfläche und seinem komplementären Teil.
• Viele Lösungsansätze sind für den elektrochemischen Nachweis der Nukleotidsequenz vorgeschlagen worden:
• (1) Registrierung der elektrischen Signale bei der irreversiblen Oxidation von Adenin bzw. Guanin od. Deoxyribose mit od. ohne elektrochemischen Katalysator [Anal. Chem., 1999, 71, 1919, and literature cited therein; Anal. Chem., 2000, 72, 3764; Langmuir, 1997, 13, 6342; Bioconjugate Chem., 1997, 8,, 906].
• (2) Benutzung der elektrochemisch aktiven Verbindungen als DNA-Markierung, z.B. Ferrocene Chem. Commun., 1997, 1609) oder thermostabilen Enzymen, die diese Verbindungen bilden bzw. zerstören [J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 769].
• (3) Benutzung der spezifischen Wechselwirkung von DNA mit elektrochemisch aktiven Markern, einschl. Intercollatoren [Anal. Chem, 2000, 72, 1334; Anal. Chem, 1994, 66, 3830; Nature Biotechnology, 2000, 18, 1096] und elektrostatischer Adsorption [Anal. Chem, 1998, 70, 4670];
• (4) Registrierung der Veränderungen elektrischer Eigenschaften der DNA auf der Elektrode, die mit der Hydratisierung einhergehen [Sens. & Actus, B, 2000, 68, 100; PCT WO99/42827; Anal. Chim. Acta, 1999, 402, 7; Synthetic Metals, 1999, 100, 89].
• Als Nachteil wirkt sich aus, dass die Reduktion und die Oxidation der DNA sich bei relativ hohen bzw. niedrigen Potentialen vollzieht; hierbei kann die Messung nur an bestimmten, (z.B. Hg-Elektroden) durchgeführt werden. Die Benutzung der Markierung ermöglicht es die Messungen bei "bequemeren" Potentialen durchzuführen, erschwert jedoch die Zubereitung der Proben und die Durchführung der DNA-Analyse. Die einzige elektrochemische Methode, die nach Firmenangeben bald kommerzialisiert wird, ist die Benutzung der Ferrocenemarkierten DNA-Reportern [Science, 1998, 282, 396]. Jedoch haben diese DNA eine ungenügende chemische Stabilität.
• Beschreibung
• Die folgende Abkürzungen werden benutzt:

ssDNA

einsträngige Nukleinsäure (allgemein), von der ein Strang mit der Thiogruppe modifiziert ist

HS-ssDNA

einsträngige Nukleinsäure (allgemein)

dsDNA

doppelsträngige Nukleinsäure

HS-dsDNA

doppelstrangige Nukleinsäure, von der ein Strang mit der Thiogruppe modifiziert ist

• Unter einer "einsträngigen Nukleinsäure" wird eine Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure oder Peptidnukleinsäure verstanden. "Doppelsträngige Nukleinsäure" bedeutet ein doppelsträngiges Hybrid aus beliebigen einsträngigen Nukleinsäuren.
• Die Messung nach dieser Methode hat somit die folgende Vorteile:
• • einfach
• • kostengünstig
• • schnell
• • markierungsfrei
• • Hybridisierung kann in Flüssigkeit, nicht ausschließlich auf der Oberfläche, stattfinden
• • Es werden keine radioaktiven, krebserregenden und hochgiftige Stoffe verwendet
• • sehr kleines Probenvolumen
• • kompatibel zum Array-Format
• • Goldelektroden können sowohl als Referenz- als auch als Arbeitselektrode verwendet werden
• Kurzbeschreibung der Abbildungen
• 1: Schematische Darstellung der Dünnfilm-Elektrode
• 2: Zyklische Voltammogramme von (a) HS-dsDNA modifizierten Goldelektroden, (b) HS-ssDNA (P1) modifizierten Goldelektroden; (c) unbeschichtete Goldelektrode. Messbedingungen: (A) 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆ in 1 mmol/L HEPES Puffer (pH 7.0); (B) 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆ in 100 mmol/L KCl und 1 mmol/L HEPES Puffer (pH 7.0).
• 3. Elektrochemische Impedanzspektren (–Z'' vs Z') der Goldelektrode (a) beschichtet mittels einer 10 μmol/L ds-DNA-Lösung; (b) unbeschitete Goldelektrode; (c) Elektrode beschichtet mittels einer 10 μmol/L ss-DNA-Lösung; gemessen in 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆ und 1 mmol/L HEPES, pH 7.0; (d) unbeschichtete Goldelektrode, gemessen in 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆, 100 mmol/L KCl und 1 mmol/L HEPES, pH 7.0.
• 4. Zyklische Voltammetrie der durch die ssDNA modifizierten Goldelektrode, gemessen in 10 mmol K₃Fe(CN)₆ and 1 mmol/L HEPES, pH 7.0. Die Beschichtung erfolgte mittels einer Lösung der ssDNA mit folgenden Konzentrationen: (a) 20 μm, (b) 10 μm, (c) 2 μm, (d) 0.2 μm (e) unbeschichtete Elektrode.
• 5. Zyklische Voltammetrie der durch die HS-dsDNA modifizierten Goldelektrode, gemessen in 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆ and 1 mmol/L HEPES, pH 7.0. Die Beschichtung erfolgte mittels einer Lösung der HS-dsDNA mit folgenden Konzentrationen: (a) 0, (b) 0.2, (c) 2, (d)10 mmol/L. Die eingefügte Abbildung stellt die Konzentationsabhängigkeit des Signals dar, die für den quantitativen Nachweis komplementärer DNA benutzt werden kann
• 6. Zyklische Voltammetrie der Goldelektroden, die durch eine vorhydratisierte Mischung der HS-ssDNA (Konzentration 10 μmol/L außer (d)) und 0 (a), 2 (b), 5 (c), 10 μmol/L (d, e) komplementärer ssDNA. Kurve (d) wurde ohne HS-ssDNA gemessen.
• Messtechnik: (A) Zyklische Voltammetrie, (B) Differentielle Puls-Voltammetrie. Messbedingungen: 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆, 1 mmol/L HEPES, pH 7.0.
• 1. Dünnfilmelektroden
• 1 ist eine schematische Darstellung der Dünnfilm-Elektrode, wie diese in dieser Arbeit verwendet wurde. Die Au-Arbeitselektroden wurden durch das typische photolythographisches Verfahren, verbunden mit der "lift-off"-Technologie vorbereitet. Als Arbeitselektrode können Stoffe wie Gold, Silber, Palladium u.a. Materialien benutzt werden. Die Auftragung der dünnen Metallfolie und Haftvermittlerschichten (z.B. 50 nm Ti oder 50 nm Pd und anschließend 150 nm Au) auf die oxidierte Silizium- oder auf Glasoberfläche kann durch die Metall-Bedämpfung oder r.f. sputtering durch eine Maske geschehen. Die Arbeitselektrode kann verschiedene Formen haben, z.B. kreisförmig, quadratisch, rechteckig, oval, u.ä. Die Größe der Elektroden kann im sub-μm bis mm-Bereich liegen. Die Elektrode wurde mit den Kontaktflächen durch dünne (z.B. 10 μm) Metallbänder verbunden; eine andere Konstruktion wurden auch verwendet. Die Elektroden wurden in folgenden Schritten gereinigt:
• 1) Ultraschallreinigung in Chloroform/Ethanol (1/1, v/v) oder in Aceton (Dauer: 5 min),
• 2) Ultraschallreinigung in dest. Wasser (Dauer: 5 min),
• 3) Eintauchen in eine frisch zubereitete, warme Lösung von konz. Schwefelsäure/ Wasserstoffperoxid 30% (3/1, v/v),
• 4) Gründliches Spülen mit doppelt-dest. Wasser
• 5) Trocknen mit N₂
• 2. DNA-Adsorption auf der Elektrode
• Die einsträngigen DNAs werden mittels der self-assembly-Technologie über eine Schwefel-Gold Bindung auf der Elektrode adsorbiert. In den meisten Versuchen wurde eine durch eine – SH Gruppe (durch -(CH₂)₆- spacer) modifizierte ss-DNA verwendet.
• Ein 1-μl Tropfen von verdünnter DNA in einem 5 mmol/L Phosphat-Buffer, 50 mmol/L NaCl, pH 7.0 wurde auf eine Elektrodenoberfläche aufgetragen und eine bestimmte Zeit in einer Kammer mit hoher Feuchtigkeit bei Raumtemperatur gelassen (das Verdampfen des Tropfens führt zu einer unspezifischen Absorption nichtmodifizierter DNA und dieses zu einer Verzerrung der Meßergebnisse, und sollte somit verhindert werden). Die Elektroden wurden anschließend gründlich mit 10 mmol/L HEPES Puffer pH 7.0 gespült, und für elektrochemische Messungen verwendet.
• Thiol-gekoppelte DNA-Duplexe wurden durch die Mischung äquimolarer Mengen HS-ssDNA und ihrer komplementärer DNA und der anschließenden Inkubation in 5 mmol/L Phosphatpuffer, 50 mmol/L NaCl für die Dauer von 10 min, hergestellt. Ein 1-μl- Tropfen der Lösung wurde im folgenden auf die Elektrodenoberfläche aufgetragen und eine bestimmte Zeit in einer Kammer mit hoher Feuchtigkeit inkubiert. Zum Schluß wurden die Elektroden mit einer Lösung 10 mmol/L HEPES Puffer pH 7.0 bis zu einer Temperatur von einigen Grad unter dem Schmelzpunkt der Probe, erhitzt, und dann konnten für elektrochemische Messungen verwendet werden.
• 3. Elektrochemische Messungen
• Elektrochemische Messungen (Zyklovoltammetrie (CV), Differentielle Pulsvoltammetrie (DPV), elektrochemische Impendanzmessungen, u.a.) wurden mittels eines elektrochemischen Analysators (Autolab) durchgeführt. Die meisten Messungen wurden mit Hilfe einer übliche drei-Elektroden Vorrichtung durchgeführt. Eine gesättigte Kalomel-Elektrode (SCE) und eine Platindraht wurden als Referenz- und Hilfselektrode verwendet.
• Eine spezielle Untersuchung konnte zeigen, dass gleiche Ergebnisse auch mit einem Zwei-Elektroden-System erzielt werden können, wobei als Referenzelektrode auch eine Elektrode aus einem Edelmetall, wie z.B. Gold dienen kann. Hierbei können beide Elektroden (Arbeitselektrode sowie die Referenzelektrode) gleichzeitig und auf der Oberfläche derselben festen Isolierunterlage, wie Glas od. Silizium mit Oxidschicht, hergestellt werden.
• Die elektrochemischen Messungen wurden in einer Lösung von 2–10 mmol/L K₃Fe(CN)₆, 2 mmol/L HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)) pH 7.0 mit einer Dauer von 10 min Entlüftungszeit mittels Stickstoff. Typische Potentialscan-Geschwindigkeit der zyklischen Voltammetrie waren 100 mV/s. Die Potentiale sind in Bezug zu SCE angegeben.
• Die typischen voltammetrischen Kurven der mit HS-modifiziertenssDNA und dsDNA beschichteten Elektroden, sowie unbeschichtete Goldelektroden sind auf 2A dargestellt. Die Messungen wurden in 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆ und in 1 mmol/L HEPES pH 7.0 durchgeführt. Zum Vergleich wurden die gleichen Elektroden in der gleichen Lösung unter Zusatz von 100 mmol/L KCl, gemessen (2B). Bei Fehlen von KCl in der Meßlösung, wie in 2A dargestellt, zeigte die zyklische Voltammetrie unbeschichteter Elektroden keine Redox-Aktivität. Hingegen zeigten die mit HS-ssDNA beschichteten Elektroden bei gleichen Bedingungen gut erkennbare und stark ausgebildete Peaks der Redox-Aktivität. Die mit HS-dsDNA beschichteten Goldelektroden zeigten keine elektrochemische Aktivität bei solchen Außenbedingungen. In einem Kontrollversuch wurde die elektrochemische Aktivität der ssDNA ohne Thiolgruppe auf dem 5'-Ende bei gleichen Bedingungen untersucht, eine Erhöhung der elektrochemischen Aktivität wurde nicht beobachtet.
• Die elektrochemische Impendanzspektroskopie kann auch zur Feststellung der Bildung von ssDNA und dsDNA – Monoschichten auf den Elektrodenoberflächen verwendet werden. Eine graphische Auftragung der gemessenen imaginären Impedanz (–Z'') vs. realer Impedanz (Z') (Nyquist Graph) für die ssDNA-, dsDNA-modifizierte Goldelektroden sowie für unbeschichtete Elektroden bei einem Potential von 0.1 V in der Messlösung von 10 mmol/L K₃Fe(CN)₆ und 1 mmol/L HEPES, pH 7 ist in 3 dargestellt. Man sieht, dass der Durchmesser des Halbkreises, der dem Reaktionswiderstand entspricht, für die mit HS-dsDNA modifizierte Elektrode (240 kOhm) größer ist, als jener für die unbeschichtete Elektrode (72 kOhm). Die Bildung der HS-ssDNA-Monoschicht verringert den Durchmesser bis auf 40 kOhm; diese Größe liegt nahe des Reaktionswiderstands für unbeschichtete Elektroden in Anwesenheit von 100 mmol/L KCl. Erstmals konnte durch diese Daten die elektrochemische Aktivität der HS-ssDNA gezeigt werden. Bis heute ist in der Literatur kein Hinweis auf diesen Effekt vorhanden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Anwendung dieses neuentdeckten Effekts.
• Folgende Beispiele illustrieren die Erfindung:
• Beispiel 1
• Elektrochemischer Nachweis der ssDNA, immobilisiert auf Goldelektroden Die Abhängigkeit des elektrochemischen Signals vom Bedeckungsgrad der Goldelektrode mit der ssDNA wurde mit Hilfe der Konzentrationsänderung der ssDNA in der Beschichtungslösung variiert, die Adsorptionszeit war konstant. Die gemessenen voltammetrischen Signale für diese Elektrode sind in 2 dargestellt. Die Erhöhung des Signals bei Konzentrationsanstieg zeigt, dass das Signal sich mit zunehmendem Bedeckungsgrad verstärkt.
• Beispiel 2
• Elektrochemischer Nachweis der dsDNA, immobilisiert auf Goldelektroden
• Die Substanz für die Messungen der dsDNA wurde hergestellt, in dem eine HS-ssDNA in Lösung mit seinem komplementären Einzelstrang hybridisiert wurde. Die Reaktion wurde in 5 mmol/L Phosphatbuffer mit 50 mmol/L KCl durchgeführt. Die auf diese Weise hergestellte HS-dsDNA wurde für die weitere Immobilisierung zu je einem 1μl-Tropfen auf jede Elektrode aufgetragen. 3 zeigt ein zyklisches Voltammogram von Goldelektroden, auf die HS-dsDNA aus Lösungen der Konzentration 0, 0.2, 2 and 10 M adsorbiert wurde. Der Reduktionspeak war monoton abhängig von der HS-dsDNA Konzentration. Diese Beobachtung kann die Grundlage für quantitative Messungen der HS-dsDNA Konzentration bilden.
• Beispiel 3
• Elektrochemische Detektion einer bestimmten Nukleotidsequenz
• Die Zubereitung der Proben erfolgte wie in Bsp. 2, mit dem Unterschied, dass die Konzentration der HS-dsDNA bei 10 μmol/L konstant war; die Konzentration der komplementären DNA variierte. Diese DNA-Proben wurden wie zuvor auf die Goldelektrode aufgetragen und in Anwesenheit von Ferro/Ferrocyanid elektrochemisch untersucht: Man stellte eine Abhängigkeit der elektrochemischen Aktivität von der Konzentration der komplementären DNA fest (4A, B). Diese Konzentrationsabhängigkeit ist die Grundlage für quantitative Messungen der Konzentration der DNA, die ein Bereich mit einer bestimmten Nukleotidsequenz beinhaltet.

Claims (18)

1. Verfahren zum Nachweis einer einsträngigen Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass aus der Erhöhung der Geschwindigkeit einer elektrochemischen Reaktion auf die Anwesenheit einer Nukleinsäure geschlossen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhöhung der Geschwindigkeit der elektrochemischen Reaktion bei einer Gesamt-Ionenkonzentration im Elektrolyt von unter 50 mmol/L stattfindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der elektrochemischen Reaktion eine wasserlösliche elektrochemisch aktive Verbindung oxidiert oder reduziert wird.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der elektrochemischen Reaktion Feno/Ferricyanid oxidiert/reduziert wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einsträngige Nukleinsäure über eine oder mehrere chemische Gruppen verfügt, die es ermöglichen, sie auf der Elektroden-Oberfläche zu adsorbieren.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Gruppe für die Anbindung an die Elektroden-Oberfläche Thiol, oder ein Edukt, das zu Thiol umgewandelt werden kann, wobei die Elektroden-Oberfläche aus Au, Pd, Ag, Cu, Pt oder GaAs besteht.
7. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure mit einer bestimmten Sequenz, in welchem die nachfolgenden Arbeitsschritte enthalten sind: – Hybridisierung mit einer einsträngigen Nukleinsäure einer bekannten Sequenz, die über eine chemische Gruppe für die Anbindung an die Elektroden-Oberfläche verfügt, – Adsorption von Substanzen aus dem vorhergehenden Schritt auf eine Elektroden-Oberfläche – Messung der Verringerung der Geschwindigkeit der elektrochemischen Reaktion im Vergleich mit einer einsträngigen nichthybridisierten Nukleinsäure.
8. Verfahren nach Ansprüch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung in wässeriger Lösung stattfindet.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in einem Elektrolyt mit einer gesamten Ionenkonzentration von unter 100 mmol/L, vorzugsweise unter 50 mmol/L, stattfindet.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in Anwesenheit von Feno/Ferricyanid stattfindet.
11. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure mit einer bestimmten Nukleotiden-Sequenz, in welchem die nachfolgenden Arbeitsschritte enthalten sind: – Hybridisierung mit einer zuvor auf einer Elektrode immobilisierten einsträngigen Nukleinsäure bekannter Sequenz, die über eine chemische Gruppe zur Anbindung an die Elektroden-Oberfläche verfügt, – Messung der Verminderung der Geschwindigkeit der elektrochemischen Reaktion im Vergleich mit einer einsträngigen Nukleinsärue ohne die Hybridisierung des zweiten Stranges
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung auf eine Elektrodenoberfläche stattfindet.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in einem Elektrolyt mit einer gesamten Ionenkonzentration von unter 100 mmol/L, vorzugsweise unter 50 mmol/L stattfindet.
14. Verfahren nach Ansprüch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in Anwesenheit der Feno/Ferricyanid stattfindet.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit, elektrochemischer Reaktion aus Strommessungen, Voltammetrie, Zyklovoltammetrie, Chronopotentiometrie, Chronoamperometrie, differentieller Pulsvoltammetrie, Impedanzmessung, Impedansspektroskopie, Kapazitätsmessungen, Messung der Pseudokapazität, Messung der Nichtlinearität der Impedanz oder der Reaktionswiderstandmessung bestimmt wird.
16. Verwendung des Verfahrens nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche für die Sequenzanalyse der Nukleinsäuren.
17. Verwendung des Verfahrens nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche in DNA (bzw. RNA oder PNA) – Arrays
18. Verwendung des Verfahrens nach einem oder mehreren der zuvor genannten Ansprüche in in der Tiermedizin, Humanmedizin, Biotechnologie, Kriminologie. Unter einer Nukleinsäure ist in den vorhergehenden Ansprüchen eine Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure oder Peptidnukleinsäure gemeint.