DE19902391A1

DE19902391A1 - Verfahren zur reversiblen, ortsspezifischen, hocheffizienten und gleichzeitigen Immobilisierung verschiedenartiger (biologischer) Makromoleküle auf Festphasen

Info

Publication number: DE19902391A1
Application number: DE1999102391
Authority: DE
Inventors: Christof Niemeyer; Larissa Boldt; Dietmar Blohm
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2000-07-27

Description

Aufgabenstellung

Verfahren zur reversiblen, ortsspezifischen, hocheffizienten und gleichzeitigen Immobilisierung verschiedenartiger (biologischer) Makromoleküle auf Festphasen.

Stand der Technik

Die Herstellung von Biosensoren erfordert Oberflächen, die in geordneter Weise mit funktionalen Makromolekülen, häufig biomolekularen Komponenten wie z. B. Antikörper, Enzyme oder Rezeptoren, modifiziert sind. Hierbei sind insbesondere für die Entwicklung miniaturisierter, massiv paralleler Analyseverfahren z. B. im Rahmen der Genom- und Proteomforschung, der biomedizinischen Diagnostik oder der Wirkstoff-Suchforschung Immobilisierungsmethoden notwendig, die es gestatten, lateral mikrostrukturierte Oberflächen außer mit Nucleinsäuren auch mit anderen Makromolekülen zu funktionalisieren. Dabei sind Verfahren der reversiblen Immobilisierung besonders attraktiv, die es ermöglichen, einmal konfigurierte Elemente zu regenerieren um beispielsweise kostenintensive Sensoroberflächen mehrfach nutzen zu können. Bisherige Strategien zur reversiblen Immobilisierung von Proteinen nutzen reversibel chemische Prozesse [Tyagi et al. (1994) Process. Biochem., 29, 443], wie z. B. Chelatisierung von Metallionen [Anspach, et al. (1994) Biotechnol Appl Biochem, 20, 323], die Spaltung von Disulfiden [Batistaviera et al. (1991) Appl. Biochem. Biotech., 31, 175] und Protein-Ligand Wechselwirkungen [Phelps et al. (1994) Biotechnol. Progr., 10, 433], sind jedoch aufgrund mangelnder Spezifität nicht geeignet sind, verschiedene Komponenten gleichzeitig an vorher definierten Orten einer Festphase zu immobilisieren. Die zur Herstellung miniaturisierter Parallelsensoren erforderliche, ortsspezifische Immobilisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen kann auch durch photolithographische Methoden erreicht werden [Rozsnyai et al. (1992) Angew. Chem. int Ed. Engl., 31, 759]. Ein grundsätzliches Problem bei der Herstellung hochgradig funktionalisierter Oberflächen resultiert jedoch aus der geringen physikalisch-chemischen Stabilität vieler biologischer Makromoleküle. Deshalb sind sukzessive Immobilisierungsverfahren, die beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäure-Mikroarrays [Lockhart et al. (1996) Nature Biotechnology, 14, 1675] verwendet werden, nicht geeignet. Stattdessen wird eine Methode benötigt, die es erlaubt, viele verschiedene, empfindliche Makromoleküle in einem einzigen Reaktionsschritt gleichzeitig an spezifischen Stellen einer strukturierten Oberfläche mit hoher Effizienz zu immobilisieren.

Lösung

Dieses Problem wird durch das in Patentanspruch 1 genannte Verfahren gelöst, in dem Nucleinsäuren als immobilisierungsvermittelnde Reagenzien genutzt werden und die zu immobilisierenden Komponenten mit Nucleinsäuren gekoppelt und die Festphasen mit hierzu komplementären Nucleinsäuren funktionalisiert sind. Die Vorteile des Verfahrens liegen darin, daß beliebig viele makromolekulare Komponenten, die mit einer individuellen, immobilisierungsvermittelnden Sequenz verknüpft sind, gemäß Patentanspruch 15 in einem Reaktionsschritt parallel immobilisiert werden können, wenn komplette oder halbfertige DNA-Mikroarrays als Festphase verwendet werden.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erimdung ist in Patentanspruch 11 gegeben, in dem spezielle Nucleinsäure-haltige Adaptermoleküle für die Kopplung der zu immobilisierenden Komponenten mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure verwendet werden. Hierdurch entfallen langwierige, direkte Kopplungsschritte mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure. Stattdessen ist lediglich eine unter schonenden Reaktionsbedingungen mögliche Einführung einer an die Adaptermoleküle bindenden Gruppe durchzuführen.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in Patentanspruch 14 gegeben, in dem BIAcore Sensorchips oder andere Marktprodukte als Festphase verwendet werden. Durch das in Patentanspruch 1 genannte Verfahren wird eine Regenerierbarkeit dieser teuren Marktprodukte möglich, wodurch sie einer mehrfachen Verwendung zugänglich werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Parallele Immobilisierung mehrerer Enzyme

Mehrere, nach bekannten Verfahren für biosensorische Zwecke einsetzbare Enzyme, beispielsweise Lipasen, Dehydrogenasen, Hydrolasen, Phosphatasen oder andere Enzyme werden jeweils mit einer individuellen Nucleinsäure gekoppelt. Die Kopplung erfolgt kovalent mit chemischen Methoden oder nicht-kovalent unter Verwendung von Nucleinsäure-Adaptermolekülen. Die Nucleinsäure-gekoppelten Enzyme werden in einem wäßrigen Puffer gemischt und ein DNA-Mikroarray, der Oberflächen-gebundene, zu den Enzym-Konjugaten komplementäre Nucleinsäure- Fragmente enthält wird in diese Lösung eingelegt. Aufgrund der Ortsspezifität des in Patentanspruch 1 genannten Verfahrens ordnen sich alle Enzym-Komponenten an die durch die Array-Nucleinsäuren festgelegten Positionen auf der Oberfläche. Der so aufgebaute Protein-Array kann für massiv parallele biosensorische Zwecke, beispielsweise dem Nachweis von Umweltgiften, der Überprüfung des Metabolitenspiegels von Lebewesen oder für ähnliche Aufgaben eingesetzt werden.

Beispiel 2 Parallele Immobilisierung mehrerer Bindeproteine

Mehrere, nach bekannten Verfahren für immunologische Zwecke einsetzbare Proteine, beispielsweise Antikörper, Rezeptoren oder andere Bindeproteine werden jeweils mit einer individuellen Nucleinsäure gekoppelt. Die Kopplung erfolgt kovalent mit chemischen Methoden oder nicht-kovalent unter Verwendung von Nucleinsäure-Adaptermolekülen. Die Nucleinsäure-gekoppelten Bindeproteine werden in einem wäßrigen Puffer gemischt und ein DNA-Mikroarray, der Oberflächen-gebundene, zu den Bindeprotein-Konjugaten komplementäre Nucleinsäure-Fragmente enthält wird in diese Lösung eingelegt. Aufgrund der Ortsspezifität des in Patentanspruch 1 genannten Verfahrens ordnen sich alle Bindeprotein-Komponenten an die durch die Array-Nucleinsäuren festgelegten Positionen auf der Oberfläche. Der so aufgebaute Bindeprotein-Array kann für massiv parallele, sensorische Verfahren, beispielsweise in der immunologischen und medizinischen Diagnostik, das Monitoring von Metaboliten oder für ähnliche Zwecke eingesetzt werden.

Beispiel 3 Parallele Immobilisierung von Syntheseenzymen

Mehrere, nach bekannten Verfahren für synthetische Zwecke einsetzbare Enzyme, beispielsweise Lipasen, Dehydrogenasen, Hydrolasen, Phosphatasen, Glycosidasen, Aldolasen oder andere Enzyme werden jeweils mit einer individuellen Nucleinsäure gekoppelt. Die Kopplung erfolgt kovalent mit chemischen Methoden oder nicht-kovalent unter Verwendung von Nucleinsäure- Adaptermolekülen. Die Nucleinsäure-gekoppelten Enzyme werden in einem wäßrigen Puffer gemischt und eine Nucleinsäure-funktionalisierte Festphase, auf der in Feldern oder Kanalstrukturen zu den Enzym-Konjugaten komplementäre Nucleinsäure-Fragmente gebunden sind, wird in diese Lösung eingelegt. Aufgrund der Ortsspezifität des in Patentanspruch 1 genannten Verfahrens ordnen sich alle Enzym-Komponenten an die durch die Array-Nucleinsäuren festgelegten Positionen auf der Oberfläche. Die hierdurch mit Syntheseenzymen funktionalisierte Festphase kann beispielsweise in nach bekannten, z. B. mikrosystemtechnischen Verfahren hergestellten Ezymreaktoren integriert werden und für synthetisch präparative Zwecke, beispielsweise der Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe, Feinchemikalien oder anderer kommerziell interessanter Zwischen- und Endprodukte der präparativen Synthese eingesetzt werden.

Beispiel 4 Verwendung von Adaptermolekülen für die Kopplung der zu immobilisierenden Komponenten mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure

Um die Kopplung der zu immobilisierenden Komponenten mit Einzelstrang- Nucleinsäuren experimentell einfach zu realisieren, werden Nucleinsäure- Adaptermoleküle verwendet. Die Adapter verfügen neben einer spezifischen Nucleinsäuresequenz über eine oder mehrere zusätzliche Bindungsstellen für eine chemische Gruppe, die in einer vorgeschalteten Reaktion in die zu immobilisierenden Komponenten eingeführt wird. Bei den Adaptermolekülen handelt es sich typischerweise um Konjugate aus DNA- oder PNA- (Protein- Nukleinsäure)-Oligonucleotiden und den Biotin-Bindungsproteinen Streptavidin oder Avidin bzw. Derivaten dieser Proteine. Die Einführung von Biotin in die zu immobilisierenden Komponenten erfolgt unter milden chemischen Bedingungen mit bekannten Methoden, beispielsweise durch Verwendung des kommerziell erhältlichen Derivatisierungsreagenzes N-Hydroxysuccinimidyl-Biotin. Anschließend wird die zu immobilisierende, biotinylierte Komponente mit dem DNA-Streptavidin Adaptermolekül gemischt, wodurch die Komponente mit einer spezifischen Nucleinsäure-Sequenz gekoppelt wird. Besonders vorteilhaft ist, daß verschiedene Adaptermoleküle mit jeweils spezifischen Nucleotidsequenzen beispielsweise als Stammlösungen lagerbar sind, so daß beliebige Biotin-haltige Komponenten nach dem Baukastenprinzip mit individuellen Nucleinsäure- Sequenzen gekoppelt werden können.

Beispiel 5 Regenerierung von Sensoroberflächen

Die Oberfläche eines Sensorchips, beispielsweise kommerziell-erhältliche Streptavidin-beschichtete Goldsensorchips für den auf Plasmonresonanz beruhenden BlAcore-Biosensor (z. B. BIAcore SA5-Chips) werden nach bekannten Methoden mit Nucleinsäure-Fragmenten beschichtet. Ein Biotin-derivatisierter Antikörper (Immunglobulin G, IgG), wird mit einem Adaptermolekül aus Einzelstrang-DNA und Streptavidin gemischt, wodurch das IgG mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure gekoppelt wird. Das resultierende Konjugat wird über den Sensorchip injiziert und bindet durch Nucleinsäure- Hybridisierung an die Chip-Oberfläche. Der auf diese Art mit Antikörpern funktionalisierte Sensorchip kann für nach bekannten Verfahren durchzuführende Sensormessungen, beispielsweise der Messung von Protein-Protein Wechselwirkungen, verwendet werden. Ist die Antikörper-Bindungskapazität aufgrund der natürlich auftretenden Denaturierung des Proteins erschöpft, wird das Antikörper-Nucleinsäure-Konjugat typischerweise durch Behandlung mit wäßriger Natronlauge oder Hitze-Einwirkung gelöst. Da die Nucleinsäure-Beschichtung des Sensorchips diese Behandlungen schadlos übersteht, kann ein neues Antikörper- Nucleinsäure-Konjugat durch Hybridisierung auf dem Chip immobilisiert werden, woraufhin der Sensorchip für weitere Wechselwirkungsmessungen verwendet werden kann. Aufgrund der hohen physikalisch-chemischen Stabilität vieler Nucleinsäuren, kann dieser Regenerierungschritt typischerweise mehr als 100 mal wiederholt werden.

Zuammenfassung

Verfahren zur reversiblen, ortsspezifischen, hocheffizienten und gleichzeitigen Immobilisierung verschiedenartiger (biologischer) Makromoleküle auf Festphasen. Die zu immobilisierenden, makromolekularen Komponenten, beispielsweise Proteine, Nucleinsäuren, Zellbestandteile und Organellen, Mikororganismen, Zellen jedoch auch organisch- und anorganisch-chemische Partikel wie Chromophore und Fluorophore, Peptide, Metall- und Halbmetallcluster, Vesikel oder Membranen, werden mit immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäuren, oder vorzugsweise mit Nucleinsäure-haltigen Adapterreagenzien gekoppelt, so daß die Makromoleküle anschließend an komplementäre, Festphasen-fixierte Nucleinsäuren hybridisieren können. Die mittels Nucleinsäure-Hybridisierung funktionalisierten Oberflächen eignen sich als Festphasen für regenerierbare, miniaturisierte Biosensoren, Bioreaktoren und andere Funktionselemente.

Beispiel 6 Verwendung nicht-natürlicher Nucleinsäure-Analoga als Immobilisierungsvermittler

Mehrere verschiedene Makromoleküle, beispielsweise Enzyme, Chromophore, Metallkolloide, Vesikel oder andere beliebige Komponenten werden jeweils mit einem individuellen Nucleinsäure-Analogon gekoppelt. Die Kopplung erfolgt kovalent mit chemischen Methoden oder nicht-kovalent unter Verwendung von Adaptermolekülen. Gemäß Patentanspruch 4 werden als Immobilisierungs- Vermittler Nucleinsäure-Analoga benutzt, die durch bekannte Verfahren [Collins et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 2979] hergestellt werden und die nicht an native Nucleinsäuren binden. Die Verwendung der Nucleinsäure-Analoga erfolgt in dem in Patentanspruch 1 genannten Verfahren, um eine unspezifische Bindung mit, beispielsweise in Zell-Extrakten vorliegenden, RNA- und DNA-Bestandteilen zu verhindern und stattdessen ausschließlich die zu-immobilisierenden Makromoleküle an der Festphase zu befestigen.

Beispiel 7 Immobilisierung organischer und anorganischer Materialien auf Nucleinsäure-Arrays

Verschiedene anorganische und organische Komponenten, beispielsweise die in den Patentansprüchen 5-7 genannten Biomoleküle, organische und anorganische Makromoleküle werden mit Nucleinsäure-Tmmobilisierungsvermittlern modifiziert und an einem Nucleinsäure-Mikroarray immobilisiert. Durch die Immobilisierung der Einzelkomponenten entsteht eine Anordnung von verschiedenen Materialkomponenten. Diese Anordnung kann unter anderem mittels bekannter Verfahren zur weiteren Abscheidung von Materialien verwendet werden, beispielsweise indem an immobilisierten Gold-Kolloiden reduktiv Silber abgeschieden wird [Holgate et al. (1983) Histochem. Cytochem. 31, 938]. Die durch das in Patentanspruch 1 genannte Verfahren zugänglichen Anordnungen von Materialkomponenten, können beispielsweise als funktionelle Einheit in nanotechnischen oder mikrosystemtechnischen Geräten verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur reversiblen, parallelen, ortspezifischen und hocheffizienten Immobilisierung von Makromolekülen an festen Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß Nucleinsäuren als immobilisierungsvermittelnde Reagenzien genutzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu immobilisierenden Komponenten mit Nucleinsäuren gekoppelt und die Festphasen mit hierzu komplementären Nucleinsäuren funktionalisiert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Desoxyribonucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren als Immobilisierungsvermittler verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß modifizierte Nucleinsäuren wie Peptidnucleinsäuren, Phosphotioat-, andere synthetische Nucleinsäure-Analoga bzw. andere synthetische Moleküle mit einer spezifischen Erkennungskapazität für oberflächengebundene Biomoleküle als Immobilisierungs vermittler verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu immobilisierenden Komponenten um biologische Makromoleküle, wie Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, Membranproteine, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren oder andere Biomoleküle handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu immobilisierenden Komponenten um anorganisch-chemische Komponenten, wie Metall- und Halbmetallcluster handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu immobilisierenden Komponenten um organisch-chemische Gruppen mit spezifischen katalytischen, optischen oder elektrischen Eigenschaften handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Oberfläche so mit Nucleinsäuren funktionalisiert wird, daß verschiedene, mit komplementären Nucleinsäuren-modifizierte Komponenten gebunden werden können.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu immobilisierenden Komponenten kovalent mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure gekoppelt sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu immobilisierenden Komponenten nicht-kovalent mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure gekoppelt sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Nucleinsäure haltige Adaptermoleküle für die Kopplung der zu immobilisierenden Komponenten mit der immobilisierungsvermittelnden Nucleinsäure verwendet werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Konjugate aus Streptavidin, Avidin oder rekombinant- oder chemisch-modifizierten Derivaten dieser Proteine und Einzelstrang-Nucleinsäuren als Adaptermoleküle verwendet werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Konjugate aus Antikörpern, Rezeptoren oder anderen Bindeproteinen und Einzelstrang- Nucleinsäuren als Adaptermoleküle verwendet werden.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß BIAcore Sensorchips oder andere Marktprodukte als Festphase verwendet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß komplette oder halbfertige DNA-Mikroarrays als Festphase verwendet werden.

16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß funktionalisierte Festphasen für Sensorelemente hergestellt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß funktionalisierte Festphasen für Reaktorelemente hergestellt werden.

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß funktionalisierte Festphasen für Elemente mit elektrischen, elektronischen oder optischen Funktionen hergestellt werden.