DE10221004A1 - Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen unter Verwendung im wesentlichen ungeladener Ligat-Oligonukleotide - Google Patents
Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen unter Verwendung im wesentlichen ungeladener Ligat-OligonukleotideInfo
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen, das die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von im Wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht, Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden, Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren und Vergleich der bei der Detektion erhaltenen Werte mit Referenzwerten umfasst.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen unter Verwendung im wesentlichen ungeladener Ligat-Oligonukleotide.
- Stand der Technik
- In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor wird zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips Anwendung. Auch bei den parallelen Verfahren beruht die eigentliche Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.
- Zur DNA-Analyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA- Sequenzen ("Ligat-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungslösung DNA-Fragmente ("Ligand-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Ligat-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, so können die Ligand-Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert (gelesen) werden.
- Obwohl inzwischen Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen mit Hilfe der Chip-Technologie bekannt sind (DE 199 26 457, DE 100 49 527) besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen Methoden, die insbesondere im Hinblick auf die Einfachheit der Durchführung bei gleicher Qualität der Messergebnisse Vorteile bieten.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen zu schaffen, welches in einfacher Weise Messungen mit guter Reproduzierbarkeit erlaubt.
- Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 25 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Beispielen und den Figuren.
- Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (Synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker- Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker- Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2)2-N(COCH2-Base)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
U Uracil
Base A, G, T, Coder U
Bp Basenpaar
Nukleinsäure Wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat- Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
nt Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure- Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind.).
ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid.
Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss Single strand (Einzelstrang)
ds Double strand (Doppelstrang)
Oxidationsmittel Chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Aufnahme von Elektronen aus einer anderen chemischen Verbindung (chemischen Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) oxidiert.
Reduktionsmittel Chemische Verbindung (chemische Substanz), die durch Abgabe von Elektronen an eine andere chemische Verbindung (chemische Substanz) diese andere chemische Verbindung (chemische Substanz) reduziert.
sulfo-NHS N-Hydroxysulfosuccinimid
NHS N-Hydroxysuccinimid
EDC (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Ligand-Oligonukleotid Bezeichnung für Oligonukleotide, die von Ligat-Oligonukleotiden spezifisch gebunden werden.
Ligat-Oligonukleotid Bezeichnung für Oligonukleotide, die von Ligand-Oligonukleotiden spezifisch gebunden werden.
Linker Molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer Äquivalent zu Linker.
Mica Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner Schichten.
Au-S-(CH2)2-ss-oligo Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten und dadurch je eine Au-S-R Bindung bewirkt wird.
Au-S-(CH2)2-ds-oligo Au-S-(CH2)2-ss-oligo-Spacer hybridisiert mit dem zu ss-oligo komplementären Oligonukleotid.
E Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
i Stromdichte (Strom pro cm2 Elektrodenoberfläche)
SECM Scanning Electrochemical Microscopy, Elektrochemische Rastermikroskopie.
UME Ultramikroelektrode
Cyclovoltammetrie Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Das Potential einer stationären Arbeitselektrode wird dabei zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
(Chrono)Amperometrie Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Chronocoulometrie Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden.
Differential-Puls-Voltammetrie Bei der Differential-Puls-Voltammetrie werden einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe Rechteckpulse mit kleiner, konstanter Amplitude überlagert. Die Messungen des Stroms als Funktion der Spannung erfolgen dabei unmittelbar vor dem Puls und am Ende des Pulses. Aufgetragen werden die Differenzen der Strommesswertpaare gegen das Potential.
Square-Wave-Voltammetrie Bei der Square-Wave-Voltammetrie wird einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe eine rechteckförmige Wechselspannung mit kleiner, konstanter Amplitude und niedriger Frequenz überlagert. Zur Messung des Stroms als Funktion der Spannung werden jeweils mehrmals die Differenzen der Ströme bei maximaler und minimaler Rechteckspannung bestimmt. - Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen bereit, das die Schritte Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht, Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden, Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren und Vergleich der bei der Detektion erhaltenen Werte mit Referenzwerten umfasst.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Tatsache ausgenutzt, dass der Umsatz einer redoxaktiven Spezies an einer Elektrode, also die Oxidation bzw. Reduktion der redoxaktiven Spezies, von dem Zustand der Elektrodenoberfläche abhängt. Ist die Elektrodenoberfläche z. B. mit negativ geladenen Molekülen oder Molekülgruppen belegt, so ist es für z. B. negativ geladene redoxaktive Substanzen deutlich schwieriger zur Elektrodenoberfläche zu gelangen und dort oxidiert zu werden, als wenn eine im wesentlichen ungeladene Elektrodenoberfläche vorliegt. Dieser Effekt kommt umso deutlicher zum Tragen, je größer die von den an die Elektrodenoberfläche gebundenen Molekülen getragene Ladung und je größer die von der redoxaktiven Spezies getragene Ladung ist.
- Der oben beschriebene Effekt kann dazu ausgenutzt werden, die Bindung chemischer Substanzen an eine Elektrodenoberfläche nachzuweisen. Die Durchführung eines geeigneten elektrochemischen Messverfahrens zur Detektion einer redoxaktiven Spezies, die in einer mit der Elektrode in Kontakt stehenden Lösung enthaltenen ist, vor und nach der Bindung einer chemischen Substanz an die Elektrodenoberfläche ergibt deutlich unterschiedliche Werte. Zum einen bewirkt die Bindung der chemischen Substanz an die Elektrodenoberfläche schon alleine durch die daraus folgende Belegung der Elektrodenoberfläche eine Modulation der Elektronentransferkinetik der redoxaktiven Substanz und damit eine Änderung des Stroms. Ist darüberhinaus die an die Elektrodenoberfläche gebundene Substanz z. B. negativ geladen und soll eine negativ geladene redoxaktive Substanz an diese Elektrode wandern, so bewirkt die elektrostatische Abstoßung zwischen den gleich geladenen Teilchen einen dramatischen Rückgang der gemessenen Stromstärke. Ebenso kann es natürlich zu einer Erhöhung der Stromstärke kommen, wenn z. B. eine negativ geladene redoxaktive Substanz an eine Elektrode wandern soll, an die eine positiv geladene Substanz gebunden ist. In jedem Fall kommt es durch die Wechselwirkungen zwischen der an die Elektrodenoberfläche gebundenen Spezies und der redoxaktiven Substanz zu einer Modulation der Elektronentransferkinetik und damit zu einer Änderung des Stroms.
- Bezüglich der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen bedeutet dies, dass die elektrochemische Detektion einer redoxaktiven Spezies zum Nachweis benutzt werden kann, ob an die Elektrodenoberfläche einsträngige Oligonukleotide oder doppelsträngige Oligonukleotide gebunden sind. Die erfindungsgemäße Verwendung von im wesentlichen ungeladenen, an die Oberfläche gebundenen Ligat-Oligonukleotiden bringt dabei einen ganz entscheidenden Vorteil mit sich: Würden an die Elektrodenoberfläche Ligat-Oligonukleotide gebunden vorliegen, die pro Phosphat-Einheit eine negative Ladung tragen, so würde sich bei der Bindung des komplementären Ligand-Oligonukleotids an die Ligat-Oligonukleotide die Anzahl der Ladungen pro Elektrodenoberfläche in erster Näherung verdoppeln. Werden hingegen wie von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide an die Elektrodenoberfläche gebunden oder im Extremfall völlig ungeladene Ligat-Oligonukleotide, so steigert sich bei anschließender Bindung eines komplementären Ligand-Oligonukleotids die Ladung pro Elektrodenoberfläche sozusagen um einen Faktor ∞. Diese dramatische Änderung der Ladungsdichte hat ebenso dramatische Auswirkungen auf den Umsatz einer negativ geladenen redoxaktiven Spezies an der Elektrodenoberfläche. Die detektierte Stromstärke nimmt deutlich ab und erlaubt so einen einfachen und eindeutigen Nachweis, ob an die oberflächengebundenen, im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide komplementäre Ligand-Oligonukleotide gebunden sind oder nicht.
- Daneben soll noch erwähnt werden, dass die Belegung der Oberfläche mit im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden grundsätzlich in jeder beliebigen Dichte erfolgen kann. Es ist offensichtlich, dass der oben beschriebene Effekt des erschwerten Zugangs der redoxaktiven Spezies an die Oberfläche umso stärker auftritt, je dichter die Oberfläche mit Ligat-Oligonukleotiden belegt ist. Eine Obergrenze der Dichte der Belegung ist durch das zur Detektion von Hybridisierungsereignissen essentielle Erfordernis eines gewissen Raumangebots um die Ligat- Oligonukleotide herum gegeben, welches die Hybridisierung mit den Ligand-Oligonukleotiden erst möglich macht.
- Unter einem geladenen Oligonukleotid wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid verstanden, das eine Anzahl an Elementarladungen trägt, welche ungefähr der Anzahl an Nukleotiden entspricht, aus denen sich das Oligonukleotid zusammensetzt. Bekanntermaßen sind die einzelnen Nukleotide über Phosphatgruppen miteinander verbunden. Da diese Phosphatgruppen in der Regel einfach negativ geladen sind, ergibt sich für das gesamte Oligonukleotid eine Gesamtladung, die im wesentlichen (nämlich bis auf am Ende der Nukleotidkette fehlende Phosphatgruppen) der Anzahl an Nukleotiden entspricht.
- Unter dem Begriff "im wesentlichen ungeladen" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anzahl an einfach negativen Ladungen (Elementarladungen) des Ligat-Oligonukleotids verstanden, die maximal 50% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt. Bevorzugt beträgt die Anzahl an Elementarladungen des Ligat-Oligonukleotids maximal 40% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids, besonders bevorzugt maximal 30%, insbesondere maximal 20% und ganz besonders bevorzugt maximal 10% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids. Die besten Resultate werden mit vollständig ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden erzielt.
- Daneben betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht und eine effektive Menge einer redoxaktiven Spezies.
- In der allgemeinsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die nach Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche detektierten Werte des Stromflusses mit bereits bekannten Referenzwerten verglichen. Diese Referenzwerte können in unabhängigen Experimenten für jeweils einen bestimmten Satz an Parametern (Konzentration der redoxaktiven Spezies in der Lösung, angelegtes Potential, Temperatur, Salzkonzentration usw.) gemessen werden.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Referenzwerte vor der Zugabe der Probe in einer separaten Messung bestimmt. In dieser Ausführungsform erfolgt also nach dem Inkontaktbringen der die redoxaktive Spezies enthaltenden Lösung mit der modifizierten Oberfläche eine Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren. Aufgrund dieser unter den exakt gleichen Bedingungen der eigentlichen Messung durchgeführten Referenzmessung werden noch genauere und zuverlässigere Werte detektiert.
- Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die getrennte Durchführung einer Referenzmessung vermieden werden. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Referenz-Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden.
- Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einer Art von Ligand-Oligonukleotiden zu der Probe, wobei das Ligand-Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotiden ist, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die notwendig ist, um die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide der T100-Test-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert. Der für den Bereich T100 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%).
- Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotiden modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem bestimmten Bereich (Test-Site T0) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also das entsprechende komplementäre Oligonukleotid nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Ligand-Oligonukleotid zu der Probe, wobei das Ligand- Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden ist, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand-Oligonukleotid wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die notwendig ist, um die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide der T100-Test-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert. Der für den Bereich T0 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%).
- Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der beiden oben geschilderten Verfahren, die ohne getrennte Referenz-Messung auskommen, erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand- Oligonukleotid zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieses Ligand-Oligonukleotid in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Ligand-Oligonukleotid weist eine Assoziationskonstante > 0 zu einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden auf, die in einem bestimmten Bereich (Test-Site Tn) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Ligand- Oligonukleotid wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotide des Test-Sites Tn in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche Tn erhaltenen Werte. Der für ein bestimmtes Test-Site Tn erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Ligat- Oligonukleotid/Ligand-Oligonukleotid-Assoziaten bezogen auf die Gesamtzahl an Ligat- Oligonukleotide der entsprechend Art.
- Die Menge an Ligand-Oligonukleotiden, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n%ige Assoziation am Test-Site Tn zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z. B. nach Detektion der Werte für T0 und T100 eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide und die Ligand-Oligonukleotide ausgestattet sind. Das Verhältnis von Ligand-Oligonukleotid-Label- Signal zu Ligat-Oligonukleotid-Label-Signal entspricht n%.
- Wird eine genügende Anzahl an Referenz-Sites Tn auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Referenzkurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Referenzkurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich.
- Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Ligand-Oligonukleotids, das nicht in der Probe enthalten ist, keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten. Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschritt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test-Sites und für die Referenz-Sites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden.
- In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, an die im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide gebunden sind. Die ungeladenen Oligonukleotide gemäß den nachfolgenden Strukturformeln liefern besonders gute Resultate und werden daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
- Das dargestellte Methylphosphonat-Oligonukleotid und das dargestellte Methylphosphat- Oligonukleotid stehen exemplarisch für Klassen von Verbindungen, bei denen die Methyl-Gruppe durch einen beliebigen ungeladenen Rest ausgetauscht ist, insbesondere gegen Alkyl-Reste wie z. B. Ethyl-Reste. Außerdem kann z. B. bei den oben dargestellten Phosphoamidaten die NHR- Gruppe z. B. durch SR ersetzt werden.
- Grundsätzlich ist es auch möglich die gesamte Phosphatgruppe zu ersetzen. Die einzelnen Sauerstoff-Atome können durch S-Atome (eine bis drei Substitutionen), P durch N, O durch NH usw. ersetzt werden. Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl solcher Verbindungen bekannt.
- Als Extremfall kann der vollständige Austausch des Zuckers und der Phosphat-Gruppe angesehen werden, wie es z. B. bei den oben dargestellten Peptid-Oligonukleotiden der Fall ist.
- Im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide können durch Verwendung der oben gezeigten ungeladenen Backbones zusammen mit "normalen" geladenen DNA-Backbones erhalten werden.
- Je nach Anteil von geladenen und ungeladenen Abschnitten ergeben sich "im wesentlichen ungeladene" Ligat-Oligonukleotide, die eine Anzahl an Elementarladungen tragen, die zwischen 0 und maximal 50% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt. Selbstverständlich können auch Mischformen der oben genannten, verschiedenen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide verwendet werden. Das Backbone besteht in diesem Fall aus beliebigen Mischformen von modifizierten oder unmodifizierten Nukleotiden, die lediglich der Bedingung genügen müssen "im wesentlichen ungeladen" zu sein.
- Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Ligat-Oligonukleotide kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden. Der feste Träger besteht aus einem leitfähigen Material.
- Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Metallen wie insbesonder Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.
- Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Array von Mikroelektroden handelt es sich um handelsübliche Bauelemente. Die Mikroelektroden selbst bestehen aus einem leitfähigen Material, während sich zwischen den einzelnen Mikroelektroden ein nicht leitfähiges Material befindet, durch das die einzelnen Mikroelektroden sowohl räumlich als elektrisch voneinander getrennt werden. Die Mikroelektroden können aktiv oder passiv angesteuert werden. Im Falle der aktiven Ansteuerung kommt insbesondere die Verwendung von CMOS-Strukturen in Frage.
- Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäure-Oligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide können z. B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid vorhandenen oder durch Derivatisierung am im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an die Oberfläche gebunden werden. Das im wesentlichen ungeladene Ligat- Oligonukleotid kann direkt oder über einen Linker/Spacer an die Oberflächenatome oder -moleküle einer Oberfläche gebunden werden. Daneben kann das im wesentlichen ungeladene Ligat- Oligonukleotid durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z. B. durch Verwendung von biotinylierten im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden zur nicht- kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Die chemische Modifikation der Ligat-Nukleinsäure-Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden (vgl. z. B. WO 00/42217).
- Als Ligand-Oligonukleotide werden Nukleinsäure-Oligomere bezeichnet, die spezifisch mit den an einer Oberfläche immobilisierten im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken können. Eine solche Wechselwirkung unter Bildung eines Komplexes setzt die Anwesenheit eines zu einem Ligand-Oligonukleotid komplementären oder nahezu komplementären im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotids voraus. Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung natürlich vorkommender DNA, RNA oder deren Transkriptions- oder Amplifikationsprodukte.
- Als redoxaktive Spezies können Übergangsmetall-Komplexe verwendet werden, die vorzugsweise eine negative Gesamtladung aufweisen. Daneben ist aber auch die Verwendung von neutralen Übergangsmetallkomplexen mit negativ geladenen Liganden möglich. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Übergangsmetallkomplexe des Eisens, Cobalts, Nickels, Kupfers, Rutheniums, und Osmiums mit negativ geladenen Liganden bevorzugt. Als Liganden können beispielsweise cyano-(CN-), thiocyanato-(SCH-), hydroxo-(OH-), halogenido-(Fl-, Cl-, Br-, I-), oxo-(O2-), thio-(S2-) Gruppen und ähnliche, aber auch sterisch aufwändigere, mit negativen Gruppen wie z. B. -COOH, -OS(OH)3 oder -OPO(OH)2 modifizierte Liganden wie pyridyl-(py), bipyridyl-(bipy), cyclopentadienyl- (cp) Derivate und ähnliche verwendet werden. Die zuletzt genannten, mit negativen Gruppen modifizierten Liganden werden bevorzugt in Lösungen eingesetzt, deren pH-Wert oberhalb des pKs- Wertes der jeweiligen Verbindung liegt, weil dadurch sichergestellt ist, dass der jeweilige Übergangsmetallkomplex in der Lösung negativ geladen vorliegt.
- Selbstverständlich können sämtliche, oben genannten Liganden in beliebigen Mischformen auftreten, es kann also ein Zentralatom eines Übergangsmetallkomplexes gleichzeitig unterschiedliche Liganden tragen. Ein willkürlich herausgegriffenes Beispiel eines solchen Komplexes ist die Verbindung Ammonium-tetranitro-diammin-kobaltat(III) NH4[Co(NO2)4(NH3)2].
- Daneben können als redoxaktive Spezies auch Chinone wie z. B. Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphthochinon oder Menachinon sowie deren mit negativen Gruppen wie z. B. -COOH, -OS(OH)3 oder -OPO(OH)2 modifizierten Derivate verwendet werden.
- Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Übergangsmetallkomplex Eisenhexacyanoferrat besonders bevorzugt.
- Wie oben bereits beschrieben, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Tatsache ausgenutzt, dass der Umsatz einer gelösten redoxaktiven Spezies an einer Elektrode, also die Oxidation bzw. Reduktion der redoxaktiven Spezies, von dem Zustand der Elektrodenoberfläche abhängt. Ist die Elektrodenoberfläche mit negativ geladenen Molekülen oder Molekülgruppen belegt, so ist es für negativ geladene redoxaktive Substanzen deutlich schwieriger zur Elektrodenoberfläche zu gelangen und dort oxidiert zu werden, als wenn eine im wesentlichen ungeladene Elektrodenoberfläche vorliegt. Dieser Effekt kommt umso deutlicher zum Tragen, je größer die von den an die Elektrodenoberfläche gebundenen Molekülen getragene Ladung und je größer die von der redoxaktiven Spezies getragene Ladung ist. Aus diesem Grund werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung redoxaktive Spezies, die eine Ladung tragen, gegenüber ungeladenen Verbindungen bevorzugt.
- Als Detektionsmethode eigenen sich elektrochemische Methoden wie die Cyclovoltammetrie, Chronoamperometrie, Chronocoulometrie, Differential-Puls-Voltammetrie, Square-Wave- Voltammetrie oder Amperometrie bei konstantem Potential.
- Bei der Cyclovoltammetrie wird eine Strom/Spannungskurve aufgezeichnet. Das Potential einer stationären Arbeitselektrode wird dabei zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
- Bei der Chronocoulometrie erfolgt die Aufzeichnung einer Ladungs/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und die transferierte Ladung in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Die Chronocoulometrie kann folglich als Integral der Amperometrie verstanden werden. Die Methode der Chronocoulometrie ist z. B. in Steel, A. B., Herne, T. M. und Tarlov M. J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670-4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben.
- Bei der Differential-Puls-Voltammetrie werden einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe Rechteckpulse mit kleiner, konstanter Amplitude überlagert. Die Messungen des Stroms als Funktion der Spannung erfolgen dabei unmittelbar vor dem Puls und am Ende des Pulses. Aufgetragen werden die Differenzen der Strommesswertpaare gegen das Potential.
- Bei der Square-Wave-Voltammetrie wird einer schrittweise anwachsenden Gleichspannungsrampe eine rechteckförmige Wechselspannung mit kleiner, konstanter Amplitude und niedriger Frequenz überlagert. Zur Messung des Stroms als Funktion der Spannung werden jeweils mehrmals die Differenzen der Ströme bei maximaler und minimaler Rechteckspannung bestimmt.
- Bei (chrono)amperometrischen Messungen erfolgt die Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet. Amperometrische Verfahren sind in der WO 00/42217 ausführlich dargestellt.
- Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode, deren Abstand von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche. Bei dieser Detektionsmethode handelt es sich um die sogenannte Scanning Electrochemical Microscopy, deren technischer Hintergrund nachfolgend kurz erläutert werden soll.
- Aus der DE 199 17 052 ist ein Verfahren zur Bestimmung von chemischen oder biochemischen Analyten bekannt, bei dem der Diffusionskoeffizient einer redoxaktiven Spezies, die mit einem spezifischen Erkennungselement gekoppelt ist, durch Anbindung einer komplementären Erkennungsstruktur moduliert wird, und die Modulation des Diffusionskoeffizienten mit einem elektrochemischen Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies detektiert wird.
- Grundlage dieser Detektion durch ein elektrochemisches Verfahren unter Verstärkung durch Recycling der Redoxspezies ist die Tatsache, dass eine Elektrode, die mit Hilfe eines Potentiostaten auf ein geeignetes konstantes Potential gegenüber einer Referenzelektrode polarisiert ist, eine sich in Lösung befindliche Redoxspezies entsprechend des Potentials oxidieren bzw. reduzieren kann. Gemäß DE 199 17 052 entsteht infolge des Umsatzes der Redoxspezies an einer Mikroelektrode ein Konzentrationsgradient vom Volumen der Lösung in Richtung der Elektrode, was den Aufbau eines hemisphärischen Diffusionsfeldes vor der Mikroelektrode zur Folge hat, in dem die Redoxspezies durch Diffusion zur Elektrodenoberfläche transportiert wird. Wird die Konzentration der umzusetzenden Redoxspezies am Ort der Elektrode gleich Null, limitiert der diffusionelle Massentransport den Umsatz an der Elektrode, und es wird als Maximalstrom der sogenannte Diffusionsgrenzstrom erhalten. Wird eine Mikroelektrode, an der diffusionslimitiert eine Oxidations- oder Reduktionsreaktion einer im Elektrolyten gelösten Redoxspezies abläuft, an eine makroskopische, leitende Oberflache so weit angenähert, dass das hemisphärische Diffusionsprofil vor der Mikroelektrode durch diese Oberfläche gestört wird, kann - bei geeignetem Potential an der makroskopischen Elektrode - die Rückreaktion der an der Mikroelektrode stattfindenden Reaktion ablaufen. Infolge dieser Rückreaktion wird im Volumenraum des Diffusionsprofils in der Zeiteinheit die Zahl der an der Mikroelektrode umzusetzenden Redoxspezies vergrößert, so dass als Folge der Diffusionsgrenzstrom anwächst.
- Das oben beschriebene elektrochemische Detektionsverfahren wird als "Elektrochemische Rastermikroskopie (SECM)" bezeichnet und gehört zur Klasse der Rastersondentechniken, gemäß denen eine Messsonde sequentiell über eine Oberfläche (Probe) gerastert wird und die aufgenommene Messgröße für jeden Rasterpunkt aus der Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe resultiert. Im speziellen Fall der SECM dient eine Ultramikroelektrode (UME) als Sonde, welche in einem Arbeitsabstand in der Größenordnung des Elektrodenspitzenradius in einem Elektrolyt über die Oberfläche bewegt wird. Das Potential der UME wird dabei über einen Potentiostaten so eingestellt, dass eine gelöste redoxaktive Spezies diffusionskontrolliert umgesetzt wird. Nähert man die UME schrittweise an die Oberfläche an und detektiert dabei den resultierenden Strom, so können zwei Fälle unterschieden werden. Handelt es sich um eine nicht leitfähige Oberfläche, so bewirkt die Annäherung der UME durch die Störung des zuvor hemisphärischen Diffusionsfeldes einen verminderten Stofftransport zur UME und somit eine Abnahme im Diffusionsgrenzstrom. Man spricht vom negativen Feedback (Fig. 1a, Fig. 2a). Liegt dagegen eine leitfähige Oberfläche vor und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der UME umgesetzten redoxaktiven Spezies statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Man spricht vom Redoxrecycling oder positivem Feedback (Fig. 1b, Fig. 2b). Die Stromamplifizierung durch Redoxrecycling ist dabei abhängig von der Konzentration der Redoxspezies, von der heterogenen Elektronentransferkinetik an der Probenoberfläche sowie dem Abstand zwischen UME und Probenoberfläche.
- Ein Rastern der Oberfläche bei konstantem Abstand unter Detektion des Stroms (Constant height mode) bzw. bei konstantem Strom unter Detektion des nachgeregelten Mikroelektrodenabstandes (Constant current mode) erlaubt somit die Topographierung der Oberfläche bzw. der elektrochemischen Aktivität der Oberfläche.
- Die elektrochemisch aktive Oberfläche der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Messelektroden ist in der Regel kreisförmig ausgeprägt (Fig. 3). In diesem Fall ist der Ausdruck "Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche" selbsterklärend. Für den Fall, dass die elektrochemisch aktive Oberfläche nicht kreisförmig ist, wird unter dem Ausdruck "Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche" die Hälfte der größten Ausdehnung des Teils der Messelektrode verstanden, der elektrochemisch aktiv ist, also mit der redoxaktiven Spezies in Kontakt steht. Im Fall einer Messelektrode mit quadratischer Spitze also die Hälfte der Diagonalenlänge.
- Aus der Fig. 2 wird deutlich, dass ein mit entsprechender Zuverlässigkeit und Genauigkeit gemessener Effekt erst dann auftritt, wenn der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer elektrochemisch aktiven Oberfläche. Mit geringer werdendem Abstand verstärkt sich der durch die Störung des Diffusionsprofils der redoxaktiven Spezies bewirkte Effekt dramatisch. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche daher maximal 4 mal, besonders bevorzugt maximal 3 mal so groß wie der Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode. Ganz besonders bevorzugt ist ein Abstand der Messelektrode von der modifizierten Oberfläche, der maximal 2 mal, besonders bevorzugt maximal genau so groß ist wie der Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode.
- Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Messelektrode mit einem Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0,05 bis 250 µm, bevorzugt von 0,5 bis 50 µm, besonders bevorzugt von 5 bis 25 µm verwendet. Typischerweise handelt es sich dabei um eine Mikroelektrode mit einem Radius < 100 µm in einer Isolationshülle, welche einen mehrfachen Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode aufweist (Fig. 3). Besonders bevorzugt wird als Messelektrode eine Scheibenelektrode verwendet, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder Polymeren umgeben ist.
- Aus der Größe der elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode ergibt sich, dass gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Abstand zwischen Messelektrode und modifizierter Oberfläche während der Messung maximal 1250 µm beträgt. Besonders bevorzugt beträgt der Abstand maximal 500 µm, ganz besonders bevorzugt 100 µm und insbesondere 50 µm.
- Die Messelektrode wird mittels Verschiebeelemente wie z. B. Schrittmotor-getriebene oder manuelle Mikrometerschrauben oder Piezostapel an die modifizierte Oberfläche angenähert, so dass das Diffusionsprofil der Redoxspezies vor der Mikroelektrode bis zur gegenüberliegenden modifizierten Oberfläche reicht (Fig. 1b).
- Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, an die wenigstens zwei verschiedene Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden angebunden sind. Es kann aber selbstverständlich eine sehr große Anzahl an Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche gebunden sein, also z. B. 100, 1000 oder mehr als 100000 verschiedene Arten. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jeweils überwiegend eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden. Unter "räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden kommen. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass jeweils ausschließlich eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten Oberfläche angebunden ist.
- Die Größe dieser räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche ist grundsätzlich beliebig. Aus technischen Gründen werden in der Regel bevorzugt bis zu 10 cm2 große räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereiche verwendet werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind räumlich im wesentlichen abgetrennte Bereiche einer Größe von 100 µm2 bis zu 1000000 µm2.
- Sind mehrere Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche gebunden, so ergibt sich das grundsätzliche Problem der Zuordnung eines detektierten Messsignals zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid. Bei Verwendung einer durchgängig leitenden Oberfläche würde in der Regel nur die Summe der durch die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden hervorgerufenen Signale detektiert werden. Dies gilt ebenso für die oben angesprochene Verwendung von Referenz- Test-Sites T100, T0 und Tn. Es muss also ein Detektionsverfahren verwendet werden, das die Zuordnung eines Messsignals zu einer bestimmten Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotid erlaubt.
- Dies kann zum einen durch die Verwendung eines Arrays von Mikroelektroden erfolgen, was im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform darstellt. In diesem Fall wird in dem Bereich einer Mikroelektrode jeweils eine Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden an die Oberfläche angebunden. Bei dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Array von Mikroelektroden handelt es sich um handelsübliche Bauelemente. Die Mikroelektroden selbst bestehen aus einem leitfähigen Material, während sich zwischen den einzelnen Mikroelektroden ein nicht leitfähiges Material befindet, durch das die einzelnen Mikroelektroden sowohl räumlich als elektrisch voneinander getrennt werden. Zur Detektion des Signals können die Mikroelektroden aktiv oder passiv angesteuert werden. Im Falle der aktiven Ansteuerung kommt insbesondere die Verwendung von CMOS-Strukturen in Frage.
- Außerdem kann die Detektion der Hybridisierungsereignisse von verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden, die in räumlich begrenzten Bereichen der modifizierten Oberfläche angebunden sind, durch SECM erfolgen. Dabei wird mit Hilfe der Messelektrode die modifizierte Oberfläche abgerastert und so die Hybridisierungsereignisse selektiv für die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in den verschiedenen räumlich begrenzten Bereichen detektiert. Wird ein Mikroelektroden-Array als modifizierte Oberfläche verwendet, so kann aufgrund des räumlichen Abstandes zwischen den einzelnen Mikroelektroden im Falle der Detektion mit Hilfe von SECM die Messelektrode problemlos exakt und eindeutig an eine bestimmte Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden angenähert werden. Somit werden eindeutig zuordenbare Messresultate erhalten.
- Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
- Fig. 1 Schematische Darstellung von negativem Feedback (Fig. 1a) und positivem Feedback (Fig. 1b).
- Fig. 2 Schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME. Fig. 2a) zeigt den Verlauf bei negativem Feedback und Fig. 2b) den Verlauf bei positivem Feedback.
- Fig. 3 Schematische Darstellung einer in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Messelektrode.
- Fig. 4 Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 mit KCl (100 mM). Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang-Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang.
- Fig. 5 Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 ohne KCl. Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang- Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang.
- Fig. 6 Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer-Peptid- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)s in TRIS-Puffer pH 7.4 ohne KCl. Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang- Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang.
- Die Fig. 1 zeigt schematisch eine Ultramikroelektrode (UME), die in einem bestimmten Arbeitsabstand in einem Elektrolyt über eine Oberfläche bewegt wird. Das Potential der UME ist dabei über einen Potentiostaten so eingestellt, dass eine gelöste redoxaktive Spezies (Red/Ox) diffusionskontrolliert umgesetzt wird. Nähert man die UME schrittweise an die Oberfläche an und detektiert dabei den resultierenden Strom, so können zwei Fälle unterschieden werden.
- Handelt es sich um eine nicht leitfähige (inaktive) Oberfläche (Fig. 1a), so bewirkt die Annäherung der UME durch die Störung des zuvor hemisphärischen Diffusionsfeldes einen verminderten Stofftransport zur UME und somit eine Abnahme im Diffusionsgrenzstrom. Man spricht vom negativen Feedback (Fig. 1a). Die Fig. 2a) zeigt eine schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME für den Fall eines negativen Feedbacks.
- Liegt dagegen eine leitfähige (aktive) Oberfläche vor (Fig. 1b) und findet dort reversibel die Rückreaktion der an der UME umgesetzten redoxaktiven Spezies (Red/Ox) statt, so werden die Diffusionswege der oxidierten und reduzierten Form der redoxaktiven Spezies mit abnehmendem Abstand immer kleiner und der resultierende Strom nimmt folglich zu. Man spricht vom Redoxrecycling oder positivem Feedback (Fig. 1b). Die Fig. 2b) zeigt eine schematische Auftragung der Stromstärke an der UME gegen den Quotienten aus Abstand der UME von der modifizierten Oberfläche und Radius der elektrochemisch aktiven Oberfläche der UME für den Fall eines positiven Feedbacks.
- Die Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Messelektrode. Die elektrochemisch aktiven Oberfläche der Messelektrode besitzt einen Radius < 100 µm und befindet sich in einer Isolationshülle (Glaskapillare), welche einen mehrfachen Durchmesser der elektrochemisch aktiven Oberfläche aufweist.
- Die Fig. 4 zeigt die Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 mit KCl (100 mM). Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang-Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Für die Doppelstrang-Monolayer ergibt sich im Vergleich zur Einzelstrang-Monolayer eine leichte Abnahme des Peakstroms. Dieser Rückgang des Peakstroms kann auf die erhöhte negative Ladung der Oligonukleotid-Monolayer und der daraus resultierenden erhöhten Coulomb-Abstoßung zwischen dem Oligonukleotid-Rückgrat und den [Fe(CN)s]3-/4-Anionen zurückgeführt werden.
- Die Deutung der in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse wird durch die Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer-Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 bei geringen Salzkonzentrationen (ohne KCl) bestätigt. In der Fig. 5 zeigt die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve die Messwerte für die Einzelstrang- Monolayer und die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Aufgrund des geringen Salzgehaltes der Lösung wird in diesem Fall die Gegenionenkompensation der negativen Ladungen im DNA-Rückgrat abgesenkt. Durch die Hybridisierung mit dem komplementären Gegenstrang wird die negative Ladung auf der Oberfläche und somit auch die Coulomb-Abstoßung zwischen dem Oligonukleotid-Rückgrat und den [Fe(CN)6]3-/4-Anionen weiter erhöht. Der Peakstrom wird daher erheblich deutlicher als bei dem in Fig. 4 dargestellten Experiment reduziert. Dies spricht für einen deutlich erschwerten Zugang der [Fe(CN)6]3-/4-Anionen zur Elektrodenoberfläche.
- Die Fig. 6 zeigt die Resultate einer cyclovoltammetrischen Messung (v = 6 mV/s) einer 20-mer- Peptid-Oligonukleotid-Monolayer in 1 mM K4Fe(CN)6 in TRIS-Puffer pH 7.4 ohne KCl. Die mit den Symbolen -□- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Einzelstrang-Monolayer, die mit den Symbolen -▪- gekennzeichnete Kurve zeigt die Messwerte für die Doppelstrang-Monolayer nach Hybridisierung mit dem zugehörigen komplementären Strang. Durch die Verwendung eines ungeladenen Peptid-Oligonukleotids wird der im Falle des Einzelstrangs detektierte Strom gegenüber den entsprechenden Messungen unter Verwendung eines geladenen Oligonukleotids (Fig. 4, 5) drastisch erhöht. Erst nach Hybridisierung mit dem "geladenen" komplementären Strang tritt Coulomb-Abstoßung und somit eine deutliche Reduzierung des Stromes auf (Fig. 6). Durch die Verwendung im wesentlichen ungeladener Oligonukleotide wird somit der Kontrast zwischen Einzel- und Doppelstrang um ein Vielfaches erhöht.
- Zur Durchführung der Detektion der Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen wurden verschiedene im wesentlichen ungeladene Ligat-Nukleinsäure-Oligomere unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Ligat-Nukleinsäure-Oligomere bekannter Sequenz an definierten Positionen der Oberfläche, einem DNA-Array, wird das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Ligand- Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Ligand-DNA detektiert, um z. B. Mutationen im Ligand-Oligonukleotid aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-IRNA-IPNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. Als Ligand-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 8 bis 50, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 30 verwendet. Als im wesentlichen ungeladene Ligat- Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. Methylphosphonat-Oligonukleotide, Methylphosphat-Oligonukleotide, Phosphoamidat-Oligonukleotide, PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 8 bis 50, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 30 verwendet.
- Wird die so bereitgestellte Oberfläche mit immobilisierten im wesentlichen ungeladenen Ligat- Oligonukleotiden mit einer (möglichst konzentrierten) Untersuchungslösung mit Ligand- Oligonukleotid(en) in Kontakt gebracht, so kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Ligand-Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen im wesentlichen ungeladenen Ligat-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.
- Nach der Hybridisierung zwischen im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden und Ligand- Oligonukleotid wird in einer elektrochemischen Messung (z. B. einer amperometrischen Messung) die Anzahl an Hybridisierungsereignissen in den verschiedenen räumlichen Bereichen des DNA- Chips bestimmt. Durch Vergleich der dabei erhaltenen Werte mit den bekannten Referenzwerten kann der Grad der Assoziation für die einzelnen Test-Sites bestimmt werden.
- Die Goldoberfläche wird mit einfach modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert) in 5 × 10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10-5 bis 10-1 molarem Propanthiol 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Peptid-Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Peptid- Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
- Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Peptid-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten monofunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).
- Die Goldoberfläche wird mit einfach modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert) in 5 × 10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Peptid-Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Peptid-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
- Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10-5 bis 10-1 molaren Propanthiol-Lösung (in Wasser oder Puffer, pH 7-7.5) komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Das freie Propanthiol belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ zu Propanthiol kann auch ein anderes Thiol oder Disulfid geeigneter Kettenlänge verwendet werden.
- Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo
- Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Peptid-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).
- Die Goldoberfläche wird mit einfach modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert) in 5 × 10-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Peptid-Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Peptid-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
- Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10-5 bis 10-1 molaren Lösung von Mercaptopropionsäure, Mercaptoethansulfonsäure oder Cysteamin (in Wasser oder Puffer, pH 7-7.5 oder in Ethanol) komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Die freie Mercaptopropionsäure belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ können auch andere funktionale Thiole oder Disulfide geeigneter Kettenlänge mit den gleichen oder anderen funktionellen Gruppen verwendet werden.
Claims (25)
1. Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die
Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von
wenigstens einer Art von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht,
b) Bereitstellen einer Probe mit Ligand-Oligonukleotiden,
c) Inkontaktbringen einer Lösung mit der modifizierten Oberfläche, wobei die Lösung
wenigstens eine Art von redoxaktiver Spezies enthält,
d) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche,
e) Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes
elektrochemisches Verfahren,
f) Vergleich der in Schritt e) erhaltenen Werte mit Referenzwerten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach Schritt c) und vor Schritt d) der Schritt
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit den in Schritt c1)
erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
1. c1) Detektion der Reduktion und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes
elektrochemisches Verfahren
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als im wesentlichen ungeladene
Ligat-Oligonukleotide Ligat-Oligonukleotide verwendet werden, die eine Anzahl an
Elementarladungen tragen, die maximal 40% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-
Oligonukleotids beträgt, bevorzugt maximal 30%.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei als im wesentlichen ungeladene Ligat-Oligonukleotide Ligat-
Oligonukleotide verwendet werden, die eine Anzahl an Elementarladungen tragen, die maximal
20% der Anzahl der Nukleotide des Ligat-Oligonukleotids beträgt, bevorzugt maximal 10%.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ungeladene Ligat-
Oligonukleotide verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als im wesentlichen ungeladene
Ligat-Oligonukleotide oder als ungeladene Ligat-Oligonukleotide Oligonukleotide ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Methylphosphonat-Oligonukleotide, Methylphosphat-
Oligonukleotide, Phosphoamidat-Oligonukleotide, Peptid-Oligonukleotide und deren
Mischungen verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der modifizierten
Oberfläche um eine leitfähige Oberfläche handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die leitfähige Oberfläche aus einem Metall, einer
Metalllegierung, einem Halbleiter, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 14 und
16, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 13 und 15, einer binären Verbindung
der Elemente der Gruppen 15 und 16, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 11
und 17, einer ternären Verbindung der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder einer
ternären Verbindung Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 besteht.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anbindung der im
wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide an die Oberfläche kovalent oder durch Chemi-
bzw. Physisorption erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei an die Oberfläche verzweigte oder
unverzweigte Molekülteile beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge kovalent oder durch
Chemi- bzw. Physisorption angebunden sind und die im wesentlichen ungeladenen Ligat-
Oligonukleotide kovalent an diese Molekülteile angebunden sind.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als redoxaktive Spezies ein oder
mehrere elektrisch geladene Verbindungen verwendet werden, insbesondere negativ geladene
Übergangsmetallkomplexe, besonders bevorzugt Cu-, Fe-, Ru-, Os-, Ni und Co-
Übergangsmetallkomplexe.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Detektionsverfahren ein
Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclovoltammetrie, Chronocoulometrie,
Differential-Puls-Voltammetrie, Square-Wave-Voltammetrie oder insbesondere Amperometrie
verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt a) eine durch
Anbindung von wenigstens zwei verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-
Oligonukleotiden modifizierte Oberfläche bereitgestellt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei jeweils überwiegend eine Art von im wesentlichen
ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten
Oberfläche angebunden ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei jeweils ausschließlich eine Art von im wesentlichen
ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden in einem räumlich begrenzten Bereich der modifizierten
Oberfläche angebunden ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Schritt a) der Schritt
durchgeführt wird, nach Schritt b) und vor Schritt d) der Schritt
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem für den Bereich
T100 erhaltenen Wert verglichen werden.
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung
von wenigstens zwei Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden
besteht und die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-
Oligonukleotiden in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die
Oberfläche gebunden sind
1. b1) Zusatz von einem Ligand-Oligonukleotid zu der Probe, wobei das Ligand-
Oligonukleotid ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante eines in einem
bestimmten Bereich T100 an die Oberfläche gebundenen im wesentlichen ungeladenen
Ligat-Oligonukleotids ist, wobei das Ligand-Oligonukleotid in einer Menge zugegeben
wird, die größer ist als die Menge an Ligand-Oligonukleotid, die notwendig ist, um die
im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide der T100-Test-Sites vollständig zu
assoziieren
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei als Schritt a) der Schritt
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem für den Bereich
T100 erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert verglichen werden.
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung
von wenigstens drei Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden
besteht und die verschiedenen Arten von im wesentlichen ungeladenen Ligat-
Oligonukleotiden in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die
Oberfläche gebunden sind, wobei wenigstens eine Art von im wesentlichen
ungeladenen Ligat-Oligonukleotid in einem bestimmten Bereich T0 an die Oberfläche
angebunden ist, und wobei in der Probe kein Bindungspartner mit hoher
Assoziationskonstante zu diesem im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotid
enthalten ist
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei vor Schritt d) der Schritt
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem für den Bereich
T100 erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche
Tn erhaltenen Werten verglichen werden.
1. b2) Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand-Oligonukleotid zu der Probe,
wobei das Ligand-Oligonukleotid in der in Schritt b) bereitgestellten Probe nicht
enthalten ist und das Ligand-Oligonukleotid eine Assoziationskonstante > 0 zu einem in
einem bestimmten Bereich Tn an die Oberfläche gebundenen im wesentlichen
ungeladenen Ligat-Oligonukleotid aufweist, wobei das Ligand-Oligonukleotid in einer
Menge zugegeben wird, dass nach Schritt d) n% der im wesentlichen ungeladenen
Ligat-Oligonukleotide in dem Bereich Tn in assoziierter Form vorliegen
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ligand-Oligonukleotide
und/oder die im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotide 3 bis 70 Basen, insbesondere
8 bis 50 Basen, besonders bevorzugt 10 bis 30 Basen umfassen.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion der Reduktion
und/oder Oxidation der redoxaktiven Spezies durch ein geeignetes elektrochemisches
Verfahren mit Hilfe einer Messelektrode im SECM-Modus durchgeführt wird, deren Abstand
von der modifizierten Oberfläche maximal 5 mal so groß ist wie der Radius ihrer
elektrochemisch aktiven Oberfläche.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Abstand der Messelektrode von der modifizierten
Oberfläche maximal 4 mal, bevorzugt maximal 3 mal so groß ist wie der Radius ihrer
elektrochemisch aktiven Oberfläche.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Abstand der Messelektrode von der modifizierten
Oberfläche maximal 2 mal, bevorzugt maximal genauso groß ist wie ihr Radius.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei eine Messelektrode mit einem Radius
der elektrochemisch aktiven Oberfläche von 0,05 bis 250 µm, bevorzugt von 0,5 bis 50 µm,
besonders bevorzugt von 5 bis 25 µm verwendet wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei als Messelektrode eine
Scheibenelektrode verwendet wird, die von einem isolierenden Mantel aus Glas oder
Polymeren umgeben ist.
25. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend
eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens einer Art
von im wesentlichen ungeladenen Ligat-Oligonukleotiden besteht, und einer effektiven Menge
einer redoxaktiven Spezies.
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|---|---|---|---|
| DE2002121004 DE10221004A1 (de) | 2002-05-11 | 2002-05-11 | Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen unter Verwendung im wesentlichen ungeladener Ligat-Oligonukleotide |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE2002121004 DE10221004A1 (de) | 2002-05-11 | 2002-05-11 | Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen unter Verwendung im wesentlichen ungeladener Ligat-Oligonukleotide |
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| DE10221004A1 true DE10221004A1 (de) | 2003-12-11 |
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ID=29432109
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10221004A1 (de) |
Citations (4)
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| EP0539731A1 (de) * | 1991-09-27 | 1993-05-05 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Sonde eines elektrochemischen Rastermikroskopes und Verfahren zur deren Herstellung |
| US5382336A (en) * | 1992-04-16 | 1995-01-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Tip position modulation and lock-in detection in scanning electrochemical microscopy |
| DE19917052A1 (de) * | 1999-04-15 | 2000-10-19 | Wolfgang Schuhmann | Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung chem. und biochem. Analyten mittels amplifizierter mikro-elektrochem. Detektion |
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2002
- 2002-05-11 DE DE2002121004 patent/DE10221004A1/de not_active Withdrawn
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