DE60126319T2

DE60126319T2 - Immobilisierung von biopolymeren auf aminierten substraten durch direkte adsorption

Info

Publication number: DE60126319T2
Application number: DE60126319T
Authority: DE
Inventors: B. Jang Yorba Linda RAMPAL; S. Robert Orange MATSON
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2000-10-23
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2021-10-23
Also published as: DE60126319D1; JP2004526420A; EP1337665B1; US20050123986A1; US6861214B1; EP1337665A2; WO2002034950A3; US20040029156A1; WO2002034950A2

Description

Gebiet des Standes der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein feste Substrate mit immobilisierten Biopolymeren. Insbesondere betrifft die Erfindung aminierte Substrate mit adsorbierten Biopolymeren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zu ihrer Verwendung in der Detektion von Targetbiopolymeren.
Beschreibung des Standes der Technik
Eine Analyse von unbekannten Biopolymertargets schließt häufig ihr spezifisches Binden an bekannte Biopolymersonden ein. Die bekannteste Technik, die immobilisierte Biopolymere einsetzt, ist die Southern Blot Hybridisierungstechnik, in der eine Reihe von DNA Targets auf einer Membran immobilisiert wird und eine Lösung, die markierte DNA Sondenmoleküle enthält, verwendet wird, um die Membran unter Bedingungen, bei denen komplementäre Moleküle sich wieder verbinden werden, zu befeuchten. In einer analogen Technik, die als Northern Blot Hybridisierung bezeichnet wird, werden RNA Targets an Membranen immobilisiert und verbinden sich wieder mit komplementären RNA Sonden. Reverse Blot Hybridisierung wendet den entgegengesetzten Ansatz an. Anstatt eines Immobilisierens von DNA Targets, wird eine Reihe von DNA Sonden auf einer festen Oberfläche immobilisiert, und das unbekannte markierte DNA Target ist in der flüssigen Phase vorhanden.
Matrices, die durch Anheften einer Vielzahl derselben oder unterschiedlicher Biopolymere an diskreten, isolierten Bereichen an der Oberfläche des Substrats konstruiert werden, werden zunehmend wichtige Hilfsmittel in der Analyse von unbekannten Biopolymeren, wie Genexpressionsanalyse, DNA Sequenzieren, Mutati onsdetektion, Polymorphismus Screenen, Bindungsanalyse, Genotypisieren einzelner Nucleotidpolymorphismen (engl.: single nucleotide polymorphisms (SNPs)) und Screenen nach alternativen Spleißvarianten in Gentranskripten.
Die Genexpressionsanalyse ist ein Verfahren von entscheidender Bedeutung für grundlegende molekulare biologische Forschung. Da in höheren Organismen die Auswahl von Genen, die in irgendeiner gegebenen Zelle exprimiert werden, eine tiefgründige Wirkung auf die Eigenschaft der Zelle aufweist, kann die Genexpressionsanalyse einen Schlüssel zur Diagnose, Prognose und Behandlung einer Vielfalt von Krankheiten in Tieren, einschließlich Menschen, und in Pflanzen bereitstellen. Zusätzlich kann die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um unterschiedlich exprimierte neue Gene zu identifizieren, um eine Genexpression mit einem besonderen Phänotyp zu korrelieren, um auf eine Krankheitsprädisposition zu screenen und um ein Toxizitätstesten durchzuführen.
Typischerweise wird in der Genexpressionsanalyse eine Matrix von Sondennucleinsäuren durch Anheften einer Reihe von einzelnen genspezifischen Sonden in einem regelmäßigen Muster an ein festes Substrat gebildet, so dass der Ort jeder Sonde bekannt ist. Die Matrix wird mit einer Probe, die Targetnucleinsäuren enthält, unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht. Die Hybride werden durch Verwenden einer breiten Vielfalt von Verfahren detektiert, am häufigsten durch Anwenden radioaktiver oder fluoreszierender Markierungen.
Es gibt zwei allgemeine Verfahren Polynucleotidmatrices für die Genexpressionsanalyse zu bilden. Das erste Verfahren schließt in situ Synthese von Oligonucleotiden an vorbestimmten Positionen eines festen Substrats ein. Das zweite Verfahren schließt das Anheften von vorsynthetisierten Oligonucleotiden oder Polynucleotiden an ein festes Substrat ein. Über in situ Synthesen von Oligonucleotiden auf Glas, das mit einem aliphatischen Polyetherlinker modifiziert wird (Southern, E. M. et al., Genomics 13: 1008, 1992), und Polypropylen als ein festes Substrat (U.S. Patent Nr. 5,554,501), ist berichtet worden. Das in situ Verfahren leidet jedoch unter bestimmten Schwächen. Da zum Beispiel die Zugabe von jedem Nucleotid eine getrennte Reaktion ist, kann die Reproduzierbarkeit und Reaktionsausbeute zwischen unterschiedlichen Orten an dem Substrat sowie zwischen unterschiedlichen Substraten stark variieren. Folglich ist es schwer, genaue und reproduzierbare Daten mit Matrices, die durch direkte Synthese gebildet werden, zu erhalten.
Alternativ können vorsynthetisierte Polynucleotide auf einem Substrat durch ultraviolette Vernetzung, chemische Adhäsion oder kovalentes Binden immobilisiert werden. Typischerweise werden ein Polynucleotid, ein festes Substrat oder beides derivatisiert, um solche Immobilisierung einzuleiten. Für gewöhnlich ist es bevorzugt, dass das feste Substrat fähig ist, Sonden DNA zu immobilisieren, während es im Wesentlichen inert gegenüber jeglicher anderer DNA ist. Glas ist ein häufig verwendetes, festes Substrat, da es kostengünstig und von guter optischer Qualität ist. Verschiedene Typen von vorderivatisierten Glassubstraten sind kommerziell verfügbar, einschließlich Mikroskopträger, die mit Poly-L-Lysin oder Aminopropylsilan beschichtet sind, oder Glasträger mit exponierten Aldehydfunktionalitäten. Jedoch bildet die Derivatisierung einer Glasoberfläche eine positive elektrostatische Nettoladung, die zu unerwünschtem nicht spezifischem, elektrostatischem Binden von Nucleinsäuren an das feste Substrat während anschließender Hybridisierungsverfahren führt. Zahlreiche andere Oberflächenbeschichtungen für effiziente Immobilisierung von Polynucleotiden sind vorgeschlagen worden und schließen ein Isolat des natürlich vorkommenden Muscheladhäsivproteins (U.S. Pat. Nr. 5,024,933), Nucleosidphosphat (U.S. Pat. Nr. 4,818,681) und Salz oder kationisches Detergens (U.S. Pat. Nr. 5,610,287), um einige zu nennen, ein. Diese Verfahren führen jedoch auch zu unspezifischem Binden von Nucleinsäuren an die Substrate. Solch unspezifisches Binden von DNA macht eine Interpretation der Hybridisierungsergebnisse schwierig.
Polynucleotide selbst können vor dem Binden an ein festes Substrat derivatisiert werden. Zum Beispiel beschreibt das U.S. Pat. Nr. 6,048,695 Epoxid-modifizierte DNA, die an einem unmodifizierten festen Substrat, wie einer nicht derivatisierten Glasoberfläche, leicht befestigt werden kann. Schließlich können sowohl ein Polynucleotid als auch ein festes Substrat modifiziert werden, um effizientes kovalen tes Binden zu gestatten. Zum Beispiel offenbart das U.S. Pat. Nr. 5,215,882 ein Modifizieren einer Nucleinsäure mit einem primären Amin oder einem Äquivalent, gefolgt durch die Reaktion der modifizierten Nucleinsäure mit dem festen Substrat, das freie Aldehydgruppen aufweist, in der Anwesenheit eines Reduktionsmittels. Jedoch sind die Derivatisierung von Polynucleotiden und ihr anschließendes kovalentes Binden an feste Substrate lange und mühsame Verfahren. Folglich sind Matrices, die durch konventionelle Techniken hergestellt werden, ziemlich teuer ($6–$36 pro Träger). Ähnliche Probleme bestehen bezüglich Immobilisierung anderer Biopolymere an festen Substraten.
Zusammenfassend stellen die konventionellen Immobilisierungsverfahren keine erwünschte schnelle Hybridisierung und hohe Bindungsspezifität von Targets an Sonden bereit. Zusätzlich sind derzeit verfügbare Verfahren zum Herstellen von Assaygegenständen zur Verwendung in der Biopolymerdetektion langsam, mühsam und ökonomisch ungünstig.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend ist es ein Ziel der Erfindung ein kosteneffizientes, schnelles und zweckmäßiges Verfahren zur Herstellung eines Assaygegenstands und ein Verfahren zur Verwendung eines solchen Assaygegenstands für eine Biopolymerdetektion bereitzustellen. Insbesondere ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Assaygegenstands durch direkte Adsorption von Biopolymeren an feste Substrate zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass modifizierte Substrate und insbesondere Plasma aminierte Polypropylensubstrate fähig sind zur direkten und stabilen Adsorption von Nucleinsäuren, Proteinen, Polypeptiden und ihren Analoga ohne chemische Vernetzung. Folglich stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Assaygegenstands zur Verwendung in der Biopolymerdetektion bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(a) Bereitstellen eines Biopolymers;
(b) Bereitstellen eines aminierten Substrats; und
(c) Kontaktieren des Biopolymers mit einer Oberfläche des aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte Adsorption des Biopolymers an der Oberfläche des Substrats ausreichend ist.

In Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann das Substrat in einer Form von Schäumen, Filamenten, Fäden, Blättern, Filmen, Trägern, Gelen, Membranen, Kügelchen oder Platten hergestellt werden. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform schließt der Schritt des Bereitstellens des Biopolymers das Bereitstellen einer Lösung des Biopolymers ein; und der Schritt des Kontaktierens des Biopolymers umfasst:

(a) Platzieren eines Aliquots der Biopolymerlösung an dem Substrat; und
(b) Lufttrocknen des Substrats, um das Biopolymer direkt an der Oberfläche des Substrats zu adsorbieren.

In Übereinstimmung mit einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann eine Vielzahl von Biopolymeren an der Oberfläche des aminierten Polypropylensubstrats in einer Matrix platziert und adsorbiert werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren eines Targetbiopolymers, welches in einer Probe enthalten ist, bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(a) Bereitstellen eines aminierten Substrats;
(b) Bereitstellen eines Sondenbiopolymers, welches einen Komplex mit dem Targetbiopolymer bilden kann;
(c) Kontaktieren von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer mit einer Oberfläche des aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte Adsorption von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer an der Substratoberfläche geeignet ist, um einen Sondenassaygegenstand bzw. einen Targetassaygegenstand zu bilden;
(d) Kontaktieren des Sondenassaygegenstands mit dem Targetbiopolymer oder Kontaktieren des Targetassaygegenstands mit dem Sondenbiopolymer unter einer Bedingung, welche die Bildung eines Komplexes, umfassend die Sonden und die Targetbiopolymere, gestattet; und
(e) Detektieren und Bestimmen der Anwesenheit des Komplexes als eine Messung der Anwesenheit oder der Menge des Targetbiopolymers, welches in der Probe enthalten ist.

Der Komplex des Sonden- und des Targetbiopolymers kann auch einen Reporter einschließen. Der Reporter kann aus der Gruppe, bestehend aus: Farbstoffen, chemilumineszierenden Verbindungen, Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, Metallkomplexen, magnetischen Teilchen, Biotin, Hapten, Radiofrequenztransmittern und Radiolumineszenzverbindungen, ausgewählt werden. Ein Assaygegenstand kann durch Anheften derselben oder unterschiedlicher unmodifizierter Sonden oder Targetbiopolymere an diskrete, isolierte Bereichen des Substrats gebildet werden, um eine Matrix herzustellen. Das Signal, das durch die Reportermoleküle, die an der Matrix immobilisiert sind, hergestellt wird, kann durch eine Anzahl von Mitteln, wie einen Laser mit einem Konfokalmatrixleser, Phosphorimager oder eine CCD-Kamera detektiert und aufgezeichnet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Assaygegenstand zum Detektieren von Biopolymeren bereit. Der Assaygegenstand umfasst ein Substrat und ein Biopolymer, welches direkt an der Oberfläche des Substrats adsorbiert ist. In einer Ausführungsform wird eine Vielzahl derselben oder unterschiedlicher Biopolymere an diskreten, isolierten Bereichen des Substrats durch direkte Adsorption angeheftet, um einen Matrix zu bilden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Testkit zum Detektieren eines Targetbiopolymers, das in einer Probe enthalten ist, bereit. Das Kit umfasst ein aminiertes Polypropylensubstrat und ein Sondenbiopolymer, das direkt an einer Oberfläche des Substrats adsorbiert ist. Wenn das Sondenpolymer mit dem Targetbiopolymer in Kontakt gebracht wird, bilden sie einen Komplex, der durch Verwenden von Reportern und Signaldetektionsvorrichtungen detektiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist gut geeignet zur Verwendung in der Entwicklung von Biopolymermatrices und Polynucleotidmatrices, wie insbesondere Genexpressionsmikromatrices zur Verwendung in der Genexpressionsanalyse. Die Polynucleotidmatrices können für die Evaluierung oder Identifikation von biologischer Aktivität verwendet werden. Die vorliegende Erfindung kann auch in der Entwicklung von Polynucleotidmatrices zum Zweck des Polynucleotidsequenzierens verwendet werden. Ferner können die erfindungsgemäßen Assaygegenstände eine Reihe von adsorbierten Biopolymeren enthalten und können in Hybridisierungsassays und Immunassays verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt viele Vorteile bereit. Da die Erfindung die Adsorption von Biopolymeren direkt an ein festes Substrat ohne chemische Vernetzung gestattet, kann eine kostspielige Herstellung modifizierter Biopolymere, wie Thiol- oder Amino-modifizierter DNA vermieden werden. Die Aufgabe der Herstellung von Matrices wird auch sehr vereinfacht, und die Herstellungskosten werden signifikant reduziert, da die Biopolymere einfach an dem Substrat luftgetrocknet werden.
Beschreibung der Figuren
Die oben erwähnten und andere Merkmale dieser Erfindung und die Weise, sie zu erhalten, wird offensichtlicher und am besten verstanden unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung zusammen mit der beigefügten 1.
1 zeigt die Hybridisierungsergebnisse von markierter Target cDNA von Aktin, β-Mikroglobulin, G3PDH und p53 mit ihrer zugehörigen Sonden cDNA, die an Polypropylensubstraten immobilisiert sind. TNF-α, der an dem Substrat immobilisiert ist, wurde als eine Kontrolle für eine nicht spezifische Hybridisierung verwendet.
2 zeigt eine Anheftung von humanem IgG an aminierte Polyproylenträger.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Assaygegenstands zur Verwendung in der Biopolymerdetektion bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:

Der Begriff "Biopolymer" wie hier verwendet, bezieht sich auf Nucleinsäuren, Polynucleotide, Polypeptide, Proteine und Analoga davon. Wie hier verwendet bezieht sich "Polynucleotid" auf ein Polymer aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden in der Form eines getrennten Fragments oder als Bestandteil eines größeren Gebildes. "Polynucleotid", wie hier verwendet, kann DNA, RNA oder ein DNA Analogon, wie PNA (Peptidnucleinsäure (engl.: peptide nucleic acid)), sein. Die DNA kann eine einzel- oder doppelsträngige DNA oder eine DNA, die durch PCR Technik amplifiziert wurde, sein. Die RNA kann eine mRNA sein. Die Länge der Polynucleotide kann von ungefähr 20 bp bis ungefähr 10 kb reichen. In Übereinstimmung mit einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Polynucleotid eine komplementäre DNA (engl.: complementary DNA (cDNA)). Die Länge eines cDNA Polynucleotids kann im Bereich von ungefähr 100 bp bis ungefähr 10 kb, vorzugsweise 200 bp bis 1000 bp, liegen.
Wie hier verwendet bezieht sich "Polypeptid" auf ein Polymer von Aminosäuren, wobei die α-Carboxylgruppe jeder Aminosäure mit der α-Aminogruppe einer anderen Aminosäure durch eine Peptidbindung verbunden ist. Ein Protein kann ein Polypeptid oder mehrere Polypeptide umfassen, die durch Disulfidbindungen mitein ander verbunden werden. Beispiele von Protein schließen Antikörper, Antigene, Liganden oder Rezeptoren ein.
Es ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass Biopolymere an Substrate durch direkte Adsorption und ohne jegliche chemische Vernetzung mit dem Substrat angeheftet werden können. Wir stellten fest, dass Polypropylensubstrate besonders nützlich zur direkten Adsorption sind. Die direkte Adsorption wird durch Modifizieren der Substrate vor deren Kontaktieren mit Biopolymeren weiter verbessert. Die Substrate können durch Einführen einer Funktionalität, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus: Amino, Carboxyl, Thiol und deren Derivate, modifiziert werden. In einer Ausführungsform wird das Substrat durch Einführen einer Amingruppe modifiziert.
Das Verfahren zum Einführen von Amingruppen auf die Polypropylenoberfläche wird in dem gemeinschaftlich übertragenen U.S. Patent Nr. 6,013,789 beschrieben. Kurz gesagt können Aminogruppen auf die Oberfläche eines Propylenmediums durch Verwenden einer Plasmaentladung in einem Ammoniak oder organisches Amin enthaltenden Gas, eingeführt werden. Das "Plasma" ist vorzugsweise ein ionisiertes Gas, das genügend Ionisierungsenergie von einem elektromagnetischen Feld erhält. Vorzugsweise wird die Ionisierungsenergie durch eine Radiofrequenz Plasmaentladung, eine Mikrowellenfrequenz Plasmaentladung oder eine Koronaentladung angewendet. In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform stammt das Amin von einem Ammoniakgas und der erhöhte Energiezustand wird mittels Radiofrequenz Plasmaentladung erreicht. Das aminierte Polypropylen wird dann zur direkten Adsorption eines vorsynthetisierten Biopolymers verwendet.
Um eine Anzahl unterschiedlicher Testtechniken, einschließlich spezialisierter Testausstattung, aufzunehmen, können aminierte Polypropylensubstrate in irgendeiner aus einer Vielfalt von Gestaltungen und Formen gestaltet werden. Beispiele solcher Gestaltungen und Formen der aminierten Polypropylensubstrate schließen Schäume, Filamente, Fäden, Blätter, Filme, Träger, Gele, Membranen, Kügelchen oder Platten ein. Ein aminiertes Polypropylensubstrat kann in der Form einer planaren Vorrichtung mit diskreten isolierten Bereichen in Form von Vertiefungen, Durchbrüchen, Sockeln, hydrophoben oder hydrophilen Stoffen bzw. Stücken oder ausgestanzten Haft-Reservoirs hergestellt werden. Beispiele eines solchen Substrats schließen eine Mikroplatte ein. Da das erfindungsgemäße Substrat besonders nützlich in der Präparation von Biopolymermatrices für die Evaluierung oder Identifikation von biologischer Aktivität ist, liegt das aminierte Polypropylensubstrat vorzugsweise in der Form einer Vorrichtung mit mindestens einer ebenen planaren Oberfläche vor. Beispiele solcher Vorrichtungen mit ebenen Oberflächen schließen Träger, Blätter oder Filme ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Größe des Substrats kann variieren und hängt von der endgültigen Verwendung der immobilisierten Biopolymere ab. Der Fachmann wird erkennen, dass Matrices von Biopolymeren, die auf miniaturisierten, festen Haltern immobilisiert sind, seit vielen Jahren entwickelt werden. Diese festen Halter können bezüglich mm² planarer Oberflächenbereich beschrieben werden und können zahlreiche unterschiedliche immobilisierte Biopolymere aufweisen, wobei jedes an einem stellenspezifische Ort an dem miniaturisierten festen Träger angeheftet ist. Feste Halter in der Form von Messstäben und Trägern liegen auch im Rahmen der Erfindung. Wie im Stand der Technik bekannt, haben Messstäbe typischerweise eine rechteckige Gestalt, wobei jede Seite einige Zentimeter misst.
Da die vorliegenden Verfahren der Assaygegenstandsbildung direkte Adsorption von Biopolymeren an Substrate einschließen, wird keine chemische Modifikation von Biopolymeren benötigt. Hier bedeutet der Begriff "direkte Adsorption" ohne irgendwelche chemische Linker. Anders als im nahe kommenden Stand der Technik, der chemische Vernetzung von Biopolymeren mit den Substraten verwendet, gestattet die vorliegende Erfindung Immobilisierung von sowohl unmodifizierten als auch modifizierten Biopolymeren an Substraten durch einfaches Lufttrocknen an dem Substrat. Für das Ziel der vorliegenden Erfindung bedeutet "unmodifiziertes Biopolymer" natives Biopolymer, und "modifiziertes Biopolymer" bedeutet ein Biopolymer mit eingeführten funktionellen Gruppen. Zum Beispiel kann ein modifiziertes Biopolymer biotinylierte oder aminierte DNA sein.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Biopolymer an einem Substrat durch Kontaktieren des Biopolymers mit dem Substrat unter einer Bedingung immobilisiert, welche für eine direkte Adsorption des Biopolymers an das Substrat ausreichend ist. Eine Bedingung ist ausreichend, wenn sie gestattet, dass das Biopolymer an der Oberfläche des Substrats in einer stabilen Weise adsorbiert wird. Ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass unter den erfindungsgemäßen Bedingungen Biopolymere durch ionische und hydrophobe Interaktion an ein Substrat adsorbiert werden können.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist es nicht entscheidend, welches besondere Verfahren verwendet wird, um den Schritt des Kontaktierens des Biopolymers mit dem Substrat durchzuführen. In Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Ausführungen kann der Kontaktierungsschritt durch Strahldrucken, Fest- oder Offenkapillarvorrichtungskontaktdrucken, Mikrofluidkanaldrucken, Siebdrucken und Drucken unter Verwendung von Vorrichtungen auf Basis von elektrochemischen oder elektromagnetischen Kräften durchgeführt werden. Zum Beispiel können thermische Tintenstrahldrucktechniken, die kommerziell verfügbare Strahldrucker verwenden, und piezoelektrische Mikrostrahldrucktechniken, wie in dem U.S. Patent Nr. 4,877,745 beschrieben, verwendet werden, um Polynucleotide auf den aminierten Substraten abzubilden. Ein Biomek High Density Replicating Tool (HDRT) (Beckman Coulter, CA) kann auch für ein automatisches Rasterbilden verwendet werden. Alternativ kann der Kontaktierungsschritt durch Abbilden der Biopolymere auf dem aminierten Substrat von Hand durchgeführt werden. Beispiele von Abbilden von Hand schließen Abbilden von Hand mit einer Pipettierhilfe ein. Es sollte verstanden werden, dass das erfindungsgemäße aminierte Substrat durch alle Verfahren Biopolymeren exponiert werden kann, solange die Biopolymere in direkten Kontakt mit dem Substrat gebracht werden.
In Übereinstimmung mit erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann der Schritt des Bereitstellens des Biopolymers Bereitstellen einer Lösung des Biopolymers einschließen. Der Schritt des Kontaktierens des Biopolymers mit aminiertem Substrat kann einschließen:

Die Lösung des Biopolymers kann irgendeine Lösung sein, die das Biopolymer an die Oberfläche des Substrats abgibt. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel ein wässriger Puffer mit einem pH von ungefähr 4 bis ungefähr 13. In einer Ausführungsform ist das Biopolymer ein Polynucleotid, und eine Lösung des Polynucleotids in 50 mM Salzbicarbonat, pH 9, wird auf dem aminierten Substrat abgebildet bzw. auf das aminierte Substrat gespottet.
Die Konzentration von Biopolymeren, die in der wässrigen Lösung enthalten sind, kann in Abhängigkeit des Typus eines Moleküls, der Molekülgröße, der Molekülstruktur und anderer Faktoren, welche die Lösungsfähigkeit der Moleküle beeinflussen können, variieren. Vorzugsweise reicht die Menge der Biopolymere, die auf das Substrat angewendet werden, von ungefähr 10^–20 bis ungefähr 10^–14 Mol. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform das Biopolymer ein Polynucleotid, und die Menge des Polynucleotids, die auf das Substrat angewendet wird, beträgt ungefähr 10^–18 Mol. Die Größe des Biopolymerlösungsaliquots ist nicht entscheidend, solange es eine ausreichende Menge des Biopolymers bereitstellt. Folglich kann die Größe der Aliquote, die auf das aminierte Substrat angewendet werden, in Abhängigkeit von der Konzentration des Biopolymers in der Lösung und den Assayanforderungen variieren. Zum Beispiel kann das Aliquot von ungefähr 0,1 nl bis ungefähr 500 nl betragen. In einer Ausführungsform ist das Biopolymer ein Polynucleotid, und Aliquote von ungefähr 10 nl der 1 nM Polynucleotidlösungen werden an dem aminierten Substrat platziert.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird der Lufttrocknungsschritt für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, eine Adsorption der Biopolymerlösung zu gestatten, durchgeführt. Die Länge der Lufttrocknungszeit hängt von dem Volumen der Aliquote, die auf das Substrat angewendet werden, der Raumtemperatur und der Feuchtigkeit ab. Für Mikro- und Nanoliteraliquote kann der Lufttrocknungsschritt von ungefähr 5 bis ungefähr 60 Minuten dauern. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform 10 nl Aliquote an der Oberfläche das aminierten Substrats platziert und bei 22°C für eine Stunde oder für ungefähr fünfzehn Minuten bei 35°C getrocknet.
Wie oben erwähnt, benötigen viele Anwendungen zum Verwenden immobilisierter Biopolymere Biopolymere, die an stellenspezifischen Orten an eine Substratoberfläche immobilisiert sind. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Biopolymeren an der Oberfläche des aminierten Polypropylensubstrats in einer Matrix platziert und adsorbiert werden. Um geordnete Matrices von Biopolymeren zu präparieren, wobei jedes Biopolymer an stellenspezifischen Orten lokalisiert ist, einschließlich Raster und 1 × n Matrices von immobilisierten Biopolymeren, wird eine vorausgewählte Stelle an der Oberfläche des Substrats einer Lösung des gewünschten Biopolymers exponiert. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann dies von Hand durch Anwenden eines Aliquots einer Biopolymerlösung auf einen vorausgewählten Ort an dem Substrat durchgeführt werden. Alternativ können thermische Tintenstrahldrucktechniken, die kommerziell verfügbare Strahldrucker verwenden, und piezoelektrische Mikrostrahldrucktechniken, wie beschrieben in dem U.S. Pat. Nr. 4,877,745, verwendet werden, um ausgewählte Substratoberflächenstellen mit ausgewählten Biopolymeren zu spotten.
Eine große Vielfalt von Matrixformaten kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Ein besonders nützliches Format ist eine lineare Matrix aus Nucleinsäuresonden, worauf im Stand der Technik allgemein als Tauchstäbchen Bezug genommen wird. Ein anderes geeignetes Format umfasst ein zweidimensionales Muster von diskreten Zellen. Natürlich könnte vom Fachmann leicht erkannt werden, dass andere Matrixformate zur erfindungsgemäßen Verwendung gleich gut geeignet sein würden.
Die erfindungsgemäße Matrix kann ein Teil einer Vielfalt von Vorrichtungen, wie Mikrotiterplatten, Teströhrchen, anorganische Blätter oder Tauchstäbchen sein. Wenn zum Beispiel das Substrat ein Faden ist, können ein oder mehrere solcher Fäden an einer Kunststoff Tauchstäbchentypusvorrichtung befestigt sein. Wenn das Substrat in Form einer Membran vorliegt, kann es an Glasträgern befestigt sein. Die besondere Vorrichtung ist an sich unwichtig, solange das Substrat sicher an der Vorrichtung befestigt ist ohne das funktionelle Verhalten des Substrats oder jeglichem adsorbierten Biopolymer zu beeinflussen. Die Vorrichtung sollte auch gegenüber jeglichen Materialien, in welche die Vorrichtung eingeführt wird, stabil sein (z.B. klinische Proben).
Das Verfahren zur Herstellung eines Assaygegenstands kann ferner einen Schritt des Exponierens des Assaygegenstands einem Reagenz, wie Ammoniumhydroxid, Ethanol oder Protein einschließen. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Ethanol für Nucleinsäurematrices verwendet, und Casein wird für Proteinmatrices verwendet.
Die direkte Adsorption von Biopolmeren an aminierte Polypropylensubstrate ist zur Verwendung in der Herstellung von Gensensoren und anderen Matrix basierten Systemen, wie differenziellen Genexpressionsmikromatrices, gut geeignet. Ein aminiertes Polypropylensubstrat mit den erfindungsgemäßen adsorbierten Biopolymeren kann auch als eine Vorrichtung zum Durchführen eines Ligandenbindungsassays oder zum Durchführen eines Hybridisierungsassays durch entweder reverse Hybridisierung (Sonden angeheftet) oder Southern Blot (Target angeheftet) verwendet werden. Eine solche Vorrichtung kann auch in einem Immunassay verwendet werden.
Dementsprechend stellt ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines Targetbiopolymers, welches in einer Probe enthalten ist, bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(a) Bereitstellen eines aminierten Substrats;
(b) Bereitstellen eines Sondenbiopolymers, welches einen Komplex mit dem Targetbiopolymer bilden kann;
(c) Kontaktieren von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer mit einer Oberfläche des aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte Adsorption von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer an der Substratoberfläche geeignet ist, um einen Sondenassaygegenstand oder einen Targetassaygegenstand zu bilden;
(d) Kontaktieren des Sondenassaygegenstands mit dem Targetbiopolymer oder Kontaktieren des Targetassaygegenstands mit dem Sondenbiopolymer unter einer Bedingung, welche die Bildung eines Komplexes, umfassend die Sonden und die Targetbiopolymere, gestattet; und
(e) Detektieren und Bestimmen der Anwesenheit des Komplexes als eine Messung der Anwesenheit oder der Menge des Targetbiopolymers, welches in der Probe enthalten ist.

Für den Zweck der vorliegenden Erfindung erkennt und bindet das Sondenbiopolymer an das Targetbiopolymer, wobei ein Sonden-Targetkomplex gebildet wird. Sowohl die Sonde als auch das Targetbiopolymer können aus einer Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden, Proteinen und deren Analoga, ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel das Target ein Polynucleotid ist, kann die Sonde ein Polynucleotid, das komplementär zu dem Target-Polynucleotid ist, umfassen (siehe 1). Wenn das Target ein Rezeptor oder ein Ligand ist, kann die Sonde einen Liganden oder einen Rezeptor umfassen, der entsprechend den Targetrezeptor oder -liganden erkennt und an ihn bindet. Wenn das Target ein Antigen ist, kann die Sonde einen Antikörper umfassen, der das Antigen erkennt oder vice versa (siehe 2).
Entweder das Target oder die Sonde kann direkt an das Substrat adsorbiert werden. Zum Beispiel werden in den Southern Blot oder Northern Blot Anwendungen Targets an das Substrat adsorbiert. Dann wird das Substrat mit den adsorbierten Targets mit den Sonden, die vorzugsweise markiert sind, in Kontakt gebracht, um die Targetbiopolymere zu detektieren. Im Gegensatz dazu werden in Ligandenbindungsassays oder Affinitätsreinigungsassays zuerst die Sonden an das Substrat gebunden. Dann wird ein Target, das in einer Probenlösung enthalten ist, mit den Sonden, die an das Substrat adsorbiert sind, in Kontakt gebracht.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist eine Adsorptionsbedingung ausreichend, wenn die Sonde oder das Target an das Substrat adsorbieren kann. Eine solche Bedingung kann in Abhängigkeit des Typus des Biopolymers und dessen Größe variieren. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform, die im Detail in dem folgenden Beispiel 1 beschrieben wird, 10 nl Aliquote von cDNA Lösungen auf ein aminiertes Polypropylensubstrat angewendet. Nach der Anwendung der cDNA wird das Substrat bei 35°C für 15 Minuten getrocknet. Dann wird das Substrat entweder in Ethanol für eine Stunde oder in Ammoniumhydroxid für 15 Minuten getränkt, um locker gebundene Nucleinsäure zu entfernen. Schließlich werden die Träger kurz mit Wasser gespült und luftgetrocknet. Der Fachmann kann leicht die geeigneten Bedingungen zum Adsorbieren anderer Sonden oder Targets angesichts der erfindungsgemäßen Lehre bestimmen. Wie oben diskutiert kann eine Vielfalt von Substraten verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch werden aminierte Polypropylensubstrate verwendet.
Das Kontaktieren der Sonden mit den Targets (oder Hybridisierung) wird unter Bedingungen, welche das Bilden von stabilen Komplexen zwischen Sonden und Targets gestatten, durchgeführt. Wenn zum Beispiel Target-Polynucleotide mit Sonden-Polynucleotiden, die an ein aminiertes Polypropylensubstrat adsorbiert sind, in Kontakt gebracht werden, verbinden sich komplementäre Regionen an den Target- und den Sonden-Polynucleotiden wieder, wobei ein Sonden-Targetkomplex gebildet wird. Die Auswahl solcher Bedingungen liegt innerhalb des Könnens des Fachmanns und schließt solche ein, bei denen ein niedriger, im Wesentlichen Null, Prozentsatz von nicht passenden Hybriden gebildet wird. Die genauen Bedingungen hängen jedoch von der erwünschten Selektivität und Sensitivität des Assays ab. Solche Bedingungen schließen die Hybridisierungstemperatur, die ionische Stärke und Viskosität des Puffers und die entsprechenden Konzentrationen der Target- bzw. der Sondenbiomoleküle ein. Die Hybridisierungsbedingungen können anfänglich ausgewählt werden, dass sie jenen entsprechen, von denen bekannt ist, dass sie sich in Standardverfahren zur Hybridisierung an Filter eignen, und dann zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen aminierten Polypropylensubstraten optimiert werden. Die Bedingungen, die zur Hybridisierung von einem Typus eines Targetmaterials geeignet sind, würden zur Verwendung mit anderen Targetmaterialien entsprechend angeglichen werden.
Zum Beispiel werden in bestimmten Ausführungsformen die Target-Polynucleotide an die Sonden-Polynucleotide bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 20°C bis ungefähr 70°C für einen Zeitraum von ungefähr 1 Stunde bis ungefähr 24 Stunden in einem geeigneten Hybridisierungspuffer hybridisiert. Geeignete Hybridisierungspuffer zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung enthalten allgemein eine hohe Konzentration an Salz. Ein typischer Hybridisierungspuffer enthält im Bereich von ungefähr 2× bis ungefähr 6 × SSC und ungefähr 0,01% bis ungefähr 0,5% SDS bei pH 7–8. Wenn der Sonden/Targetkomplex gebildet ist, wird das Substrat unter Bedingungen gewaschen, die geeignet sind, alle nicht spezifisch gebundene Target- oder Sondenpolymere im Wesentlichen zu entfernen. Vorzugsweise wird das Waschen bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 20°C–70°C mit einem Puffer, der ungefähr 0,1–6 × SSC und 0,01–0,1% SDS enthält, durchgeführt. Die am meisten bevorzugten Waschbedingungen für Polynucleotide schließen derzeit eine Temperatur, welche dieselbe wie die Hybridisierungstemperatur ist, und einen Puffer, der 2 × SSC und 0,01% SDS enthält, ein. Wie vorher angemerkt, würde es für den Fachmann eine Routineangelegenheit sein, die Kontaktierungs-(Hybridisierungs-)bedingungen für irgendeine gegebene Kombination von Target- und Sondenbiopolymeren zu optimieren.
In Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Ausführungsformen können entweder die erfindungsgemäßen Targets oder Sonden mit einem Reporter markiert werden. Detektionsfähigkeit kann durch solche Merkmale, wie Farbwechsel, Lumineszenz, Fluoreszenz oder Radioaktivität bereitgestellt werden. Beispiele von Reportern schließen Farbstoffe, chemilumineszierende Verbindungen, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, Metallkomplexe, magnetische Teilchen, Biotin, Haptene, Radiofrequenztransmitter und Radiolumineszenzverbindungen ein. Der Fachmann kann leicht den Typus eines zu verwenden Reporters bestimmen, sobald der Typus der Target- oder Sondenbiopolymere bestimmt ist.
Das Markierungsverfahren kann vor der Analyse (direktes Markieren) oder nach der Hybridisierung (indirektes Markieren) stattfinden. Ein Beispiel von indirektem Markieren würde die Biotinylierung eines Target-Polynucleotids, dessen Hybridisieren mit einer Sonde und Reagieren des Target-Sondenkomplexes mit einem Streptavidin-Alkaliphosphatasekonjugat bzw. Streptavidin-alkalische Phosphatasekonjugat sein. Die Biotinanteile, die nach der Hybridisierung mit Sonden-Polynucleotiden zurückgehalten werden, binden an ein Streptavidin-alkalische Phosphatasekonjugat, das dann auf ein chromogenes Substrat, wie Enzymmarkiertes fluoreszierendes (engl.: Enzyme Labeled Fluorescent (ELF)) Reagenz, wirkt.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung können dieselben oder unterschiedliche Biopolymere an das Substrat angeheftet werden. Wenn die Biopolymere unterschiedlich sind, werden sie vorzugsweise an isolierten Bereichen des Substrats lokalisiert, um Matrices zu bilden. Zum Beispiel kann ein Substrat eine Mikroplatte sein. Unterschiedliche Biopolymere können innerhalb unterschiedlicher Vertiefungen der Mikroplatte adsorbiert werden, um Matrices zu bilden. In Übereinstimmung mit einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das Substrat ein Träger sein, und unterschiedliche Biopolymere werden an unterschiedlichen Bereichen des Trägers adsorbiert, um ein Matrix zu bilden.
Das durch eine Matrix hergestellte Signal kann durch das bloße Auge oder mittels einer speziell gestalteten Ausstattung, wie eines Konfokalmatrixlesers, detektiert werden. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform ein fluoreszierendes Signal mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtungs-(engl.: charged coupled device (CCD)) Kamera aufgezeichnet. Es würde durch den Fachmann erkannt werden, dass die Auswahl eines besonderen Verfahrens, das verwendet wird, um das Signal zu detektieren und quantifizieren, nicht entscheidend für diese Erfindung ist. Im Wesentlichen kann irgendein Detektionsverfahren verwendet werden, solange es konsistente und genaue Ergebnisse bereitstellt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Assaygegenstand zum Detektieren von Targetbiopolymeren bereit. Der erfindungsgemäße Assaygegenstand umfasst ein Substrat und ein Biopolymer, das direkt an der Oberfläche des Substrats adsorbiert ist.
Das Substrat kann aus einer Vielfalt von Materialien hergestellt werden. In einer Ausführungsform wird das Substrat aus Polypropylen oder Polyethylen hergestellt. Polypropylen und Polyethylen sind organische Materialien, die oberflächenaktiviert sein können, aber andererseits unter strengen chemischen Bedingungen chemisch inert sind. Polypropylen kann in sehr korrosiven Umgebungen verwendet werden. Zum Beispiel hat Polypropylen eine hohe chemische Beständigkeit gegenüber einer Vielfalt von Mineralsäuren (z.B. Salzsäure), organischen Säuren (z.B. Ameisensäure, Essigsäure), Basen (z.B. Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid), Salzen (z.B. Natriumchlorid), Oxidationsmitteln (z.B. Peressigsäure, Iodlösungen) und organischen Lösungsmitteln (z.B. Aceton, Ethylalkohol, Acetonitril oder Dichlormethan). Zusätzlich sind Polypropylen und Polyethylen hydrophob und stellen einen geringen Fluoreszenzhintergrund bereit. Aminogruppen können durch Verwenden einer Plasmaentladung in einem Ammoniak oder einem organisches Amin enthaltenden Gases, wie oben beschrieben, auf die Polypropylen- und Polyethylenoberfläche eingeführt werden.
Der erfindungsgemäße Assaygegenstand kann in einer Vielfalt von Gestalten, die Schäume, Filamente, Fäden, Blätter, Filme, Träger, Gele, Membranen, Kügelchen oder Platten einschließen, gestaltet oder anderweitig geformt werden.
Das Biopolymer kann aus einer Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden, Proteinen und Analoga davon, ausgewählt werden. Ein Sondenbiopolymer kann ein Polynucleotid, wie eine amplifizierte DNA, cDNA, RNA oder Protein, sein. Ein Targetbiopolymer kann amplifizierte DNA, cDNA, Oligonucleotide, PNA, RNA oder Protein sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat aus einem aminierten Polypropylensubstrat in einer Form eines Trägers hergestellt, und das adsorbierte Biopolymer ist ein Polynucleotid. Polynucleotide von unterschiedlichen Längen können direkt an das aminierte Polypropylensubstrat adsorbiert werden. In Übereinstimmung mit erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die Länge der adsorbierten Polynucleotide von ungefähr 20 bp bis ungefähr 10 kb betragen. Um eine höhere Effizienz der Adsorption zu erreichen, beträgt die Länge der adsorbierten Polynucleotide vorzugsweise zwischen ungefähr 100 bp und ungefähr 10 kb.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Testkit zur Detektion eines Targetbiopolymers, das in einer Probe enthalten ist, bereit. Das Kit umfasst ein aminiertes Polypropylensubstrat und ein Sondenbiopolymer, das direkt an der Oberfläche des Substrats adsorbiert ist. Wenn das Sondenpolymer mit dem Targetbiopolymer in Kontakt gebracht wird, bilden sie einen Komplex, der durch Verwenden von Reportern und Signaldetektionsvorrichtungen detektiert werden kann. Das Kit kann auch einen Reporter zum Erzeugen eines Signals, das eine Bildung des Komplexes anzeigt, einschließen. Vorzugsweise sind eine Vielzahl derselben oder unterschiedlicher Biopolymere an das Substrat angeheftet, wobei eine Matrix gebildet wird.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und wie es oben beschrieben ist, können dieselben oder unterschiedliche Biopolymere an die aminierten Polypropylensubstrate geheftet werden, um eine Matrix zu bilden.
Die Erfindung kann besser verstanden werden unter Bezugnahme auf das beigefügte Beispiel, das nur Darstellungszwecken dient und nicht in irgendeiner Hinsicht als den Schutzbereich der Erfindung, der in den hier angehängten Patentansprüchen definiert ist, beschränkend ausgelegt werden soll. Während die beschriebenen Verfahren in dem folgenden Beispiel für jene, die verwendet werden könnten, typisch sind, können andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, alternativ verwendet werden. In der Tat kann sich der Fachmann leicht weitere Ausführungsformen, die auf der Lehre hier beruhen, ohne übermäßiges Experimentieren vorstellen und herstellen.
Beispiel 1:
Präparation von cDNA Matrices
Polypropylenträger wurden durch eine Radiofrequenzentladung in Ammoniakgas oberflächenaminiert, wie in Coassin et al. (U.S. Pat. Nr. 5,554,501, übertragen auf den Übertragungsempfänger der vorliegenden Erfindung) beschrieben. Unmodifizierte cDNA von Aktin, β-Mikroglobulin, G3PDH, p53 und TNF-α Gene wurden jeweils in einer Endkonzentration von 1 nM in 50 mM Salzbicarbonat Puffer, pH 9, präpariert. Ein Biomek 2000^TM Robotersystem (Beckman Coulter, Inc., CA), ausgestattet mit einem 384-pin HDRT System (Beckman Coulter, Inc., CA), wurde verwendet, um 10 nl Aliquote von cDNA Lösungen auf die aminierten Polypropylenträger anzuwenden. Eine Reihe von 5-(Biotinamid)pentylamin (BAPA) Markierungen (Pierce Chemical, IL) wurde auch an beiden Enden jedes Trägers gedruckt, wodurch die cDNA flankiert wurde. BAPA, welches Streptavidin-Enzymkonjugate unabhängig von einer Hybridisierung bindet, dient als eine interne Kontrolle für die Assayrobustheit. Nach der Anwendung der cDNA und BAPA Markierungen, wurden die Träger bei 35°C für 15 Minuten getrocknet. Dann wur den die Träger entweder in Ethanol für eine Stunde oder in Ammoniumhydroxid für 15 Minuten getränkt, um locker gebundene Nucleinsäure zu entfernen. Dann wurden die Träger kurz mit Wasser gespült und luftgetrocknet. In einem Fall wurde ein Ethanol gequenschter Träger ferner in 1 M NaOH für 15 Minuten gespült. Die Träger wurden bei –20°C über Nacht aufbewahrt.
Hybridisierung
Zur Hybridisierung wurde jeder Träger auf Raumtemperatur gebracht und für 15 Minuten in 0,15 M NaCl und 0,5 M NaOH Lösung denaturiert. Eine Mischung Biotin markierter cDNA Targets von Aktin, β-Mikroglobulin, G3PDH und p53 wurde in einer Endkonzentration von 0,5 nM angewendet, dem folgen Denaturierung und die Zugabe von Hybridisierungspuffer (2,4 × SSC, 0,016% SDS, 0,28 M TRIS, 0,028 NaCl, pH 7,5). Das TNF-α Target wurde nicht zugegeben, so dass unspezifische Hybridisierung an die TNF-α Sonde gemessen werden konnte. Die Hybridisierung wurde für 1 Stunde bei 60°C fortgesetzt, gefolgt durch eine Stringenzspülung in 2 × SSC, 0,01% SDS bei derselben Temperatur. Die Träger wurden mit Streptavidin-alkalische Phosphatasekonjugat und ELF-Reagenz (fluoreszierendes Substrat für alkalische Phosphatase) für 30 min. inkubiert. Nach der Inkubation wurde das fluoreszierende Signalbild durch Verwenden einer CCD-Kamera aufgezeichnet.
Ergebnisse
Ein Matrix aus cDNA und BAPA Markierungen wurde erfolgreich an den aminierten Polypropylenträger adsorbiert, wie durch Hybridisierung einer Mischung der entsprechenden cDNAs bestimmt wurde (1). 1 zeigt Biomek HDRT Drucken von cDNA und BAPA Markierungen auf aminierte Polypropylenträger. Das TNF-α Signal war abwesend (Negativkontrolle), während das verbleibende cDNA Hybridisierungssignal ungefähr bei derselben Intensität blieb wie die Signale der BAPA Markierungen (Positivkontrolle). Das Signal der Ammoniumhydroxid gequenschten Träger wurde in der Intensität über das der Ethanol gequenschten Träger signifikant reduziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Ethanol- vs. Ethanol-NaOH vorbehandelten Trägern. Dieses Beispiel stellt dar, dass Plasma aminierte Polypropylenträger zu direkter und stabiler Adsorption von cDNA ohne chemische Vernetzung fähig sind.
Somit sind die erfindungsgemäßen aminierten Polypropylenträger mit direkt adsorbierten Biopolymeren und das Verfahren zu ihrer Verwendung in der Detektion von Targetbiopolymeren gut angepasst, um all die Zwecke und die Ziele, die oben dargelegt wurden, zusammen mit anderen Vorteilen, die dem System eigen sind, zu erreichen. Die vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ohne von ihren wesentlichen Merkmalen abzuweichen, durchgeführt werden. Die beschriebene Ausführungsform ist in allen Beziehungen nur als darstellend und nicht als beschränkend zu erachten. Der Schutzbereich der Erfindung wird deshalb durch die angehängten Patentansprüche statt durch die vorangegangene Beschreibung angegeben. Alle Änderungen, die in die Bedeutung und den Bereich der Äquivalenz der Patentansprüche fallen, werden in ihren Schutzbereich eingeschlossen.
Beispiel 2:
Präparation einer Proteinmatrix
Anheftung von humanem IgG: Ein Polypropylenfilm wurde durch eine Radiofrequenzentladung oberflächenaminiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Verdünntes humanes IgG (Pierce Chemicals, Kat. # 31877, 28 mg/ml) wird zu 1 mg/ml in Natriumbicarbonat (50 mM, pH 9) und 4% Natriumsulfat gelagert. Einundzwanzig 0,5 μl Spots wurden auf einen 2 cm breiten und 8 cm langen Polypropylenstreifen pipettiert. Die Adsorption wurde für 60 min. bei 25°C fortzugesetzt. Der Film wurde mit Caseinlösung (1 mg/ml in 50 mM Natriumcarbonat, 0,15 M NaCl pH 9) für 60 min. bei 25°C gespült und dann zweimal in deionisiertem Wasser und kurz mit 1 × TBS, 0,02% Tween-20, pH 7,4 gespült. Der Streifen wurde dann für den Bindungsassay verwendet.
Konjugation mit Ziege Anti-human IgG alkalische Phosphatase: Die 200 μl der verdünnten Ziege Anti-human IgG alkalische Phosphatase (Pierce Chemicals, Kat. # 31310) Lösung 1:1000 in Blockierungspuffer (1 × TBS, 1 mg/ml Casein, 0,02% Tween-20 pH 7,4) wurden in eine Petri Schale pipettiert, und der oben gespottete Polypropylenstreifen wurde, mit der gespotteten Seite des Polypropylenstreifens nach unten auf die Oberfläche der Lösung, auf ihr platziert und wurde für 60 min. bei 25°C inkubiert. Der Polypropylenstreifen wurde dann 4 Mal in 20 ml 1 × TBS, 0,02% Tween-20, pH 7,4 gespült.
ELF-Detektion: Um ein Fluoreszenzsignal zu detektieren, wurde das Enzymsubstrat, ELF, durch Mischen von Bestandteilen A und B (1:25) (Molecular Probes, Eugene, OR) präpariert, und 200 μl Lösung wurde für jeden Streifen, wie oben beschrieben, verwendet. Nach 30 min. Inkubation bei 22°C wurde der Streifen einmal in deionisiertes Wasser getaucht. Die Signale wurden durch Verwenden von 365 nm UV Licht und einer CCD Kamera mit einem 520 nm Filter, wie in 2 gezeigt, detektiert.
Ergebnisse
Eine Matrix von IgG wurde erfolgreich an den aminierten Polypropylenfilm adsorbiert, wie in 2 gezeigt.
Somit sind die erfindungsgemäßen aminierten Polypropylenträger mit direkt adsorbierten Biopolymeren und das Verfahren ihrer Verwendung in der Detektion von Targetbiopolymeren gut angepasst, um all die Zwecke und Ziele, die oben dargelegt wurden, zusammen mit anderen Vorteilen, die dem System eigen sind, zu erreichen. Die vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ohne von ihren wesentlichen Merkmalen abzuweichen, ausgeführt werden. Die beschriebene Ausführungsform ist in allen Beziehungen nur als darstellend und nicht als beschränkend zu erachten. Der Schutzbereich der Erfindung wird deshalb durch die angehängten Patentansprüche statt durch die vorangegangene Be schreibung angegeben. Alle Änderungen, die in die Bedeutung und den Bereich der Äquivalenz der Patentansprüche fallen, werden in ihren Schutzbereich eingeschlossen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Matrixgegenstands zur Verwendung in der Biopolymerdetektion, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen mindestens einer Biopolymerlösung, (b) Bereitstellen eines Substrats mit einer Oberfläche mit mindestens einer Funktionalität, ausgewählt aus Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Thiol und deren Derivaten, und (c) Bilden des Matrixgegenstands durch Kontaktieren von Aliquoten der Biopolymerlösung mit diskreten, isolierten Stellen an der Oberfläche des Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte Adsorption des Biopolymers an den Stellen an der Oberfläche des Substrats ausreichend ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Biopolymer vor dem Kontaktierungsschritt unmodifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Biopolymer vor dem Kontaktierungsschritt modifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus der Gruppe, bestehend aus organischen Polymeren, deren Analoga, Blends und Copolymeren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polycarbonaten, Polyethylenen, Polypropylenen, Polymethacrylaten, Polymethylpentenen, Polysulfonen, Polytetrafluorethylenen und Polyvinylidendifluoriden, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Substrat aminiertes Polypropylen ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Substrat in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Schäumen, Filamenten, Fäden, Blättern, Filmen, Trägern, Gelen, Membranen, Kügelchen oder Platten, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kontaktierungsschritt durch eine Technik, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Strahldrucken, Fest- oder Offenkapillarvorrichtungskontaktdrucken, Mikrofluidkanaldrucken, Siebdrucken, Drucken unter Verwendung von Vorrichtungen auf Basis von elektrochemischen oder elektromagnetischen Kräften und Abbilden von Hand, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Biopolymer aus der Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden, Proteinen und Analoga davon, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Biopolymer ein Polynucleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Polynucleotid cDNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Kontaktierens ferner das Lufttrocknen des Substrats zum direkten Adsorbieren der Biopolymerlösung an der Oberfläche des Substrats umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Substrat ein Amino-modifiziertes Substrat ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Amino-modifizierte Substrat Amino-polypropylen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge des Biopolymers, welches in den Aliquoten enthalten ist, in einem Bereich von etwa 10^–20 bis etwa 10^–14 Mol liegt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Biopolymer ein Polynucleotid ist und die Menge des Polynucleotids etwa 10^–18 Mol beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aliquot von etwa 0,1 nL bis etwa 500 nL beträgt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Biopolymer ein Polynucleotid ist und das Aliquot etwa 10 nL beträgt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Lufttrocknungsschritt für einen Zeitraum in einem Bereich von etwa 5 Minuten bis etwa 60 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Lufttrocknungsschritt für einen Zeitraum von etwa 15 Minuten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Aliquote einer Vielzahl unterschiedlicher Biopolymere mit den Stellen an der Oberfläche des Substrats in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Substrat ein Amino-modifiziertes Substrat ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Amino-modifizierte Substrat Aminopolypropylen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend den Schritt des Exponierens des Assaygegenstands einem Reagens.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Reagens aus der Gruppe, bestehend aus: Ammoniumhydroxid, Ethanol und Protein, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Protein Casein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus Polypropylen oder Polyethylen hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 26, ferner umfassend den Schritt des Modifizierens der Substratoberfläche vor dem Kontaktierungsschritt, wobei der Schritt des Modifizierens des Substrats das Einführen einer Funktionalität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Thiol und deren Derivaten, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Funktionalität eine Aminogruppe ist.
Verfahren zum Detektieren eines Targetbiopolymers, welches in einer Probe enthalten ist, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Substrats mit einer Oberfläche mit mindestens einer Funktionalität, ausgewählt aus Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Thiol und deren Derivaten, (b) Bereitstellen eines Sondenbiopolymers, welches einen Komplex mit dem Targetbiopolymer bilden kann, (c) Kontaktieren von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer mit einer Oberfläche des Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte Adsorption von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer an der Substratoberfläche geeignet ist, um einen Sondenassaygegenstand oder einen Targetassaygegenstand zu bilden, (d) Kontaktieren des Sondenassaygegenstands mit dem Targetbiopolymer oder Kontaktieren des Targetassaygegenstands mit dem Sondenbiopolymer unter einer Bedingung, welche die Bildung eines Komplexes, umfassend die Sonden- und die Targetbiopolymere, gestattet, und (e) Detektieren und Bestimmen der Anwesenheit des Komplexes als eine Messung der Anwesenheit oder der Menge des Targetbiopolymers, welches in der Probe enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Substrat ein Amino-modifiziertes Substrat ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Amino-modifizierte Substrat ein Aminopolypropylen ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei jedes von den Target- und den Sondenpolymere aus der Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden, Proteinen und Analoga davon, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Targetbiopolymer ein Target-Polynucleotid ist und das Sondenbiopolymer ein Polynucleotid ist, welches komplementär zu dem Target-Polynucleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Komplex ferner einen Reporter, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Farbstoffen, chemilumineszierenden Verbindungen, Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, Metallkomplexen, magnetischen Teilchen, Biotin, Haptenen, Radiofrequenztransmittern und Radiolumineszenzverbindungen, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Biopolymer ein Polynucleotid ist, der Reporter Biotin ist, und das Verfahren nach Anspruch 29 ferner einen Schritt des Inkubierens des Komplexes, welcher an der Oberfläche des Substrats mit Streptavidin-Alkaliphosphatase und einem ELF-Reagenz zum Entwickeln eines Fluoreszenzsignals vor dem Detektionsschritt adsorbiert ist, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Substrat ein Amino-modifiziertes Substrat ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Amino-modifizierte Substrat Amino polypropylen ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die gleichen oder unterschiedlichen Sonden- oder Targetbiopolymere an diskreten, isolierten Bereichen an der Oberfläche des aminierten Polypropylensubstrats adsorbiert sind, um eine Matrix zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei der Detektionsschritt das Aufzeichnen des Signals mit einem Konfokalmatrixleser umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Signal eine Fluoreszenz ist und der Konfokalmatrixleser eine CCD-Kamera ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Substrat aus Polypropylen oder Polyethylen hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 41, ferner umfassend einen Schritt des Aminierens der Oberfläche des Substrats vor dem Schritt des Kontaktierens.
Matrixgegenstand, umfassend: ein Substrat mit einer Oberfläche mit mindestens einer Funktionalität, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Thiol und deren Derivaten, und eine Vielzahl von gleichen oder unterschiedlichen Biopolymeren, die direkt an diskreten, isolierten Stellen an der Oberfläche des Substrats adsorbiert sind, wodurch eine Matrix gebildet wird.
Assaygegenstand nach Anspruch 43, wobei das Substrat in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Schäumen, Filamenten, Fäden, Blättern, Filmen, Trägern, Gelen, Membranen, Kügelchen, Platten und planaren Vorrichtungen mit diskreten isolierten Bereichen in Form von Vertiefungen, Durchbrüchen, Sockeln, hydrophoben oder hydrophilen Stoffen bzw. Stücken oder ausgestanzten Haft-Reservoirs, ausgewählt ist.
Assaygegenstand nach Anspruch 43, wobei das Biopolymer aus einer Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden, Proteinen und Analoga davon, ausgewählt ist.
Assaygegenstand nach Anspruch 45, wobei das Biopolymer ein Protein oder ein Polynucleotid ist.
Assaygegenstand nach Anspruch 45, wobei das Substrat aus Polypropylen oder Polyethylen hergestellt ist.
Assaygegenstand nach Anspruch 47, wobei das Substrat aminiert ist.
Assaygegenstand nach Anspruch 47, wobei das Biopolymer ein Polynucleotid ist und das Substrat in einer Form eines Trägers vorliegt.
Assaygegenstand nach Anspruch 49, wobei die Länge des Polynucleotids in einem Bereich von etwa 20 bp bis etwa 10 kb liegt.
Testkit zum Detektieren mindestens eines Targetbiopolymers, welches in einer Probe enthalten ist, wobei das Kit: ein aminiertes Polypropylensubstrat mit einer Oberfläche und eine Vielzahl von Sondenbiopolymeren, die direkt an diskreten, isolierten Stellen an der Oberfläche des Substrats adsorbiert sind, wobei jedes Sondenbiopolymer einen Komplex mit dem Targetbiopolymer bildet, umfaßt.
Testkit nach Anspruch 51, ferner umfassend einen Reporter, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Farbstoffen, chemilumineszierenden Verbindungen, Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, Metallkomplexen, magnetischen Teilchen, Biotin, Haptenen, Radiofrequenztransmittern und Radiolumineszenzverbindungen.
Testkit nach Anspruch 51 oder 52 zum Detektieren einer Vielzahl von Targetbiopolymeren, wobei eine Vielzahl von gleichen oder unterschiedlichen Sondenbiopolymeren direkt an diskreten, isolierten Stellen der Substratoberfläche adsorbiert sind, wodurch eine Sondenmatrix gebildet wird, wobei für jedes Targetbiopolymer ein entsprechendes Sondenbiopolymer existiert, welches an der Oberfläche adsorbiert ist, welches einen Komplex mit dem Targetbiopolymer bildet.