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EP1495326A1 - Verfahren zum immobilisieren von molekülen auf oberflächen - Google Patents

Verfahren zum immobilisieren von molekülen auf oberflächen

Info

Publication number
EP1495326A1
EP1495326A1 EP03722450A EP03722450A EP1495326A1 EP 1495326 A1 EP1495326 A1 EP 1495326A1 EP 03722450 A EP03722450 A EP 03722450A EP 03722450 A EP03722450 A EP 03722450A EP 1495326 A1 EP1495326 A1 EP 1495326A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecules
polymer
polymer layer
biomolecules
immobilization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03722450A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Holger Klapproth
Ulrich Sieben
Ingo Freund
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TDK Micronas GmbH
Original Assignee
TDK Micronas GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10236925A external-priority patent/DE10236925A1/de
Application filed by TDK Micronas GmbH filed Critical TDK Micronas GmbH
Publication of EP1495326A1 publication Critical patent/EP1495326A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
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    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
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    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3276—Copolymers
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    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3289—Coatings involving more than one layer of same or different nature
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for immobilizing compounds, in particular molecules, such as biomolecules, on surfaces or solid supports.
  • Chip packaging techniques in which multiple ICs (integrated circuit) are housed in one package are known in the art.
  • ICs integrated circuit
  • intermediate layers of polymers are often used, which establish the connection of the stacked ICs and at the same time help to mechanically protect the sensitive top side of the lower chip.
  • the production of such layers is part of the series production process in some factories and in particular the thicknesses of such layers can be set precisely in the range of a few ⁇ and even below.
  • EP 1132739 B1 discloses a method which serves to bind molecules to inorganic substrates via cross-linkers during bioconjugation, such cross-linkers being silanes, for example.
  • EP 1132739 B1 also proposes a linker system which can be used for the detection and isolation of biomolecules and as a component of a sensor or biochip or as a diagnostic instrument.
  • an immobilized enzyme can be used several times in biochemical processes.
  • the immobilization of enzymes and other biomolecules is one Key technology in the development of bio-compatible implants.
  • a total of several methods are known for binding molecules - for example biomolecules - to surfaces of supports.
  • polystyrene surfaces such as PolySorp and MaxiSorp are used to bind or conjugate biomolecules to surfaces.
  • a method for attaching biomolecules to surfaces using linker-like groups is described in DE 100 04 884.
  • the method involves contacting the polymer having the linker-like groups with a source of hydroxide ions, whereby biomolecules, e.g. Heparin, can be applied to substrate surfaces.
  • biomolecules e.g. Heparin
  • a disadvantage of the known methods for bioconjugation is that linkers are used to bind the molecules to the carrier. The presence of the linkers adversely reduces the activity of the bound molecules.
  • the known methods are still time-consuming and expensive due to the use of the linkers or the corresponding analogs.
  • the technical problem on which the present invention is based is to provide a method which enables simple and inexpensive conjugation or immobilization of biomolecules on a surface and in which the activity of the bound molecules is largely retained.
  • hydrophobic polymers are, for example, polyimide or polystyrene.
  • the surface to which the polymer layer is applied preferably consists of an inorganic material, such as, for example, a semiconductor material, in particular silicon, a semiconductor oxide, in particular silicon dioxide, glass, nitride or ceramic.
  • Hydrophobic polymers such as polyimide or polystyrene
  • Hydrophobic polymers have the advantage that they can be applied to the surface of an inorganic carrier by means of conventional processes known in semiconductor technology.
  • they electrically isolate the carrier from the molecules applied to the surface of the polymer layer or from substances related to these molecules.
  • Electrical sensors and evaluation circuits can thus be integrated in the carrier, which consists for example of a semiconductor material, without negatively influencing their function by the molecules and substances applied to the surface of the polymer layer.
  • the surface of the carrier can be completely or only partially covered with the organic hydrophobic polymer, parts of the surface being able to be left out with the aid of a mask process customary in the semiconductor industry.
  • electrical connection contacts can later be attached to the carrier, for example a chip. It is also possible to leave out parts of the surface for other reasons and thus leave areas of the possibly inorganic surface uncovered, or vice versa to coat only those specific * areas of the surface with which molecules, for example biomolecules, can later adhere.
  • the polymer layer is brought into contact with organic molecules which can form a connection with it.
  • the contacting takes place in such a way that the molecules are bound site-specifically.
  • Sensor elements are preferably integrated in the carrier below the surface to which the polymer layer is applied, in order to be able to carry out measurements on the molecules immobilized on the surface of the polymer layer. These measurements can be used, for example, to characterize the properties of the biomolecules or chemical reactions that take place in their environment.
  • antibodies can be well bound to surfaces of hydrophobic polymer layers, for example made of a polyimide or a polystyrene, with which semiconductor bodies or semiconductor layers serving as supports can be easily coated, so that classic detection reactions such as ELISA reactions can subsequently be carried out.
  • Molecules in connection with the present invention are in particular peptides, proteins, genes and their fragments, nucleic acids, carbohydrate structures such as sugar, cells and their fragments, cell membrane components and / or hormones.
  • microorganisms, cell extracts, ligands, antigens, antibodies, receptors, lectins, glycopeptides and / or lipids can also be immobilized as a molecule on the surface of the polymer layer.
  • the microorganisms can be living or dead microorganisms, the living microorganisms in the sense of the invention relating to both growing and resting cells.
  • the microorganisms can be pre-immobilized on the carrier by intracellular crosslinking of the cells, pre-immobilization being understood to mean all methods which, before immobilization according to the method according to the invention, can lead to fixation of the molecules or cells.
  • biopolymers are expediently used, such as, for example, polysaccharides or proteins, or else synthetic polymers.
  • Ligands in the sense of the invention are, for example, molecules, such as proteins or ions, which can be grouped around a central structure. Ligands can be monodentate. However, ligands can also be understood to mean molecules which are bound to specific sites of macromolecules, for example substrates or coenzymes to a protein.
  • molecules or biomolecules also include antigens and / or antibodies.
  • antigens are all substances which can trigger an immune response.
  • An antigen according to the invention manure can consist of a high-molecular part, which serves as a substrate for usually several small-molecule groups, which are decisive for the specificity of the immune response and the reaction of the antigens with the corresponding immunoglobulins.
  • the antigens can be polyvalent and monovalent and thus interact with one or more types of antibodies.
  • antibodies particular glycoproteins to be understood that specifically mi * t an antigen interact. The interaction leads to the formation of antigen-antibody complexes.
  • the antibodies can be, for example, different groups of the immunoglobulins.
  • the antibodies can be immobilized as intact antibodies or as different fragments, which can be generated, for example, by cleaving different peptidases.
  • the antibodies can be modified before, during or after immobilization on the support, for example by reduction, oxidation or by oligomerization. It is also possible to use receptors as biomolecules.
  • Receptors are, for example, proteins which interact with an extracellular signaling molecule, for example a ligand, and which activate or initiate certain functions, in particular via secondary messenger substances, through changes in conformation.
  • receptors in the sense of the invention can also be special cells that absorb stimuli and pass on the corresponding information; Examples would be photo, chemo, thermo and baroreceptors.
  • the surface to which the polymer layer is applied is preferably largely planar, ie it is a surface with low roughness, such as surfaces of semiconductor layers or semiconductor bodies with integrated circuits (IC surfaces), but which is lo kale microscopic structures that would be suitable, for example, for the absorption of biomolecules.
  • Immobilization or pre-immobilization in the sense of the invention is to be understood to mean all methods for restricting the mobility and solubility of molecules in chemical, biological and / or physical ways, with pre-immobilization relating to all methods for fixing the molecules which, according to the invention, prior to immobilization procedure.
  • the immobilization and / or pre-immobilization can be carried out by different methods, such as the binding of the molecules to one another or to supports, by being held in the network of a polymer matrix or enclosed by membranes.
  • the immobilization not only makes the molecules reusable, but can also be used the process of interaction with the sample can be easily separated off, and can be used in much higher local concentrations and in continuous flow systems.
  • the binding or immobilization of the molecules to the support can be carried out by direct support connection and by crosslinking
  • carrier binding takes place in particular by ionic, adsorptive or by covalent binding.
  • the crosslinking in the sense of the invention is a crosslinking of the molecules with one another or with other polymers.
  • the molecules are in gel structures or in M membranes are enclosed before being immobilized on the surface of the support.
  • the immobilization should take place in such a way that each probe or molecule can be assigned a defined position on the support and that each position on the support can be evaluated independently. However, it may also be desirable for the application sites of different molecules or probes to overlap partially or completely, or for biomolecule mixtures to be worn.
  • the immobilization can take place, for example, using a method based on semiconductor technology.
  • the molecules or biomolecules can be immobilized on the support in two fundamentally different ways: (a) on the one hand, the in situ synthesis of the molecules at defined positions on the support is possible by successive coupling of monomeric synthesis building blocks, (b) on the other others, it is possible to deposit and immobilize previously synthesized or library-derived biomolecules or other molecules at defined positions of the, in particular, functionalized carrier material. Both spotting and printing processes can be used for this. Spotting is understood to mean processes in which liquid drops in which the molecules are located are deposited on the support, essentially round spots being formed by surface interaction and drying.
  • Selected methods for immobilization or pre-immobilization are, for example, contact tip printing, ring and pin printing, nanoelectric printing and nanopipetting, bubble jet printing, top spot printing, micro contact printing, micro fluidic networks methods, photolithographic activation.
  • inorganic surfaces comprising metal, polypropylene, Teflon, polyethylene, polyester, polystyrene, nitride, ceramic and / or glass can be used as supports. be set, or IC (integrated circuit) surfaces, silicon, silicon dioxide or others.
  • Metals in the sense of the invention are all compounds whose cohesion is created by a crystal lattice. The boundary between metals and non-metals is fluid, so that the elements Ce, Sn, As and Sb are also metals in the sense of the invention.
  • the metals according to the invention also include the metallic glasses, that is to say materials which are in a metastable, largely amorphous state.
  • metallically conductive polymers are metals in the sense of the invention.
  • metals advantageously have, in particular, good strength, good hardness and wear resistance, high toughness and good electrical and thermal conductivity.
  • Polypropylenes in the sense of the invention are thermoplastics
  • Polymers of propylene Polypropylenes are particularly characterized by their high hardness, resilience, rigidity and heat resistance. Teflon according to the invention are polytetrafluoroethylenes which advantageously have good thermoplastic properties. Polyethylenes are created in particular by polymerizing ethylene using essentially two different methods, the high-pressure and low-pressure processes. Polyethylenes which are produced in the high-pressure process advantageously have a low density. The properties of carriers comprising polypropylene are essentially determined by the character of the polyethylene as a partially crystalline hydrocarbon. Advantageously, polyethylenes of up to 60 ° are practically insoluble in all common solvents.
  • polar liquids such as alcohol, esters and ketones hardly cause polyethylene to swell at room temperature and thus cause the carrier coating to swell.
  • Polyethylenes are advantageously completely indifferent to water, alkalis and salt solutions as well as inorganic acids.
  • Carriers comprising polyethylenes for example, have a very low water vapor permeability.
  • the carrier can expediently also comprise polyester.
  • polyester For the purposes of the invention, compounds are those which are prepared by ring-opening polymerization of lactones or by polycondensation of hydroxycarboxylic acids or of diols and dicarboxylic acids or dicarboxylic acid derivatives.
  • polyesters also include polyester resins, polyesterimides, polyester rubbers, polyester polyols and polyester polyuretanes.
  • Polyesters are advantageously thermoplastics and have a distinct material character. For example, they are characterized by high thermal stability and can be processed into alloys with metals such as copper, aluminum and magnesium.
  • the carrier comprises ceramic.
  • Ceramic in the sense of the invention is a collective name for in particular inorganic and predominantly non-metallic compounds that contain more than 30 vol. % comprise crystalline materials.
  • Various ceramics or ceramic materials are known to the person skilled in the art, which he can use as a carrier. It can be, for example, so-called earthenware, split plates, laboratory porcelain, aluminum oxide ceramics, permanent magnet materials, silica stones and magnesia stones.
  • clay ceramic materials a distinction is made between coarse and fine materials in the sense of the invention, fine clay ceramic materials comprising earthenware, earthenware, stoneware and porcelain.
  • the carrier can preferably also comprise glass.
  • Glass in the sense of the invention are substances in the amorphous, non-crystalline solid state, that is to say the glass state can be understood in the sense of the invention as frozen, supercooled liquid or melt. Glasses are therefore inorganic or organic, mostly oxidic melt products, which have been converted into a solid state by an insertion process without crystallization of the melt phase components.
  • crystals, melts and supercooled melts are also glasses in the sense of the invention specific.
  • the glasses can be, for example, flat glass, laboratory equipment glass, lead crystal glass, fiber glass, optical glass fibers and others.
  • silicate-free glasses for example phosphate glasses.
  • the support can also be designed in such a way that optical glasses, that is to say, for example glasses with special optical refractive indices, are used.
  • the surface of the carrier can be modified.
  • the carriers can be modified in particular by the action of biological, physical and / or chemical influences. Physical action would be, for example, polishing, etching, pickling, sandblasting, but also physical processes that lead to hardening, coating, tempering, covering with protective skins and the like.
  • a surface treatment by biological action can include, for example, overgrowth by microorganisms.
  • a chemical modification of the surface of the carrier includes, for example, treatment with acids, bases, metal oxides and others.
  • the surface of the carrier can be modified in such a way that the molecules adhere particularly well to the carrier or in such a way that their activity is not disadvantageously modified.
  • the surface modification also includes coating with poly-L-lysines, aminosilanes, aldehyde silanes, epoxy groups, gold, streptavidin, reactive groups, polyacrylamide pads, immobilized nitrocellulose and / or activated aldehydes or agarose aldehyde groups, which means that in particular are bound: DNA, COO ⁇ groups, NH 2 groups, biotin, thiol groups and others.
  • a surface modification of the carrier naturally also includes a treatment which leads to increased stability and breaking strength. Of course, especially when immobilizing biomolecules, classic surface modifications from histology can also be carried out.
  • further semiconductor bodies or semiconductor layers with integrated circuits or additional microsystems are provided in certain sections of the surface of the polymer layer.
  • a polyimide which is known for such applications in semiconductor technology is particularly suitable as the polymer layer.
  • Polyimides are particularly high-temperature resistant polymers; they advantageously have excellent mechanical, thermal and electrical properties.
  • Previously known applications of the polyimide in semiconductor technology include in particular buffer layers, passivation layers, bonding layers and dielectric intermediate layers on the carrier.
  • Polyimides are especially applied in liquid form and then cured. In this curing step, the polyimide is advantageously given the desired properties.
  • the polyimide can be structured lithographically for the applications.
  • polyimide can also be used as an adhesion promoter for potting material and as a buffer layer.
  • the polyimide layer for example, reduces the stress in silicon caused by the encapsulation and prevents cracks on the edges.
  • the polyimide must be cured in particular under very uniform temperature conditions in order to prevent cracking in the polyimide and color irregularities. Low oxygen values are advantageous, for example, in order to achieve good adhesion.
  • the polystyrene which can also be used as a polymer layer for immobilizing molecules according to the invention is a thermoplastic which is obtained above all by free-radical polymerization of styrene.
  • the radical end of a growing polymer chain never attacks a double bond in the ring because the benzene ring is an extremely stable structure.
  • This has several advantages when using polystyrene for example polystyrene is resistant to acids, alkalis and alcohol.
  • the hydrophobic polymer is applied to the surface only in predefined areas.
  • the surface is positively and / or negatively charged electrically by plasma treatment, i.e. the surfaces are charged differently at the most varied of locations.
  • Polymer materials are particularly available in various forms. The individual forms place different demands on the machining process. Depending on the shape of the surface, this is e.g. accessible to the plasmas in different ways.
  • a plasma treatment of the polymer surface can advantageously greatly increase the surface energy and enable other processing methods.
  • the ions and radicals of the plasma in particular react with the polymer surface and generate functional groups there which advantageously determine the surface properties of the polymer.
  • the positive or negative charge in particular improves the wettability and / or the binding of the biomolecules.
  • UV reactive molecules are covalently immobilized by the irradiation with UV light.
  • it can be provided to activate photolabile protective groups on glass by means of light which radiates selectively through a photolithographic mask for the oligosynthesis in a location-specific manner.
  • the glass is then flooded with photolabile molecules, for example DNA bases, which bind to the defined, previously illuminated array locations.
  • Other photolithographic masks are then used accordingly for the next oligo bases in the sequences and the process is repeated. For each base in the sample oligo (per position), 4 masks are required.
  • Advantages can thus be produced directly from known sequence databases, with uniform standardization being achieved. If hydrophobic molecules, in particular biomolecules, are applied to the surface of the hydrophobic polymer layer by means of one of the abovementioned processes, for example a printing process, these molecules adhere to this surface on account of a well-known interaction.
  • one embodiment of the method according to the invention provides for the surface of the polymer layer to be activated at least in sections, for example using a conventional mask technique, in an oxygen plasma.
  • aldehyde groups, carboxy groups or hydroxide groups are formed on the surface of the polymer layer.
  • These groups are hydrophilic and enable covalent bonds with biomolecules which are applied to these activated areas, for example by printing with a solution containing the molecules.
  • These covalent bonds are so stable that the polymer layer with the molecules immobilized on it can then be boiled in soap without destroying the bonds.
  • the surface is preferably only activated island-like by oxygen plasma treatment, the areas of the polymer layer which remain hydrophobic and which surround the "island” limit the running of the applied solution on the surface.
  • Silicon sensor chips with CMOS photodiodes are coated with polystyrene in a spin coater with a layer of approx. 100 to 200 nm Polystyrene covered.
  • the chips are coated with 200 ⁇ l of a 0.1% (w / v) polystyrene solution in toluene for one minute at 3000 rpm in a spin coater.
  • the sensor areas (photodiodes) are then printed with a protein solution in a grid-like arrangement.
  • Antibodies in PBS buffer are used. The antibodies are used in a concentration of 5 ⁇ g / ml. Part of the grid is printed with antibodies that are conjugated with fluorescent dyes.
  • the antibodies are incubated in a moist chamber at 4 ° C. overnight and the unbound antibodies are then rinsed off with PBS buffer. After washing with aqua dest. the success of the immobilization is checked with the aid of a fluorescence measuring device. The successful binding of the antibodies to the sensor areas is demonstrated by the fluorescence of the antibodies.
  • the chip is then sealed by applying a PMMA reaction chamber. The reaction chamber is applied by connecting the PMMA to the polystyrene layer. The finished structure is stabilized by the use of a commercially available stabilizing reagent for proteins and is ready for use.
  • Silicon sensor chips with CMOS photodiodes are already coated on the waver with a 5 ⁇ m layer of polyimide.
  • the polyimide is then coated with a copolymer of benzophenone methacrylate and acrylic acid.
  • the carriers can then be easily printed with biomolecules such as DNA (5 ⁇ M oligonucleotide in PBS buffer).
  • the immobilization is carried out by UV exposure at 300 nm for about 10 minutes.
  • the benzophenone of the copolymer forms radicals that create a covalent bond to the polyimide coating and to the DNA.
  • the same process can also be carried out with all other biomolecules such as proteins, in particular antibodies, peptides, sugars, lipids and triglycerides, as well as complex structures thereof.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Immobilisieren von Molekülen auf Oberflächen vorgeschlagen, wobei eine weitgehend planare Oberfläche mit einem Polymer beschichtet wird und folgend die Moleküle mittels des Polymers auf der Oberfläche immobilisiert werden.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Immobilisieren von Molekülen auf Oberflächen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Immobilisieren von Verbindungen, insbesondere von Molekülen, wie beispielsweise Biomolekülen, auf Oberflächen oder festen Trägern.
Chip-Verpackungstechniken, bei denen mehrere ICs (integrated circuit) in einem Gehäuse untergebracht werden sind im Stand der Technik bekannt. Dabei werden z.B. beim stacked-die- Aufbau häufig Zwischenschichten aus Polymeren verwendet, welche die Verbindung der übereinander gestapelten ICs herstel- len und gleichzeitig die unter Umständen empfindliche Oberseite des unteren Chips mechanisch schützen helfen. Die Herstellung solcher Schichten ist in einigen Fabriken Teil des Serien-Herstellungsprozesses und insbesondere können die Dicken solcher Schichten im Bereich weniger μ und sogar darun- ter genau eingestellt werden.
Für viele biochemische und biotechnologische Applikationen ist es sinnvoll, Biomoleküle an feste Träger zu immobilisieren. Zur Biokonjugation an anorganische Substrate werden üb- licherweise Cross-Linker verwendet, die die Verbindung zwischen der anorganischen Schicht und den Biomolekülen herstellen. Beispielsweise wird in der EP 1132739 Bl ein Verfahren offenbart, welches dazu dient, bei der Biokonjugation Moleküle an anorganische Substrate über Cross-Linker zu binden, wo- bei solche Cross-Linker beispielsweise Silane sein können. Es wird in der EP 1132739 Bl weiterhin ein Linker-System vorgeschlagen, welches zum Nachweis und zur Isolierung von Biomolekülen und als Bestandteil eines Sensor- oder Biochips bzw. als diagnostisches Instrument eingesetzt werden kann. Bei- spielsweise kann so in biochemischen Prozessabläufen ein immobilisiertes Enzym mehrfach verwendet werden. Fernerhin ist die Immobilisierung von Enzymen und anderen Biomolekülen eine Schlüsseltechnologie in der Entwicklung von bio-kompatiblen Implantaten.
Es sind insgesamt mehrere Verfahren bekannt, Moleküle - bei- spielsweise Biomoleküle - an Oberflächen von Trägern zu binden. Im Bereich der Immunologie werden beispielsweise Po- lystyrenoberflachen wie PolySorp und MaxiSorp eingesetzt, um Biomoleküle an Oberflächen zu binden oder zu konjugieren.
Aus der EP 0646 038 ist bekannt, passivierte und stabilisierte, poröse Träger herzustellen und zur Biokonjugation zu verwenden. Diese Träger weisen ein umkehrbares hohes Sorptionsvermögen auf, das im wesentlichen nicht einhergeht mit einer nicht-spezifischen Adsorption von Molekülen wie z.B. Protei- nen, Polysacchariden oder Oligo- oder Polynukleotiden.
Ein Verfahren zum Anbringen von Biomolekülen an Oberflächen mittels Linker-ähnlicher Gruppen wird in der DE 100 04 884 beschrieben. Das Verfahren beinhaltet ein in Kontakt bringen des die Linker-ähnlichen Gruppen aufweisenden Polymers mit einer Quelle für Hydroxidionen, wodurch Biomoleküle, wie z.B. Heparin, auf Substratoberflächen aufgebracht werden können.
Für den Fachmann sind in dem Zusammenhang der Biokonjugation zwei wesentliche Fragestellungen relevant:
(i) wie viele Moleküle binden insgesamt auf einer definierten Oberfläche und
(ii) wie viele Moleküle weisen nach dem Prozess der Bindung noch eine Aktivität auf.
Nachteilig bei den bekannten Verfahren zur Biokonjugation ist, das Linker eingesetzt werden, um die Moleküle an die Träger zu binden. Die Anwesenheit der Linker setzt die Akti- vität der gebundenen Moleküle nachteilig herab. Die bekannten Verfahren sind weiterhin zeitaufwendig und durch den Einsatz der Linker oder der entsprechenden Analoga teuer. Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das eine einfache und kostengünstige Konjugation oder Immobilisie- rung von Biomolekülen an einer Oberfläche ermöglicht und bei dem die Aktivität der gebundenen Moleküle weitestgehend erhalten bleibt .
Dieses Ziel wird durch ein Verfahren gemäß der Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Immobilisieren von Molekülen auf Oberflächen, ist vorgesehen, eine Schicht eines hydrophoben und insbesondere nicht quellbaren Polymers auf die Oberfläche aufzubringen und Moleküle auf einer Oberfläche der Polymerschicht zu immobilisieren.
Derartige hydrophobe Polymere sind beispielsweise Polyimid oder Polystyrol. Die Oberfläche, auf welche die Polymerschicht aufgebracht ist, besteht vorzugsweise aus einem anorganischen Material, wie beispielsweise einem Halbleitermaterial, insbesondere Silizium, einem Halbleiteroxid, insbesondere Siliziumdioxid, Glas, Nitrid oder Keramik.
Hydrophobe Polymere, wie Polyimid oder Polystyrol, besitzen den Vorteil, dass sie mittels herkömmlicher, in der Halbleitertechnologie bekannter Verfahren auf die Oberfläche eines anorganischen Trägers aufgebracht werden können. Darüber hin- aus isolieren sie den Träger elektrisch gegenüber den auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebrachten Molekülen oder in Zusammenhang mit diesen Molekülen stehenden Substanzen. In den beispielsweise aus einem Halbleitermaterial bestehenden Träger können somit elektrische Sensoren und Auswerteschal- tungen integriert werden, ohne deren Funktion durch die auf die Oberfläche der Polymerschicht aufgebrachten Moleküle und Substanzen negativ zu beeinflussen. Die Oberfläche des Trägers kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vollständig oder nur teilweise mit dem organischen hydrophoben Polymer bedeckt werden, wobei mit Hilfe eines in der Halbleiterindustrie üblichen Maskenprozesses Teile der Oberfläche ausgespart werden können. Dadurch können später elektrische Anschlusskontakte (Bonds) an dem Träger, beispielsweise einem Chip, angebracht werden können. Es ist auch möglich, Teile der Oberfläche aus anderen Gründen auszusparen und so Bereiche der gegebenenfalls anorganischen Oberfläche unbedeckt zu lassen, oder umgekehrt nur solche bestimmte* Stellen der Oberfläche mit dem Polymer zu beschichten, an denen später Moleküle, beispielsweise Biomoleküle, haften können .
Für die Immobilisierung wird die Polymerschicht mit organischen Molekülen, die mit dieser eine Verbindung eingehen können, in Kontakt gebracht. Das in Kontakt bringen erfolgt so, dass die Moleküle ortsspezifisch gebunden werden.
Vorzugsweise sind Sensorelemente in dem Träger unterhalb der Oberfläche, auf welche die Polymerschicht aufgebracht ist, integriert, um Messungen an den auf der Oberfläche der Polymerschicht immobilisierten Molekülen vornehmen zu können. Diese Messungen können beispielsweise dazu dienen, die Eigenschaften der Biomoleküle oder chemische Reaktionen, die in deren Umgebung stattfinden, zu charakterisieren.
Beispielsweise können Antikörper an Oberflächen hydrophober Polymerschichten, beispielsweise aus einem Polyimid oder einem Polystyrol, mit denen als Träger dienende Halbleiterkörper oder Halbleiterschichten leicht beschichtet werden können, gut gebunden werden, so dass sich anschließend klassische Nachweisreaktionen wie z.B. ELISA Reaktionen durchführen lassen. Moleküle im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Peptide, Proteine, Gene und deren Fragmente, Nukleinsäuren, Kohlenhydratstrukturen wie Zucker, Zellen und deren Fragmente, Zellmembranbestandteile und/oder Hormone. Selbstverständlich können auch Mikroorganismen, Zellextrakte, Liganden, Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Lektine, Glyco- peptide und/oder Lipide als Molekül an der Oberfläche der Polymerschicht immobilisiert werden. Bei den Mikroorganismen kann es sich um lebende oder tote Mikroorganismen handeln, wobei die lebenden Mikroorganismen im Sinne der Erfindung sowohl wachsende als auch ruhende Zellen betreffen. Die Mikroorganismen können durch intrazelluläre Vernetzung der Zellen auf dem Träger preimmobilisiert werden, wobei unter Preimmo- bilisierung alle Verfahren verstanden werden, die vor dem Im- mobilisieren gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zu einer Fixierung der Moleküle oder Zellen führen können. Bei dem Einschluss in eine Polymermatrix zur Preimmobilisierung der Mikroorganismen werden zweckmäßigerweise Biopolymere verwendet, wie beispielsweise Polysaccharide oder Proteine oder a- ber synthetische Polymere.
Weiterhin ist es selbstverständlich möglich, auch Liganden als Moleküle auf der Oberfläche der Polymereschicht zu immobilisieren. Liganden im Sinne der Erfindung sind z.B. Molekü- le, wie zum Beispiel Proteine oder Ionen, die um eine Zentralstruktur gruppiert sein können. Liganden können ein und mehrzähnig sein. Unter Liganden können jedoch auch Moleküle verstanden werden, die an spezifische Stellen von Makromolekülen gebunden werden, beispielsweise Substrate oder Coenzyme an ein Protein. Im Sinne der Erfindung sind unter Molekülen oder Biomolekülen auch Antigene und/oder Antikörper zu verstehen. Antigene im Sinne der Erfindung sind alle Substanzen, die eine Immunantwort auslösen können. Es kann sich um körperfremde, natürliche oder synthetische Makromoleküle, insbe- sondere Proteine oder Polysaccharide, mit einem Molekulargewicht von über 2 Kilo-Dalton handeln sowie um Oberflächenstrukturen von Fremdpartikeln. Ein Antigen gemäß der Erfin- dung kann aus einem hochmolekularen Teil bestehen, der als Substrat von meist mehreren niedermolekularen Gruppen dient, die für die Spezifität der Immunantwort und die Reaktion der Antigene mit den entsprechenden Immunoglobulinen ausschlag- gebend sind. Die Antigene können polyvalent und monovalent sein und so mit einer bzw. mit mehreren Antikörperarten wechselwirken.
Es kann auch vorgesehen sein, statt der Antigene Antikörper auf dem Träger zu immobilisieren. Unter Antikörpern werden insbesondere Glycoproteine verstanden, die spezifisch mi*t einem Antigen wechselwirken. Durch die Wechselwirkung kommt es zur Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen. Die Antikörper können beispielsweise verschiedene Gruppen der Immunglobuline sein. Die Antikörper können als intakte Antikörper oder als verschiedene Fragmente, die beispielsweise mittels Spaltung von verschiedenen Peptidasen erzeugt werden können, immobilisiert werden. Die Antikörper können vor oder während bzw. nach der Immobilisierung auf dem Träger modifiziert werden, zum Beispiel durch Reduktion, Oxidation oder durch eine Oli- gomerisation. Weiterhin ist es möglich, als Biomoleküle auch Rezeptoren einzusetzen. Rezeptoren sind beispielsweise Proteine, die mit einem extrazellulären Signalmolekül, beispielsweise einem Ligand, in Wechselwirkung treten und durch Kon- formationsänderungen bestimmte Funktionen, insbesondere über sekundäre Botenstoffe, aktivieren oder initiieren. Rezeptoren im Sinne der Erfindung können jedoch auch spezielle Zellen sein, die Reize aufnehmen und die entsprechende Informationen weiterleiten; Beispiele hierfür wären Foto-, Chemo-, Thermo- und Barorezeptoren.
Vorzugsweise ist die Oberfläche, auf welche die Polymerschicht aufgebracht wird, weitgehend planar, d.h., es handelt sich um eine Oberfläche mit geringer Rauhigkeit wie z.B. Oberflächen von Halbleiterschichten oder Halbleiterkörpern mit integrierten Schaltungen (IC Oberflächen) , die jedoch lo- kale mikroskopische Strukturen, die z.B. zur Aufnahme von Biomolekülen geeignet wären, aufweisen können.
Unter Immobilisierung oder Preimmobilisierung im Sinne der Erfindung sind alle Methoden zur Einschränkung der Beweglichkeit und Löslichkeit von Molekülen auf chemischen, biologischen und/oder physikalischen Wegen zu verstehen, wobei die Preimmobilisierung alle Verfahren zur Fixierung der Moleküle betrifft, die vor der Immobilisierung gemäß des erfindungsge- mäßen Verfahrens durchgeführt werden. Die Immobilisierung und/oder Preimmobilisierung kann durch unterschiedliche "Methoden erfolgen, wie der Bindung der Moleküle untereinander oder an Träger, durch Festhalten im Netzwerk einer polymeren Matrix oder Umschließen durch Membranen. Durch die Immobili- sierung werden die Moleküle nicht nur wiederverwendbar, sondern können nach dem Prozess der Interaktion mit der Probe leicht wieder abgetrennt werden. Sie lassen sich in sehr viel höheren lokalen Konzentrationen und in kontinuierlichen Durchflusssystemen einsetzen. Die Bindung bzw. die Immobili- sierung der Moleküle an den Träger kann durch direkte Trägerverbindung und durch Quervernetzung erfolgen. Die Trägerbindung erfolgt gemäß der Erfindung insbesondere durch ionische, adsorptive oder durch kovalente Bindung. Die Quervernetzung im Sinne der Erfindung ist eine Vernetzung der Moleküle un- tereinander oder mit anderen Polymeren. Bei der Immobilisierung durch Einschluss werden die Moleküle in Gelstrukturen bzw. in Membranen eingeschlossen, bevor sie auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert werden.
Dem Fachmann sind zahlreiche Möglichkeiten bekannt, die Moleküle auf dem Träger zu immobilisieren. Die Immobilisierung sollte hierbei so erfolgen, dass jeder Sonde bzw. Molekül eine definierte Position auf dem Träger zugeordnet werden kann und das jede Position auf dem Träger unabhängig ausgewertet werden kann. Es kann aber auch gewünscht sein, dass sich die Auf ragungsorte verschiedener Moleküle oder Sonden teilweise oder vollständig überlappen oder dass Biomolekülgemische auf- getragen werden. Die Immobilisierung kann beispielsweise mit einem an die Halbleitertechnik angelehnten Verfahren erfolgen. Im wesentlichen können die Moleküle oder Biomoleküle auf zwei prinzipiell verschiedenen Wegen auf dem Träger immobili- siert werden: (a) zum einen ist die In situ-Synthese der Moleküle an definierten Positionen auf dem Träger durch sukzessive Kopplung monomerer Synthesebausteine möglich, (b) zum anderen ist ein Ablegen und Immobilisieren von zuvor synthetisierten oder aus Bibliotheken stammenden Biomoleküle oder anderer Moleküle an definierten Positionen des insbesondere funktionalisierten Trägermaterials möglich. Hierfür können sowohl Spotting als auch Druckverfahren eingesetzt werden. Unter Spotting versteht man Verfahren, bei denen Flüssigkeitstropfen, in denen die Moleküle befindlich sind, auf dem Träger abgelegt werden, wobei durch Oberflächenwechselwirkung und Trocknung im wesentlichen runde Spots entstehen. Aber auch andere Druckverfahen ermöglichen es, die Moleküle in definierten Flächen auf der Oberfläche des Trägers abzulegen, wodurch eine stabile Bindung der Proben an die Substratober- fläche der Moleküle mit hoher Kopplungseffizienz erfolgen kann. Alle dem Fachmann bekannten Immobilisierungsmaßnahmen von Biomolekülen an z.B. Säulenmaterialien können ebenfalls verwandt werden, um die Moleküle auf dem Träger zu immobilisieren .
Ausgewählte Verfahren zum Immobilisieren oder Preimmobilisie- ren sind beispielsweise das Contact Tip Printing, Ring and Pin Printing, Nanoelectric Printing and Nanopipetting, Bubble Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic Networks-Methoden, Photolithographic Activation-
Verfahren, Photoresist Lithography, Electrochemical Focusing und Micro Wet Printing. Erfindungsgemäß können alle diese Verfahren angewendet werden.
In Sinne der Erfindung können als Träger anorganische Oberflächen umfassend Metall, Polypropylen, Teflon, Polyethylen, Polyester, Polystyren, Nitrid, Keramik und/oder Glas einge- setzt werden, beziehungsweise IC (integrated circuit) Oberflächen, Silizium, Siliziumdioxid oder andere. Metalle im Sinne der Erfindung sind alle Verbindungen, deren Zusammenhalt durch ein Kristallgitter entsteht. Die Grenze zwischen Metallen und Nichtmetallen ist fließend, so dass auch die E- lemente Ce, Sn, As und Sb im Sinne der Erfindung Metalle sind. Zu den Metallen gemäß der Erfindung gehören auch die metallischen Gläser, das heißt Werkstoffe, die sich in einem metastabilen, weitgehend amorphen Zustand befinden. Selbst- verständlich sind auch metallisch leitfähige Polymere Metalle im Sinne der Erfindung. Vorteilhafter weise weisen Metalle im Sinne der Erfindung insbesondere eine gute Festigkeit, eine gute Härte und Verschleißbeständigkeit, eine hohe Zähigkeit und eine gute elektrische und thermische Leitfähigkeit auf. Polypropylene im Sinne der Erfindung sind thermoplastische
Polymere des Propylens. Polypropylene zeichnen sich insbesondere durch eine hohe Härte, Rückstellfähigkeit, Steifheit und Wärmebeständigkeit aus. Teflon gemäß der Erfindung sind Poly- tetrafluoroethylene, die vorteilhafter weise gute thermoplas- tische Eigenschaften aufweisen. Polyethylene entstehen insbesondere durch eine Polymerisation von Ethylen nach im wesentlichen zwei unterschiedlichen Methoden, dem Hochdruck- und dem Niederdruckverfahren. Polyethylene, die im Hochdruckverfahren hergestellt werden, weisen vorteilhafter weise eine geringe Dichte auf. Die Eigenschaften von Trägern, die Polypropylen umfassen, werden im wesentlichen durch den Charakter des Polyethylen als partiell kristallinem Kohlenwasserstoff bestimmt. Vorteilhafter weise sind Polyethylene bis zu 60° Grad in allen üblichen Lösungsmitteln praktisch unlös- lieh. Vorteilhafter weise bewirken polare Flüssigkeiten wie Alkohol, Ester und Ketone bei Zimmertemperatur kaum eine Quellung von Polyethylenen und somit der Trägerbeschichtung. Gegen Wasser, Laugen und Salzlösungen sowie anorganischen Säuren verhalten sich Polyethylene vorteilhafter weise völlig indifferent. Träger, die Polyethylene umfassen, haben z.B. eine sehr geringe Wasserdampfdurchlässigkeit . Der Träger kann jedoch zweckmäßigerweise auch Polyester umfassen. Polyester im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die durch Ringöffnungspolymerisation von Lactonen oder durch Polykondensation von Hydroxycarbonsäuren bzw. von Diolen und Dicarbonsäuren bzw. Dicarbonsäurederivaten hergestellt werden. Polyester im Sinne der Erfindung umfassen auch Polyesterharze, Polyesteri- mide, Polyesterkautschuke, Polyesterpolyole und Polyesterpo- lyuretane. Polyester sind vorteilhafter weise Thermoplaste und besitzen ausgesprochenen WerkstoffCharakter . Sie zeichnen sich beispielsweise durch eine hohe Thermostabilität aus und können zu Legierungen mit Metallen, wie beispielsweise Kupfer, Aluminium und Magnesium, verarbeitet werden.
Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass der Träger Keramik umfasst. Keramik im Sinne der Erfindung ist eine Sammelbe- Zeichnung für insbesondere anorganische und überwiegend nicht-metallische Verbindungen, die zu mehr als 30 Vol . % kristalline Materialien umfassen. Dem Fachmann sind verschiedene Keramiken bzw. keramische Werkstoffe bekannt, die er als Träger einsetzen kann. Es kann sich beispielsweise um sogenann- tes Steingutgeschirr, Spaltplatten, Laborporzellan, Aluminiumoxidkeramik, Dauermagnetwerkstoffe, Silicasteine und Magnesiasteine handeln. Bei tonkeramischen Werkstoffen wird im Sinne der Erfindung in grobe und feine Werkstoffe unterschieden, wobei feine tonkeramische Werkstoffe Irdengut, Steingut, Steinzeug und Porzellan umfassen. Es können jedoch mit Vorteil auch sonderkeramische Werkstoffe wie Glas-, Oxidkeramik, SiC-Steine und schmelzflüssig gegossene Steine als Träger eingesetzt werden. Bevorzugt kann der Träger auch Glas umfassen. Glas im Sinne der Erfindung sind Stoffe, im amorphen, nichtkristallinen Festzustand, das heißt, der Glaszustand lässt sich im Sinne der Erfindung als eingefrorene unterkühlte Flüssigkeit bzw. Schmelze auffassen. Gläser sind daher anorganische oder organische, meist oxidische Schmelzprodukte, die durch einen Einführvorgang ohne Auskristallisation der Schmelzphasenkomponenten in einen festen Zustand überführt wurden. Selbstverständlich sind im Sinne der Erfindung auch Kristalle, Schmelzen und unterkühlte Schmelzen als Gläser aufzufassen. Die Gläser können zum Beispiel Flachglas, Laborgeräteglas, Bleikristallglas, Faserglas, optische Glasfasern und andere sein. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass Silicat-freie Gläser beispielsweise Phosphatgläser eingesetzt werden. Der Träger kann jedoch auch so beschaffen sein, dass optische Gläser, das heißt, z.B. Gläser mit besonderen optischen Brechungsindexen, eingesetzt werden.
Es ist im Sinne der Erfindung selbstverständlich, dass die Oberfläche der Träger modifiziert werden kann. Die Modifizierung der Träger kann insbesondere durch Einwirken von biologischen, physikalischen und/oder chemischen Einflüssen erfolgen. Physikalisches Einwirken wäre beispielsweise das Polieren, Ätzen, Beizen, Sandstrahlen, aber auch physikalische Verfahren, die zu einem Härten, Beschichten, Vergüten, Überziehen mit Schutzhäuten und ähnlichem führen. Eine Oberflächenbehandlung durch biologische Einwirkung kann beispielsweise das Bewachsen durch Mikroorganismen umfassen. Eine chemische Modifikation der Oberfläche der Träger beinhaltet bei- spielsweise die Behandlung mit Säuren, Basen, Metalloxiden und anderem. Die Oberfläche der Träger kann so modifiziert werden, dass die Moleküle auf dem Träger besonders gut haften bzw. so haften, dass sie in ihrer Aktivität nicht nachteilig modifiziert werden. Die Oberflächenmodifizierung umfasst auch das Beschichten mit Poly-L-Lysinen, Aminosilanen, Aldehydsi- lanen, Epoxy-Gruppen, Gold, Streptavidin, reaktive Gruppen, Polyacrylamid-Pads, immobilisierte Nitrocellulose und/oder aktivierten Aldehyden bzw. Agarose-Aldehyd-Gruppen, wodurch insbesondere gebunden werden: DNA, COO~-Gruppen, NH2-Gruppen, Biotin, Thiol-Gruppen und andere. Eine Oberflächenmodifizierung der Träger umfasst selbstverständlich auch eine Behandlung, die zu einer erhöhten Stabilität und Bruchfestigkeit führt. Es können selbstverständlich, insbesondere beim Immobilisieren von Biomolekülen, auch klassische Oberflächenmodi- fizierungen aus der Histologie vorgenommen werden. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen in bestimmten Abschnitten der Oberfläche der Polymerschicht weitere Halbleiterkörper oder Halbleiterschichten mit integrierten Schaltungen oder zusätzliche Mikrosysteme aufzubringen. Als Polymerschicht eignet sich hierbei insbesondere ein Polyimid, das für solche Anwendungen in der Halbleitertechnologie bekannt ist. Polyimide sind insbesondere hochtemperaturbeständige Polymere; vorteilhaft weisen sie ausgezeichnete mechanische, thermische und elektrischen Eigenschaften auf. Bisher bekannten Anwendungen des Polyimids in der Halbleitertechnologie umfassen insbesondere Pufferschichten, Passivierurigs- schichten, Bindeschichten und dielektrische Zwischenschichten auf dem Träger. Polyimide werden insbesondere flüssig aufgebracht und dann ausgehärtet. Bei diesem Aushärtungsschritt erhält das Polyimid mit Vorteil die gewünschten Eigenschaften. Für die Anwendungen kann das Polyimid lithographisch strukturiert werden. Polyimid kann selbstverständlich auch als Haftungsvermittler für Vergussmaterial und als Pufferschicht eingesetzt werden. Die Polyimidschicht reduziert bei- spielsweise den Stress im Silizium, der durch die Kapselung hervorgerufen wird und verhindert Risse an den Kanten. Das Polyimid muss insbesondere unter sehr gleichmäßigen Temperaturbedingungen gehärtet werden um Rissbildung im Polyimid und Farbungleichmäßigkeiten zu verhindern. Niedrige Sauerstoff- werte sind z.B. vorteilhaft, um eine gute Haftung zu erreichen.
Das ebenfalls als Polymerschicht zur Immobilisierung von Molekülen gemäß der Erfindung verwendbare Polystyrol ist ein thermoplastischer Kunststoff, der vor allem durch radikali- sehe Polymerisation von Styrol gewonnen wird. Das radikalische Ende einer wachsenden Polymerkette greift nie eine Doppelbindung im Ring an, da der Benzolring eine außerordentlich stabile Struktur ist. Hieraus leiten sich mehrere Vorteile bei der Verwendung von Polystyrol ab, beispielsweise ist Po- lystyrol beständig gegenüber Säuren, Laugen und Alkohol. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltungsform der Erfindung wird das hydrophobe Polymer nur in vordefinierten Bereichen auf die Oberfläche aufgetragen.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltungsform wird die Oberfläche durch Plasmabehandlung positiv und/oder negativ elektrisch geladen, d.h., die Oberflächen sind an den unterschiedlichsten Stellen unterschiedlich geladen. Polymere Werkstoffe liegen insbesondere in verschiedenen Formen vor. Die einzelnen Formen stellen unterschiedliche Anforderungen an den Bearbeitungsprozess . Je nach Ausformung der Oberfläche ist diese z.B. den Plasmen in unterschiedlicher Weise zugänglich. Eine Plasmabehandlung der Polymeroberfläche kann vorteilhafter weise die Oberflächenenergie stark erhöhen und an- dere Verarbeitungsverfahren ermöglichen. Bei einer Plasmabehandlung reagieren vor allem die Ionen und Radikale des Plasmas mit der Polymeroberfläche und erzeugen dort funktionale Gruppen, welche die Oberflächeneigenschaften des Polymers mit Vorteil bestimmen. Durch die positive oder negative Ladung wird insbesondere eine bessere Benetzbarkeit und/oder eine bessere Bindung der Biomoleküle erreicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung werden UV reaktive Moleküle durch die Bestrahlung mit UV Licht kovalent immobilisiert. Beispielsweise kann es vorgesehen sein, photolabile Schutzgruppen auf Glas durch Licht, das selektiv durch eine photolithografische Maske strahlt, ortsgebunden für die Oligosynthese zu aktivieren. Das Glas wird dann mit photolabilen Molekülen, beispielsweise DNA-Basen, geflutet, die an die definierten vorher beleuchteten Array- stellen binden. Für die nächsten Oligo-Basen in den Sequenzen werden dann entsprechend andere photolithographische Masken benutzt und der Vorgang wiederholt. Für Jede Base im Proben- Oligo (pro Position) werden also 4 Masken benötigt. Mit Vor- teile kann so Herstellung direkt aus bekannten Sequenzdatenbanken erfolgen, wobei eine einheitliche Normierung erreicht wird. Werden hydrophobe Moleküle, insbesondere Biomoleküle mittels eines der oben genannten Verfahren, beispielsweise einem Druckverfahren, auf die Oberfläche der hydrophoben Polymerschicht aufgebracht, so haften diese Moleküle aufgrund einer hinlänglich bekannten Wechselwirkung an dieser Oberfläche an.
Zur Immobilisierung von Molekülen an der Oberfläche der Polymerschicht ist bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, die Oberfläche der Polymerschicht wenigstens abschnittsweise, beispielsweise unter Verwendung einer herkömmlichen Maskentechnik, in einem Sauerstoffplasma zu aktivieren. Dadurch werden an der Oberfläche der Polymerschicht Aldehydgruppen, Carboxygruppen oder Hydroxidgruppen gebildet. Diese Gruppen sind hydrophil und ermöglichen kova- lente Bindungen mit Biomolekülen, die auf diese aktivierten Bereiche, beispielsweise durch Bedrucken mit einer die Mole- küle enthaltenden Lösung, aufgebracht werden. Diese kovalen- ten Bindungen sind so stabil, dass die Polymerschicht mit den darauf immobilisierten Molekülen anschließend in Seife gekocht werden kann, ohne die Bindungen zu zerstören. Vorzugsweise wird die Oberfläche nur inselhaft durch Sau- erstoffplasmabehandlung aktiviert, wobei die die „Insel" umgebenden hydrophob gebliebenen Bereiche der Polymerschicht ein Verlaufen der aufgebrachten Lösung auf der Oberfläche begrenzen.
Im Folgenden soll die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiel 1
Silizium-Sensorchips mit CMOS Photodioden werden mit Polystyrol im Spincoater mit einer Schicht von ca. 100 bis 200 nm Polystyrol überzogen. Dazu werden die Chips mit 200 μl einer 0, 1 % (w/v) Polystyrol-Lösung in Toluol für eine Minute bei 3000 rpm im Spincoater beschichtet. Anschließend werden die Sensorbereiche (Photodioden) mit einer Proteinlösung in einer rasterartigen Anordnung bedruckt. Es werden Antikörper in PBS-Puffer verwendet. Die Antikörper werden jeweils in einer Konzentration von 5 μg/ml eingesetzt. Ein Teil des Rasters wird mit Antikörpern bedruckt, die mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert sind. Die Antikörper werden in einer feuchten Kam- mer bei 4°C über Nacht inkubiert und die nicht gebundenen anschließend mit PBS Puffer abgespült. Nach dem Waschen mit A- qua dest . wird der Erfolg der Immobilisierung mit Hilfe eines Fluoreszenzmessgerätes überprüft. Die erfolgreiche Bindung der Antikörper an die Sensorbereiche wird durch die Fluores- zenz der Antikörper nachgewiesen. Anschließend wird der Chip durch Aufbringen einer Reaktionskammer aus PMMA versiegelt. Die Aufbringung der Reaktionskammer erfolgt durch Verbindung des PMMA an die Polystyrolschicht. Der fertige Aufbau wird noch durch die Verwendung eines kommerziellen erhältlichen Stabilisierungsreagenz' für Proteine stabilisiert und ist einsatzfertig.
Beispiel 2
Slizium-Sensorchips mit CMOS Photodioden werden bereits auf dem Waver mit einer 5 μm Schicht Polyimid beschichtet. Anschließend wird das Polyimid mit einem Copolymer aus Ben- zophenonmetacrylat und Acrylsäure beschichtet. Die Träger können dann auf einfache Weise mit Biomolekülen wie DNA (5 μM Oligonukleotid in PBS Puffer) bedruckt werden. Die Immobilisierung erfolgt durch UV-Belichten bei 300 nm für ca. 10 Minuten. Das Benzophenon des Copolymers bildet dabei Radikale, die an das Polyimidcoating sowie an die DNA eine kovalente Bindung herstellen. Der gleiche Prozess lässt sich auch mit allen anderen Biomolekülen wie Proteinen, insbesondere Antikörpern, Peptiden, Zuckern, Lipiden und Triglyceriden sowie auch komplexen Strukturen derselben durchführen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Immobilisieren von Molekülen auf Oberflächen, das folgende Verfahrensschritte umfasst:
- Aufbringen einer Schicht eines hydrophoben Polymers auf die Oberfläche,
- Immobilisieren von Molekülen auf einer Oberfläche der Schicht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polymer ein Polyimid und/oder Polystyrol ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Polymerschicht nur in vordefinierten Bereichen auf die Oberfläche aufgetragen wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Oberfläche der Polymerschicht wenigstens abschnittsweise durch Plasmabehandlung positiv oder negativ elektrisch geladen wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem UV reaktive Moleküle durch die Bestrahlung mit UV Licht kovalent immobilisiert werden.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Polymerschicht wenigstens abschnittsweise in einem Sauer- stoffplasma aktiviert wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Teil der Oberfläche der Polymerschicht für eine Aufbringung mit einer integrierten Schaltung (integrated cir- cuit (IC) ) oder einem Mikrosystem genutzt wird.
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