DE10221091B4

DE10221091B4 - SECM zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen

Info

Publication number: DE10221091B4
Application number: DE10221091A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dr. Hartwich; Wolfang Dr. Schuhmann; Peter Dr. Frischmann; Herbert Dr. Wieder
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GESELLSCHAFT FUER BIOANALYTIK MBH, 814
Priority date: 2002-05-11
Filing date: 2002-05-11
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2022-05-12
Also published as: WO2003095672A1; DE10221091A1; AU2003233768A1

Abstract

Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von Ligat-Oligonukleotiden besteht,
b) Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden,
c) Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält,
d) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche,
e) Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche,
f) Vergleich der in Schritt e) erhaltenen Werte mit Referenzwerten.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen unter Anwendung der Scanning Electrochemical Microscopy.

Aus der DE 199 17 052 ist ein Verfahren zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Analyten bekannt, bei dem der Diffusionskoeffizient einer redoxaktiven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektrochemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detektiert wird.

Grundlage dieser Detektion durch ein elektrochemisches Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies ist die Tatsache, dass eine Elektrode, die mit Hilfe eines Potentiostaten auf ein geeignetes konstantes Potential gegenüber einer Referenzelektrode polarisiert ist, eine sich in Lösung befindliche Redoxspezies entsprechend des Potentials oxidieren bzw. reduzieren kann. Gemäß DE 199 17 052 entsteht infolge des Umsatzes der Redoxspezies an einer Mikroelektrode ein Konzentrationsgradient vom Volumen der Lösung in Richtung der Elektrode, was den Aufbau eines hemisphärischen Diffusionsfeldes vor der Mikroelektrode zur Folge hat, in dem die Redoxspezies durch Diffusion zur Elektrodenoberfläche transportiert wird. Wird die Konzentration der umzusetzenden Redoxspezies am Ort der Elektrode gleich Null, limitiert der diffusionelle Massentransport den Umsatz an der Elektrode, und es wird als Maximalstrom der sogenannte Diffusionsgrenzstrom erhalten. Wird eine Mikroelektrode, an der diffusionslimitiert eine Oxidations- oder Reduktionsreaktion einer im Elektrolyten gelösten Redoxspezies abläuft, an eine makroskopische, leitende Oberflache so weit angenähert, dass das hemisphärische Diffusionsprofil vor der Mikroelektrode durch diese Oberfläche gestört wird, kann – bei geeignetem Potential an der makroskopischen Elektrode – die Rückreaktion der an der Mikroelektrode stattfindenden Reaktion ablaufen. Infolge dieser Rückreaktion wird im Volumenraum des Diffusionsprofils in der Zeiteinheit die Zahl der an der Mikroelektrode umzusetzenden Redoxspezies vergrößert, so dass als Folge der Diffusionsgrenzstrom anwächst.

Das oben beschriebene elektrochemische Detektionsverfahren wird als "Elektrochemische Rastermikroskopie (SECM)" bezeichnet und gehört zur Klasse der Rastersondentechniken, gemäß denen eine Messsonde sequentiell über eine Oberfläche (Probe) gerastert wird und die aufgenommene Messgröße für jeden Rasterpunkt aus der Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe resultiert. Im speziellen Fall der SECM dient eine Ultramikroelektrode (UME) als Sonde, welche in einem Arbeitsabstand in der Größenordnung des Elektrodenspitzenradius in einem Elektrolyt über die Oberfläche bewegt wird. Das Potential der UME wird dabei über einen Potentiostaten so eingestellt, dass eine gelöste redoxaktive Spezies diffusionskontrolliert umgesetzt wird. Nähert man die UME schrittweise an die Oberfläche an und detektiert dabei den resultierenden Strom, so können zwei Fälle unterschieden werden. Handelt es sich um eine nicht leitfähige Oberfläche, so bewirkt die Annäherung der UME durch die Störung des zuvor hemisphärischen Diffusionsfeldes einen verminderten Stofftransport zur UME und somit eine Abnahme im Diffusionsgrenzstrom. Man spricht vom negativen Feedback (1a, 2a). Liegt dagegen eine leitfähige Oberfläche vor und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der UME umgesetzten redoxaktiven Spezies statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Man spricht vom Redoxrecycling oder positivem Feedback (1b, 2b). Die Stromamplifizierung durch Redoxrecycling ist dabei abhängig von der Konzentration der Redoxspezies, von der heterogenen Elektronentransferkinetik an der Probenoberfläche sowie dem Abstand zwischen UME und Probenoberfläche.

Ein Rastern der Oberfläche bei konstantem Abstand unter Detektion des Stroms (Constant height mode) bzw. bei konstantem Strom unter Detektion des nachgeregelten Mikroelektrodenabstandes (Constant current mode) erlaubt somit die Topographierung der Oberfläche bzw. der elektrochemischen Aktivität der Oberfläche.

In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor wird zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips Anwendung. Auch bei den parallelen Verfahren beruht die eigentliche Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.

Zur DNA-Analyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Ligat-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungslösung DNA-Fragmente ("Ligand-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Ligat-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, so können die Ligand-Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert (gelesen) werden.

Obwohl inzwischen Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen mit Hilfe der Chip-Technologie bekannt sind ( DE 199 26 457 , DE 100 49 527 ) besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen Methoden, die insbesondere im Hinblick auf Verlässlichkeit und Reproduzierbarkeit der Messergebnisse Vorteile bieten.

Darstellung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen zu schaffen, welches Messungen mit hoher Reproduzierbarkeit erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 28 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Beispielen und den Figuren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:

DNA: Desoxyribonukleinsäure
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (Synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH₂)₂-N(COCH₂-Base)-CH₂CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
U: Uracil
Base: A, G, T, C oder U
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: Wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
nt: Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B. Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind.).
ns-Oligomer: Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss: Single strand (Einzelstrang)
ds: Double strand (Doppelstrang)
Oxidationsmittel: Chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Aufnahme von Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemischen Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) oxidiert.
Reduktionsmittel: Chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) reduziert.
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
NHS: N-Hydroxysuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-(2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Ligand-Oligonukleotid: Bezeichnung für Oligonukleotide, die von Ligat-Oligonukleotiden spezifisch gebunden werden.
Ligat-Oligonukleotid: Bezeichnung für Oligonukleotide, die von Ligand-Oligonukleotiden spezifisch gebunden werden.
Linker: Molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d.h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1 – 20, insbesondere der Kettenlänge 1 – 14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Äquivalent zu Linker.
Mica: Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo: Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten und dadurch je eine Au-S-R Bindung bewirkt wird.
Au-S-(CH₂)₂-ds-oligo: Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-Sparer hybridisiert mit dem zu ss-oligo komplementären Oligonukleotid.
E: Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
i: Stromdichte (Strom pro cm² Elektrodenoberfläche)
SECM: Scanning Electrochemical Microscopy, Elektrochemische Rastermikroskopie.
UME: Ultramikroelektrode
Cyclovoltammetrie: Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Das Potential einer stationären Arbeitselektrode wird dabei zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
(Chrono)Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z.B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Chronocoulometrie: Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z.B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden.
Differential-Puls-Voltammetrie: Bei der Differential-Puls-Voltammetrie werden einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe Rechteckpulse mit kleiner, konstanter Amplitude überlagert. Die Messungen des Stroms als Funktion der Spannung erfolgen dabei unmittelbar vor dem Puls und am Ende des Pulses. Aufgetragen werden die Differenzen der Strommesswertpaare gegen das Potential.
Square-Wave-Voltammetrie: Bei der Square-Wave-Voltammetrie wird einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe eine rechteckförmige Wechselspannung mit kleiner, konstanter Amplitude und niedriger Frequenz überlagert. Zur Messung des Stroms als Funktion der Spannung werden jeweils mehrmals die Differenzen der Ströme bei maximaler und minimaler Rechteckspannung bestimmt.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen bereit, das die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von Ligat-Oligonukleotid besteht, Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden, Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche, und Vergleich der bei der Detektion erhaltenen Werfe mit Referenzwerten umfasst.

Die elektrochemisch aktive Oberfläche der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Messelektroden ist in der Regel kreisförmig ausgeprägt (3). In diesem Fall ist der Ausdruck "Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche" selbsterklärend. Für den Fall, dass die elektrochemisch aktive Oberfläche nicht kreisförmig ist, wird unter dem Ausdruck "Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche" die Hälfte der größten Ausdehnung des Teils der Messelektrode verstanden, der elektrochemisch aktiv ist, also mit der redoxaktiven Spezies in Kontakt steht. Im Fall einer Messelektrode mit quadratischer Spitze also die Hälfte der Diagonalenlänge.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Tatsache ausgenutzt, dass der Umsatz einer redoxaktiven Spezies an einer Elektrode, also die Oxidation bzw. Reduktion der redoxaktiven Spezies, von dem Zustand der Elektrodenoberfläche abhängt. Die Bindung einer chemischen Substanz an die Elektrodenoberfläche bewirkt schon alleine durch die daraus folgende Belegung der Elektrodenoberfläche eine Modulation der Elektronentransferkinetik der redoxaktiven Substanz und damit eine Änderung des Stroms. Ist die Elektrodenoberfläche z.B. mit negativ geladenen Molekülen oder Molekülgruppen belegt, so ist es für z.B. negativ geladene redoxaktive Substanzen deutlich schwieriger zur Elektrodenoberfläche zu gelangen und dort oxidiert zu werden, als wenn eine ungeladene Elektrodenoberfläche vorliegt. Es kommt in diesem Fall zu einem dramatischen Rückgang der gemessenen Stromstärke. Ebenso kann es natürlich zu einer Erhöhung der Stromstärke kommen, wenn z.B. eine negativ geladene redoxaktive Substanz an eine Elektrode wandern soll, an die eine positiv geladene Substanz gebunden ist. In jedem Fall kommt es durch die Wechselwirkungen zwischen der an die Elektrodenoberfläche gebundenen Spezies und der redoxaktiven Substanz zu einer Modulation der Elektronentransferkinetik und damit zu einer Änderung des Stroms.

Die Detektionsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung basiert auf einer SECM-Messung. Bei der Annäherung der Messelektrode an die modifizierte Oberfläche kommt es zu einer Störung des hemisphärischen Diffusionsfeldes der in der in der Lösung enthaltenen redoxaktiven Spezies. Wird eine nicht leitfähige modifizierte Oberfläche verwendet, so bewirkt die Annäherung der Messelektrode einen verminderten Stofftransport zur Messelektrode und somit eine Abnahme des Diffusionsgrenzstroms. Ein solches negatives Feedback ist in den 1a und 2a schematisch dargestellt. Wird eine leitfähige Oberfläche verwendet und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der Messelektrode umgesetzten redoxaktiven Spezies statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Dieses positive Feedback ist schematisch in den 1b und 2b dargestellt.

Der beschriebene Effekt kommt in dem Fall besonders deutlich zum Ausdruck, wenn es sich bei der redoxaktiven Spezies um eine Spezies handelt, die an der Messelektrode reversibel oxidierbar oder reduzierbar ist.

Aus der 2 wird deutlich, dass ein mit entsprechender Zuverlässigkeit und Genauigkeit gemessener Effekt erst dann auftritt, wenn der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche. Mit geringer werdendem Abstand verstärkt sich der durch die Störung des Diffusionsprofils der redoxaktiven Spezies bewirkte Effekt dramatisch. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche daher maximal 4 mal, besonders bevorzugt maximal 3 mal so groß wie der Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode. Ganz besonders bevorzugt ist ein Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche, der maximal 2 mal, besonders bevorzugt maximal genau so groß ist wie der Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Messelektrode mit einem Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0,05 bis 250 μm, bevorzugt von 0,5 bis 50 μm, besonders bevorzugt von 5 bis 25 μm verwendet. Typischerweise handelt es sich dabei um eine Mikroelektrode mit einem Radius < 100 μm in einer Isolationshülle, welche einen mehrfachen Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode aufweist (3). Besonders bevorzugt wird als Messelektrode eine Scheibenelektrode verwendet, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist.

Aus der Größe der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode ergibt sich, dass gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Abstand zwischen Messelektrode und modifizierter Oberfläche während der Messung maximal 1250 μm beträgt. Besonders bevorzugt beträgt der Abstand maximal 500 μm, ganz besonders bevorzugt 100 μm und insbesondere 50 μm.

Die Messelektrode wird mittels Verschiebeelemente wie z.B. Schrittmotor-getriebene oder manuelle Mikrometerschrauben oder Piezostapel an die modifizierte Oberfläche angenähert, so dass das Diffusionsprofil der Redoxspezies vor der Mikroelektrode bis zur gegenüberliegenden modifizierten Oberfläche reicht (1b). Im Falle einer leitfähigen modifizierten Oberfläche wird die redoxaktive Spezies an dieser Oberfläche regeneriert. Diese Regeneration der Redoxspezies führt zu einer durch den Abstand der Messelektrode in weiten Grenzen wählbaren Amplifizierung des Stromes in Abhängigkeit des Diffusionskoeffizienten der an der Messelektrode umgesetzten Redoxspezies.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, an die wenigstens zwei verschiedene Arten von Ligat-Oligonukleotide angebunden sind. Es kann aber selbstverständlich eine sehr große Anzahl an Arten von Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche gebunden sein, also z.B. 100, 1000 oder mehr als 100000 verschiedene Arten. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jeweils überwiegend eine Art von Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden. Unter "räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Ligat-Oligonukleotid modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden kommen. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass jeweils ausschließlich eine Art von Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden ist.

Die Größe dieser räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche ist grundsätzlich beliebig. Aus technischen Gründen werden in der Regel bevorzugt bis zu 10 cm² große räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche verwendet werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche einer Größe von 100 μm² bis zu 1000000 μm².

Sind die verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden in räumlich begrenzten Bereichen der modifizierten Oberfläche angebunden, so kann bei der Detektion der Hybridisierungsereignisse mit Hilfe der Messelektrode die modifizierte Oberfläche abgerastert werden und so die Hybridisierungsereignisse selektiv für die verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden in den verschiedenen räumlich begrenzten Bereichen detektiert werden. In diesem Zusammenhang werden Arrays von Test-Sites (räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche) bevorzugt, die durch Gebiete der Oberfläche voneinander abgetrennt sind, in denen keine Ligat-Oligonukleotide an die Oberfläche gebunden sind. Aufgrund des räumlichen Abstandes zwischen den einzelnen Test-Sites kann die Messelektrode problemlos exakt und eindeutig an eine bestimmte Art von Ligat-Oligonukleotid angenähert werden. Somit werden eindeutig zuordenbare Messresultate erhalten.

Ganz besonders bevorzugt ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Array von Mikroelektroden als modifizierte Oberfläche zu verwenden. In diesem Fall wird in dem Bereich einer Mikroelektrode jeweils eine Art von Ligat-Oligonukleotid an die Oberfläche angebunden. Aufgrund des räumlichen Abstandes zwischen den einzelnen Mikroelektroden kann die Messelektrode problemlos exakt und eindeutig an eine bestimmte Art von Ligat-Oligonukleotid angenähert werden.

Durch die Ansteuerbarkeit der einzelnen Mikroelektroden lassen sich die erhaltenen Messresultate sehr leicht bestimmten Hybridisierungsereignissen zuordnen.

In der allgemeinsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die nach Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche detektierten Werfe des Stromflusses mit bereits bekannten Referenzwerten verglichen. Diese Referenzwerte können in unabhängigen Experimenten für jeweils einen bestimmten Satz an Parametern (Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche, Konzentration der redoxaktiven Spezies in der Lösung, angelegtes Potential, Temperatur, Salzkonzentration, usw.) gemessen werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Referenzwerte vor der Zugabe der Probe in einer separaten Messung bestimmt. In dieser Ausführungsform erfolgt also nach dem Inkontaktbringen der die redoxaktive Spezies enthaltenden Lösung mit der modifizierten Oberfläche eine Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche. Aufgrund dieser unter den exakt gleichen Bedingungen der eigentlichen Messung durchgeführten Referenzmessung werden noch genauere und zuverlässigere Werte detektiert.

Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die getrennte Durchführung einer Referenzmessung vermieden werden. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Referenz-Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von Ligat-Oligonukleotiden modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einer Art von Ligand-Oligonukleotiden zu der Probe, wobei das Ligand-Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligat-Oligonukleotiden ist, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T₁₀₀) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die notwendig ist, um die Ligat-Oligonukleotide der T₁₀₀-Test-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T₁₀₀ erhaltenen Wert. Der für den Bereich T₁₀₀ erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von Ligat-Oligonukleotiden modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von Ligat-Oligonukleotiden in einem bestimmten Bereich (Test-Site T₀) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also das entsprechende komplementäre Oligonukleotid nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Ligand-Oligonukleotid zu der Probe, wobei das Ligand-Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligat-Oligonukleotiden ist, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T₁₀₀) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die notwendig ist, um die Ligat-Oligonukleotide der T₁₀₀-Test-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T₁₀₀ erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T₀ erhaltenen Wert. Der für den Bereich T₀ erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%).

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der beiden oben geschilderten Verfahren, die ohne getrennte Referenz-Messung auskommen, erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand- Oligonukleotid zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieses Ligand-Oligonukleotid in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Ligand-Oligonukleotid weist eine Assoziationskonstante >0 zu einer Art von Ligat-Oligonukleotiden auf, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T_n) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der Ligat-Oligonukleotide des Test-Sites T_n in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T₁₀₀ erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T₀ erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche T_n erhaltenen Werte. Der für ein bestimmtes Test-Site T_n erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Ligat-Oligonukleotid/Ligand-Oligonukleotid-Assoziaten bezogen auf die Gesamtzahl an Ligat-Oligonukleotide der entsprechend Art.

Die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n%ige Assoziation am Test-Site T_n zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z.B. nach Detektion der Werfe für T₀ und T₁₀₀ eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen die Ligat-Oligonukleotide und die Ligand-Oligonukleotide ausgestattet sind. Das Verhältnis von Ligand-Oligonukleotid-Label-Signal zu Ligat-Oligonukleotid-Label-Signal entspricht n%.

Wird eine genügende Anzahl an Referenz-Sites T_n auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Referenzkurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Referenzkurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich.

Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Ligand-Oligonukleotids, das nicht in der Probe enthalten ist, keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten. Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschntt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test-Sites und für die Referenz-Sites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden.

Wie oben bereits beschrieben, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Tatsache ausgenutzt, dass der Umsatz einer redoxaktiven Spezies an einer Elektrode, also die Oxidation bzw. Reduktion der redoxaktiven Spezies, von dem Zustand der Elektrodenoberfläche abhängt. Ist die Elektrodenoberfläche teilweise oder vollständig mit negativ geladenen Molekülen oder Molekülgruppen belegt, so ist es für negativ geladene redoxaktive Substanzen deutlich schwieriger zur Elektrodenoberfläche zu gelangen und dort oxidiert zu werden, als wenn eine ungeladene Elektrodenoberfläche vorliegt. Dieser Effekt kommt umso deutlicher zum Tragen, je größer die von den an die Elektrodenoberfläche gebundenen Molekülen getragene Ladung und je größer die von der redoxaktiven Spezies getragene Ladung ist. Aus diesem Grund werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung redoxaktive Spezies, die eine hohe Ladung tragen, gegenüber Spezies mit geringer Ladung und diese wiederum gegenüber ungeladenen Verbindungen bevorzugt.

Daneben soll noch erwähnt werden, dass die Belegung der Oberfläche mit Molekülen oder Molekülgruppen selbstverständlich in beliebiger Dichte erfolgen kann. Es ist offensichtlich, dass der oben beschriebene Effekt des erschwerten Zugangs der redoxaktiven Spezies an die Oberfläche umso stärker auftritt, je dichter die Oberfläche mit Molekülen oder Molekülgruppen belegt ist. Gleiches gilt für an die Oberfläche gebundene Ligat-Oligonukleotide. Eine Obergrenze der Dichte der Belegung ist in diesem Fall durch das zur Detektion von Hybridisierungsereignissen essentielle Erfordernis eines gewissen Raumangebots um die Ligat-Oligonukleotide herum gegeben, welches die Hybridisierung mit den Ligand-Oligonukleotiden erst möglich macht.

Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide verwendet, was einen ganz entscheidenden Vorteil mit sich bringt: Sind an die Elektrodenoberfläche Ligat-Oligonukleotide gebunden, die pro Phosphat-Einheit eine negative Ladung tragen, so ergibt sich bei der Bindung des komplementären Ligand-Oligonukleotids an die Ligat-Oligonukleotide in erster Näherung eine Verdopplung der Anzahl der Ladungen pro Elektrodenoberfläche. Werden hingegen im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide an die Elektrodenoberfläche gebunden, so steigert sich bei anschließender Bindung eines komplementären Ligand-Oligonukleotids die Ladung pro Elektrodenoberfläche sozusagen um einen Faktor ∞. Diese dramatische Änderung der Ladungsdichte hat ebenso dramatische Auswirkungen auf den Umsatz einer negativ geladenen redoxaktiven Spezies an der Elektrodenoberfläche. Die detektierte Stromstärke nimmt deutlich ab und erlaubt so einen einfachen und eindeutigen Nachweis, ob an die oberflächengebundenen, im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide komplementäre Ligand-Oligonukleotide gebunden sind oder nicht.

Unter einem geladenen Oligonukleotid wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid verstanden, das eine Anzahl an Elementarladungen trägt, welche ungefähr der Anzahl an Nukleotiden entspricht, aus denen sich das Oligonukleotid zusammensetzt. Bekanntermaßen sind die einzelnen Nukleotide über Phosphatgruppen miteinander verbunden. Da diese Phosphatgruppen in der Regel einfach negativ geladen sind, ergibt sich für das gesamte Oligonukleotid eine Gesamtladung, die im wesentlichen (nämlich bis auf am Ende der Nukleotidkette fehlende Phosphatgruppen) der Anzahl an Nukleotiden entspricht.

Unter dem Begriff "im wesentlichen ungeladen" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anzahl an einfach negativen Ladungen (Elementarladungen) des Ligat-Oligonukleotids verstanden, die maximal 50% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt. Bevorzugt beträgt die Anzahl an Elementarladungen des Ligat-Oligonukleotids maximal 40% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids, besonders bevorzugt maximal 30%, insbesondere maximal 20% und ganz besonders bevorzugt maximal 10% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids. Die besten Resultate werden mit vollständig ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden erzielt. Die ungeladenen Oligonukleotide gemäß den nachfolgenden Strukturformeln liefern besonders gute Resultate und werden daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.

Das dargestellte Methylphosphonat-Oligonukleotid und das dargestellte Methylphosphat-Oligonukleotid stehen exemplarisch für Klassen von Verbindungen, bei denen die Methyl-Gruppe durch einen beliebigen ungeladenen Rest ausgetauscht ist, insbesondere gegen Alkyl-Reste wie z.B. Ethyl-Reste. Außerdem kann z.B. bei den oben dargestellten Phosphoamidaten die NHR-Gruppe z.B. durch SR ersetzt werden.

Grundsätzlich ist es auch möglich die gesamte Phosphatgruppe zu ersetzen. Die einzelnen Sauerstoff-Atome können durch S-Atome (eine bis drei Substitutionen), P durch N, Odurch NH usw. ersetzt werden. Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl solcher Verbindungen bekannt.

Als Extremfall kann der vollständige Austausch des Zuckers und der Phosphat-Gruppe angesehen werden, wie es z.B. bei den oben dargestellten Peptid-Oligonukleotiden der Fall ist.

Im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide können durch Verwendung der oben gezeigten ungeladenen Backbones zusammen mit "normalen" geladenen DNA-Backbones erhalten werden. Je nach Anteil von geladenen und ungeladenen Abschnitten ergeben sich "im wesentlichen ungeladene" Ligat-Oligonukleotide, die eine Anzahl an Elementarladungen tragen, die zwischen 0 und maximal 50% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt. Selbstverständlich können auch Mischformen der oben genannten, verschiedenen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide verwendet werden. Das Backbone besteht in diesem Fall aus beliebigen Mischformen von modifizierten oder unmodifizierten Nukleotiden, die lediglich der Bedingung genügen müssen "im wesentlichen ungeladen" zu sein.

Daneben betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von Ligat-Oligonukleotiden besteht und eine effektive Menge einer redoxaktiven Spezies.

Die Oberfläche

Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Ligat-Oligonukleotide kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden. Der feste Träger kann aus leitfähigem oder nicht leitfähigem Material bestehen.

Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Metallen wie insbesonder Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.

Als Materialien der nichtleitenden Oberflächen werden Glas, modifiziertes Glas und Polymere bevorzugt. Die Modifizierung kann z.B. durch Silanisierung erfolgen und führt in allen Fällen zu funktionellen Gruppen, die geeignet sind, in Kopplungsreaktionen entsprechend funktionalisierte Ligat-Oligonukleotide zu binden. Diese Modifizierung schließt Schichtaufbauten auf der Glasoberfläche unter Verwendung von Polymeren wie z.B. Dextranpolymeren, die eine Variation der Schichtdicke und Oberflächenbeschaffenheit erlauben, mit ein. Weitere Derivatisierungsmöglichkeiten des Glases zur letztendlichen Anbindung der Ligat-Oligonukleotide bestehen z.B. im Aufbringen einer dünnen (ca. 10 – 200 nm) Metallisierungsschicht, insbesondere einer Gold-Metallisierungsschicht, die zusätzlich mit (Thiol-funktionalisierten) Polymeren, insbesondere Dextranen, belegt sein kann. Daneben kann das Glas nach der Silanisierung auch mit Biotin funktionalisiert werden (z.B. aminofunktionalisierte Glasoberfläche nach der Silanisierung und Kopplung der Carbonsäure Biotin über EDC und NHS bzw. über einen Biotinaktivester wie Biotin-N-succinimidylester) oder alternativ mit an Dextran-Lysin oder Dextran immobilisierten Biotin überzogen werden. Die so erzeugten biotinylierten Glasoberflächen werden anschließend mit Avidin oder Streptavidin behandelt und können dann zur Anbindung von biotinylierten Ligat-Oligonukleotiden verwendet werden.

Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Array von Mikroelektroden handelt es sich um handelsübliche Bauelemente. Die Mikroelektroden selbst bestehen aus einem leitfähigen Material, während sich zwischen den einzelnen Mikroelektroden ein nicht leitfähiges Material befindet, durch das die einzelnen Mikroelektroden sowohl räumlich als elektrisch voneinander getrennt werden. Die Mikroelektroden können aktiv oder passiv angesteuert werden. Im Falle der aktiven Ansteuerung kommt insbesondere die Verwendung von CMOS-Strukturen in Frage.

Bindung der Ligat-Oligonukleotide an die Oberfläche

Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäure-Oligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Ligat-Oligonukleotide können z.B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Ligat-Oligonukleotid vorhandenen oder durch Derivatisierung am Ligat-Oligonukleotid angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an die Oberfläche gebunden werden. Das Ligat-Oligonukleotid kann direkt oder über einen Linker/Spacer an die Oberflächenatome oder -moleküle einer Oberfläche gebunden werden. Daneben kann das Ligat-Oligonukleotid durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Ligat-Oligonukleotiden zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Die chemische Modifikation der Ligat-Nukleinsäure-Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden (vgl. z.B. WO 00/42217).

Ligand-Oligonukleotide

Als Ligand-Oligonukleotide werden Nukleinsäure-Oligomere bezeichnet, die spezifisch mit den an einer Oberfläche immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken können. Eine solche Wechselwirkung unter Bildung eines Komplexes setzt die Anwesenheit eines zu einem Ligand-Oligonukleotid komplementären oder nahezu komplementären Ligat-Oligonukleotids voraus. Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z.B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat-, ein Phosphoramid-, ein Alkyl-Phophonat-, ein Alkyl-Phosphat- oder ein Phosphoamidit-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung natürlich vorkommender DNA, RNA oder deren Transkriptions- oder Amplifikationsprodukte.

Redoxaktive Spezies

Als redoxaktive Spezies können Übergangsmetall-Komplexe verwendet werden, die vorzugsweise eine negative Gesamtladung aufweisen. Daneben ist aber auch die Verwendung von neutralen Übergangsmetallkomplexen mit negativ geladenen Liganden möglich. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Übergangsmetallkomplexe des Eisens, Cobalts, Nickels, Kupfers, Rutheniums, und Osmiums mit negativ geladenen Liganden bevorzugt. Als Liganden können beispielsweise cyano- (CN-), thiocyanato-(SCN-), hydroxo-(OH-), halogenido-(Fl^-, Cl^-, Br, I^-), oxo- (O^2-), thio- (S^2-) Gruppen und ähnliche, aber auch sterisch aufwändigere, mit negativen Gruppen wie z.B. -COOH, -OS(OH)₃ oder -OPO(OH)₂ modifizierte Liganden wie pyridyl- (py), bipyridyl- (bipy), cyclopentadienyl-(cp) Derivate und ähnliche verwendet werden. Die zuletzt genannten, mit negativen Gruppen modifizierten Liganden werden bevorzugt in Lösungen eingesetzt, deren pH-Wert oberhalb des pKs-Wertes der jeweiligen Verbindung liegt, weil dadurch sichergestellt ist, dass der jeweilige Übergangsmetallkomplex in der Lösung negativ geladen vorliegt.

Selbstverständlich können sämtliche, oben genannten Liganden in beliebigen Mischformen auftreten, es kann also ein Zentralatom eines Übergangsmetallkomplexes gleichzeitig unterschiedliche Liganden tragen. Ein willkürlich herausgegriffenes Beispiel eines solchen Komplexes ist die Verbindung Ammonium-tetranitro-diammin-kobaltat(III) NH₄[Co(NO₂)₄(NH₃)₂].

Daneben können als redoxaktive Spezies auch Chinone wie z.B. Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphthochinon oder Menachinon sowie deren mit negativen Gruppen wie z.B. -COOH, -OS(OH)₃ oder -OPO(OH)₂ modifizierten Derivate verwendet werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Übergangsmetallkomplex Eisenhexacyanoferrat besonders bevorzugt.

Elektrochemische Methoden

Als Detektionsmethode eigenen sich elektrochemische Methoden wie die Cyclovoltammetrie, Chronoamperometrie, Chronocoulometrie, Differential-Puls-Voltammetrie, Square-Wave-Voltammetrie oder Amperometrie bei konstantem Potential.

Bei der Cyclovoltammetrie wird eine Strom/Spannungskurve aufgezeichnet. Das Potential einer stationären Arbeitselektrode wird dabei zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.

Bei der Chronocoulometrie erfolgt die Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z.B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden. Die Methode der Chronocoulometrie ist z.B. in Steel, A.B., Herne, T.M. und Tarlov M.J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670 – 4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben.

Bei der Differential-Puls-Voltammetrie werden einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe Rechteckpulse mit kleiner, konstanter Amplitude überlagert. Die Messungen des Stroms als Funktion der Spannung erfolgen dabei unmittelbar vor dem Puls und am Ende des Pulses. Aufgetragen werden die Differenzen der Strommesswertpaare gegen das Potential.

Bei der Square-Wave-Voltammetrie wird einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe eine rechteckförmige Wechselspannung mit kleiner, konstanter Amplitude und niedriger Frequenz überlagert. Zur Messung des Stroms als Funktion der Spannung werden jeweils mehrmals die Differenzen der Ströme bei maximaler und minimaler Rechteckspannung bestimmt.

Bei (chrono)amperometrischen Messungen erfolgt die Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z.B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Amperometrische Verfahren sind in der WO 00142217 ausführlich dargestellt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
1 Schematische Darstellung von negativem Feedback (1a) und positivem Feedback (1b).
2 Schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME. 2a) zeigt den Verlauf bei negativem Feedback und 2b) den Verlauf bei positivem Feedback.
3 Schematische Darstellung einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Messelektrode.
4 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Hybridisierung von ss-DNA zu ds-DNA an vordefinierten Stellen der Chip-Oberfläche.
5 Resultate einer SECM-Messung einer 20-mer-Oligonukleotid-Monolayer (5 mmol/l K₄Fe(CN)₆ in 0,1 mol/l Phosphatpuffer pH 7; Pt Mikroelektrode mit Durchmesser von 10 m μm; Rastergeschwindigkeit: 10 μm/s). Die verschiedenen Graustufen geben einen Stromwert entsprechend der abgebildeten Graustufenskala wieder.
6 Drei-dimensionale Darstellung der Messwerte gemäß 5.
Die 1 zeigt schematisch eine Ultramikroelektrode (UME), die in einem bestimmten Arbeitsabstand in einem Elektrolyt über eine Oberfläche bewegt wird. Das Potential der UME ist dabei über einen Potentiostaten so eingestellt, dass eine gelöste redoxaktive Spezies (Red/Ox) diffusionskontrolliert umgesetzt wird. Nähert man die UME schrittweise an die Oberfläche an und detektiert dabei den resultierenden Strom, so können zwei Fälle unterschieden werden.
Handelt es sich um eine nicht leitfähige (inaktive) Oberfläche (1a), so bewirkt die Annäherung der UME durch die Störung des zuvor hemisphärischen Diffusionsfeldes einen verminderten Stofftransport zur UME und somit eine Abnahme im Diffusionsgrenzstrom. Man spricht vom negativen Feedback (1a). Die 2a) zeigt eine schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME für den Fall eines negativen Feedbacks.
Liegt dagegen eine leitfähige (aktive) Oberfläche vor (1b) und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der UME umgesetzten redoxaktiven Spezies (Red/Ox) statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Man spricht vom Redoxrecycling oder positivem Feedback (1b). Die 2b) zeigt eine schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME für den Fall eines positiven Feedbacks.
Die 3 zeigt eine schematische Darstellung einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Messelektrode. Die elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode besitzt einen Radius < 100 μm und befindet sich in einer Isolationshülle (Glaskapillare), welche einen mehrfachen Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche aufweist.
Die 4 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Hybridisierung von ss-DNA zu ds-DNA an vordefinierten Stellen der Chip-Oberfläche. Über einer leitenden Oberfläche wird der an der Mikroelektrode diffusionslimitiert oxidierte Redoxmediator Fe(CN)₆ ^3-/4- (dargestellt als Fe^2+/3+) mit hoher Elektronentransferkinetik rereduziert, so dass die lokale Konzentration des reduzierten Mediators im Diffusionsfeld vor der Mikroelektrode im zeitlichen Mittel vergrößert wird. Es wird ein vergleichsweise hoher Strom detektiert (die gestrichelte Linie in 4 stellt eine in vertikaler Richtung zunehmende Stromstärke dar). Über mit ss-DNA modifizierten Stellen der Oberfläche ergibt sich sowohl durch Coulomb'sche Wechselwirkungen als auch durch die sterische Blockierung der Elektrodenoberfläche eine Modulation der Elektronentransferkinetik (im gezeigten Fall eine Verlangsamung der Rereduktion des an der Mikroelektrode oxidierten Redoxmediators Fe(CN)₆ ^3-/4-). Es wird eine Verringerung des Messstroms detektiert. Nach selektiver Hybridisierung der Ligat-Oligonukleotide mit den komplementären Ligand-Oligonukleotiden ergibt sich eine weitere Blockierung der Oberfläche und damit eine stärkere Modulation der Elektronentransferrate des frei diffundierenden Redoxmediators.
Es wird eine weitere Verringerung des Messstroms festgestellt.
In der 5 sind die Resultate einer SECM-Messung einer 20-mer-Oligonukleotid-Monolayer in 5 mmol/l K₄Fe(CN)₆, 0,1 mol/l Phosphatpuffer pH 7 dargestellt. Es wurde eine Pt-Mikroelektrode mit einem Durchmesser von 10 μm und eine Rastergeschwindigkeit von 10 μm/s verwendet. Den beim Abrastern der Oberfläche mit der Mikroelektrode angefahrenen x,y-Koordinaten ist ein Stromwert entsprechend der abgebildeten Graustufenskala zugeordnet. Die hybridisierten Spots sind deutlich an den signifikant verringerten Stromwerten zu erkennen.
Die 6 zeigt eine drei-dimensionale Darstellung der Messwerte des in 5 dargestellten Experiments. Die drei-dimensionale Darstellung verdeutlicht die durch Hybridisierung der ss-Oligonukleotide zu ds-Oligonukleotiden induzierte Modulation der Elektronentransferrate.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Zur Durchführung der SECM-Messungen wurden verschiedene modifizierte Ligat-Nukleinsäure-Oligomere unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Ligat-Nukleinsäure-Oligomere bekannter Sequenz an definierten Positionen der Oberfläche, einem DNA-Array, wird das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Ligand-Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Ligand-DNA detektiert, um z.B. Mutationen im Ligand-Oligonukleotid aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. Als Ligat-Nukleinsäure-Oligomere und/oder Ligand-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z.B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 8 bis 50, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 30 verwendet.
Wird die so bereitgestellte Oberfläche mit immobilisierten Ligat-Oligonukleotiden mit einer (möglichst konzentrierten) Untersuchungslösung mit Ligand-Oligonukleotid(en) in Kontakt gebracht, so kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Ligand-Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Ligat-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.
Nach der Hybridisierung zwischen Ligat-Oligonukleotid und Ligand-Oligonukleotid wird in einer SECM-Messung (z.B. einer amperometrischen Messung) die Anzahl an Hybridisierungsereignissen in den verschiedenen räumlichen Bereichen des DNA-Chips bestimmt. Durch Vergleich der dabei erhaltenen Werte mit den bekannten Referenzwerten kann der Grad der Assoziation für die einzelnen Test-Sites bestimmt werden.
Beispiel 1: Darstellung von amino- und thiol-modifizierten Oligonukleotiden zur Verankerung auf Gold als Ligat-Oligonukleotide
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 Minuten verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Darstellung von 3'-thiolmodifizierten Ligat-Oligonukleotiden (bzw. HO-(CH₂)₂-SS-(CH₂)₂OPO₃-Oligonukleotiden) erfolgt an 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) analog zu Standardprotokollen, wobei die Oxidationsschritte mit einer 0.02 mol/l Iodlösung durchgeführt werden, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt. Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C über einen Zeitraum von 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0.1 mol/l Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS.
Beispiel 2: Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH₂)₂-ss-oligo
Die Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche und der Derivatisierung der Oberfläche mit dem Ligat-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt).
Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wird in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon-Ionenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wird der Gold-Film mit 30% H₂O₂/70% H₂SO₄ von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Oberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Oberfläche eine vorher bereitete 1 × 10^-4 molare Lösung des (modifizierten) Oligonukleotids aufgetragen, so dass die komplette Gold-Oberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).
Zur Inkubation wird ein modifiziertes 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAG CGG ATA ACA CAG TCA CC-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH (vgl. Bsp. 1) verestert ist. Zu einer 5 × 10^-5 molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0.1 molar in Wasser, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB) wird eine ca. 10^-5 bis 10^-1 molare Propanthiol-Lösung (oder ein anderes Thiol oder Disulfid geeigneter Kettenlänge) zugegeben, die Gold-Oberfläche eines Test-Sites komplett benetzt und 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S-Bindung aus, wodurch es zu einer 1:1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S-Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem unmodifizierten Komplementärstrang hybridisiert sein.
Beispiel 3: Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH₂)₂-ss-oligo
Die alternative Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo gliedert sich in 3 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der Derivatisierung der Oberfläche mit dem Ligat-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten monofunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt). Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Ligat-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen), vgl. Bsp. 2.
Zur Inkubation wird ein modifiziertes 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAG CGG ATA ACA CAG TCA CC-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Die Goldoberfläche eines Test-Sites wird mit einer ca. 5 × 10^-5 molaren Lösung dieses Oligonukleotids in HEPES-Puffer (0.1 molar in Wasser, pH 7.5) benetzt und 2 – 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S-Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt (Inkubationsschritt).
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Elektrode mit einer ca. 10^-5 bis 10^-1 molaren Propanthiol-Lösung (in Wasser oder Puffer, pH 7 – 7.5) oder mit einem anderen Thiol oder Disulfid (geeigneter Kettenlänge) komplett benetzt und 2 – 24h inkubiert. Das freie Propanthiol belegt nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S-Bindung.

Claims

Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von Ligat-Oligonukleotiden besteht, b) Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden, c) Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält, d) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, e) Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche, f) Vergleich der in Schritt e) erhaltenen Werte mit Referenzwerten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach Schritt c) und vor Schritt d) der Schritt c₁) Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit den in Schritt c₁) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche maximal 4 mal, bevorzugt maximal 3 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche maximal 2 mal, bevorzugt maximal genauso groß ist wie ihr Radius.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Messelektrode mit einem Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0,05 bis 250 μm, bevorzugt von 0,5 bis 50 μm, besonders bevorzugt von 5 bis 25 μm verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Messelektrode eine Scheibenelektrode verwendet wird, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Detektionsverfahren ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclovoltammetrie, Chronocoulometrie, Differential-Puls-Voltammetrie, Square-Wave-Voltammetrie oder insbesondere Amperometrie verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als redoxaktive Spezies ein oder mehrere elektrisch geladene Verbindungen verwendet werden, insbesondere negativ geladene Übergangsmetallkomplexe, besonders bevorzugt Cu-, Fe-, Ru-, Os-, Ni und Co-Übergangsmetallkomplexe.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der modifizierten Oberfläche um eine leitfähige Oberfläche handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die leitfähige Oberfläche aus einem Metall, einer Metalllegierung, einem Halbleiter, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 14 und 16, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 13 und 15, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 15 und 16, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 11 und 17, einer ternären Verbindung der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder einer ternären Verbindung Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als modifizierte Oberfläche ein Array von Mikroelektroden verwendet wird und im Bereich einer Mikroelektrode jeweils eine Art von Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche angebunden ist:
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei der modifizierten Oberfläche um eine nicht leitfähige Oberfläche handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die nicht leitfähige Oberfläche aus Glas, modifiziertem Glas oder einem Polymer-Material besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anbindung der Ligat-Oligonukleotide an die Oberfläche kovalent oder durch Chemi- oder Physisorption erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei an die Oberfläche verzweigte oder unverzweigte Molekülteile beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge kovalent oder durch Chemi- oder Physisorption angebunden sind und die Ligat-Oligonukleotide kovalent an diese Molekülteile angebunden sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt a) eine durch Anbindung von wenigstens zwei verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden modifizierte Oberfläche bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei jeweils überwiegend eine Art von Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei jeweils ausschließlich eine Art von Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Schritt a) der Schritt a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens zwei Arten von Ligat-Oligonukleotiden besteht und die verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden sind durchgeführt wird, nach Schritt b) und vor Schritt d) der Schritt b₁) Zusatz von einem Ligand-Oligonukleotid zu der Probe, wobei das Ligand-Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante eines in einem bestimmten Bereich T₁₀₀ an die Oberfläche gebundenen Ligat-Oligonukleotids ist, wobei das Ligand-Oligonukleotid in einer Menge zugegeben wird, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotid, die notwendig ist, um die Ligat-Oligonukleotide der T₁₀₀-Test-Sites vollständig zu assoziieren durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T₁₀₀ erhaltenen Wert verglichen werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei als Schritt a) der Schritt a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens drei Arten von Ligat-Oligonukleotiden besteht und die verschiedenen Arten von Ligat-Oligonukleotiden in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden sind, wobei wenigstens eine Art von Ligat-Oligonukleotid in einem bestimmten Bereich T₀ an die Oberfläche angebunden ist, und wobei in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu diesem Ligat-Oligonukleotid enthalten ist durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T₁₀₀ erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T₀ erhaltenen Wert verglichen werden.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei vor Schritt d) der Schritt b₂) Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand-Oligonukleotid zu der Probe, wobei das Ligand-Oligonukleotid in der in Schritt b) bereitgestellten Probe nicht enthalten ist und das Ligand-Oligonukleotid eine Assoziationskonstante >0 zu einem in einem bestimmten Bereich T_n an die Oberfläche gebundenen Ligat-Oligonukleotid aufweist, wobei das Ligand-Oligonukleotid in einer Menge zugegeben wird, dass nach Schritt d) n% der Ligat-Oligonukleotide in dem Bereich T_n in assoziierter Form vorliegen durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T₁₀₀ erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T₀ erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche T_n erhaltenen Werten verglichen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ligand-Oligonukleotide und/oder die Ligat-Oligonukleotide 3 bis 70 Basen, insbesondere 8 bis 50 Basen, besonders bevorzugt 10 bis 30 Basen umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Ligat-Oligonukleotide im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei als im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide Ligat-Oligonukleotide verwendet werden, die eine Anzahl an Elementarladungen tragen, die maximal 40% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt, bevorzugt maximal 30%.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei als im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide Ligat-Oligonukleotide verwendet werden, die eine Anzahl an Elementarladungen tragen, die maximal 20% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt, bevorzugt maximal 10%.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Ligat-Oligonukleotide ungeladene Ligat-Oligonukleotide verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei als im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide oder als ungeladene Ligat-Oligonukleotide Oligonukleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylphosphonat-Oligonukleotide, Methylphosphat-Oligonukleotide, Phosphoamidat-Oligonukleotide, Peptid-Oligonukleotide und deren Mischungen verwendet werden.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von Ligat-Oligonukleotid besteht, und einer effektiven Menge einer redoxaktiven Spezies.