DE10332804A1

DE10332804A1 - Biosensor

Info

Publication number: DE10332804A1
Application number: DE2003132804
Authority: DE
Inventors: Bernard Mandrand; Agnès DUPONT-FILLIARD
Original assignee: Apibio SAS
Current assignee: Apibio SAS
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-03-03

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor, umfassend eine Hilfselektrode, eine Referenzelektrode und eine Arbeitselektrode, wobei die Gesamtanordnung, bestehend aus der Hilfselektrode, der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode, eine C¶2v¶ oder C¶s¶ symmetrische Anordnung aufweist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor, umfassend eine Hilfselektrode, eine Referenzelektrode und eine Arbeitselektrode, wobei die Gesamtanordnung, bestehend aus der Hilfselektrode, der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode eine lokale C₂- oder C_S-symmetrische Anordnung aufweist.
Die Bestimmung von Biomolekülen, beispielsweise genetischem Material von Pathogenen oder Nukleinsäuresequenzen zur Bestimmung von infektiösen Krankheiten, Gen- und Krebsscreening ist in der heutigen Biochemie und medizinischen Forschung immer wichtiger geworden.
Beispielsweise bieten Verfahren, die Sonden auf Nukleinsäurebasis verwenden, einige Vorteile hinsichtlich konventioneller mikrobiologischer oder immunobiologischer Verfahren zur Bestimmung von Organismen, wie sie von Nakamura und Bulund beschrieben wurden (J. Clinical Laboratory Analysis, 6, 73–83, 1992).

Die meisten bisher bekannten Verfahren basieren auf der Bestimmung von Signalen, die nach der Hybridisierung von Nukleinsäuresonden, beispielsweise nach verschiedenen Amplifizierungsschemata, wie Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), transkriptionsbasierter Amplifizierung, zyklischen Sondenreaktionen etc. erzeugt werden.

Die Sonden- oder Hybridisierungsassays basieren häufig auf dem Befestigen einer Oligonukleotidsonde an einer Oberfläche, um ein Zielnukleinsäuremolekül aus einer Probe einzufangen. Das Befestigen dieser Sonde an der Oberfläche wird durch die Ausbildung von kovalenten Bindungen oder durch eine Vielzahl passiver Absorptionsmechanismen erzielt.

Die immobilisierte Sonde ist in der Lage, spezifisch mit den Zielmolekülen wechselzuwirken, beispielsweise mit Nukleinsäuresequenzen in Lösung. Diese Wechselwirkung und nachfolgende Hybridisierung ermöglicht die Bestimmung der Zielsubstanz mittels unterschiedlicher Verfahren.

Das US Patent No. 6,355,429 offenbart eine optische Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit einer ersten Nukleinsäure in einer Probe, umfassend eine zweite Nukleinsäure, die komplementär zu der ersten Nukleinsäure ist und in der Lage ist, mit der ersten Nukleinsäure unter Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, wobei die zweite Nukleinsäure auf einem festem Träger immobilisiert ist und der feste Träger mit einer lichtreflektierenden Oberfläche ausgestattet ist, wobei die Hybridisierung der Probe mit der Zielnukleinsäure zu einer Veränderung in den lichtreflektierenden Eigenschaften führt, die als Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit der Zielnukleinsäuren in der Probe verwendet werden.

Der letzte Assayschritt, um die optischen Eigenschaften der Oberfläche zu verändern, wird durch Ausfällen eines Enzymsubstrats erreicht, das große Moleküle durch eine enzymabhängige Reaktion auf die Oberfläche ablagert. Das Ausfällen bedingt eine sichtbare Farbänderung von gold nach purpurrot, die durch optische Messverfahren detektiert werden kann.

Das US Patent No. 6,096,825 offenbart die Verwendung von elektrisch leitenden und elektroaktiv funktionalisierten, konjugierten Polypyrrolpolymeren, die mit einem ersten biologischen Molekül verbunden werden können. Diese Polypyrrolpolymere sind elektrisch leitfähig und bilden eine Elektrode. Das so verbundene erste biologische Molekül kann als Assay zur Bestimmung und/oder Extraktion eines zweiten biologischen Moleküls verwendet werden, das in der Lage ist, spezifisch mit dem besagten ersten biologischen Molekül wechselzuwirken, wodurch es die Gesamtleitfähigkeit der „Polymerelektrode" ändert. Ein großer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Veränderung des elektrochemischen Verhaltens im Vergleich zu einem Referenzpolymer so groß sein muss, dass die Gesamtempfindlichkeit eines derartigen Biochips verringert wird. Die Empfindlichkeit von diesen Biochips ist auf die Größenordnung von > 10¹¹ Moleküle/ml beschränkt.

Die WO 02/20838 offenbart ein Verfahren und System zur Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen in Proben, die eine Mischung von Nukleinsäuren enthalten. Auf einer festen Oberfläche ist eine Sonde befestigt, umfassend ein Oligonukleotid, das komplementär zu einem Segment der Zielnukleinsäure ist, und eine Probe, die nachfolgend mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird, an die das Oligonukleotid gebunden ist, wodurch es der Sonde ermöglicht wird, an die Zielnukleinsäure zu binden; gefolgt von einer Inkubation der gebundenen Zielnukleinsäure mit vier Nukleotidarten und einem Replikationsbiokatalysator, der eine vielsträngige Nukleinsäureanordnung bildet, wobei mindestens eine der Nukleotidarten durch einen Marker gebunden ist und der Marker auf der vielsträngigen Nukleinsäureanordnung detektiert wird, wodurch indirekt die Zielnukleinsäure detektiert wird. Die Bestimmung findet mittels einer Enzymreaktion mit Substraten statt, die danach auf der Oberfläche des festen Trägermaterials ausfallen. Das Ausfällen verringert die elektrische Leitfähigkeit der Oberfläche, die als eine Elektrode wirkt.

Die WO 01/11080 offenbart einen Biosensor auf einer bedruckten Leiterplatte, mit Sondenbiomolekülen, die an eine Arbeitselektrode gebunden sind. Die Sondenbiomoleküle sind in der Lage, Zielbiomoleküle in Proben zu bestimmen, wenn ein elektrisches Potential zwischen der Arbeitselektrode und der Referenzelektrode angelegt wird. Jedoch hat dieses System im Vergleich zu einem „klassischen" System mit drei Elektroden (Referenz-, Arbeits- und Hilfselektrode) nur zwei Elektroden (eine Referenz- und eine Arbeitselektrode), und ist deshalb weniger zuverlässig. Desweiteren erfordert dieser Aufbau ein komplexes Verbindungssystem, wenn mehrere Paare von Elektroden vorhanden sind, da jede Arbeitselektrode mit einer Referenzelektrode verbunden ist.

Ein Problem, das oft in der elektrochemischen Sensorik auftaucht, besteht darin, dass Metall-/ Metallionenelektroden recht unpraktisch bei der Verwendung in elektrochemischen Zellen oder in Lösungen sind. Deshalb wurden sogenannte „Quasi-Referenz-Elektroden" eingesetzt. Dies sind Pt- oder Ag- Drähte, die direkt in die Testlösung eintauchen und mäßig stabile und nicht sehr reproduzierbare Potentiale haben (P.J. Peerce et al, J. Electroanaly. Chem 108, 1980, pp 121–125). Jedoch zeigten elektrisch aufgebrachte Polyvinylferrocen-Filme ein konstantes und reproduzierbares Potential.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand deshalb in der Bereitstellung eines Biosensors für eine stabile und zuverlässige elektrochemische Bestimmung von biologischen Zielmolekülen in Lösung, der einfach anzuwenden, reproduzierbar und kosteneffektiv ist.

Diese Aufgabe wurde durch einen Biosensor gelöst, der eine Hilfselektrode, eine Referenzelektrode und eine Arbeitselektrode umfasst, wobei die Gesamtanordnung, bestehend aus der Hilfselektrode, der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode eine C₂- oder C_S-symmetrische Anordnung bildet. Die Befolgung der spezifischen C₂- oder C_S Symmetrie der lokalen Anordnung der Arbeitselektrode in Bezug auf die Referenz- und Hilfselektrode im Falle mehrerer Arbeitselektroden ist äußerst wichtig. Dabei werden identische Ströme und Potentiale von einer Vielzahl an Arbeitselektroden erhalten. Folglich ermöglicht diese Symmetrie unter einem Gesichtspunkt die Herstellung einer Vielzahl von identischen und reproduzierbaren Arbeitselektroden und unter einem anderen Gesichtspunkt die Durchführung von simultanen elektrochemischen Messungen, die in zuverlässiger Weise für jede Arbeitselektrode vergleichbar sind. Es ist besonders bevorzugt, alle drei oben genannten Elektroden in einer kreisförmigen KonAbbildungation anzuordnen, um – wie nachfolgend erklärt – die Oberfläche(n) von allen drei Elektroden durch ein einziges Tröpfchen eines vorher bestimmten Volumens einer Lösung zu bedecken, welche die zu analysierenden Moleküle umfasst. Üblicherweise hat das Tröpfchen ein Volumen von 20–100 Mikrolitern, bevorzugterweise von 30–70 Mikrolitern und am meisten bevorzugt von 40–60 Mikrolitern. In den meisten Fällen wird ein Tröpfchen verwendet, da ein Volumen von 50 Mikrolitern besitzt.

Es ist am meisten bevorzugt, dass der Biosensor eine Vielzahl an Arbeitselektroden umfasst. Dies ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung einer Vielzahl an unterschiedlichen Zielbiomolekülen, da jede einzelne Arbeitselektrode angepasst werden kann, um unterschiedliche Zielbiomoleküle zu bestimmen.

Bevorzugterweise ist die Zusammenstellung, bestehend aus der Hilfselektrode, der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode auf der Oberfläche der bedruckten Leiterplatte angeordnet. Dies ermöglicht eine einfache Herstellung des Biosensors und die Verwendung des Biosensors in standardisierten Vorrichtungen und Assays.

Es ist bevorzugt, dass das Verhältnis der Oberfläche der Hilfselektrode zu der Oberfläche oder der Summe der Oberflächen der Arbeitselektrode(n) des Biosensors im Bereich von 1 bis 10, aufweist, bevorzugter im Bereich von 2 bis 6, weiter bevorzugt von 3 bis 5. Die Bedingungen, die für die Oberfläche und die Größe der Hilfselektrode gewählt werden, ermöglichen die maximale Optimierung des Transfers von Elektronen, der bei der Arbeitselektrode stattfindet. Es wurde beobachtet, dass überhaupt keine Beschränkung des Elektronentransfers auftritt, wenn eine Hilfselektrode verwendet wird, deren Oberfläche größer ist als die Oberfläche der Arbeitselektrode.

Vorteilhafterweise haben die Referenzelektrode und die Arbeitselektrode(n) die Form eines Kreises. Diese „Kreisform" der Arbeitselektrode, sowie der Hilfselektrode, bietet eine Möglichkeit zur Eliminierung negativer Nebeneffekte aufgrund gleicher Potentiale der elektrischen Stromflusslinien. Ebenso ist eine Kreisform leichter herzustellen als beispielsweise eine rechtwinklige oder eine andere gewinkelte Form.

In einer vorteilhaften Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Biosensors liegt die Oberfläche der Referenzelektrode in einem Bereich von 0,3 bis 0,8 mm², weiter bevorzugt von 5 und 0,6 mm². Die Oberfläche der Referenzelektrode spielt eine sehr wichtige Rolle beim Erzielen von exakten Messungen. Die Oberfläche sollte so klein wie möglich sein, um die Störungen zu begrenzen, die die Arbeitselektrode auf die Linien des elektrischen Stroms ausüben kann. Diese Störungen kommen dadurch zustande, dass die Referenzelektrode üblicherweise zwischen der Arbeitselektrode(n) und der Hilfselektrode angeordnet ist, so dass die Referenzelektrode bestimmte Stromflusslinien beeinflussen kann, wobei sie diese inhomogen macht. Wie oben angegeben, werden diese Störungen durch das Beobachten der Oberflächenwerte minimiert.

Es ist weiter bevorzugt, dass die Referenzelektrode die Form eines Kreises hat, wobei sich die Hilfselektrode in einer besonders bevorzugten Ausführungsform in dem Zentrum dieses Kreises befindet. Der Kreis kann ein geschlossener oder ein „offener Kreis" sein. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck offener Kreis auf eine grundsätzlich kreisförmige Anordnung, bestehend aus getrennten geometrischen Elementen wie Linien, Punkten, Dreiecken usw. Ein offener Kreis besteht in einem Extremfall aus einer Linie mit einer Öffnung und in einem anderen Extremfall aus einer Vielzahl identischer oder unterschiedlicher geometrischer Elemente, mit einer Vielzahl an Öffnungen, die die Elemente voneinander trennen. Alle Variationen zwischen diesen Extremfällen, unter Einfluss dieser Extremfälle, können für den Zweck der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine Vielzahl an kreisförmigen Arbeitselektroden in einer kreisförmigen Art um die Referenzelektrode angeordnet.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die kreisförmige Referenzelektrode bei 2/3 oder mehr des Abstands zwischen dem Zentralpunkt der Hilfselektrode und einer Kreislinie, die die zentralen Punkte der Arbeitselektroden verbindet, angeordnet. Der Grund für die Wahl des Abstandes für die Positionierung der Referenzelektrode besteht darin, dass die Referenzelektrode so nahe wie möglich an den Arbeitselektroden plaziert werden sollte, um die Ohmschen Verluste zwischen diesen Elektroden zu minimieren und zuverlässigere Messungen zu ermöglichen. Wenn der Abstand weniger als 2/3 beträgt, nehmen die Ohmschen Verluste beträchtlich zu, wobei Störungen hervorgerufen werden.

Bevorzugterweise umfasst die Referenzelektrode eine Vielzahl von kreisförmigen Elementen umfasst, die am meisten bevorzugt untereinander verbunden sind. Die kreisförmigen Elemente sind entweder offene oder geschlossene Kreise oder geometrische Elemente wie Punkte, usw., die in der Form eines Kreises angeordnet sind.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Arbeitselektroden im Zentrum der kreisförmigen Elemente angeordnet. Es ist bevorzugt, dass die Oberfläche der Referenzelektroden (d.h. der kreisförmigen Elemente) in einem Bereich von 0,2 bis 0,5 mm² liegt, weiter bevorzugt von 0,3 bis 0,4 mm². Diese kreisförmigen Elemente, beispielsweise in der Form einer „Krone" (falls sie aus untereinander verbundenen, offenen Kreisen bestehen), sind jeweils eine individuelle Elektrode, die als einzelne Referenzelektrode arbeitet. Alle diese kreisförmigen Elemente haben bevorzugterweise die gleichen Abmessungen, um identische Messungen zu ermöglichen. Desweiteren müssen sie eine kleine Oberfläche aufweisen, um die elektrochemischen Messungen noch zuverlässiger zu machen (Abnahme der Effekte der Ohmschen Verluste).

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Arbeitselektrode molekulare Elektroden. Noch bevorzugter ist die Oberfläche (zum Teil oder gänzlich) der Referenzelektrode mit molekuraren Elektroden bedeckt. Dies ermöglicht ein stabiles und reproduzierbares Potential und vermeidet somit die Probleme die mit einer metallischen Quasi-Referenzelektrode einhergehen. Es ist weiter bevorzugt, dass die molekularen Elektroden ein Redoxpaar umfassen.

Es ist bevorzugt, dass die molekularen Elektroden elektrisch leitfähige Polymerketten und in einer noch bevorzugteren Ausführungsform ein Sondenbiomolekül umfassen. Es ist sogar weiter bevorzugt, dass die Polymerketten separate, einzelne Polymerketten sind, wobei die Vielzahl diese Polymerketten derart beschrieben werden kann, dass sie eine „Bürste" bilden. Die Sondenbiomoleküle sind ausgewählt aus der Gruppe, die aus Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Antikörper, Antigene, Enzyme, Rezeptoren, Zucker und Derivate davon besteht. Um stabile Potentiale zu erhalten, ist es besonders bevorzugt, dass die molekularen Elektroden ein Redoxpaar umfassen.

Der erfindungsgemäße Biosensor wird vorteilhafterweise in einer Vorrichtung und/oder in einem System zur Bestimmung von Biomolekülen verwendet, beispielsweise in der medizinischen Wissenschaft zur Bestimmung von Pathogenen oder für die Analyse von Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuresequenzen, Metallionen und organischen Molekülen. Metallionen können beispielsweise über chelatisierende Sondeneinheiten, die an die Polymerketten angebracht sind, gebunden werden. Organische Moleküle können über übliche Konkurrenzassays mit beispielsweise Antikörpern usw., die an Polymerketten gebunden sind, detektiert werden. Metallionen können selektiv durch Wechselwirkung mit Chelaten von definierter Größe und Form, an der Arbeitselektrode, detektiert werden. Die Chelate sind bevorzugterweise kovalent an leitfähige Polymere gebunden. Kleine organische Moleküle sind durch Wechselwirkung mit spezifischen Liganden detektierbar, entweder mit einem Antikörper, einem Rezeptor oder einem Haptamer. Diese Wechselwirkung wird direkt oder über ein kompetitives Molekül beobachtet, das an Moleküle wie Proteine oder an Partikel gebunden ist.

Definitionen und Abkürzungen

Im Folgenden werden die Bezeichnungen und Definitionen, wie sie vorliegend verwendet werden, zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung erklärt.

Der Ausdruck „bestimmen" oder „Bestimmung", so wie hier verwendet, bezeichnet eine qualitative und quantitative Bestimmung und Identifikation von Zielmolekülen in der Probe.

Die Bezeichnung „Biomolekül" bezieht sich auf jedes in der Natur existierende oder künstlich, gemäß einer in der Natur existierenden Matrix, erzeugte Molekül und umfasst beispielsweise Antikörper, Proteine, Peptide, Nukleinsäuresequenzen, d.h. Polynukleotide oder Oligonukleotide, umfassend mindestens zwei Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, optional umfassend mindestens ein modifiziertes Nukeotid, beispielsweise ein Nukleotid mit einer modifizierten Base, umfassend. Es ist versteht sich, dass sich die Ausdrücke Poly- oder Nukleotide insbesondere auf jede An von natürlich existierender oder chemisch synthetisierter oder modifizierter DNA (cDNA umfassend), RNA (cRNA, mRNA umfassend), PLA, LNA und Chimären davon beziehen. Weiterhin auf Gene, nukleotide Polymorphismen, Antisense-Sequenzen, Ribozyme, exprimierte Sequenzmarkierungen, einen Vektor, ein Plasmid.

Die Ausdruck „Peptid", wie er hier verwendet wird, bezieht sich insbesondere auf jedes Peptid aus mindestens zwei Aminosäuren, insbesondere ein Protein, ein Proteinfragment oder Oligopeptid, das extrahiert, getrennt oder in wesentlichen isoliert oder synthetisiert wurde, insbesondere solche, die mittels chemischer Synthese oder mittels Expression in einem rekombinanten Organismus erhalten wurden.

Der Ausdruck „Träger" bezeichnet jeden festen, dreidimensionalen Körper, der nicht chemisch oder physikalisch mit einer Probe wechselwirkt. Der Träger kann elektrisch leitfähig oder nicht leitfähig sein.

Der Ausdruck „wechselwirken", wie er hier verwendet wird, bedeutet jede Wechselwirkung zwischen molekularen Einheiten umfassend, die Bildung einer chemischen Bindung (kovalent oder ionisch), van-der-Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Adorptionsphänomene und ähnliches.

Der Ausdruck „Komplex" bezeichnet eine Einheit, die durch mindestens zwei unterschiedliche molekulare Einheiten gebildet ist, die wie oben spezifiziert untereinander wechselwirken.

Ein erfindungsgemäßer Komplex wird durch Wechselwirkungen, wie sie oben spezifiziert sind, zusammengehalten.

Im Folgenden wird die Erfindung, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen und der technischen Beschreibung detailliert, erläutert. Es versteht sich, dass die folgenden Beispiele rein illustrativ sind und keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung bedeuten.
1 zeigt einen erfindungsgemäßen Biosensor, wobei 1a eine horizontale Projektion und 1b eine vergrößerte Ansicht der Elektrodenanordnung ist.
2 zeigt einen weiteren erfindungsgemäßen Biosensor, wobei 2a eine horizontale Projektion und 2b eine vergrößerte Ansicht der Elektrodenanordnung ist.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Biosensors mit einer konzentrischen Elektrodenanordnung.
4 zeigt eine lineare Elektrodenanordnung für einen erfindungsgemäßen Biosensor.
5 zeigt eine zylindrische Elektrodenanordnung für einen erfindungsgemäßen Biosensor.
6 zeigt ein Kontrollbeispiel mit einer Ag/AgCl-Referenzelektrode.
7 zeigt die Stabilität des elektrochemischen Ansprechverhaltens einer Polypyrrol/Ferrocen-Referenzelektrode.
8a zeigt das Ansprechverhalten von polymeren Arbeitselektroden mit einer Quasi-Referenzelektrode aus Gold, 8b zeigt das Ansprechverhalten von polymeren Arbeitselektroden mit einer Polypyrrol/Ferrocen-Referenzelektrode.
9 zeigt die elektrochemischen Messungen von Arbeitselektroden, die mittels Impedanzspektroskopie gemessen wurden, die mit elektrisch leitfähigen Polymerketten bedeckt sind.
10 zeigt zwei elektrochemische Messungen, vor und nach einer Hybridisierungsreaktion, gemessen mittels Impedanzspektroskopie.
11 zeigt die Entwicklung des voltamperometrischen Ansprechverhaltens des Redoxpaars Fe/Fe⁺ während der Bestimmungszeit der Hybridisierung.
In 1 besteht der erfindungsgemäße Biosensor 100 aus einem T-förmigen festen Träger 101, aus Fiberglas (Poly(meth)acrylat) oder einem anderen geeigneten, bevorzugt chemisch inerten Material. Der Träger ist mit einem isolierende Lack (einem schwarzen, hydrophoben, photosensitiven Epoxidharz) überzogen. Am Boden des Substrats 101 sind 10 elektrische Verbindungsvorrichtungen 102 lokalisiert, bevorzugterweise aus Gold gefertigt. 8 kreisförmige Spots 105', aus Gold gemacht (Durchmesser 0,3 mm) mit einer nutzbaren Oberfläche 105 von 0,03 mm² sind in der Form eines Kreises angeordnet, der einen Durchmesser von 2,35 mm hat. Der Lack bedeckt die Spots 105' partiell bis dahin, wo die nutzbare Oberfläche 105 beginnt, d.h. die nutzbare Oberfläche ist nicht mit dem Lack überzogen. Es versteht sich, dass die Oberfläche der Spots 105 und 105' so wie in dem vorliegenden Beispiel gleich sein kann, aber sie können auch variieren. Diese Spots 105' werden als Arbeitselektroden verwendet und sind jeweils unabhängig voneinander über dünne, aufgedruckte Metalldrähte mit den Verbindungsvorrichtungen 102 verbunden. An den Spots sind molekulare Elektroden angebracht, gefertigt beispielsweise aus einem elektrisch leitfähigen Polymer, wie Polypyrrol, Polythiophen usw., wobei die molekularen Einheiten über ein Heteroatom oder über ihre 3 Position oder einer Mischung aus beidem verbunden sind. Die molekularen Elektroden können desweiteren ein Redoxpaar wie beispielsweise Ferrocen und ein Sondenmolekül, wie beispielsweise eine Polynukleotidsequenz, einen Chelatliganden, ein Antigen usw. umfassen. Die Anzahl der Spots 105' kann jede gerade oder ungerade Zahl sein, aber im allgemeinen ist eine gerade Anzahl bevorzugt, um eine perfekte Symmetrie der Elektrodenanordnung zu erhalten. Ein zentraler Spot 106', mit einer nutzbaren Oberfläche 106 mit 0,28 mm², ist in dem Zentrum des Kreises lokalisiert, der durch die Spots 105' gebildet wird. Die Oberfläche 106 ist größer als die Summe der Oberflächen 105 der Spots 105'. Der zentrale Spot 106' ist die Hilfselektrode und ist ebenfalls über eine Verbindung 103 an eine der Verbindungsvorrichtungen 102 verbunden. Die Referenzelektrode hat die Form einer „Krone". Die Krone wird durch eine Vielzahl an untereinander verbundenen, kleineren, offenen Kreisen 104' gebildet, mit der nutzbaren Oberfläche 104, wobei eine Elektrode mit einer einzigen Oberfläche gebildet wird und die auch über eine Verbindung 103 an eine der Verbindungsvorrichtungen 105 angeschlossen ist. Jeder Spot 105' ist in dem Zentrum eines dieser kleineren, offenen Kreise 104' angeordnet. Diese „Krone" 104' befindet sich bei ca. 2/3 des Abstands zwischen dem Zentrum von Spot 106' und dem Kreis, der durch die Arbeitselektroden 105 gebildet wird. Die lokale Elektrodensymmetrie ist insgesamt C₂ oder noch spezifischer C_2v. Eine Referenzelektrode, beispielsweise eine metallische Ag/AgCl- oder, bevorzugterweise eine molekulare Elektrode, noch bevorzugter eine molekulare Elektrode, die ein Redoxpaar umfasst, ist auf der „Krone" 104' aufgebracht. Die molekulare Elektrode umfasst ein elektrisch leitfähiges Polymer, wie Polypyrrol, Polythiophen usw., wobei die molekularen Einheiten über das Heteroatom oder über ihre 3 Position oder eine Mischung aus beidem aneinander gebunden sind.
2 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Biosensors. Die Art des Substrats und der Elektroden und das Ausmaß an Bedeckung des Biosensors 200 mit einem Lack ist genauso, wie in 1 erläutert. Der Unterschied hinsichtlich 1 besteht in der Anordnung der Zusammenstellung der Elektroden 204, 205 und 206. Die lokale Elektrodensymmetrie ist insgesamt ebenfalls eine C₂ oder noch spezifischer eine C_2v, Symmetrie. Die Elektroden sind alle über Drähte 203 an die Verbindungsvorrichtung 202 angeschlossen. Die Arbeitselektrode umfasst eine symmetrische Zahl an Spots 205', bevorzugterweise aus Gold gefertigt. In 2 sind 8 kreisförmige Spots 205', aus Gold gefertigt, mit einer nutzbaren Oberfläche 205 von 0,03 mm² in der Form eines Kreises angeordnet, der einen Durchmesser von 2,35 mm besitzt. Es versteht sich, dass die Oberfläche der Spots 205 und 205' die gleiche sein kann wie in dem vorliegenden Beispiel, diese aber auch abweichen können. Diese Spots 205' werden als die Arbeitselektroden verwendet und sind jeweils unabhängig über dünne, aufgedruckte Metalldrähte an die Verbindungsvorrichtungen 202 angeschlossen. Die an die Spots 205' angebrachten Spots sind molekulare Elektroden, beispielsweise aus einem elektrisch leitfähigen Polymer wie Polypyrrol, Polythiophen usw, gefertigt, wobei die molekularen Einheiten über das Heteroatom oder über ihre 3 Position oder eine Mischung aus beidem verbunden sind. Die molekularen Elektroden können desweiteren ein Redoxpaar wie beispielsweise Ferrocen und ein Sondenbiomolekül, wie beispielsweise eine Polynukleotidsequenz usw, umfassen. Die Anzahl an Spots 205' kann jede gerade oder ungerade Zahl sein, aber im allgemeinen ist eine gerade Anzahl bevorzugt, um eine perfekte Symmetrie der Elektrodenanordnung zu erhalten. Ein zentraler Spot 206' (Durchmesser 0,7 mm) mit einer nutzbaren Oberfläche 206 (Durchmesser 0,6 mm) von 0,28 mm² ist im Zentrum des Kreises angeordnet, der durch die Spots 205' gebildet wird. Dieser zentrale Spot dient als Hilfselektrode. Eine Referenzelektrode, beispielsweise eine metallische Ag/ AgCl- oder, bevorzugt eine molekulare Elektrode, ein Redoxpaar wie Ferrocen umfassend, wurde auf dem offenen Kreis 204 aufgebracht. Die molekulare Elektrode umfasst ein elektrisch leitfähiges Polymer, d.h. einzelne Polymerketten wie Polypyrrol, Polythiophen usw, wobei die molekularen Einheiten über das Heteroatom oder über ihre 3 Position oder eine Mischung aus beidem verbunden sind. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform kann auch ein Polymerfilm verwendet werden. Bei ungefähr 2/3 des Abstands zwischen dem Zentrum des Spots 206' und dem Kreis, der durch die Arbeitselektroden 205 gebildet wird, ist dieser offene Kreis 204 (Außendurchmesser 1,8 mm) mit einer nutzbaren Oberfläche 204' (Durchmesser 1,4 mm) lokalisiert. Dieser Kreis 204 ist auch aus Gold gefertigt. Dieser offene Kreis 204 dient als Referenzelektrode.
3 zeigt noch eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Biosensors 300. 3a zeigt einen Biosensor 300, wobei 3b eine detaillierte Ansicht der Elektrodenanordnung zeigt. Der Biosensor 300 ist eine bedruckte Leiterplatte, auf ein geeignetes Substrat 301 gedruckt ist, wie es beispielsweise in den vorangegangenen Abbildungen erläutert ist. Achtzehn Spots 303 aus Gold gefertigt, mit einer nutzbaren Oberfläche von 0,03 mm², sind in der Form eines Kreises mit einem Durchmesser von 3,7 mm angeordnet. Diese Spots 303 sind die Arbeitselektroden und sind jeweils unabhängig über achtzehn Metalldrähte, auf die Rückseite und/oder auf die Vorderseite des Substrats 301 aufgedruckt, und nicht in 3 gezeigt, an die Verbindungsvorrichtungen 302 angeschlossen. Die lokale Elektrodensymmetrie ist insgesamt eine C₂ Symmetrie. Zum besseren Verständnis, sind in 3a die Verbindungsdrähte 306 nur schematisch gezeigt und die Verbindungsdrähte 307, 308, 309 schematisch in 3b. Ein zentraler Spot 305, der als Hilfselektrode dient, mit einer nutzbaren Oberfläche von 1 mm², ist in dem Zentrum des Kreises angeordnet, der durch die Spots 303 gebildet wird. Die Oberfläche des zentralen Spots 305 ist größer als die Summe der Oberflächen der Spots 303. Die Referenzelektrode 304 ist in dieser Ausführungsform in der Form eines Kreises lokalisiert bei 2/3 des Abstands zwischen dem Zentrum von Spot 305 und einer Kreislinie, die durch die Zentren der Spots 303 gezogen wird. Der Außendurchmesser der Referenzelektrode ist 2,84 mm und der innere Durchmesser ist 2,34 mm.
4 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Biosensors 400. 4 zeigt nur die C₂(C_2v) symmetrische Anordnung der relevanten Elektroden. Diese Anordnung kann auf jedes geeignete Substrat aufgedruckt werden. 8 Arbeitselektroden 405, aus Gold gefertigt, sind symmetrisch in einer Ebene angeordnet. Es versteht sich, dass auch weniger oder mehr Arbeitselektroden im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Üblicherweise wird eine gerade Anzahl an Arbeitselektroden bevorzugt. Die Oberfläche 405 von diesen Elektroden kann auch variabel sein. Die Hilfselektrode 406 hat die Form eines Stabes, kann aber auch jede andere geeignete, rechtwinklige Form haben. Die Referenzelektrode 404 ist als ein offenes Rechteck ausgebildet, und bei 2/3 des Abstands zwischen der zentralen Linie durch die Hilfselektrode 406 und einer Linie durch die Zentren von jeder Hälfte der Arbeitselektroden 405 (mit einer Oberfläche von 0,03 mm²), angeordnet. Das Material der Referenzelektrode ist das Gleiche, wie vorstehend erläutert. Auf den Arbeitselektroden 405 sind Sondenbiomoleküle, elektrisch leitfähige Polymere und falls notwendig ein Redoxpaar, aufgebracht.
5 zeigt noch eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Biosensors. Er umfasst im Wesentlichen drei Zylinder. Eine Vielzahl an Arbeitselektroden 505 ist auf einem ersten Zylinder 507 angeordnet (Durchmesser 7 mm, aus Fiberglass oder einem anderen geeigneten Material gemacht). Die Abmessungen und das Material von diesen Arbeitselektroden ist das Gleiche, wie im Vorangegangenen erläutert. Ein Netz aus Gold eines zweiten Zylinder 504 ist in dem ersten Zylinder 506 angeordnet, (Durchmesser 5 mm). Es versteht sich, dass ebenfalls jedes andere geeignete Material, anstelle von Gold, verwendet werden kann. Der Zylinder 504 ist die Referenzelektrode und ist bevorzugterweise aus einem Netz aus Gold, mit einem Redoxpolymer, gemacht. Ein dritter Zylinder 506, der die Hilfselektrode darstellt, ist innerhalb dieses Zylinders 504 angeordnet. Die lokale Symmetrie ist insgesamt C_S. Es versteht sich hier ebenfalls von selbst, dass jedes andere geeignete Material anstelle von Gold verwendet werden kann.
Im Nachfolgenden wird die Herstellung und Modifizierung der Elektroden im Detail beschrieben:
Abkürzungen

ECS:: gesättigte Kalomelelektrode (Referenzelektrode)
CP:: Oligonukleotid zur Positivkontrolle mit der folgenden Sequenz: 5' TTT TTT TTT TGC CTT GAC GAT ACA GCT A 3'
CP-Biotin (CP-Bio):: Komplementäres, biotinyliertes Oligonukleotid von CP mit der folgenden Sequenz: 5' Biotin – T AGC TGT ATC GTC AAG GCA 3'
M5:: Oligonukleotid zur Negativkontrolle mit der folgenden Sequenz: 5' TTT TTT TTT TTT GGA GCT GCT GGC G 3'
M5-Biotin (M5-Bio):: Komplementäres, biotinyliertes Oligonukleotid von M5 mit der folgenden Sequenz: 5' Biotin – C GCC AGC AGC TCC AAA 3'
ODN:: Oligonukleotid
TH1X:: TH1X ist eine Pufferlösung bestehend aus < 13.3 g/l Na₂HPO₄, 29,22 g/l NaCl, 20 g/l PEG 4000, 6,5 % Tween 20, 1 g/l Gelatine, 14 % DNA von Heringsperma 10 mg/mL ultrabeschallt
TR:: TR ist ein Puffer zum Waschen, bestehend aus: 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl,0,76 g/l Na₂HPO₄, 0,19 g/l KH₂PO₄, 0,5 % Tween 20, 1 mM EDTA.
PAL:: Alkalische Phosphatase
BM purple AP Substrat:: Chromogenes Substrat für die Alkalische Phosphatase, (Roche Applied Substrate)
CV:: Cyclische Voltammetrie
Fc: Ferrocen

Der Ausdruck „Gegenelektrode" ist ein Synonym für „Hilfselektrode".
1. Erzeugung der Ag/AgCl-Referenzelektrode
Ein erfindungsgemäßer elektrochemischer Aufbau umfasst drei Elektroden, wobei eine Referenzelektrode die Kontrolle der Differenzen der angelegten Potentiale zwischen der Arbeitselektrode und der Hilfselektrode ermöglicht. Die in der Zelle ablaufende Gesamtreaktion ist die Summe aus zwei unabhängigen elektrochemischen Reaktionen, wovon eine an der Arbeitselektrode stattfindet und die andere an der Referenzelektrode, die konstant ein stabiles Potential besitzt. Die Referenzelektrode, die, im Stand der Technik weit verbreitet, auf einem festen Träger verwendet wird, ist üblicherweise eine Metall-Ionen Ag/AgCl-Elektrode, da sie für eine Vielzahl an metallischen Oberflächen verwendet werden kann.
Die nachfolgenden Beispiele zeigen das Aufbringen einer Ag/AgCl-Referenzelektrode auf einem erfindungsgemäßen Biochip, wie es beispielsweise in den 1 und 2 beschrieben ist. Der Träger der Referenzelektrode ist die Goldkrone 104, wie in 1 gezeigt ist, oder der offene Kreis 204 in 2 (im Folgenden auch als „Referenzträger" bezeichnet). Es wird eine Lösung von mit Succinimid komplexierten Silber (bei einem pH von ca. 8) verwendet. Die Lösung besteht aus 20 g/l Silbermetall und 30 g/l eines Komplexierungsmittels. Das Aufbringen der Referenzelektrode wird in zwei Schritten durchgeführt: Der erste Schritt umfasst das Ausfällen von Silber, der zweite Schritt die Chlorierung des metallischen Silberniederschlags.
In dem ersten Schritt wird ein erfindungsgemäßer Biochip in einer elektrochemische Zelle platziert, die eine Platinscheibe mit einem Durchmesser von vier Millimetern umfasst und mit einer Referenzelektrode aus gesättigtem Kalomel (ECS) ausgestattet ist. Die elektrochemische Zelle enthält das komplexierte Silber. Der verwendete elektrochemische Aufbau erlaubt es, nur die ausgewählte Referenzelektrode auf dem Biochip anzusteuern. Ein Potential von –0,3 V/ ECS wird für 30 Sekunden an diese Referenzelektrode angelegt. Ein hellgrauer Silberniederschlag bildet sich auf dem Referenzträger. Der Biochip wird anschließend mit entionisiertem Wasser abgespült. In einem zweiten Schritt wird der erfindungsgemäße Biochip in ein chlorierendes Bad gegeben, das 1 M KCl und Salzsäure bei einem pH von 2,2 enthält. Ein Potential von +0,1 V/ ECS wird für zehn Sekunden an die Zielelektrode angelegt. Der Silberniederschlag wird schwarz, was die Bildung von Silberchlorid anzeigt. Nach der Chlorierung wird der Niederschlag mit H₂SO₄ (10–20 %) für 20 Sekunden gewaschen, um organische Lösemittel zu entfernen.
6 zeigt ein Kontrollbeispiel der so erhaltenen Ag/AgCl-Referenzelektrode. Ein Tröpfchen von 30–50 Mikrolitern einer wässrigen Lösung enthaltend von 20 mM und 0,1 M, dem Redoxpaar Fe^II/Fe^III an NaCl, wurde auf den Biochip aufgebracht wobei alle Arbeitselektroden, die Hilfselektroden und die integrierte Ag/ AgCl-Referenzelektrode davon bedeckt wurden. Das Ansprechverhalten des Redoxpaars Fe^II/Fe^III zeigt einen Oxidationspeak bei +0,24 V mit Referenz zu der Referenzelektrode aus gesättigtem Kalomel (ECS) (a) und bei +0,27 V mit Referenz zu der integrierten Ag/ AgCl- Referenzelektrode (b). Unter den angewendeten Bedingungen ist die theoretische Potentialdifferenz zwischen der externen Referenzelektrode ECS und der internen Ag/ AgCl- Referenzelektrode ungefähr +38 mV.
Die beobachtete Potentialdifferenz zwischen den zwei Referenzelektroden ist üblicherweise im Bereich von +30 mV, was in Übereinstimmung mit den theoretischen Berechnungen ist. Diese Referenz zeigt über einen Zeitraum von einem Monat eine gute Stabilität des Potentials. Die integrierte Ag/AgCl- Referenzelektrode, die, wie vorstehend erläutert, aufgebracht wird, ist deshalb eine sehr stabile und zuverlässige Referenz.
2. Aufbringen der polymeren elektroaktiven Polypyrrol-Ferrocen-Referenz und Vergleich mit einer Quasi-Referenz aus Gold
Das Aufbringen einer integrierten Ag/ AgCl- Referenzelektrode wurde modifiziert, um ein leichteres und noch praktischeres Aufbringen der Referenzelektrode zu erreichen.
Es wurde gefunden, dass das gut bekannte Redoxpaar Ferrocen/Ferrocenium (Fc/Fc⁺) ein gutes Referenzsystem mit einem Redoxverhalten darstellt, das reversibel und stabil ist. Die Immobilisation dieses Paares auf dem Referenzträger wird durch Mittel erreicht, die dem Fachmann im Wesentlichen wohl bekannt sind (kovalente Bindung, Adsorption, Insertion in ein Polymer). Als Ausgangsmaterial wurde ein Pyrrol-Ferrocen-Monomer für die Bildung von polymeren Ketten in der Form einer „Bürste" verwendet, in dem ein Ferrocenmotiv nach bekannten und klassischen Methoden in die Elektroden integriert ist. Deshalb enthält die partiell oxidierte Polymerbürste gleichzeitig Ferrocenspezies (Fc) und Ferroceniumspezies (Fc⁺) und besitzt ein stabiles und reproduzierbares thermodynamisches Potential und kann deshalb auch vorteilhaft als Referenzelektrode eingesetzt werden.
Wie vorstehend erklärt, wird die Polypyrrol-Ferrocen-Referenz aus einer Lösung auf den erfindungsgemäßen Biochip aufgebracht. Die Lösung enthält 0,08 M Pyrrol-Ferrocen, in 3 Position funktionalisiert, 0,02 M Pyrrol, alkoholfunktionalisiert in 3 Position und 0,1 M LiClO₄. Ein Tröpfchen von 30 bis 50 Mikrolitern dieser Lösung wird auf den Biochip aufgebracht. Das Aufbringen der Referenz wird in einem Schritt einer Elektrosynthese, durch das Anlegen eines Potentials von +0,8 Volt über einen Zeitraum von ca. 20 Sekunden an die Elektrode (Ladung der Elektrosynthese: 60 mC·cm^–2) durchgeführt. Der Biochip wird mit einer Mischung aus Wasser und einem organischen Lösemittel und anschließend mit entionisiertem Wasser gespült.
7 zeigt die Stabilität des elektrochemischen Ansprechverhaltens dieser Pyrrol-Ferrocen-Referenz in Wasser, 0,1 M LiClO₄ bei t=0 (c) und t=4 Tage (d). Der zu der Oxidation von Fe nach Fe⁺ zugehörige Peak zeigte ein Potential von +0,22 Volt und der Peak für die Reduktion von Fe⁺ nach Fe ein Potential von +0,05 Volt. Diese Potentiale variieren über einen ausgedehnten Zeitraum nur in einem kleinen Bereich. Daher wird dieses System ebenfalls als gute Referenzelektrode für den erfindungsgemäßen Biochip betrachtet.
Weitere Ausführungsformen für sogenannte „Quasi-Elektroden", die als Referenzelektroden verwendet werden können, sind beispielsweise ein Platindraht oder ein Silberdraht, der direkt in die zu testende Lösung eintaucht. Diese zeigen nur ein instabiles Potential, das in den meisten Fällen nicht reproduzierbar ist (8). Dieses Beispiel zeigt deutlich das elektrochemischen Antworten einer Polypyrrol-Alkohol-Arbeitselektrode im Vergleich zu einer metallischen Quasi-Referenz-Elektrode einer Referenzelektrode aus Gold und anderer Seits gegenüber einer Polypyrrol-Ferrocen-Referenzelektrode. Die Polypyrrolpolymere werden bei einem Potential von +0,65 Volt auf den Spots für die Arbeitselektroden des erfindungsgemäßen Biochips, simultan mittels eines Mehrkanalpotentiostaten (EGG) aus einem Tröpfchen von 50 Mikrolitern einer wässrigen Lösung enthaltend, 20 mM an Pyrrol-/ OH-Monomer und 0,7 M an LiClO₄, elektrosynthetisiert.
8a und 8b zeigen das Ansprechverhalten dieser polymeren Filme, das simultan in einer Analyselösung aus LiClO₄ (0,1 M) mit einer Quasi-Referenz aus Gold (8a) und der Polypyrrol-Ferrocen-Referenz (8b) erhalten wurde. Das Ansprechverhalten der Arbeitselektroden gegen die Quasi-Referenz aus Gold unterschied sich immer durch das Potential und/ oder der Intensität der Oxidations- und Reduktionspeaks. Im Gegensatz zu den Quasi-Referenz-Metallelektroden war das Ansprechverhalten der Arbeitselektroden gegen die Referenz mit Polypyrrol-Fc-Ketten perfekt identisch (gleiche Intensitäten und gleiche Peakpotentiale).
Dieses Beispiel zeigt die Stabilität einer aus Polypyrrol-Fc erzeugten Referenzelektrode. Die Verwendung einer solchen integrierten Referenz auf einem erfindungsgemäßen Biochip ermöglicht eine beträchtliche Verbesserung der Reproduzierbarkeit der molekularen Elektroden für die Messung von biologischen Phänomenen.
Beispiel 1
Aufbringen und Ansprechverhalten von molekularen Polymeren auf einem erfindungsgemäßen Biochip.
Copolymerketten, umfassend eine Mischung von Polypyrrol und stickstofffunktionalisierten Polypyrrol und DNA Sequenzen (CP = TTT TTT TTT TGC CTT GAC GAT ACA GCT A), wurden an die 8 metallischen Spots für die Arbeitselektrode angebracht. Die wässrige Lösung für die Elektrosynthese der Polymerketten (pH=3) enthielt 0,1 M Pyrrol-OH, 5 μM Pyrrol-CP, und 0,7 M LiClO₄. Ein Tröpfchen dieser Lösung (≅ 50 Mikrolitern) wird auf den Biochip aufgetragen, die 8 Arbeitselektroden, die Gegenelektrode und die Referenzelektrode bedeckend. An jeden der Spots wird ein Potential von +0,8 Volt, gemessen gegen Gold, über unterschiedliche Zeiten hinweg angelegt. 9 zeigt das mittels Impedanzspektroskopie gemessene Ansprechverhalten von zwei Spots mit einer unterschiedlichen Polymerkettenlänge (80 nm und 160 nm). Die elektrischen Eigenschaften dieser zwei Polymere unterschieden sich beträchtlich. Je länger das elektrisch leitfähige Molekül oder Polymer ist (gemischtes Polymer, elektronische und ionische Leitung), desto mehr erniedrigt sich der elektrische Widerstand (der Imaginärteil und der Realteil der Impedanz nimmt ab). Das Aufbringen von molekularen Elektroden hat deshalb weiterhin den Vorteil, dass die elektrischen Eigenschaften des Systems moduliert werden können. Die elektrische Bestimmung von biologischen Affinitäten auf dem erfindungsgemäßen Biochip werden deshalb vorteilhaft durch elektrische Modifikationen und Redoxmodifikationen der molekularen Anordnung, d.h. der Art und der Eigenschaft der Polymerketten, verstärkt.
Beispiel 2
Elektrische Bestimmung der Hybridisierung durch Impedanzspektroskopie.
Dieses Beispiel zeigt die indirekte elektrische Bestimmung der Hybridisierung von DNA mittels Impedanzspektroskopie auf einem erfindungsgemäßen Biochip. Das Prinzip der Bestimmung basiert auf der Bildung eines isolierenden Niederschlags auf molekularen Elektroden, wo die Hybridisierung eines komplementären DNA-Strangs zwischen Ziel- und Sonden-DNA erfolgt. Dieses Prinzip ist beispielsweise in der unveröffentlichten Deutschen Patentanmeldung No. 1031135 beschrieben.
Die Synthese der molekularen Elektroden findet in vier Schritten statt:

1. Elektrosynthese von Polypyrrol-OH-/Polypyrrol- DNA-Molekularelektroden,
2. Inkubierung in einer Lösung eines Hybridisierungspuffers, der komplementäre DNA-Zielsequenzen enthält, die durch eine Biotineinheit funktionalisiert sind,
3. Inkubierung in einer Lösung aus Streptavidin, welches durch die Alkalische Phosphatase funktionalisiert ist,
4. Enzymatische Reaktion des ausfallenden Substrats und Bildung eines isolierenden Niederschlags.

In diesen Beispielen werden die Abscheidungen aus einer wässrigen, elektrolytischen Lösung aus 0,7 M LiClO₄, bei 0,85 Volt gegen Gold realisiert, bestehend aus einer Mischung aus 0,1 M Pyrrol-Alkohol, der in 3 Position funktionalisiert ist (PPy-OH) und Pyrrol in 3 Position funktionalisiert, durch CP- oder M5-DNA-Sequenzen (5 μM). In einem ersten Schritt wird ein Tröpfchen (50 Mikroliter) der CP-Lösung auf dem Biochip aufgebracht, der die 8 Arbeitselektroden, die Gegenelektrode und die Referenzelektrode bedeckt. Vier von den acht Spots werden simultan unter den gleichen Bedingungen angesteuert. Auf diesen vier Spots werden identische polymere Ketten von PPy-OH/PPy-CP (Qs = 20 mC·cm^–2) gebildet. Auf den vier verbleibenden Spots werden vier identische polymere „Bürsten" aus PPy-OH/ PPy-M5 (Qs = 20 mC·cm^–2) gebildet. Ein Tröpfchen eines Hybridisierungspuffers (≅50 Mikrolitern), enthaltend 1 nM komplementäre CP-Biotin-DNA-Sequenzen als Zielsequenzen, wird anschließend auf den Biochip aufgetragen. Der Biochip wird für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und anschließend mit einem Waschpuffer abgespült. Ein Tröpfchen von 30 Mikrolitern einer Lösung von 400 ng Streptavidin-Alkalische-Phosphatase wird auf den Biochip aufgetragen. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei Umgebungstemperatur wird der Biochip noch einmal mit einem Waschpuffer gespült. Zuletzt wird ein Tröpfchen (50 Mikroliter) BM purple AP Substratlösung auf den Biochip gegeben, wobei alle Spots bedeckt werden.
Nach 30 Minuten werden die acht Spots durch Impedanzspektroskopie mit einem Mehrkanal VMP Potentiostaten (EGG) analysiert. 10 zeigt zwei Messungen, Schaubild (e), welcher relativ zu dem Ansprechverhalten eines positiven Spots ist (molekulare Elektrode einer hybridisierten CP-Sequenz) und Schaubild (f), der mit dem Ansprechverhalten eines Blindspots oder Negativspots korreliert ist (molekulare Sonde mit einer Sequenz M5, die nicht hybridisiert ist). Der isolierende Niederschlag, welcher auf der molekularen CP-Elektrode gebildet wird, blockiert den Elektronentransfer zwischen der metallischen Elektrode und der ionischen Lösung, wodurch die Leitfähigkeit der gesamten Ansammlung reduziert wird (Zunahme der Impedanz).
Beispiel 3
Elektrische Bestimmung der Hybridisierung durch Cyclische Voltammetrie (Ferrocen System).
Das Bestimmungsprinzip basiert auf der Modifikation des elektrochemischen Ansprechverhaltens eines elektrochemischen Markers, während der Hybridisierung von komplementären DNA-Strängen, wobei dieser in eine molekulare Elektrode integriert ist, die aus Ferrocen besteht.
Die Synthese der molekularen Elektroden findet in 3 Schritten statt:

1. Elektrosynthese von molekularen Elektroden umfassend aktivierte Polypyrrol-OH-/ Polypyrrol-Ferrocenester (aktiviertes Fe-NHP),
2. Aufpropfen von aminierten DNA-Sequenzen (Sonden),
3. Inkubierung eines Hybridisierungspuffers, enthaltend Ziel-DNAs, die komplementär zu den Sonden-DNA sind.

In diesem Beispiel wird die Abscheidung (10 mC·cm^–2) bei +0,8 Volt gegen Gold aus einer organischen Lösung aus Propylencarbonat durchgeführt, enthaltend 0,08 M Pyrrol-Fc-NHP, 0,02 M Pyrrol-OH, und 0,5 M LiClO₄. Die aminierten DNA-Sequenzen werden auf den erfindungsgemäßen Biochip übertragen, der acht molekulare Elektroden aus PPy-OH/ PPy-NHP umfasst. Die DNA-Sequenzen werden als S1 bezeichnet (5' TCA ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA G3') und durch eine Inkubation des Biochips in einer Übertragungslösung (50% Phosphatpuffer/ 50 % Acetonitril) von S1 (50 μM) bei Umgebungstemperatur über zwei Stunden, übertragen. Der Biochip wurde anschließend mit einem Phosphatpuffer gespült. Vor der Analyse wurden die acht Spots des Biochips mit Ethanolamin neutralisiert (Hydrolyse der aktivierten Estergruppen, welche nach dem Übertragen übrig bleiben). Das Ziel war, das elektrochemische Ansprechverhalten der molekularen Elektrode zu stabilisieren. Nach dem Spülen des Biochips mit einem Hybridisierungspuffer wurden die acht Spots des Biochips in dem gleichen Puffer analysiert. Vier Spots des Biochips werden in einem Hybridisierungspuffer in der Anwesenheit nicht-komplementärer DNA-Sequenzen (5' ACC TTA TGA GTC CAA GGA TAA C3'-Biotin) und die vier anderen Spots in einem Hybridisierungslösung in der Anwesenheit komplementärer Sequenzen (5' CCA ACA TTG AGA TTC CCG AGA T3'-Biotin), inkubiert. In diesem Beispiel ist die Konzentration der DNA-Ziellösung ungefähr 0,2 μM. 11 zeigt die Entwicklung des voltamperometrischen Ansprechverhaltens des Fe/ Fe⁺-Paars während der Bestimmung. Schaubild g zeigt das Ansprechverhalten des Fe/ Fe⁺-Paars vor der Inkubierung in einer Lösung, die DNA-Zielsequenzen enthält. Graph h zeigt das Ansprechverhalten einer molekularen Fe/ Fe⁺-Elektrode nach der Inkubierung in einer Lösung aus DNA-Zielsequenzen, die nicht komplementär sind. Dieses Ansprechverhalten variiert nur zu einem kleinen Grad und eine Abnahme der Intensität des Oxidationspeaks ist im Bereich von 5%, bezogen auf das ursprüngliche Schaubild g. Das Schaubild zeigt das Ansprechverhalten, das nach der Inkubation in einer Lösung erhalten wird, die komplementäre DNA-Zielsequenzen enthält. In diesem Fall variiert das Ansprechverhalten beträchtlich und die Intensität der Oxidationspeaks zeigt eine Abnahme in der Größenordnung von 50%. Diese Variation ist auf die Modifikation der elektronischen Struktur des Polymers zurückzuführen, die deshalb die des Ferrocens beeinflusst. Ebenso ist diese Abnahme relativ zu der Menge an Zielen, die in der Lösung anwesend sind. Deshalb bietet das System die Möglichkeit, Biomoleküle quantitativ zu bestimmen.

Claims

Biosensor, umfassend eine Hilfselektrode, eine Referenzelektrode und eine Arbeitselektrode, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtanordnung, bestehend aus der Hilfselektrode, der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode eine lokale C₂ oder C_S symmetrische Anordnung aufweist.
Biosensor gemäß Anspruch 1, umfassend weiterhin eine Vielzahl an Arbeitselektroden.
Biosensor gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammenstellung, bestehend aus der Hilfselektrode, der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode(n), auf der Oberfläche einer bedruckten Leiterplatte angeordnet ist.
Biosensor gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzelektrode eine Vielzahl an kreisförmigen Elementen umfasst.
Biosensor gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Oberfläche der Hilfselektrode zu der Oberfläche oder der Summe der Oberflächen der Arbeitselektrode(n) in einem Bereich von 2 bis 6, bevorzugt von 3 bis 5 liegt.
Biosensor gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kreiselemente untereinander verbunden sind.
Biosensor gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Arbeitselektroden in dem Zentrum der Kreiselemente angeordnet sind.
Biosensor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzelektrode die Form eines offenen Kreises aufweist.
Biosensor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfselektrode in dem Zentrum des offenen Kreises lokalisiert ist.
Biosensor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzelektrode die Form eines geschlossenen Kreises aufweist.
Biosensor gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfselektrode in dem Zentrum des geschlossenen Kreises angeordnet ist.
Biosensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl an kreisförmigen Arbeitselektroden in einem Kreis um die Referenzelektrode angeordnet ist.
Biosensor gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzelektrode bei 2/3 des Abstands zwischen dem Zentrum der Hilfselektrode und einer kreisförmigen Linie, welche die zentralen Punkte der Arbeitselektroden verbindet, angeordnet ist.
Biosensor gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der offene Kreis eine Vielzahl an kleineren, offenen Kreisen umfasst.
Biosensor gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die kreisförmigen Elemente die Form von geschlossenen und offenen Kreisen aufweisen.
Biosensor gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Arbeitselektroden in dem Zentrum der kleineren, offenen Kreise befinden.
Biosensor gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis des Außendurchmessers zu dem Innendurchmesser der kleineren, offenen Kreise in einem Bereich von 1,1 bis 1,8, bevorzugt von 1,1 bis 1,3 liegt, am meisten bevorzugt 1,2 ist.
Biosensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 14–17, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis des Außendurchmesser zu dem Innendurchmesser der kreisförmigen Elemente in einem Bereich von 1,1 bis 1,8, bevorzugt von 1,1 bis 1,3 liegt, am meisten bevorzugt 1.2 ist.
Biosensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Arbeitselektrode molekulare Elektroden umfasst.
Biosensor gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der Referenzelektrode mit einer Vielzahl an einzelnen, molekularen Elektroden bedeckt ist.
Biosensor gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Elektroden elektrisch leitfähige Polymerketten umfassen.
Biosensor gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Elektroden der Arbeitselektroden ein Sondenbiomolekül umfassen.
Biosensor gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Elektroden ein Redoxpaar umfassen.
Biosensor gemäß Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenbiomoleküle aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Nukleinsäuren, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Enzymrezeptoren, Zuckern und Derivaten davon besteht.
Biosensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselwirkung zwischen den Sondenbiomolekülen und den Probenbiomolekülen ein elektrochemisches Signal erzeugt.
Vorrichtung, umfassend einen Biosensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
System zur Bestimmung von Zielbiomolekülen in einer Probe, umfassend den Biosensor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 25 und/ oder die Vorrichtung gemäß Anspruch 26, weiterhin umfassend Mittel zur Bestimmung von elektrochemischen Signalen, die durch eine Wechselwirkung zwischen Sonden- und Probenbiomolekülen erzeugt werden.
Kit umfassend den Biosensor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25 und/oder der Vorrichtung gemäß Anspruch 26 oder das System gemäß Anspruch 27, weiterhin umfassend Anleitungen zur Verwendung des Kits.
Verwendung des Biosensors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25 und/oder des Apparats gemäß Anspruch 26 oder das Systems gemäß Anspruch 27 oder des Kits gemäß Anspruch 28 zur Bestimmung von Mikroorganismen, Polynukleotidsequenzen, Peptiden, Polypeptiden, Metallionen, organischen Molekülen.