DE19745668A1 - Definierte Kopplung von biotechnologischen Funktionseinheiten - Google Patents
Definierte Kopplung von biotechnologischen FunktionseinheitenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die definierte Kopplung von biotechnologischen
Funktionseinheiten untereinander oder an (bio)technologische Oberflächen.
Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biotechnologie, Bioanalytik und
Diagnostik, sowie die Sensorik.
Das Problem der Kopplung von biotechologischen Funktionseinheiten
untereinander und an Oberflächen besteht darin, daß diese Kopplung eine
definierte, reproduzierbare und stabile Bindung darstellen soll. Die häufig
eingeschränkte Lebensdauer biomolekularer und biotechnologischer
Funktionseinheiten macht aber eine reversible Kopplung wünschenswert.
Idealerweise ist also eine solche Kopplung nicht nur stabil und
reproduzierbar (in Bezug auf die Herstellung) sondern sie läßt sich auch
definiert lösen, ist also regenerierbar.
In der Literatur finden sich zahlreiche Ansätze und Vorschläge, die eine
Kopplung von Funktionseinheiten an Oberflächen oder auch untereinander
ermöglicht (z. B. Guillbault). Diese Kopplungen sind entweder durch
Adsorption oder Einschluß bewerkstelligt oder werden durch kovalente
Bindungen an aktivierte Oberflächen vermittelt. Diese Vorschläge beinhalten
in der Regel nicht die Möglichkeit einer Regenerierung. Sie führen darüber
hinaus meist zu statistisch verteilten Funktionseinheiten, die Kopplung
selbst ist nicht variabel.
Die Erfindung hat das Ziel, Kopplungen von biotechnologischen
Funktionseinheiten untereinander oder an (bio)technologischen Oberflächen
zu realisieren, die sowohl stabil als auch reproduzierbar sind.
Darüberhinaus soll die Kopplung unter definierten Bedingungen lösbar sein,
um die Funktionseinheiten und/oder die Oberfläche wieder vollständig für
weitere Funktionalisierungen freizusetzen.
Das Ziel der Erfindung wird gemäß Anspruch 1 gelöst, die Unteransprüche
sind Vorzugsvarianten.
Die erfindungsgemäße Kopplung erlaubt eine gerichtete Kopplung von
Funktionseinheiten untereinander bzw. auf einer Oberfläche. Dadurch lassen
sich definierte Schichten erzeugen.
Ebenso ist es möglich, lateral zu strukturieren, indem z. B. durch
Photoaktivierung bestimmte Bereiche mit unterschiedlichen Oligonukleotiden
belegt werden. Dadurch entstehen funktionelle Arrays, deren
Funktionalitäten einzeln abgefragt oder gezielt in Korrespondenz gebracht
werden können. Hiermit ergibt sich die Möglichkeit, eine Vielzahl von
Substanzen parallel zu untersuchen, z. B. aus einer Blutprobe oder einem
Fermentationsextrakt, ohne daß eine Trennung oder eine Kompartimentierung
notwendig wird (Diagnostischer Chip oder Screening).
Die Kopplung kann durch die Wahl der Nucleotidzusammensetzung in der Stärke
bestimmt werden, so daß gezielt Kopplungen früher oder später, d. h. nach
Wahl der Bedingungen, gelöst werden können. Das Lösen der Kopplung kann
durch basische Pufferlösungen, durch schwache Laugen oder durch Erhitzen
über den Schmelzpunkt des Hybrids erreicht werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert
werden.
Es wurden zwei kompetitive Assays für verschiedene Analyte auf derselben
Oberfläche durchgeführt. Das Prinzip ist in der Abb. 1 wiedergegeben.
Es wurde eine Sensoroberfläche (Tantaloxid-Lichtwellenleiter,
Gitterkoppler) mit einem Oligonucleotid (DNA 35-mer, Template) durch
kovalente Kopplung am 5'-Ende modifiziert. An das 3'-Ende wurde ein 14-mer
(DNA) hybridisiert, das mit 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D) am 5'-
Ende modifiziert war. Hierdurch entsteht eine Oberfläche, die mit 2,4-D
belegt ist. Auf dieser läßt sich mittels Monoklonaler Antikörper (MAk) ein
kompetitiver Immunoassay durchführen. In der Abb. 2 sind Bindung eines MAk
gegen 2,4-D (a) und unterdrückte Bindung (b) durch einen Überschuß an 2,4-D
wiedergegeben. Zwischen allen Schritten wurde regeneriert, in dem der
Doppelstrang durch NaOH gelöst wurde. Danach wurde die Oberfläche neu mit
markiertem Oligomer durch Hybridisierung belegt. Anschließend wurden
dieselben Schritte mit einem Atrazin-modifizierten Oligomer (14-mer mit
derselben Basenzusammensetzung wie das 2,4-D markierte) wiederholt. (c) und
(d) gibt die Bindung des Anti-Atrazin-Antikörpers in verschiedenen
Konzentrationen wieder, (e) zeigt die Inhibition der Bindung in Gegenwart
von Atrazin.
Unspezifische Bindung wurde nicht beobachtet, wenn eine kovalente Kopplung
des Template-Oligomers durchgeführt wurde. Abb. 3 zeigt den vollständigen
kompetitiven Assay am Beispiel Atrazin; der Assay war bzgl. Empfindlichkeit
nicht optimiert.
Abschließend wurden weitere Oligonucleotide, die überlappend komplementär
waren, immobilisiert (f).
Ein Enzym (z. B. eine Oxidoreduktase) wird mit einem Oligonucleotid,
vorzugsweise aus PNA, kovalent verknüpft, wobei das 5'-Ende (bzw. C-
Terminus) am Enzym gekoppelt ist. Goldelektroden werden über 5'-Thiol-
modifizierte Oligomere mit komplementärer Sequenz vorbereitet. Die
modifizierten Enzyme binden spezifisch an die Goldelektrode mit der die
Aktivität z. B. durch Substratumsatz nachgewiesen werden kann.
Die kovalente Anknüpfung eines Nucleotidstranges an ein Enzym (z. B.
Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Galaktosidase) und die kovalente
Anknüpfung des dazu koplementären Stranges an einen Antikörper läßt
Konjugate entstehen, die als Marker einsetzbar sind und durch Bedingungen,
die den Doppelstrang lösen ohne die Proteine zu zerstören z. B., geringe
Ionenstärke oder erhöhte Temperatur, wieder zerlegen.
Auf dieselbe Weise lassen sich Bi-Enzyme aus Oxidoreduktasen herstellen,
die z. B. als Redox-Zyklus verstärkend aktiv sind.
Abb. 1 zeigt den prinzipiellen Verlauf des Experimentes zur
Funktionalisierung mit 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D) und Anbindung
eines spezifischen Antikörpers gegen 2,4-D (oben), Regenerierung (mitte)
und wiederholten Funktionalisierung mit neuer Funktionalität, nämlich
Atrazin (Atrazinderivat: Aminohexylatrazin, AHA), sowie Anbindung eines
spezifischen Antikörpers gegen Atrazin. Dies entspricht den
Bindungssignalen (a) und (c) oder (d) der Abb. 2.
Abb. 2. Meßsignal eines Gitterkoppler-Sensors, der effektive
Brechzahländerungen an der Oberfläche hervorgerufen durch Anlagerung
detektiert. Ein DNA-Oligomer (14-mer) wurde auf der Oberfläche
immobilisiert. Komplementäre DNA Oligomere, die mit 2,4-D oder AHA
modifiziert waren, hybridisieren an die Oberfläche.
(a) Hybridisierung des 2,4-D-Oligomer und anschließende Zugabe des 2,4-D-
Antikörpers, (b) zusätzlich wurde 2,4-D dazugegeben und somit die Bindung
des Antikörpers unterbunden. (c) Hybridisierung des AHA-Oligomer und
anschließende Zugabe des Atrazin-Antikörpers, (d) dasselbe mit geringerer
Antikörperkonzentration, (e) mit zusätzlicher Zugabe von Atrazin, (f)
stufenweise Hybridisierung überlappender Oligomere zeigt, daß ein weiterer
Aufbau der Schichten für neue Funktionalitäten möglich ist.
Abb. 3. Ein vollständiger kompetitiver Immunoassay für Atrazin auf der
Basis einer Nucleinsäure-modifizierten Oberfläche, gemessen wie in Abb. 2.
Claims (27)
1. Definierte Kopplung von biotechnologischen Funktionseinheiten
untereinander oder an (bio)technologische Oberflächen,
dadurch gekennzeichnet, daß die miteinander zu verbindenden Komponenten
jeweils separat mit zueinander komplementären Oligonukleotid- oder
Nucleinsäuresträngen (Linker) kovalent verbunden werden und nachfolgend die
Kopplung durch Mischen der Komponenten unter Bildung von Hybriden erfolgt.
1a. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonucleotide DNA, RNA oder Peptid-Nucleinsäuren (PNA) sind, oder
Derivate davon, die zur Stabilisierung gegen Nucleasen modifiziert wurden.
1b. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
gebildeten Hybride jede Art von Homo- und Heterohybriden, bevorzugt
DNA/DNA, DNA/PNA, RNA/PNA oder modDNA/DNA, darstellen.
2. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Enzyme oder Enzymkomplexe sind.
3. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Antikörper oder Antikörperfragmente
oder Antigene sind.
4. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Polysaccharide oder Lipide sind.
5. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Rezeptoren oder Lectine sind.
6. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten eine Rezeptor-Transport-Enzym-Kaskade
darstellen oder durch die Kopplung eine solche fixiert wird.
7. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Phagen, Mikroorganismen oder ganze
(eukaryontische) Zellen sind.
8. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten funktionelle oder modifizierte
funktionelle Nukleinsäuren, namentlich Ribozyme oder Aptamere, sind.
9. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Haptene, Hormone, Agonisten oder
Antagonisten sind.
10. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Peptide oder andere Leitstrukturen
sind.
11. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Enzymsubstrate oder -inhibitoren
sind.
12. Definierte Kopplung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
biotechnologischen Funktionseinheiten Marker oder Label sind, so z. B.
Fluorochrome, Redoxlabel oder aber auch in diesem Sinne verwendete Enzyme,
oder Spin-label (für NMR, ESR) sind.
13. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche durch einen festen oder löslichen
anorganischen oder organischen polymeren Träger gegeben ist.
14. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche durch einen Silizium-Wafer, eine
Glasoberfläche oder Sol/Gelmaterialien gegeben ist.
15. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche durch Kunststoffe in Form von Titerplatten
oder Reaktionsgefäßen, Durchflußreaktoren, bzw. darin enthaltenes
Trägermaterial, oder Schläuchen gegeben ist.
16. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche aus Gold oder einem anderen Edelmetall, z. B.
in Form von Goldpartikeln (für EM-Markierung), besteht.
17. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche aus Latex oder Derivaten besteht, oder aus
ggf. beschichteten oder aktivierten magnetische Partikeln, u. a. für
chromatographische oder reinigende Zwecke.
18. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche die Ausformung eines Transducers hat; das
sind Elektroden aller Art oder optische Sensoren, Lichtwellenleiter oder
beschichtete Lichtwellenleiter, namentlich Gold und Silberbeschichtungen
für SPR, Piezokristalle und Oberflächenschwinger.
19. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die
(bio)technologische Oberfläche die Ausformung einer AFM-Spitze oder einer
SNOM-Spitze oder einer SEM-Spitze (Scanning Electrochemical Microscopy)
oder einer anderen Scanning Probe Microscopy-Spitze hat.
20. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß der
Abstand mehrerer Funktionseinheiten durch die Länge mindestens eines
Nukleotidstranges variiert wird.
21. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß der
Abstand der Funktionseinheiten von einer Oberfläche durch die Länge
mindestens eines Nukleotidstranges variiert wird.
22. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-21, dadurch gekennzeichnet, daß die
verwendeten Nukleinsäuren gegen enzymatischen Abbau durch chemische
Modifikation oder Änderung des Phosphorzuckerrückgrates oder Verwendung von
enzymatisch nicht erkennbaren veränderten Nucleotidbausteinen stabilisiert
sind.
23. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-22, dadurch gekennzeichnet, daß die
Stabilität der Kopplung durch die Anzahl und Position der komplementären
Basen bestimmt wird.
24. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-23, dadurch gekennzeichnet, daß
durch die Koppler ein Array mit vorbestimmten unterschiedlichen
Stabilitäten und damit abrufbaren Funktionseinheiten erzeugt wird.
25. Definierte Kopplung nach Anspruch 1-24, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kopplung durch Mischung der mit einzelsträngigen Nucleinsäuren versehenen
Funktionseinheiten bzw. Oberflächen unter mehr oder weniger stringenten
Bedingungen durchgeführt wird, d. h. nur mehr oder weniger vollständig
passende Basenpaarung stabile Hybride erzeugen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19745668A DE19745668A1 (de) | 1996-10-17 | 1997-10-17 | Definierte Kopplung von biotechnologischen Funktionseinheiten |
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|---|---|---|---|
| DE19644811 | 1996-10-17 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=7810238
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| DE19745668A Ceased DE19745668A1 (de) | 1996-10-17 | 1997-10-17 | Definierte Kopplung von biotechnologischen Funktionseinheiten |
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