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EP1489407A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Leitfähigkeitsmessung von Analyten mit elektrisch aktiven Markern - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur Leitfähigkeitsmessung von Analyten mit elektrisch aktiven Markern Download PDF

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Publication number
EP1489407A1
EP1489407A1 EP04013399A EP04013399A EP1489407A1 EP 1489407 A1 EP1489407 A1 EP 1489407A1 EP 04013399 A EP04013399 A EP 04013399A EP 04013399 A EP04013399 A EP 04013399A EP 1489407 A1 EP1489407 A1 EP 1489407A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
measuring
analytes
electrode
recognition
electrically active
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04013399A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Edgar Dr. Diessel
Jens Dr. Burmeister
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Technology Services GmbH filed Critical Bayer Technology Services GmbH
Publication of EP1489407A1 publication Critical patent/EP1489407A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/04—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating resistance
    • G01N27/12—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating resistance of a solid body in dependence upon absorption of a fluid; of a solid body in dependence upon reaction with a fluid, for detecting components in the fluid

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for quantitative electrical Detection of analytes in a sample. This is preferably the specific one Detection of a biologically relevant molecule in an aqueous medium.
  • the sensor principle or such a sensor has a large area of application e.g. in the Environmental analysis, the food sector, human and veterinary diagnostics, plant protection and in biochemical or pharmacological research.
  • Bio- and chemical sensors are known for such diagnostic applications have biofunctional surface and a physical signal converter.
  • Under one biofunctional surface is to be understood as a surface to which biological, chemical or biochemical recognition elements are bound.
  • Biofunctional surfaces such as DNA, RNA, aptamers, receptors to which an analyte is bound during detection binds specifically by means of a recognition reaction.
  • recognition reactions are the binding of ligands to complexes that Complexation of ions, binding of ligands to (biological) receptors, membrane receptors or ion channels, from antigens or haptens to antibodies (immunoassays), from Substrates to enzymes, from DNA or RNA to certain proteins, from aptamers or Spiegelmers their targets, the hybridization of DNA / RNA / PNA or other nucleic acid analogues (DNA assays) or the processing of substrates by enzymes.
  • analytes to be detected are DNA, RNA, PNA, nucleic acid analogs, enzyme substrates, Peptides, proteins, potential active substances; Medicines, cells, viruses.
  • recognition elements to which the analytes to be detected bind are DNA, RNA, PNA, nucleic acid analogs, aptamers, Spiegelmers, peptides, proteins, complexing agents for Metals / metal ions, cyclodextrins, crown ethers, antibodies or their fragments, anticalins, Enzymes, receptors, membrane receptors, ion channels, cell adhesion proteins, gangliosides, Mono- or oligosaccharides.
  • Different detection elements are spatially separated from each other on the surface of the signal converter bound separately, so a large number of recognition reactions with one too examining sample can be carried out simultaneously.
  • This is realized e.g. at so-called DNA arrays with different DNA sequences (e.g. oligonucleotides or cDNAs) are immobilized on a solid support (e.g. glass).
  • DNA arrays are usually included optical but also with electrical methods and are used in the Expression profiling, sequencing, detection of viral or bacterial nucleic acids or genotyping.
  • the detection of the detection reaction in bio or chemical sensors can be applied optical, electrical or electrochemical, mechanical or magnetic signal conversion processes respectively.
  • the most advanced optical methods described have However, due to the complex structure of the light source, The sensor and light detector are usually only miniaturized to a limited extent and are therefore the inferior to electrical methods in terms of manufacturing costs.
  • the development of electrical sensors is growing Meaning too.
  • the use of microstructuring technology leads from the Semiconductor technology to miniaturized formats that have high sensitivity at low Promise manufacturing costs.
  • the marking units are particularly advantageous for the analyte, the properties of which differ significantly from those of the constituents distinguish the sample to be analyzed.
  • metallic nanoparticles as marking units.
  • Certain electrical biosensors are also part of direct current measurements metallic nanoparticles have the potential for extremely high sensitivity down to the Single-molecule range. This potential is opened up in particular by autometallographic Deposition.
  • autometallography process which consists of photography and the Known by electron microscopy, the nanoparticles or colloids act as catalysts for the electron transfer from a reducing agent to an Au or Ag ion, which is in the form an Ag or Au salt with the reducing agent such as e.g. Hydroquinone in the reinforcement solution located. After the reduction, the ion on the colloid precipitates as metal.
  • Electrical signal converters are selected for this by electrode pairs, which are separated by an insulator are separated from each other.
  • the disadvantage of this method is the comparatively small measuring area, which leads to a bad one Signal-to-noise ratio leads. Furthermore, if necessary, falsifying are complex Washing and drying steps necessary to prepare the measurement.
  • the invention has for its object a highly sensitive electrical measuring device and to develop a measurement method for the detection of analytes by means of recognition reactions, which avoids the disadvantages of the prior art.
  • the essence of the invention relates to the online measurement of electrical resistance or Conductivity between the measuring electrode and the counter electrode of the measuring device during there is a suitable reinforcement solution on the measuring device.
  • the measuring electrode together with the adjacent insulating substrate area are the following measurement area called.
  • the size of the measuring area is immobilized by the area of the associated area Detection molecules defined. It was found that during the reinforcement process a significant change in resistance or conductivity between the measuring electrode and counter electrode can be measured.
  • An interpretation for the drop in resistance consists in the fact that at this point the conductive marking units located on the Insulator, form a conductive layer and conductively linked to the measuring electrode become. This greatly increases the electrode area.
  • the measuring electrode can be used Recognition DNA must be occupied. However, this is not necessary if the conductive layer due to the spatial proximity of the marking units on the insulator to the measuring electrode the marking units are electrically conductively linked to the electrode.
  • increasing the amplification process is done by Sensor device in the vicinity of the measuring electrode additionally an insulated from the measuring electrode conductive layer applied to a certain area. This area only needs partially to be covered by the area of the sample molecules. Through the recognition reaction with subsequent reinforcement, this surface is electrically conductively linked to the measuring electrode, which additionally increases the increase in conductivity or decrease in resistance.
  • the online measurement allows in particular a quantification by analyzing the temporal Course of resistance or conductivity.
  • the curve shape of the temporal course of the electrical parameter with a suitable mathematical function be adjusted. In this case, the analyte concentration becomes the curve parameters certainly.
  • the associated time period or parameters are used to quantify an analyte from the curve fitting with those from at least one control sample with known ones Analyte concentration compared.
  • a method is therefore also preferred, characterized in that the concentration information in a quantitative assay or the basic evidence in a qualitative assay the duration of reaction B) until a significant gradient in time was reached Course of resistance or conductivity with time of reaction B) of a reference sample compared and used for quantitative or qualitative analysis of the analyte.
  • the immobilization of the recognition molecules on the measuring surface and / or the adjacent one Insulating layer is carried out in particular by methods known in principle to the person skilled in the art.
  • This immobilization is e.g. DNA recognition units in S.L. Beaucage, Curr. Med. 8, 1213-1244 (2001).
  • For the immobilization on the measuring surface there is an optimal density of detection units which, with a high surface density, ensure optimal activity of the Detection unit guaranteed.
  • the immobilization of recognition elements such as antibodies can be covalent or noncovalent.
  • avidin or streptavidin can be found on the surface is physisorbed or covalent after suitable surface biofunctionalization be immobilized.
  • biotinylated antibodies can be specifically immobilized.
  • Recognition elements for the analytes on a measuring surface with a biofunctional are preferred Surface bound.
  • the analytes undergo a recognition reaction with the recognition elements on.
  • the analyte can be electrically connected to the detection element before it is bound active marking unit or it is only after the binding to the Identification element marked by e.g. a binding element that with a marker unit is marked, binds to the complex consisting of the recognition element and the molecule.
  • the analytes can also be indirectly detected by the recognition reaction and therefore do not necessarily have to be marked.
  • indirect detection Analytes that are already labeled with labeling units before binding to the recognition element are brought into contact with the biofunctional surface. At the same time, additional unlabelled analytes brought into contact with the biofunctional surface. These two Species compete for binding to the immobilized recognition elements. Are located If there are no unlabelled analytes in the measuring solution above the measuring surface, all binding sites will be on the detection elements of labeled analytes and the modification of the Resistance or conductivity becomes maximum.
  • the binding sites on the recognition elements become corresponding of the respective concentrations of unlabelled analytes and labeled analytes occupied so that the modification of the resistance compared to the vanishing concentration of the unlabelled analyte is smaller.
  • This mixing system is calibrated by the measurement of at least one sample containing only the labeled analyte with a known one Contains concentration.
  • a variant of the method is therefore preferred, characterized in that in step A) quantitatively predetermined amount of a known analyte which is provided with labeling units is mixed with the sample of an unlabeled known analyte and from a Comparison of the analysis D) of this mixing system with the analysis of the pure known labeled Analyte the concentration of the unlabelled analyte is determined.
  • analytes are labeled with labeling units which are in are suitably electrically active.
  • the electrical activity can be in the electrical Conductivity of the material used for the marking units exist, which is preferred is in the range of metallic conductivities.
  • Monomers can also be more electrically conductive Polymers can be chosen as electrically active elements.
  • enzymes are also considered considered electrically active elements when they catalyze a reaction, which leads to conductive products leads like conductive polymers.
  • Nanoparticles, metal complexes and / or can be used as electrically active marking units Clusters of conductive materials such as Au, Ag, Pt, Pd, Cu can be used.
  • the size of the electrically active marking units is preferably in the range from 1 to 100 nm, particularly preferably in the range from 1 to 30 nm, particularly preferably in the range from 1 to 2 nm.
  • the latter size is e.g. through Au clusters consisting of 50-150 atoms realized.
  • the size specification refers to the largest diameter of the marking units.
  • non-conductive particles with a conductive coating or non-conductive particles with a metallic coating can be used as marking units.
  • non-conductive Particles can e.g. Be polystyrene beads.
  • Labeling units can preferably be based on conductive polymers e.g. polyanilines, Polythiophenes, especially polyethylene dioxythiophene, polyphenylenes, polyphenylene vinylene, Polythiophene vinylene, polypyrroles.
  • conductive polymers e.g. polyanilines, Polythiophenes, especially polyethylene dioxythiophene, polyphenylenes, polyphenylene vinylene, Polythiophene vinylene, polypyrroles.
  • a variant of the method is also preferred, characterized in that the electrical active labeling units based on enzymes, preferably HRP, by the implementation a substrate selected from aniline or ethylenedioxythiophene electrically active labeling units form.
  • HRP is the deposition of a polymer to which e.g. nanoparticles or all of the labeling units described above directly or indirectly via biotin streptavidin, Biotin-Avidin or Biotin-NeutrAvidin are bound.
  • the polymer is biotinylated. This principle is known as Catalyzed Reporter Deposition (CARD).
  • a method is particularly preferred, characterized in that the electrically active Labeling unit based on an enzyme that prevents the formation of a non-conductive polymer, in particular catalyzes a biotinylated polymer, which in turn directly or indirectly with Nanoparticles, metal complexes or clusters based on elements from the Au, Ag, Pt, Pd, Cu or is connected to electrically conductive polymers.
  • Suitable reinforcement solutions depend on the type of electrically active selected Labeling units.
  • non-conductive particles with metallic coating become special advantageous autometallographic reinforcement solutions based on Ag or Au salts Signal amplification used.
  • Reinforcement solutions can be used for monomers of electrically conductive polymers consist of catalysts, initiators and / or further monomers of these polymers, which are required for the polymerization.
  • aniline can be used as a catalyst e.g. HRP can be used.
  • enzymes as electrically active labeling units e.g. HRP the monomers of an electrically conductive polymer e.g. Aniline as a reinforcement solution be used.
  • Reinforcement solutions can be placed above electrical marking units in the course of the reinforcement process change their concentration so that the amplification process enters a saturation phase entry.
  • the reinforcement solution should preferably be exchanged. This can be done by stirring or by complete Exchange of liquid e.g. within the framework of a microfluidic flow system. The Exchange is preferably continuous.
  • the method according to the invention can e.g. for the analysis of peptides, proteins or Nucleic acids are used.
  • the recognition reaction used in the method is preferred
  • DNA assays serve preferably for the detection of viral DNA or RNA or of DNA of bacterial species, as well as expression profiling, genotyping for the diagnosis of hereditary diseases or for pharmacogenomics (genetically determined mode of action or side effects of pharmaceuticals), Nutrigenomics (genetically determined mode of action or side effects of food).
  • the method according to the invention allows the simultaneous analysis of a large number of analytes by A corresponding number of measuring surfaces are available for such multiplex analyzes is provided.
  • One analyte is detected for each measurement area.
  • On several measuring surfaces can also use the same detection elements for multiple detection of an analyte be immobilized.
  • Individual measuring surfaces can e.g. for the detection of reference substances which the influence of e.g. Temperature, light used to characterize the amplification process become. These reference values can be used to normalize the signals of other measuring surfaces become.
  • a method is therefore also preferred, characterized in that a A large number of recognition reactions with steps A) to D) simultaneously and simultaneously on one Sensor device can be performed by using the measuring device with a variety of Measuring electrodes is provided, on each of which the same or different detection elements are attached. Multiplex assays are used for scientific applications Numbers> 1000 used, while for diagnostic applications with numbers 1 - 1000 is expected. Because of the possible large number of measuring surfaces, the device can simultaneously for the detection of a large number of proteins or peptides as a protein array or Peptide array or for the detection of nucleic acids can be used as a nucleic acid array.
  • aqueous media are body fluids such as blood, saliva, urine, sweat, interstitial Fluid and tear fluid.
  • the measuring surfaces, detection elements, analytes, electrically active marking units and reinforcement solutions preferably those for implementation the properties described above.
  • the determination of the conductivity is e.g. carried out in a 2 or 3 point geometry.
  • the counter electrode or the reference and counter electrode be attached together with the measuring surface on a common substrate or as a separate Electrodes in a measuring cell. This enables cost-saving production the measuring cell.
  • one or, advantageously, a plurality of measuring surfaces are on a substrate applied. Accordingly, a species of Immobilized detection elements. Different measuring surfaces can be the same or wear pairs of different species of recognition elements.
  • a device is therefore preferred, characterized in that the surface of the measuring device has a plurality of measuring electrodes, on each of which the same or different Detection molecules are attached.
  • the measuring electrodes can advantageously be realized by screen printing techniques with structure widths between approx. 100 ⁇ m and 1 mm.
  • Optical lithography methods allow lateral structure sizes of approx. 2 ⁇ m. Much smaller lateral dimensions are achieved using electron beam techniques.
  • the size of the measuring surface covered with recognition molecules is preferably 100 ⁇ m to 1 mm.
  • the one according to the invention is suitable Device as a platform for nucleic acid and protein arrays.
  • An embodiment of the device is also preferred, characterized in that the sets of Detection molecules with measuring electrodes a nucleic acid array, a peptide array or a Form a protein array.
  • the feed lines to the electrodes are advantageously isolated from the reinforcement solution. This can be achieved, for example, by the deposition of SiO 2 on the feed lines.
  • the electrodes can be made planar or in non-planar geometries.
  • a device is also preferred, characterized in that the measuring electrodes on a Substrate are carried out planar side by side.
  • one or more measuring surfaces are located side by side on a substrate.
  • Analyte and amplification solutions can be channeled into the microchannels Substrate are etched, the measuring surfaces are fed.
  • the measuring surfaces e.g. on the bottom of these channels.
  • a component provided with microchannels can be used as Lid can be used for a planar substrate.
  • a multiplex assay is implemented in particular in that a set of Microchannels in a layer structure with at least one top and one base layer (electrical insulator) and at least one intermediate layer of alternating side by side attached electrically conductive layers (measuring layers) and insulator layers becomes.
  • the channels are arranged side by side and pass independently of one another electrically controllable measuring layers, the individual channels with different Recognition DNAs are populated.
  • the spatially resolved DNA immobilization in a microchannel can be achieved by the electrical attraction of polystyrene beads on their Surface recognition DNA - is immobilized between two selectable electrodes done, see Velev et al., Langmuir 15, 3693 (1999).
  • the sample feed is advantageous via microchannels that are perpendicular to the measuring surface in the range between 1 and 1000 ⁇ m, preferably 1 - 50 ⁇ m.
  • the Size specifications are related to the diffusion coefficients of biomolecules Incubation times in the seconds to the lower minutes range of 1-10 minutes motivated.
  • the electrolyte space is formed by one or more channels that have a variety of Have measuring electrodes and a maximum height of 100 ⁇ m above the measuring electrodes exhibit.
  • the reinforcement solution is preferred by those described above microfluidic channels exchanged gradually or continuously. Besides, one is To provide a device that drives the liquid exchange. Pumps or Syringes are used. You can also use additional electrodes in the duct system electroosmotic flows are generated.
  • the non-conductive substrates preferably consist of a material selected from the series: glass, SiO 2 , plastics, for example made of polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene.
  • Metals such as Au, Pl, Ag, Ti, semiconductors such as e.g. Si, in particular doped Si, metal oxides in particular indium tin oxide (ITO) or conductive polymers such as Polyanilines, polythiophenes, in particular polyethylene dioxythiophene, polyphenylenes, polyphenylene vinylene, Polythiophene vinylene, polypyrroles in question.
  • semiconductors such as e.g. Si, in particular doped Si
  • metal oxides in particular indium tin oxide (ITO) or conductive polymers such as Polyanilines, polythiophenes, in particular polyethylene dioxythiophene, polyphenylenes, polyphenylene vinylene, Polythiophene vinylene, polypyrroles in question.
  • ITO indium tin oxide
  • conductive polymers such as Polyanilines, polythiophenes, in particular polyethylene dioxythiophene, polyphenylenes, polyphenylene vinylene, Poly
  • the invention further relates to the use of the device as a nucleic acid array, Peptide array or as a protein array.
  • the sensor of the measuring device essentially consists of a polyethylene terephthalate substrate 1 with printed carbon electrodes 2 and 3, see. Fig. 1. Is over electrodes 2 and 3 an insulating polymer layer 4 is applied, which is between the connection points of the sensor and the area of the measuring electrodes.
  • the sensors were made by Molecular Circuitry, West Conshohocken, PA, USA.
  • An Ag wire 5 serves as the counter electrode about 1 mm away from the sensor is mounted in a Petri dish 6.
  • A serves as the measuring device 7 Keithley 2000 multimeter, which is operated in resistance mode, measuring range 10 MOhm.
  • the inputs of the measuring device can optionally be connected to the electrodes 2 via the leads 8, 9, 10 or 3 and the Ag wire 5 are connected via the lead 11.
  • the sensors were placed in ethanol for 30 min in the first cleaning step and then rinsed in ddH 2 0. This cleaning step was repeated once.
  • the sensors were placed in 2% Alconox solution for 15 min and then rinsed with ddH 2 0. This cleaning step was also repeated once.
  • the sensors were incubated in an aqueous poly (phenylalanine) lysine (Sigma) (0.1 mg / ml) solution at 2M NaCl and 50 mM KH 2 PO 4 (pH 7.1) at RT for 1 h to apply a polymer layer to the sensor raise.
  • aqueous poly (phenylalanine) lysine Sigma (0.1 mg / ml) solution at 2M NaCl and 50 mM KH 2 PO 4 (pH 7.1) at RT for 1 h to apply a polymer layer to the sensor raise.
  • recognition DNA positive (5'-amino-GTCCCCTACGGACA.AGGCGCGT-3 ') Positive region 12 and recognition DNA negative (5'-amino - TTTTTCGCGCCTTGTCCGTAGGGGACT-3 ') to negative area 13.
  • recognition DNA negative (5'-amino - TTTTTCGCGCCTTGTCCGTAGGGGACT-3 ')
  • Recognition DNAs were dissolved in phosphate buffer pH 7.2 and incubated with 0.1 M bis-sulfosuccinimidyl suberate (BS3, manufactured by Pierce) at RT for 10 min. The reaction was stopped by dilution with phosphate buffer. The detection DNA was purified by chromatography on a NAP-10 column (manufacturer Pharmacia). The purified recognition DNA was applied to the surfaces of the sensor in volumes of, for example, 20 ⁇ l and incubated overnight at room temperature. The resulting DNA chips were washed with 1% aqueous ammonium hydroxide solution and ddH 2 O. To block the unreacted amino groups on the chip surface, the sensor was incubated for 4 hours with an activated carboxymethyl-dextran solution.
  • BS3 bis-sulfosuccinimidyl suberate
  • the solution was prepared as follows: Part: 20 mg / ml carboxymethyl-dextran in ddH 2 O and part 2: 0.2 mmol / ml EDC + 0.2 mmol / ml NHS in ddH 2 O. Mix solution part 1 + solution part 2 in a ratio of 1: 1 and let react for 20 min. The sensors were then incubated in ddH 2 O for 1 h.
  • DNA hybridization reactions with an analyte DNA sample of the sequence 5'-biotin-TTTTTCGCGCCTTGTCCGTAGGGGACT-3 ' were carried out on the sensor surfaces 12 and 13 coated with recognition DNAs.
  • a 10 -8 M solution of the DNA in Tris buffer pH 8, 1M NaCl, 0.005% SDS was incubated on the sensor in a volume of 20 ⁇ l overnight at 56 ° C. It was then washed with hybridization buffer in order to remove non-hybridized DNA from the chip surface.
  • the hybridized target DNA was incubated for 4 h at RT with a solution of streptavidin-gold (diameter of the gold particles 10 nm, Sigma).
  • the sensors were washed with hybridization buffer, in which 1 M NaCl was replaced by 1 M NaNO 3 , and then dried at RT. 50 ⁇ l of the amplification solution (1: 1 mixture of (4.8 ⁇ l 1 M AgNO 3 to 0.2 ml 0.3 M citrate buffer) and (61 mg hydroquinone to 5 ml 0.3 M citrate buffer) was applied to the sensor for 1 The sensors were then rinsed twice with ddH 2 O and dried.
  • the sensor was placed in approx. 6 ml of the amplification solution (1: 1 1 mixture of (4.8 ⁇ l 1 M AgNO 3 to 0.2 ml 0.3 M citrate buffer) and (61 mg hydroquinone to 5 ml 0.3 M citrate buffer), the resistance measuring device 7 was placed alternately for 20 seconds between the electrodes 9, 10 and the counter electrode 11 and the resistance was measured.
  • the amplification solution 1: 1 1 mixture of (4.8 ⁇ l 1 M AgNO 3 to 0.2 ml 0.3 M citrate buffer) and (61 mg hydroquinone to 5 ml 0.3 M citrate buffer
  • FIG. 3 A further embodiment is realized in FIG. 3, one through the recognition reaction effected connection of a conductive surface 14 made of Au to the carbon measuring electrode 15 allows.
  • the conductive surface and electrode are on an insulating substrate 1 applied from polyethylene terephthalate.
  • the measuring area is defined by the immobilization area 16 therefore defines and covers both the end 17 of the electrode 15 and the measuring surface.
  • the Preparation of this sensor, performing a hybridization reaction and Ag amplification with simultaneous resistance measurement is carried out analogously to Example 1.
  • An alternative embodiment for a sensor according to the invention is an electrode-insulator layer sequence according to FIG. 4 arranged one above the other.
  • An Au layer is deposited on a glass substrate 18. This layer is separated into individual areas 19 by means of photolithography. The gaps 20 are then filled with SiO 2 using plasma deposition processes.
  • An SiO 2 cover layer 21 is applied to this layer by the same method.
  • a microchannel 22 with a width of, for example, 20 ⁇ m is realized by ion beam etching through the layer structure.
  • the immobilization of amino-functionalized DNA is achieved using known silanization processes, such as, for example, using aminopropyltriethoxysilane (APTES) on the SiO 2 inside of this microchannel and a bifunctional linker BS 3 from Example 1.
  • APTES aminopropyltriethoxysilane

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten und eine Vorrichtung mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann durch eine Erkennungsreaktion, unter Verwendung einer Vorrichtung mit einem mit Elektrolyten gefüllten Elektrolytraum (6) aufweisend mindestens eine Messelektrode (2, 3) mit gegebenenfalls einem, an die Messelektrode (2, 3) angrenzenden isolierenden Bereich (1) (Isolierschicht) und Erkennungsmolekülen, die auf der Messelektrode (2, 3) und/oder auf dem an die Messelektrode/n (2, 3) angrenzenden isolierenden Bereich immobilisiert sind und einer Gegenelektrode (5), A) in Kontaktbringen von mit elektrisch aktiven Markierungseinheiten markierten Analyten mit den Erkennungsmolekülen, wobei die elektrisch aktiven Markierungseinheiten entweder vor dem Kontakt der Analyten mit Erkennungsmolekülen an die Analyten gebunden worden sind oder nach dem Kontakt der Analyten mit der biofunktionellen Oberfläche an die Analyten gebunden werden, B) Applikation einer reaktiven Verstärkungslösung in den Elektrolytraum zur Verstärkung/Erzeugung der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch aktiven Markierungseinheiten, C) Messung der elektrischen Leitfähigkeit bzw. des Widerstands zwischen der oder den Messelektrode/n und der Gegenelektrode in Abhängigkeit von der Entwicklungszeit, D) Analyse des zeitl. Verlaufs der Leitfähigkeit bzw. des Widerstands nach C).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum quantitativen elektrischen Nachweis von Analyten in einer Probe. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um die spezifische Detektion eines biologisch relevanten Moleküls in einem wässrigen Medium. Ein derartiges Sensorprinzip bzw. ein solcher Sensor hat ein großes Anwendungsgebiet z.B. in der Umweltanalytik, dem Nahrungsmittelbereich, der Human- und Veterinärdiagnostik, dem Pflanzenschutz und in der biochemischen bzw. pharmakologischen Forschung.
Für derartige diagnostische Anwendungen sind Bio- und Chemosensoren bekannt, die eine biofunktionelle Oberfläche und einen physikalischen Signalwandler aufweisen. Unter einer biofunktionellen Oberfläche ist dabei eine Oberfläche zu verstehen, an die biologische, chemische oder biochemische Erkennungselemente gebunden sind.
An biofunktionelle Oberflächen werden biologische, chemische oder biochemische Erkennungselemente wie DNA, RNA, Aptamere, Rezeptoren gebunden, an die ein Analyt beim Nachweis mittels einer Erkennungsreaktion spezifisch bindet.
Beispiele für Erkennungsreaktionen sind die Bindung von Liganden an Komplexe, die Komplexierung von Ionen, die Bindung von Liganden an (biologische) Rezeptoren, Membranrezeptoren oder Ionenkanäle, von Antigenen oder Haptenen an Antikörper (Immunoassays), von Substraten an Enzyme, von DNA oder RNA an bestimmte Proteine, von Aptameren oder Spiegelmeren an ihre Targets, die Hybridisierung von DNA/RNA/PNA oder anderen Nukleinsäure-Analoga (DNA-Assays) oder die Prozessierung von Substraten durch Enzyme.
Beispiele für nachzuweisende Analyten sind DNA, RNA, PNA, Nukleinsäure-Analoga, Enzymsubstrate, Peptide, Proteine, potentielle Wirkstoffe; Medikamente, Zellen, Viren.
Beispiele für Erkennungselemente, an die die nachzuweisenden Analyten binden, sind DNA, RNA, PNA, Nukleinsäure-Analoga, Aptamere, Spiegelmere, Peptide, Proteine, Komplexbildner für Metalle/Metallionen, Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper oder deren Fragmente, Anticaline, Enzyme, Rezeptoren, Membranrezeptoren, Ionenkanäle, Zelladhäsionsproteine, Ganglioside, Mono- oder Oligosaccharide.
Werden an die Oberfläche des Signalwandlers verschiedene Erkennungselemente räumlich voneinander getrennt gebunden, so kann eine große Zahl von Erkennungsreaktionen mit einer zu untersuchenden Probe zeitgleich durchgeführt werden. Verwirklicht ist dies z.B. bei sogenannten DNA-Arrays, bei denen verschiedene DNA-Sequenzen (z.B. Oligonukleotide oder cDNAs) auf einem festen Träger (z.B. Glas) immobilisiert sind. Solche DNA-Arrays werden in der Regel mit optischen aber auch mit elektrischen Methoden ausgelesen und finden Anwendung in der Expressions-Profilierung, der Sequenzierung, dem Nachweis viraler oder bakterieller Nukleinsäuren oder der Genotypisierung.
Die Detektion der Erkennungsreaktion bei Bio- oder Chemosensoren kann durch Anwendung optischer, elektrischer bzw. elektrochemischer, mechanischer oder magnetischer Signalwandlungsverfahren erfolgen.
Insbesondere die am weitesten fortgeschrittenen beschriebenen optischen Verfahren verfügen zwar über hohe Empfindlichkeiten lassen sich aber aufgrund des komplexen Aufbaus aus Lichtquelle, Sensor und Lichtdetektor in der Regel nur beschränkt miniaturisieren und sind daher den elektrischen Methoden in Bezug auf Herstellungskosten unterlegen.
Aus diesen Gründen kommt der Entwicklung von elektrischen Sensoren eine wachsende Bedeutung zu. Insbesondere führt der Einsatz von Mikrostrukturierungstechnik aus der Halbleitertechnologie zu miniaturisierten Formaten, die hohe Empfindlichkeiten bei geringen Herstellungskosten versprechen. Insbesondere sind Methoden vorteilhaft, die Markierungseinheiten für den Analyten benutzen, deren Eigenschaften sich signifikant von denen der Bestandteile der zu analysierenden Probe unterscheiden. Hierzu bieten sich z.B. metallische Nanopartikel als Markierungseinheiten an.
Im Rahmen von Gleichstrommessungen besitzen bestimmte elektrische Biosensoren mit metallischen Nanopartikeln das Potenzial für eine außerordentlich hohe Empfindlichkeit bis in den Einzelmolekülbereich. Dieses Potenzial erschließt sich insbesondere durch autometallografische Abscheidung. Bei diesem sog. Autometallografie-Prozess, der aus der Fotografie und der Elektronenmikroskopie bekannt ist, wirken die Nanopartikel oder Kolloide als Katalysatoren für den Elektronenübertrag von einem Reduktionsmittel auf ein Au- oder Ag-Ion, das sich in Form eines Ag oder Au-Salzes mit dem Reduktionsmittel wie z.B. Hydrochinon in der Verstärkungslösung befindet. Nach erfolgter Reduktion fällt das Ion auf dem Kolloid als Metall aus. Als elektrischer Signalwandler werden hierfür Elektrodenpaare gewählt, die durch einen Isolator voneinander getrennt sind. Mit Nanopartikeln markierte Analytmoleküle bilden mit autometallographischer Verstärkung eine leitfähige Brücke zwischen den Elektroden, die durch eine Gleichstrom-Widerstandsmessung detektiert wird. Die grundlegende Technik hierzu ist beschrieben in: US-A- 5,284,748. Weitere Offenbarungen bezüglich der Anwendung auf die DNA-Selektion finden sich in WO 99/57550-A2 und in WO 01/00876-A2. Die Detektion von Nukleinsäuren durch Gleichstrom-Widerstandsmessung wurde demonstriert (vgl. Möller et al., Langmuir 17, 5426 (2001)). Als weitere Ausbaustufe dieser Methode wird die Diskriminierung von Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)) in (Park et al., Science 295, 1503 (2002)) beschrieben. Quantifizierung mit dieser Methode ist zwar möglich jedoch sehr aufwendig, da eine Kette von Verstärkungszyklen mit anschließenden punktuellen Messungen durchlaufen werden muss.
Nachteil der bekannten Verfahren sind komplizierte Folgen von Aufbringungs-, Entwicklungs-, Wasch- und Trockenschritten, wobei evtl. Entwicklungs-, Wasch- und Trockenschritte wiederholt werden müssen.
Ein Konzept zur praktikableren Lösung für eine Quantifizierung wird in WO 02/02810-A2 beschrieben. Hier wird der elektrisch leitfähige Niederschlag auf den Markierungseinheiten während der Abscheidungsreaktion mittels Leitfähigkeitsmessungen zwischen zwei paarweise angeordneten Mikroelektroden detektiert. Die Leitfähigkeit zwischen den Elektroden wird durch das Ausbilden einer metallischen Brücke aufgrund der Erkennungsreaktion verändert.
Nachteil dieses Verfahrens ist, dass für jede dieser Anforderungen pro Messfläche zwei Mikrostrukturelektroden erforderlich sind, die benachbart sind und daher Störungen der Leitfähigkeitsmessung durch unbeabsichtigte Kurzschlüsse die Messung auf DNA verfälschen können.
Alternativ zum Ausbilden einer metallischen Brücke zwischen zwei Elektroden sind Verfahren bekannt, die auf einer Elektrode gebundenen Analyten mittels autometallografisch verstärkten Metallkolloide elektrochemisch nachweisen (Cai et al., Analytica Chimica Acta 469, 165-172 (2002)).
Nachteil dieses Verfahrens ist die vergleichsweise kleine Messfläche, die zu einem schlechten Signal-Rauschverhältnis führt. Ferner sind wiederum gegebenenfalls verfälschende aufwendige Wasch- und Trockenschritte zur Vorbereitung der Messung notwendig.
Der zeitliche Verlauf des Wachstumsprozesses kann hiermit ebenfalls nicht verfolgt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine hochempfindliche elektrische Messvorrichtung und eine Messmethode zum Nachweis von Analyten mittels Erkennungsreaktionen zu entwickeln, der die Nachteile des Standes der Technik vermeidet.
Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht in einem
  • Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten durch eine Erkennungsreaktion, unter Verwendung
  • einer Vorrichtung mit einem mit Elektrolyten gefüllten Elektrolytraum aufweisend
  • mindestens eine Messelektrode mit gegebenenfalls einem, an die Messelektrode angrenzenden isolierenden Bereich (Isolierschicht)
  • Erkennungsmolekülen, die auf der Messelektrode und/oder auf dem an die Messelektrode/n angrenzenden isolierenden Bereich immobilisiert sind und einer Gegenelektrode,
    • A) in Kontaktbringen von mit elektrisch aktiven Markierungseinheiten markierten Analyten mit den Erkennungsmolekülen, wobei die elektrisch aktiven Markierungseinheiten entweder vor dem Kontakt der Analyten mit Erkennungsmolekülen an die Analyten gebunden worden sind oder nach dem Kontakt der Analyten mit der biofunktionellen Oberfläche an die Analyten gebunden werden,
    • B) Applikation einer reaktiven Verstärkungslösung in den Elektrolyträum zur Verstärkung/Erzeugung der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch aktiven Markierungseinheiten,
    • C) Messung der elektrischen Leitfähigkeit bzw. des Widerstands zwischen der oder den Messelektrode/n und der Gegenelektrode in Abhängigkeit von der Entwicklungszeit,
    • D) Analyse des zeitlichen Verlaufs der Leitfähigkeit bzw. des Widerstands nach C).
    Der Kern der Erfindung betrifft die Onlinemessung des elektrischen Widerstands oder der Leitfähigkeit zwischen der Messelektrode und der Gegenelektrode der Messvorrichtung während sich eine geeignete Verstärkungslösung auf der Messvorrichtung befindet. Die Messelektrode zusammen mit dem angrenzenden isolierenden Substratbereich werden im folgenden Messfläche genannt. Die Größe der Messfläche wird durch die Fläche des zugehörigen Bereichs immobilisierter Erkennungsmoleküle definiert. Es wurde gefunden, dass während des Verstärkungsprozesses eine signifikante Veränderung des Widerstands oder der Leitfähigkeit zwischen Messelektrode und Gegenelektrode gemessen werden kann. Eine Deutung für den Widerstandsabfall besteht darin, dass zu diesem Zeitpunkt die leitfähigen Markierungseinheiten, die sich auf dem Isolator befinden, eine leitfähige Schicht ausbilden und mit der Messelektrode leitfähig verknüpft werden. Hiermit wird die Elektrodenfläche stark vergrößert. Die Messelektrode kann hierbei mit Erkennungs-DNA belegt sein. Dies ist jedoch nicht nötig, wenn während des Ausbildens der leitfähigen Schicht durch die räumliche Nähe der Markierungseinheiten auf dem Isolator zur Messelektrode die Markierungseinheiten mit der Elektrode elektrisch leitend verknüpft werden.
    Um die Elektrodenfläche über den Bereich der immobilisierten Erkennungsmoleküle hinaus durch den Verstärkungsprozess zu vergrößern, wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Sensorvorrichtung in der Nähe der Messelektrode zusätzlich eine von der Messelektrode isolierte leitfähige Schicht einer bestimmten Fläche aufgebracht. Hierbei braucht diese Fläche nur partiell von dem Bereich der Probenmoleküle bedeckt zu sein. Durch die Erkennungsreaktion mit nachfolgender Verstärkung wird diese Fläche elektrisch leitend mit der Messelektrode verknüpft, womit die Leitfähigkeitserhöhung bzw. Widerstandserniedrigung zusätzlich verstärkt wird.
    Zum Nachweis können alle bekannten Verfahren aus der Elektrochemie wie z.B. Cyclo-Voltammetrie angewendet werden. Diesbezüglich können in 3-Elektrodenanordnungen Potentiostatschaltungen zum Einsatz gebracht werden. Hierzu wird in einer bevorzugten Ausführung zusätzlich zu Mess- und Gegenelektrode eine Referenzelektrode in den Messaufbau integriert, wobei die Referenzelektrode gegenüber der Messelektrode auf konstanter Spannung gehalten wird. Aufgrund der Einfachheit wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform nur in einer 2-Punkt-Geometrie mit Mess- und Gegenelektrode gemessen. Hierzu kann entweder a) eine Spannung oder b) ein Strom zwischen der oder den Messelektroden und einer Gegenelektrode während des Verstärkungsprozesses angelegt werden, und entweder im Fall a) der Strom oder im Fall b) die Spannung zwischen den Elektroden während des Verstärkungsprozesses gemessen werden. Generell werden im Text mit der Bezeichnung von Widerstands- und Leitfähigkeitsmessungen im breitesten Sinne die vorgenannten Methoden sowohl in 2-Punkt als auch in 3-Punkt-Geometrie eingeschlossen.
    Die Onlinemessung gestattet insbesondere eine Quantifizierung über die Analyse des zeitlichen Verlaufs des Widerstands oder der Leitfähigkeit. Je höher die Dichte der elektrisch aktiven Markierungseinheiten auf der Messfläche nach einer erfolgten Erkennungsreaktion ist, desto früher wird ein deutlicher Widerstandsabfall oder einer Leitfähigkeitszunahme erreicht. Dies spiegelt sich insbesondere durch ein Extremum in der 1. Ableitung, des Gradienten, im zeitlichen Verlauf wider. Es ergibt sich ein monotoner Zusammenhang zwischen der Zeitdauer bis zum Erreichen dieses Verhaltens und der Konzentration des Analytens, der zur Quantifizierung herangezogen werden kann. Zur Erhöhung der Genauigkeit der Quantifizierung kann die Kurvenform des zeitlichen Verlaufs der elektrischen Kenngröße mit einer geeigneten mathematischen Funktion angepasst werden. In diesem Fall wird aus den Kurvenparametern die Analytkonzentration bestimmt. Zur Quantifizierung eines Analytens werden die zugehörigen Zeitdauer bzw. Parameter aus der Kurvenanpassung mit denen aus mindestens einer Kontrollprobe mit bekannter Analytkonzentration verglichen.
    Bevorzugt ist daher auch ein Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentrationsangabe in einem quantitativen Assay bzw. der grundsätzliche Nachweis in einem qualitativen Assay über die Zeitdauer der Reaktion B) bis zum Erreichen eines signifikanten Gradienten im zeitlichen Verlaufs von Widerstand oder Leitfähigkeit mit Zeitdauer der Reaktion B) einer Referenzprobe verglichen und zur quantitativen oder qualitativen Analyse des Analyten verwendet wird.
    Die Immobilisierung der Erkennungsmoleküle auf der Messfläche und/oder der angrenzenden Isolierschicht erfolgt insbesondere durch dem Fachmann grundsätzlich bekannte Methoden. Für DNA-Erkennungseinheiten ist diese Immobilisierung z.B. in S. L. Beaucage, Curr. Med. 8, 1213-1244 (2001) beschrieben. Für die Immobilisierung auf der Messfläche wird eine optimale Dichte von Erkennungseinheiten angestrebt, die bei hoher Flächendichte eine optimale Aktivität der Erkennungseinheit gewährleistet. Die Immobilisierung von Erkennungselementen wie Antikörpern kann kovalent oder nichtkovalent erfolgen. Beispielsweise können Avidin oder Streptavidin auf der Oberfläche physisorbiert oder nach geeigneter Biofunktionalisierung der Oberfläche kovalent immobilisiert werden. An die mit Avidin oder Streptavidin beschichtete Oberfläche können beispielsweise biotinylierte Antikörper spezifisch immobilisiert werden.
    Bevorzugt sind Erkennungselemente für die Analyten an eine Messfläche mit biofunktioneller Oberfläche gebunden. Die Analyten gehen mit den Erkennungselementen eine Erkennungsreaktion ein. Der Analyt kann vor der Bindung an das Erkennungselement bereits mit einer elektrisch aktiven Markierungseinheit markiert sein oder er wird erst nach der Bindung an das Erkennungselement markiert, indem z.B. ein Bindungselement, das mit einer Markierungseinheit markiert ist, an den Komplex bestehend aus Erkennungselement und Molekül bindet.
    Die Analyten können durch die Erkennungsreaktion auch indirekt nachgewiesen werden und müssen daher nicht notwendigerweise markiert werden. Bei der indirekten Detektion werden Analyten, die bereits vor Bindung an das Erkennungselement mit Markierungseinheiten markiert sind, in Kontakt mit der biofunktionellen Oberfläche gebracht. Gleichzeitig werden zusätzlich unmarkierte Analyten in Kontakt mit der biofunktionellen Oberfläche gebracht. Diese beiden Spezies kompetieren um die Bindung an die immobilisierten Erkennungselemente. Befinden sich in der Messlösung über der Messfläche keine unmarkierten Analyten, so werden alle Bindungsplätze an den Erkennungselementen von markierten Analyten besetzt und die Modifikation des Widerstands oder der Leitfähigkeit wird maximal. Für eine nichtverschwindende Konzentration von unmarkierten Analyten werden die Bindungsplätze an den Erkennungselementen entsprechend der jeweiligen Konzentrationen von unmarkierten Analyten und markierten Analyten anteilig besetzt, so dass die Modifikation des Widerstands im Vergleich zur verschwindenden Konzentration des unmarkierten Analytens kleiner ist. Die Kalibration dieses Mischsystems erfolgt durch die Messung von mindestens einer Probe, die nur den markierten Analyten mit einer bekannter Konzentration enthält.
    Bevorzugt ist daher eine Variante des Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt A) eine quantitativ vorbestimmte Menge eines bekannten Analyten, der mit Markierungseinheiten versehen ist, gemischt wird mit der Probe eines unmarkierten bekannten Analyten und aus einem Vergleich der Analyse D) dieses Mischsystems mit der Analyse des reinen bekannten markierten Analyten die Konzentration des unmarkierten Analyten bestimmt wird.
    Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich die Modifikation der Leitfähigkeit bzw. des Widerstands zwischen den Elektroden durch eine einzige Markierungseinheit pro Analytmolekül nachweisen. Um die Empfindlichkeit der Methode noch zusätzlich zu steigern, können Analytmoleküle mit mehreren elektrisch aktiven Markierungseinheiten versehen werden.
    Nach dem bevorzugten Verfahren werden Analyten mit Markierungseinheiten markiert, die in geeigneter Weise elektrisch aktiv sind. Die elektrische Aktivität kann in der elektrischen Leitfähigkeit des für die Markierungseinheiten verwendeten Materials bestehen, die vorzugsweise im Bereich metallischer Leitfähigkeiten liegt. Außerdem können Monomere elektrisch leitfähiger Polymere als elektrisch aktive Elemente gewählt werden. Schließlich werden auch Enzyme als elektrisch aktive Elemente betrachtet, wenn sie eine Reaktion katalysieren, die zu leitfähigen Produkten führt wie z.B. leitfähige Polymere.
    Als elektrisch aktive Markierungseinheiten können Nanopartikel, Metallkomplexe und/oder Cluster aus leitfähigen Materialien wie Au, Ag, Pt, Pd, Cu eingesetzt werden.
    Die Größe der elektrisch aktiven Markierungseinheiten liegt bevorzugt im Bereich von 1 bis 100 nm, insbesondere bevorzugt im Bereich von 1 bis 30 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 nm. Die letztgenannte Größe wird z.B. durch Au-Cluster bestehend aus 50-150 Atomen realisiert. Die Größenangabe bezieht sich dabei auf den größten Durchmesser der Markierungseinheiten.
    Weiterhin können nichtleitfähige Partikel mit leitfähiger Beschichtung oder nichtleitfähige Partikel mit metallischer Beschichtung als Markierungseinheiten eingesetzt werden. Nichtleitfähige Partikel können z.B. Polystyrolbeads sein.
    Markierungseinheiten können bevorzugt auf leitfähigen Polymeren basieren z.B. Polyaniline, Polythiophene, insbesondere Polyethylendioxythiophen, Polyphenylene, Polyphenylenvinylen, Polythiophenvinylen, Polypyrrole.
    Bevorzugt ist auch eine Variante des Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch aktiven Markierungseinheiten auf Enzymen, bevorzugt HRP basieren, die durch die Umsetzung eines Substrats ausgewählt aus Anilin oder Ethylendioxythiophen elektrisch aktive Markierungseinheiten bilden.
    Eine weitere Anwendung von HRP ist die Abscheidung eines Polymers, an das z.B. Nanopartikel oder alle oben beschriebenen Markierungseinheiten direkt oder indirekt über Biotin-Streptavidin, Biotin-Avidin oder Biotin-NeutrAvidin gebunden werden. Für den indirekten Fall ist das Polymer biotinyliert. Dieses Prinzip ist als Catalyzed Reporter Deposition (CARD) bekannt.
    Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch aktive Markierungseinheit auf einem Enzym basiert, das die Bildung eines nichtleitfähigen Polymeren, insbesondere eines biotinylierten Polymeren katalysiert, das seinerseits direkt oder indirekt mit Nanopartikeln, Metallkomplexen oder Clustern auf Basis von Elementen aus der Reihe Au, Ag, Pt, Pd, Cu oder mit elektrisch leitfähigen Polymeren verbunden ist.
    Geeignete Verstärkungslösungen sind abhängig von der Art der gewählten elektrisch aktiven Markierungseinheiten. Im Falle von Nanopartikeln, Metallkomplexen und/oder Clustern aus leitfähigen Materialien, nichtleitfähige Partikel mit metallischer Beschichtung werden besonders vorteilhaft autometallografische Verstärkungslösungen auf der Basis von Ag- oder Au-Salzen zur Signalverstärkung eingesetzt. Hierbei werden als Reduktionsmittel z.B. Hydrochinon oder Formaldehyd eingesetzt. Für Monomere elektrisch leitfähiger Polymere können Verstärkungslösungen aus Katalysatoren, Initiatoren und/oder weiteren Monomeren dieser Polymere bestehen, die zur Polymerisation benötigt werden. Für die Polymerisierung von Anilin kann als Katalysator z.B. HRP eingesetzt werden. Für Enzyme als elektrisch aktive Markierungseinheiten z.B. HRP können die Monomere eines elektrisch leitenden Polymers z.B. Anilin als Verstärkungslösung verwendet werden.
    Verstärkungslösungen können oberhalb elektrischer Markierungseinheiten im Laufe des Verstärkungsprozesses ihre Konzentration ändern, so dass der Verstärkungsprozess in eine Sättigungsphase eintritt. Um den Verstärkungsprozess in diesem Fall fortzuführen, soll die Verstärkungslösung bevorzugt ausgetauscht werden. Dies kann durch Rühren oder durch kompletten Austausch der Flüssigkeit z.B. im Rahmen eines mikrofluidischen Flusssystems erfolgen. Der Austausch erfolgt vorzugsweise kontinuierlich.
    Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. für die Analyse von Peptiden, Proteinen oder Nukleinsäuren eingesetzt werden. Bevorzugt ist die in dem Verfahren angewendete Erkennungsreaktion A) ein Peptid- oder Proteinassay insbesondere ein Immunoassay oder ein Nukleinsäure-, insbesondere ein RNA- oder DNA-Assay, besonders bevorzugt ein SNP-Assay. DNA-Assays dienen bevorzugt zur Detektion von viraler DNA oder RNA oder von DNA bakterieller Spezies, sowie zur Expressions-Profilierung, zur Genotypisierung für die Diagnose von Erbkrankheiten oder für Pharmacogenomics (genetisch bedingte Wirkweise bzw. Nebenwirkungen von Pharmaka), Nutrigenomics (genetisch bedingte Wirkweise bzw. Nebenwirkungen von Nahrungsmitteln). Bei der Genotypisierung werden insbesondere Veränderungen von Genen festgestellt, die nur auf der Variation einer Base beruhen (single nucleotide polymorphism = SNP).
    Die erfindungsgemäße Methode erlaubt die simultane Analyse einer Vielzahl von Analyten, indem für derartige Multiplex-Analysen eine entsprechende Vielzahl von Messflächen zur Verfügung gestellt wird. Hierbei wird pro Messfläche ein Analyt detektiert. Auf mehreren Messflächen können auch zur Mehrfachdetektion eines Analytens jeweils die gleichen Erkennungselemente immobilisiert sein. Einzelne Messflächen können z.B. zur Detektion von Referenzsubstanzen, die den Einfluss von z.B. Temperatur, Licht auf den Verstärkungsprozess charakterisieren, verwendet werden. Diese Referenzwerte können zur Normalisierung der Signale anderer Messflächen herangezogen werden. Bevorzugt ist daher auch ein Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Erkennungsreaktionen mit den Schritten A) bis D) parallel simultan auf einer Sensorvorrichtung durchgeführt werden, indem die Messvorrichtung mit einer Vielzahl von Messelektroden versehen wird, auf denen jeweils gleiche oder unterschiedliche Erkennungselemente angebracht sind. Für wissenschaftliche Anwendungen werden Multiplex-Assays mit Anzahlen > 1000 verwendet, während für diagnostische Anwendungen mit Zahlen 1 - 1000 gerechnet wird. Aufgrund der möglichen Vielzahl von Messflächen kann die Vorrichtung gleichzeitig zum Nachweis einer Vielzahl von Proteinen oder Peptide als Proteinarray oder Peptidarray bzw. für den Nachweis von Nukleinsäuren als Nukleinsäure-Array eingesetzt werden.
    Insbesondere werden bis zu 1000 Erkennungsreaktionen simultan auf einer Sensorvorrichtung durchgeführt.
    Die Detektion des Analyten wird insbesondere in wässrigem Medium durchgeführt. Bevorzugt als wässrige Medien sind Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel, Urin, Schweiß, interstitielle Flüssigkeit und Tränenflüssigkeit.
    Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten durch eine Erkennungsreaktion, insbesondere nach dem beschriebenen Verfahren, wenigstens umfassend
    • mindestens eine Messelektrode und mindestens einen angrenzenden isolierenden Bereich (Isolierschicht)
    • Erkennungsmoleküle, die auf dem an die Elektrode/n angrenzenden isolierenden Bereich und optional auf der Elektrode/n immobilisiert sind, eine Gegenelektrode
    • Analyten, die mit elektrisch aktiven Markierungseinheiten markiert sind gegebenenfalls eine Verstärkungslösung und
    ein Messgerät zur zeitaufgelösten Erfassung der Leitfähigkeit bzw. des Widerstands zwischen der oder den Messelektrode/n und Gegenelektrode während des Verstärkungsprozesses.
    In der erfindungsgemäßen Vorrichtung weisen die Messflächen, Erkennungselemente, Analyten, elektrisch aktiven Markierungseinheiten und Verstärkungslösungen, bevorzugt die zur Durchführung des Verfahrens oben beschriebenen Eigenschaften auf.
    Die Bestimmung der Leitfähigkeit wird z.B. in einer 2- oder 3-Punktgeometrie durchgeführt. In beiden Anordnungen können die Gegenelektrode bzw. die Referenz- und Gegenelektrode zusammen mit der Messfläche auf einem gemeinsamen Substrat angebracht sein oder als separate Elektroden in einer Messzelle ausgeführt werden Dies ermöglicht eine kostensparende Herstellung der Messzelle.
    Auf einem Substrat werden dem Verfahren gemäß ein oder vorteilhaft mehrere Messflächen aufgebracht. Dementsprechend werden auf den einzelnen Messflächen jeweils eine Spezies von Erkennungselementen immobilisiert. Unterschiedliche Messflächen können jeweils gleiche oder paarweise unterschiedliche Spezies von Erkennungselementen tragen.
    Bevorzugt ist daher eine Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der Messvorrichtung eine Vielzahl von Messelektroden aufweist, auf denen jeweils gleiche oder unterschiedliche Erkennungsmoleküle angebracht sind.
    Die Messelektroden können vorteilhaft durch Siebdrucktechniken mit Strukturbreiten zwischen ca. 100 µm und 1 mm realisiert werden. Optische Lithografiemethoden erlauben laterale Strukturgrößen von ca. 2 µm. Wesentlich kleinere laterale Dimensionen werden durch Elektronenstrahltechniken erzielt. Je kleiner die Messelektrode im Vergleich zum immobilisierten Bereich der Erkennungselemente ist, desto höher ist wahrscheinlich die erreichbare Empfindlichkeit. Mit Messflächen von z.B. 100 µm2 lassen sich auf einem 100 mm2 großen Chip 106 Elemente unterbringen. Für diagnostische Anwendungen mit ca. 100 Analyten sind dagegen Messflächen von bis zu 1 mm2 auf der gleichen Fläche mit vergleichsweise geringerem Aufwand realisierbar.
    Diese Größenangaben haben lediglich Beispielcharakter und schließen andere Größen und Anzahlen nicht aus. Um viele Elektroden einzeln anzusteuern, werden Multiplexschaltkreise eingesetzt.
    Die Größe der mit Erkennungsmolekülen belegten Messfläche beträgt bevorzugt 100 µm bis 1 mm.
    Aufgrund der möglichen hohen Packungsdichte der Messflächen eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung als Plattform für Nukleinsäure- und Proteinarrays.
    Bevorzugt ist auch eine Ausführung der Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Sätze von Erkennungsmolekülen mit Messelektroden ein Nukleinsäure-Array, ein Peptid-Array oder ein Protein-Array bilden.
    Um die Verstärkungslösung nicht unspezifisch durch elektrochemische Prozesse an den elektrischen Zuleitungen zu verarmen, werden vorteilhaft die Zuleitungen zu den Elektroden von der Verstärkungslösung isoliert. Dies kann z.B. durch die Abscheidung von SiO2 auf die Zuleitungen realisiert werden.
    Die Elektroden können planar oder in nichtplanaren Geometrien ausgeführt werden.
    Bevorzugt ist auch eine Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Messelektroden auf einem Substrat planar nebeneinander ausgeführt sind.
    In der planaren Ausführung befinden sich eine oder mehrere Messflächen seitlich nebeneinander auf einem Substrat. Analyt- und Verstärkungslösungen können über Mikrokanäle, die in das Substrat geätzt sind, den Messflächen zugeführt werden. Hierbei befinden sich die Messflächen z.B. auf dem Boden dieser Kanäle. Alternativ kann ein mit Mikrokanälen versehenes Bauteil als Deckel für ein planares Substrat eingesetzt werden.
    Besonders vorteilhaft können mehrere Messflächen vertikal übereinander in Form von alternierenden Schichtstrukturen von Elektroden und Isolatorschichten ausgeführt werden, da hier Abscheidungsverfahren aus der Halbleitertechnik Anwendung finden können. Zusätzlich können diese Schichtenpakete mit parallel zur Flächennormalen dieser Schichten angebrachten Mikrokanälen versehen werden, durch die Analyt- und Verstärkungslösungen auf die Messflächen appliziert werden. Ein Multiplex-Assay wird insbesondere dadurch realisiert, dass ein Satz von Mikrokanälen in einer Schichtstruktur mit mindestens je einer Deck- und Basisschicht (elektrischer Isolator) und wenigstens einer Zwischenschicht aus alternierend nebeneinander angebrachten elektrisch leitenden Schichten (Messschichten) und Isolatorschichten angebracht wird. Die Kanäle sind nebeneinander angeordnet und durchtreten unabhängig voneinander elektrisch ansteuerbare Messschichten, wobei die einzelnen Kanäle mit unterschiedlichen Erkennungs-DNAs bestückt werden. Alternativ können in einem Schichtenpaket mehrere übereinander liegende Messflächen erzeugt werden, indem mehrere durch Isolatorschichten vertikal voneinander isolierte Schichten aus alternierend nebeneinander angebrachten leitenden Messschichten und Isolatorschichten von den Mikrokanälen durchdrungen werden. Bei elektrischer Kontaktierung der einzelnen leitenden Messschichten werden so in einzelnen Mikrokanälen übereinander angeordnete Paare von Elektroden und Isolatoren realisiert. Werden zwischen den Elektroden eines einzigen Mikrokanals der letztgenannten Anordnung selektiv verschiedene Erkennungs-DNAs immobilisiert, wird mit diesem Aufbau ein multiplexfähiger Mikrokanal für die Online-Widerstands- bzw. Leitfähigkeitsmessung realisiert. Die ortsaufgelöste DNA-Immobilisierung in einem Mikrokanal kann durch die elektrische Anziehung von Polystyrolbeads, auf deren Oberflächen Erkennungs-DNA - immobilisiert ist, zwischen zwei vorwählbaren Elektroden erfolgen, s. Velev et al., Langmuir 15, 3693 (1999).
    Die Probenzuführung wird vorteilhaft über Mikrokanäle, die senkrecht zur Messfläche eine Höhe im Bereich zwischen 1 und 1000 µm, bevorzugt 1 - 50 µm besitzen, bewerkstelligt. Die Größenangaben sind durch die Diffusionskoeffizienten von Biomolekülen im Zusammenhang mit Inkubationszeiten im Sekunden- bis in den unteren Minutenbereich von 1-10 Minuten motiviert.
    Bevorzugt ist auch eine Ausführungsvariante der Vorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Elektrolytraum durch einen oder mehrere Kanäle gebildet wird, die eine Vielzahl von Messelektroden aufweisen und eine Höhe von maximal 100 µm über den Messelektroden aufweisen.
    Um einer Verarmung der Verstärkungslösung induziert durch die elektrisch aktiven Markierungseinheiten vorzubeugen, wird die Verstärkungslösung bevorzugt durch die oben beschriebenen mikrofluidischen Kanäle schrittweise oder kontinuierlich ausgetauscht. Außerdem ist eine Vorrichtung vorzusehen, die den Flüssigkeitsaustausch treibt. Hierzu können Pumpen bzw. Spritzen verwendet werden. Außerdem können durch zusätzliche Elektroden im Kanalsystem elektroosmotische Flüsse erzeugt werden.
    Die nichtleitenden Substrate bestehen bevorzugt aus einem Material ausgewählt aus der Reihe: Glas, SiO2, Kunststoffen, z.B. aus Polyethylenterephtalat, Polycarbonat, Polystyrol.
    Für die Elektroden kommen Metalle wie Au, Pl, Ag, Ti, Halbleiter wie z.B. Si, insbesondere dotiertes Si, Metalloxide insbesondere Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder leitfähige Polymere wie Polyaniline, Polythiophene insbesondere Polyethylendioxythiophen, Polyphenylene, Polyphenylenvinylen, Polythiophenvinylen, Polypyrrole in Frage.
    Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der Vorrichtung als Nukleinsäure-Array, Peptid-Array oder als Protein-Array.
    Mit dem beschriebenen Verfahren und Vorrichtung wird in Bezug auf den nächstliegenden Stand der Technik (WO 02/02810) ein einfacherer Elektrodenaufbau ermöglicht, da eine metallische Überbrückung von eng benachbarten Elektroden nicht erforderlich ist und auch nur eine gemeinsame Gegenelektrode benötigt wird. In Bezug auf den nächstliegenden Stand der Technik (Cai et al., Analytica Chimica Acta 469, 165-172 (2002)) lässt das beschriebene Verfahren höhere Empfindlichkeiten durch die Ausbildung der elektrisch leitfähigen Schicht auf der Messfläche erwarten. Darüber hinaus kann durch die während der Verstärkung erfolgende Messung der Leitfähigkeit der Verstärkungsprozess beurteilt werden und gegebenenfalls zeitsparend abgebrochen werden und macht auch zusätzliche Schritte wie z.B. Waschschritte überflüssig.
    Die Erfindung wird nachstehend anhand der Figuren beispielhaft näher erläutert.
    Es zeigen
    Fig. 1
    Ein Schema der Messvorrichtung
    Fig. 2
    das Widerstands-Zeit-Diagramm einer DNA-Hybridisierungsreaktion mit Kontrollhybridisierungsreaktion
    Fig. 3
    einen Sensor mit zusätzlicher leitfähigen Fläche
    Fig. 4
    die vertikale Anordnung von Elektroden-Isolatorschichtfolgen
    Beispiele Beispiel 1 Methode und Vorrichtung zur Detektion von DNA auf einem Polymer-Chip
    Der Sensor der Messvorrichtung besteht im wesentlichen aus einem PolyethylenterephtalatSubstrat 1 mit aufgedruckten Kohleelektroden 2 und 3, s. Fig. 1. Über die Elektroden 2 und 3 ist ein isolierende Polymerschicht 4 aufgebracht, die sich zwischen den Anschlussstellen des Sensors und den Bereich der Messelektroden befindet. Die Sensoren wurden von der Firma Molecular Circuitry, West Conshohocken, PA, USA bezogen. Als Gegenelektrode dient ein Ag-Draht 5, der ca. 1 mm entfernt vom Sensor in einer Petrischale 6 montiert ist. Als Messgerät 7 dient ein Keithley 2000 Multimeter, das im Widerstand-Modus, Messbereich 10 MOhm, betrieben wird. Die Eingänge des Messgeräts können wahlweise über die Zuleitungen 8, 9, 10 mit den Elektroden 2 oder 3 und dem Ag-Draht 5 über die Zuleitung 11 verbunden werden.
    Zur Reinigung wurden die Sensoren im ersten Reinigungsschritt 30 min in Ethanol eingelegt und anschließend in ddH20 gespült. Dieser Reinigungsschritt wurde einmal wiederholt. Im zweiten Reinigungsschritt wurden die Sensoren 15 min in 2 % Alconox-Lösung eingelegt und anschließend mit ddH20 gespült. Auch dieser Reinigungsschritt wurde einmal wiederholt.
    Die Sensoren wurden in eine wässrige Poly(Phenylalanin)-Lysin (Sigma) (0,1mg/ml)-Lösung bei 2M NaCl und 50 mM KH2PO4 (pH 7.1) 1 h bei RT inkubiert, um eine Polymerschicht auf den Sensor aufzuziehen.
    Auf den Sensoren wurden zwei unterschiedliche Bereiche von Erkennungselementen immobilisiert: Erkennungs-DNA-Positiv (5'-Amino-GTCCCCTACGGACA.AGGCGCGT-3') auf Positiv-Bereich 12 und Erkennungs-DNA-Negativ (5'-Amino--TTTTTCGCGCCTTGTCCGTAGGGGACT-3') auf Negativ-Bereich 13. Hiermit werden für einen Analyten Positiv- und Negativkontrolle simultan in einem Assay bei Zugabe nur eines Positiv-Analytens ermöglicht.
    Erkennungs-DNAs wurden in Phosphatpuffer pH 7,2 gelöst und mit 0,1 M Bis-sulfo-succinimidylsuberat (BS3, Hersteller Fa. Pierce) 10 min bei RT inkubiert. Durch Verdünnung mit Phosphatpuffer wurde die Reaktion abgebrochen. Die Reinigung der Erkennungs-DNA erfolgte durch Chromatographie auf einer NAP-10-Säule (Hersteller Fa. Pharmacia). Die gereinigte Erkennungs-DNA wurde in Volumina von z.B. 20 µl auf die Oberflächen des Sensors aufgebracht und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden DNA-Chips wurden mit 1 % wässriger Ammoniumhydroxid-Lösung sowie ddH2O gewaschen. Zur Blockierung der nicht umgesetzten Aminogruppen auf der Chipoberfläche wurde der Sensor 4 h mit einer aktivierten Carboxymethyl-Dextran-Lösung inkubiert. Die Lösung wurde wie folgt hergestellt: Teill: 20 mg/ml Carboxymethyl-Dextran in ddH2O und Teil2: 0,2 mmol/ml EDC + 0,2 mmol/ml NHS in ddH2O lösen. Lösung Teil1 + Lösung Teil 2 im Verhältnis 1:1 mischen und 20 min reagieren lassen. Die Sensoren wurden anschließend 1 h in ddH2O inkubiert.
    Auf den mit Erkennungs-DNAs beschichteten Sensoroberflächen 12 und 13 wurden DNA-Hybridisierungsreaktionen mit einer Analyt-DNA-Probe der Sequenz 5'-Biotin-TTTTTCGCGCCTTGTCCGTAGGGGACT-3'durchgeführt. Es wurde eine 10-8 M Lösung der DNA in Tris-Puffer pH 8, 1M NaCl, 0,005 % SDS auf dem Sensor in einem Volumen von 20 µl über Nacht bei 56°C inkubiert. Anschließend wurde mit Hybridisierungspuffer gewaschen, um nicht hybridisierte DNA von der Chipoberfläche zu entfernen. Die hybridisierte Target-DNA wurden 4 h bei RT mit einer Lösung von Streptavidin-Gold (Durchmesser der Goldpartikel 10 nm, Sigma) inkubiert. Die Sensoren wurde mit Hybridisierungspuffer gewaschen, bei dem 1 M NaCl durch 1 M NaNO3 ausgetauscht wurde, und anschließend bei RT getrocknet. 50 µl der Verstärkungslösung (1:1 Mischung aus (4,8 µl 1 M AgNO3 auf 0,2 ml 0,3 M Citratpuffer) und (61 mg Hydrochinon auf 5 ml 0,3 M Citratpuffer) wurde auf den Sensor für 1. min gegeben. Anschließend wurden die Sensoren 2x mit ddH2O gespült und getrocknet.
    Für die Online-Messung wurde der Sensor in ca. 6 ml der Verstärkungslösung (1:1 1 Mischung aus (4,8 µl 1 M AgNO3 auf 0,2 ml 0,3 M Citratpuffer) und (61 mg Hydrochinon auf 5 ml 0,3 M Citratpuffer) eingetaucht. Im Abstand von 20 s wurde alternierend das Widerstands-Messgerät 7 für ca. 10 s zwischen die Elektroden 9, 10 und der Gegenelektrode 11 gelegt und der Widerstand gemessen.
    Fig. 2 zeigt den Widerstand als Funktion der Zeit während des Ag-Verstärkungsprozesses für a) die Positivreaktion der Analyt-DNA mit der Erkennungs-DNA-Positiv und b) der Kontrollhybridisierungsreaktion von Analyt-DNA mit der Erkennungs-DNA-Negativ. Für die positive Reaktion lässt sich eine signifikante sprunghafte Erniedrigung des Widerstands bei t = 220 s detektieren. Im Vergleich hierzu erfolgt der Widerstandsabfall bei der negativen Reaktion deutlich später und nicht so steil.
    Beispiel 2 Methode und Vorrichtung zur Detektion von DNA mit zusätzlicher leitfähiger Schicht
    In Fig. 3 ist eine weitere Ausführungsform realisiert, die eine durch die Erkennungsreaktion bewirkten Anbindung einer leitfähigen Fläche 14 aus Au an die Kohle-Messelektrode 15 ermöglicht. Leitfähige Fläche und Elektrode sind wie in Beispiel 1 auf einem isolierendes Substrat 1 aus Polyethylenterephtalat aufgebracht. Die Messfläche wird durch den Immobilisierungsbereich 16 definiert und deckt daher sowohl das Ende 17 der Elektrode 15 definiert die Messfläche. Die Präparation dieses Sensors, Durchführung einer Hybridisierungsreaktion und die Ag-Verstärkung mit simultaner Widerstandsmessung wird analog zu Beispiel 1 durchgeführt.
    Beispiel 3 Detektion von DNA mit einer Vorrichtung mit übereinander angeordneter Elektroden-Isolatorschichtfolge
    Eine alternative Ausführung für einen erfindungsgemäßen Sensor ist eine übereinander angeordnete Elektroden-Isolatorschichtfolge nach Fig. 4. Auf ein Glassubstrat 18 wird eine Au-Schicht abgeschieden. Mittels Fotolithografie wird diese Schicht in einzelne Bereiche 19 vereinzelt. Die Zwischenräume 20 werden anschließend mit SiO2 über Plasmaabscheidungsverfahren aufgefüllt. Auf diese Schicht wird eine SiO2-Deckschicht 21 durch die gleiche Methode aufgebracht. Durch Ionenstrahlätzen wird ein Mikrokanal 22 einer Weite von z.B. 20 µm durch die Schichtstruktur realisiert. Die Immobilisierung von aminofunktionalisierter DNA wird über bekannte Silanisierungsverfahren wie z.B. mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) an der SiO2-Innenseite dieses Mikrokanals und einem bifunktionellen Linker BS3 aus Beispiel 1 erreicht. In diesem Beispiel werden auf den Messflächen der einzelnen Kanäle jeweils verschiedene Erkennungs-DNAs für die simultane Detektion unterschiedlicher Analyten immobilisiert. Die Durchführung des Assays sowie Ag-Verstärkung mit simultaner Widerstandsmessung findet analog zu Beispiel 1 statt, wobei lediglich die Reaktionslösungen mit einem spritzenbetriebenen Schlauchsystem durch die Öffnungen der Vorrichtung gespült werden. Die elektrischen Widerstände der einzelnen Bereiche 19 gegen eine einzige Gegenelektrode im Reaktionsgefäß werden nacheinander oder simultan gemessen.

    Claims (11)

    1. Verfahren zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten durch eine Erkennungsreaktion, unter Verwendung
      einer Vorrichtung mit einem mit Elektrolyten gefüllten Elektrolytraum aufweisend
      mindestens eine Messelektrode mit gegebenenfalls einem, an die Messelektrode angrenzenden isolierenden Bereich (Isolierschicht)
      Erkennungsmolekülen, die auf der Messelektrode und/oder auf dem an die Messelektrode/n angrenzenden isolierenden Bereich immobilisiert sind und einer Gegenelektrode,
      A) in Kontaktbringen von mit elektrisch aktiven Markierungseinheiten markierten Analyten mit den Erkennungsmolekülen, wobei die elektrisch aktiven Markierungseinheiten entweder vor dem Kontakt der Analyten mit Erkennungsmolekülen an die Analyten gebunden worden sind oder nach dem Kontakt der Analyten mit der biofunktionellen Oberfläche an die Analyten gebunden werden,
      B) Applikation einer reaktiven Verstärkungslösung in den Elektrolytraum zur Verstärkung/Erzeugung der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch aktiven Markierungseinheiten,
      C) Messung der elektrischen Leitfähigkeit bzw. des Widerstands zwischen der oder den Messelektrode/n und der Gegenelektrode in Abhängigkeit von der Entwicklungszeit,
      D) Analyse des zeitlichen Verlaufs der Leitfähigkeit bzw. des Widerstands nach C).
    2. Verfahren nach einem der Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentrationsangabe in einem quantitativen Assay bzw. der grundsätzliche Nachweis in einem qualitativen Assay über die Zeitdauer der Reaktion B) bis zum Erreichen eines signifikanten Gradienten im zeitlichen Verlaufs von Widerstand oder Leitfähigkeit mit Zeitdauer der Reaktion B) einer Referenzprobe verglichen und zur quantitativen oder qualitativen Analyse des Analyten verwendet wird.
    3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsmoleküle über eine biofunktionelle Oberflächenbeschichtung auf der Messelektrode und/oder der angrenzenden Isolierschicht angebracht sind.
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt A) eine quantitativ vorbestimmte Menge eines bekannten Analyten, der mit Markierungseinheiten versehen ist, gemischt wird mit der Probe eines unmarkierten bekannten Analyten und aus einem Vergleich der Analyse D) dieses Mischsystems mit der Analyse des reinen bekannten markierten Analyten die Konzentration des unmarkierten Analyten bestimmt wird.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Analytmolekül mit einem oder mehreren elektrisch aktiven Markierungseinheiten markiert wird.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch aktiven Markierungseinheiten nichtleitfähige Partikel auf Basis von Polymeren mit leitfähiger Beschichtung, bevorzugt nichtleitfähige Partikel mit metallischer Beschichtung sind.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch aktiven Markierungseinheiten auf leitfähigen Polymeren basieren.
    8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Erkennungsreaktionen mit den' Schritten A) bis D) parallel simultan auf einer Sensorvorrichtung durchgeführt werden, indem die Messvorrichtung mit einer Vielzahl von Messflächen versehen werden, auf denen jeweils gleiche oder unterschiedliche Erkennungselemente angebracht sind.
    9. Vorrichtung zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten durch eine Erkennungsreaktion, insbesondere nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wenigstens umfassend
      mindestens eine Messelektrode und mindestens einen angrenzenden isolierenden Bereich (Isolierschicht)
      Erkennungsmoleküle, die auf dem an die Elektrode/n angrenzenden isolierenden Bereich und optional auf der Elektrode/n immobilisiert sind,
      eine Gegenelektrode
      Analyten, die mit elektrisch aktiven Markierungseinheiten markiert sind
      gegebenenfalls eine Verstärkungslösung und ein Messgerät zur zeitaufgelösten Erfassung der Leitfähigkeit bzw. des Widerstands zwischen der oder den Messelektrode/n und Gegenelektrode während des Verstärkungsprozesses.
    10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Gegenelektrode bzw. die Referenz- und Gegenelektrode zusammen mit der Messelektrode auf einem gemeinsamen Substrat angebracht sind.
    11. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 10 als DNA-Array oder als Protein-Array.
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