CZ20021096A3

CZ20021096A3 - Médium pro bezbílkovinnou a bezsérovou kultivaci buněk

Info

Publication number: CZ20021096A3
Application number: CZ20021096A
Authority: CZ
Inventors: Manfred Reiter; Wolfgang Mundt; Friedrich Dorner; Leopold Grillberger; Artur Mitterer
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-09-28
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2003-01-15
Also published as: US8021881B2; AU7908300A; JP2011135880A; IL219969A0; EP1220893B1; IL250619B; RU2266325C2; DE60028989T2; RU2536244C2; ATA165999A; IL148642A0; JP2016127839A; HU228210B1; US20150072415A1; IL250619A0; JP6348521B2; US8722406B2; US20160369316A1; IL148642A; HUP0202759A2

Description

W-favnAow

Médium pro bezbílkovinnou a bezsérovou kultivaci buněk

Oblast techniky

Vynález se týká média pro proteinu prostou a séra prostou kultivaci buněk.

Dosavadní stav techniky

Kultivace buněk, zejména eukaryotických buněk nebo savčích buněk, stále volá po používání speciálních kultivačních medií, která dodávají buňkám živné látky a růstové látky, jež jsou vyžadovány pro účinný růst a produkci požadovaných proteinů. Z tohoto hlediska jsou jako složka media zpravidla užívány sérum nebo sloučeniny ze séra pocházející (např. hovězí sérum).

Avšak v případě, že se v buněčných kulturách použijí séra nebo proteinová aditiva, která pocházejí z lidských nebo zvířecích zdrojů, existují mnohé problémy, zejména když výchozí materiál pro přípravu medicínského preparátu, který má být lidem podáván, byl zpřístupněn cestou kultivace buněk.

V případě takových sérových přípravků tudíž složení a kvalita vždy kolísá od vsádky k vsádce právě kvůli různosti organismu dárce takových přípravků. To představuje závažný problém zejména pro standardizaci produkce buněk a stanovení standardních podmínek růstu pro takové buňky. Nicméně v každém případě se vyžaduje intenzivní a konstantní kontrola kvality materiálu séra, které se používá. To je však neobyčejně časově náročné a velmi nákladné, zejména v případě takové složité kompozice jako je sérum.

Kromě toho takové komplexní přípravky obsahují množství proteinů, které mohou působit rozkladným způsobem, zvláště v kontextu rafinačního procesu pro rekombinantní protein, který má být z buněčné kultury získán. To se týká zejména těch proteinů, které jsou homologické nebo podobné s proteinem, který má být získán. Tyto problémy jsou zvláště akutní, protože biogenní protějšek v použitém mediu (např. hovězí protein) může být spolehlivě odstraněn v souvislosti s rafinaci pouze cestou zcela specifické rozlišovací rafinace (např. s protilátkami, které jsou specificky zaměřeny pouze proti rekombinantnímu proteinu a nikoliv proti hovězímu proteinu [Bjórck L., J. Immunol. 140, 1194-1197 (1988); Nilson a spol., J. Immunol. Meth. 164, 33-40 (1993)].

• ·

Avšak výslovným problémem při používání séra nebo sloučenin pocházejících ze séra v kultivačním mediu, je také riziko kontaminace mykoplasmou, viry nebo BSE působky. V souvislosti s preparáty, které pocházejí z lidské krve musí být zejména zdůrazněno riziko nakažení viry, jako hepatitidou nebo HIV. V případě séra, nebo složek séra pocházejících z hovězího materiálu, existuje zejména nebezpečí BSE nákazy. Vedle toho všechny materiály pocházející ze séra mohou být kontaminovány navíc choroby vyvolávajícími působky, které jsou dosud neznámé.

Odhlížeje od mála výjimek, bylo dříve pro kultivaci buněk na tuhých površích považováno za nezbytné, přesné přidání komponent séra, aby se zaručila adekvátní adheze buněk k jejich povrchům, a aby se zaručila adekvátní produkce požadovaných substancí. Tak pomocí metody, která je popsána na příklad v WO 91/09935 bylo možné provádět proces séra prosté a proteinu prosté kultivace FSME virus / antigen virus, pomocí séra prosté a proteinu prosté kultivace na povrchu závislých permanentních buněk, přednostně vero buněk (viz WO 96/15231). Ty však nejsou rekombinantními buňkami, ale spíše hostitelskými buňkami, jež jsou používány pro produkci virového antigenu při lytickém procesu.

Na rozdíl od toho buňky, které vysoko převažují v používání pro rekombinační preparaci, na příklad CHO buňky, jsou schopné adheze pouze v omezeném rozsahu. Tak CHO buňky, které byly pěstovány konvenčními metodami se vážou jak na hladké tak porézní mikronosiče pouze za podmínek obsahujících sérum [viz US 4 973 616; Cytotechnology 9, 247-253 (1992)]. Jsou-li však buňky pěstovány za podmínek séra prostých, tuto vlastnost ztrácejí a nepřilnou k hladkým nosičům, nebo se dají od nich snadno oddělit, pokud mediem nebyly poskytovány jiné adhezi podporující substance jako např. fibronektin, inzulín nebo transferin. To jsou však také proteiny, které pocházejí ze séra.

Jako alternativa k tomu, mohou být buňky pěstovány při aplikaci techniky suspenzní kultivace právě tak jako např. při použití procesu po jednotlivých násadách nebo při využití techniky kontinuální kultury. Kultivace přednostně probíhá za použití procesu chemostat (Ozturk S. S. a spol., 1996, Abstr. Pap. Chem. Soc., BIOT 164; Payne G. F. a spol., v Large Scale Cell Culture Technology, 206-212, 1987, editor Lydersen B. K., Hauser Publishers). Kattinger H. a spol. [Advances Mol. Cell. Biology, 15A, 193-207 (1996)] popisuje dlouhodobou kultivaci buněk v protein prostém mediu, avšak tyto buňky musí být pěstovány na nosičích a nedovolují alternativy jako kontinuální kultivační techniky. Konstatuje se, že tyto buňky vykazují « « · a · · · • · · · · · dlouhodobou stabilitu pouze když lnou k povrchu nosičů, protože mají zredukovaný růst jako důsledek sníženého požadavku na růstové faktory.

Kromě toho byly původně činěny pokusy adaptovat buňky na proteinu prosté medium vycházející z podmínek sérum obsahujících. Avšak v případě takové adaptace bylo opakovaně zjišťováno, že ve srovnání s podmínkami sérum obsahujícími, výtěžek exprimovaného proteinu a produktivita rekombinantních buněk je po adaptaci v proteinu prostém mediu znatelně snížena [Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 691-658 (1994)].

Bylo také zjištěno, že v případě vysoké hustoty buněk je podle příležitosti produkce rekombinantních proteinů podstatně omezena. Během pokusů adaptovat buňky na proteinu prostá a séra prostá media, se u buněk, které jsou používány, opakovaně zjišťuje nestabilita se sníženým růstem, takže se produkují buňky se sníženou expresí, nebo se produkují i neproduktivní buňky, čímž tyto mají ve vztahu k produkujícím buňkám v proteinu prostém a séra prostém mediu v růstu převahu a to vede ke skutečnosti, že tyto přerostou produkující buňky a potom konečně právě celá kultura dává velice nízké výtěžky produktu.

Podstata vynálezu

Předložený vynález má proto tedy za cíl zlepšit možnosti pro proteinu prostou a séra prostou kultivaci rekombinantních buněk a vytvoření činidel a dostupných procesů pomocí nichž mohou být rekombinantní buňky účinně kultivovány séra prostým nebo proteinu prostým způsobem. Navíc by mělo být možné nejen kultivovat na povrchu závislé buňky, ale užívat také suspenzní kultivační techniku, čímž se chce, aby nestabilita v produktivitě buněk byla potlačena tak, jak je to jen možné.

Dalším předmětem předloženého vynálezu dodatečně je účinně zvýšit produkci rekombinantních buněk.

Konečně v souhlase s vynálezem je zapotřebí, aby^4Czlepšila a vytvořila adaptace rekombinantních buněk na séra prostá a proteinu prostá media.

V souhlase s vynálezem jsou tyto úkoly plněny pomocí media pro proteinu prostou a séra prostou kultivaci buněk, zejména savčích buněk, jehož charakteristickým rysem je, že medium obsahuje podíl sojového hydrolyzátu.

Překvapivě bylo možné ukázat, že cílů, které jsou shora definovány, může být dosaženo kultivací buněk v mediu, které obsahuje sojový hydrolyzát, bez nutnosti *

snášet nevýhody séra prosté kultivace, které jsou v dřívější praxi popisovány. Na rozdíl od jiných, z dřívější praxe známých hydrolyzátů, jako jsou například pšeničné hydrolyzáty, rýžové hydrolyzáty nebo kvasničné hydrolyzáty, bylo zjištěno, že pouze sojové hydrolyzáty zprostředkují vlastnosti v souhlase s vynálezem a vedou například k výrazně zvýšenému výtěžku cílového rekombinantního proteinu. Při zacházení s těmito termíny, může být používán buď termín sojový hydrolyzát nebo sojový pepton, aniž by měly různé významy.

Medium v souhlase s vynálezem obsahuje nejlépe sojový hydrolyzát v množství více než 10 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost media. Zpravidla je sojový hydrolyzát v mediu poskytován v množství 4 až 40 %.

Volba specifického sojového hydrolyzátů není v souhlase s vynálezem rozhodující. Podle vynálezu může být používáno velké množství sojových preparátů, které se vyskytují na trhu, např. peptony ze sojové moučky, enzymaticky štěpené (např. papainem), s hodnotou pH mezi 6,5 a 7,5, celkovým obsahem dusíku mezi 9 a 9,7 % a obsahem popela mezi 8 a 15 %. Toto jsou peptony ze sóji ve formě, ve které jsou odborníky v tomto oboru pro buněčnou kulturu obecně používány.

V souhlase s preferovanou formou provedení se v mediu podle vynálezu používá rafinovaný preparát sojového hydrolyzátů nebo jeho surová frakce. Nečistoty, které by mohly s účinnou kultivací interferovat, jsou nejvhodněji odstraněny během této rafinace nebo se vylepší přesnost hydrolyzátů např. co se týká molekulové hmotnosti.

Podle vynálezu se během této rafinace v praxi osvědčilo zařazení ultrafiltračního kroku jako zvláště cenné; vzhledem k tomu je v mediu podle vynálezu speciálně dávána přednost používání sojového hydrolyzátů po ultrafiltraci.

Ultrafiltrace může probíhat v souhlase s procesem jak je zevrubně popisován v dřívější technice např. při používání membránových flitrů s definovanou mezní velikostí.

Rafinace sojového peptonu po ultrafiltraci může probíhat pomocí gelové chromatografie, např. chromatografie na Sephadexu, například se Sephadexem G25 nebo Sephadexem G10 nebo ekvivalentními materiály, chromatografie na inotoměničích, afinitní chromatografie, velikostně vylučovací chromatografie nebo chromatografie na obrácených fázích. To jsou technické procesy, se kterými je odborník na tomto poli obeznámen. Při aplikaci těchto metod mohou být voleny • «· ·♦ · · · · · ···· ··· · · · · • · · · · · ·· · • · · · ······· · · « · · · « · · « «······ · · · · · ···· takové frakce, které obsahují sojový hydrolyzát o definované molekulové hmotnosti, tj. < 1000 daltonů. výhodně < 500 daltonů a zejména < 350 daltonů.

Proto vynález také zahrnuje postup produkce séra prostého a proteinu prostého media pro kultivaci buněk, skládající se ze získání sojového hydrolyzátu, ultrafiltrování řečeného sojového hydrolyzátu ultrafiltračním procesem, rafinování frakce řečeného sojového hydrolyzátu za použití velikostně vylučovací chromatografie a vybrání frakcí sojového hydrolyzátu, které tvoří sojový hydrolyzát mající molekulovou hmotnost < 1000 daltonů, výhodně < 500 daltonů a zejména < 350 daltonů.

Charakteristickým rysem zvláště výhodného sojového hydrolyzátu je, že má obsah volných aminokyselin mezi 10,3 % a 15,6 %, nebo raději mezi 12% a 13,54 %, celkový obsah dusíku mezi 7,6 % a 11,4 % nebo lépe mezi 8,7 % a 9,5 % a obsah endotoxinů < 500 jednotek./g a přičemž nejméně 40 %, výhodně nejméně 50 % anebo lépe zejména pak 55 %, má molekulovou hmotnost 200 až 500 daltonů a nejméně 10 % nebo lépe 15 %, má molekulovou hmotnost 500 až 1000 daltonů. Nejvýhodnější je. když nejméně 90 % sojového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů. Takový hydrolyzát se zvlášť dobře hodí pro průmyslovou produkci rekombinantních proteinů, protože vzhledem ke svým speciálním charakteristickým rysům, může být zvlášť snadno standardizován a je využitelný v rutinních postupech.

Kromě sojového hydrolyzátu může medium v souhlase s vynálezem obsahovat o sobě známým způsobem také syntetická media, jako např. DMEM / HAM's F12, Medium 199 nebo RPMI, která jsou z literatury dostatečně známa.

Nad to navíc obsahuje medium podle vynálezu výhodně také aminokyseliny, nejlépe takové, které jsou zvoleny ze skupiny, jež obsahuje L-asparagin, L-cystein, Lcystin, L-prolin, L-tryptofan, L-glutamin nebo jejich směsi.

Následující kyseliny jsou podle vynálezu k mediu výhodně i přidávány: Lasparagin (v množství 0,001 až 1 g/l media, výhodně 0,1 až 0,05 g/l a zejména 0,015 až 0,03 g/l); L-cystein (0,001 až 1 g/l, výhodně 0,005 až 0,05 g/l a zejména 0,01 až 0,03 g/l); L-cystin (0,001 až 1 g/l, výhodně 0,01 až 0,05 g/l a zejména 0,015 až 0,03 g/l); L-prolin (0,001 až 1,5 g/l, výhodně 0,01 až 0,07 g/l a zejména 0,02 až 0,05 g/l); L-tryptofan (0,001 až 1 g/l, výhodně 0,01 až 0,05 g/l a zejména 0,015 až 0,03 g/l); Lglutamin (0,05 až 1 g/l, výhodně 0,1 až 1 g/l).

Nahoře označené aminokyseliny mohou být podle vynálezu přidávány k mediu buď individuálně nebo v kombinaci. Kombinovaná adice směsi aminokyselin, která obsahuje všechny shora zmíněné aminokyseliny je zvláště preferována.

Séra prosté a proteinu prosté medium se používá při speciální formě provedení, při níž toto medium dodatečně obsahuje kombinaci shora zmíněné směsi aminokyselin a rafinovaný, ultrafiltrovaný sojový pepton.

Bylo například překvapivě zjištěno, že kvůli inaktivaci virů nebo jiných patogenů může být medium bez negativních vlivů zahříváno přibližně 5 až 20 min, výhodně 15 min na 70 až 95°C a zejména 85 až 95°C.

Podle vynálezu lze používat v kombinaci se sojovým hydrolyzátem každé známé syntetické medium. Běžná syntetická media mohou obsahovat anorganické soli, aminokyseliny, vitaminy, sacharidové zdroje a vodu. Použito může být na příklad medium DMEM / HAM's F12. Koncentrace sojového extraktu v mediu může být vhodně mezi 0,1 a 100 g/l, zejména pak 1 a 5 g/l. V souhlase se zvlášť preferovanou formou provedení může být použit sojový pepton, který byl z hlediska své molekulové hmotnosti standardizován. Vhodná molekulová hmotnost sojového peptonu je méně než 50 kD, lépe méně než 10 kD a nejlépe méně než 1 kD.

Přidávání ultrafiltrovaného sojového peptonu se ukázalo jako zvláště výhodné pro produktivitu řad rekombinantních buněk, přičemž průměrná molekulová hmotnost sojového peptonu je 350 daltonů (Quest Company). To je sojový izolát s celkovým obsahem dusíku kolem 9,5 % a obsahem volných aminokyselin kolem 13 %.

Dává se přednost zejména používání ultrafiltrovaného sojového peptonu s molekulovou hmotností < 1.000 daltonů, výhodně < 500 daltonů a zejména < 350 daltonů.

Podle vynálezu obsahuje medium vhodně také pomocné látky, jako např. pufrovací substance, stabilizátory oxidace, stabilizátory působení proti mechanickému tlaku nebo inhibitory proteázy.

Užívá se zejména medium s následujícím složením: minimální syntetické medium (1 až 25 g/l), sojový pepton (0,5 až 50 g/l), L-glutamin (0,5 až 1 g/l), NaHCO₃ (0,1 až 10 g/l), kyselina askorbová (0,0005 až 0,05 g/l), ethanolamin (0,0005 až 0,05 g/l) a seleničitan sodný (1 až 15 pg/l).

Pokud je zapotřebí, může být podle vynálezu k mediu přidáván jako odpěňovací činidlo neiontový tenzid jako např. polypropylenglykol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 nebo PLURONIC F-108).

Toto činidlo se používá obvykle, aby chránilo buňky před negativními účinky aerace, protože bez přidání tenzidu stoupající a praskající vzduchové bubliny mohou vést k poškození těch buněk, které jsou umístěny na povrchu těchto vzduchových bublin (vystřelování) [Murhammer a Goochee, Biotechnol. Prog., 6, 142-148 (1990)]

Množství neiontového tenzidu může být takto mezi 0,05 a 10 g/l, nicméně se však dává přednost zejména nejmenšímu možnému množství mezi 0,1 a 5 g/l.

Mimoto může medium podle vynálezu obsahovat také cyklodextrin nebo jeho deriváty.

Séra prosté a proteinu prosté medium obsahuje výhodně inhibitor proteasy, který je vhodný pro tkáňovou kultury a je syntetického nebo rostlinného původu.

V souhlase s vynálezem jsou jako buňky pro kultivaci v mediu výhodně používány buňky, které již byly adaptovány, tj. buňky, které již byly adaptovány pro růst v proteinu prostém a séra prostém mediu. Bylo zjištěno, že s takovými předem adaptovanými buňkami mohou být dosahovány nejen vyšší výtěžky, ale i jejich stálost vůči kultivaci v séra prostém a proteinu prostém mediu je při použití media podle vynálezu zřetelně zlepšena.

Avšak bylo dokázáno, že v souhlase s vynálezem jsou zvláště cenné rekombinantní buněčné klony, protože ty jsou v séra prostých a proteinu prostých mediích stálé od počátku až do nejméně 40 generací, výhodně až nejméně 50 generací a exprimují rekombinantní produkty.

Takové buněčné klony se dají získat z buněčné kultury, která se obdrží po kultivaci rekombinantního originálního buněčného klonu v sérum obsahujícím mediu a readaptací buněk na séra prosté a proteinu prosté medium.

Výrazu originální buněčný klon je možné rozumět tak, že znamená transfektant rekombinantního buněčného klonu, který po transfekci hostitelských buněk rekombinantní nukleotidovou sekvencí, exprimuje za laboratorních podmínek stabilním způsobem rekombinantní produkt. Aby se optimalizoval jeho růst, množí se originální klon v mediu obsahujícím sérum. Pro zvýšení jeho produktivity se originální klon množí, popřípadě v přítomnosti selekčního činidla, se selekcí na selekční markér a/nebo amplifikační markér. Pro průmyslovou produkci ve velkém měřítku se

originální buněčný klon množí za sérum obsahujících podmínek kultivace do vysoké hustoty buněk a potom je právě před produkční fází readaptován na séra prosté nebo proteinu prosté medium. V tomto případě probíhá kultivace výhodně bez selekčního tlaku.

Kultivace rekombinantního originálního buněčného klonu může probíhat od začátku v séra prostém a proteinu prostém mediu a výsledkem potom je, že readaptace dále již není nutná. Pokud se požaduje, může i v tomto případě být použito selekční činidlo a selekce proběhne na selekčním markéru a/nebo amplifikačním markéru. Postup je popsán například v EP 0 711 385.

Buněčná kultura, která se získá po readaptaci na séra prosté a proteinu prosté medium, se testuje na ty klony buněk buněčné populace, které dávají produkty za séra prostých a proteinu prostých podmínek stabilním způsobem, popřípadě v absenci selekčního tlaku. Může to probíhat například pomocí imunofluorescence se značkovanými specifickými protilátkami, které jsou zaměřeny na rekombinantní polypeptid nebo protein. Buňky, které jsou identifikovány jako producenti produktu, se izolují z buněčné kultury a jsou znovu namnoženy za séra prostých a proteinu prostých podmínek, které jsou výhodně ekvivalentní podmínkám produkce. Izolace buněk může takto proběhnout oddělením buněk a jejich testováním na producenty produktu.

Buněčná kultura, obsahující stabilní buňky, může být znovu testována na stabilní rekombinantní klony a ty jsou z buněčné kultury izolovány a subklonovány. Stabilní rekombinantní buněčné klony, které se získaly za séra prostých a proteinu prostých podmínek, mohou být pak za séra prostých a proteinu prostých podmínek dále množeny.

Rekombinantní buněčné klony nebo buněčné populace, které byly touto cestou v souhlase s vynálezem připraveny, vynikají zejména tím význačným rysem, že jsou stálé nejméně po 40 generací, výhodně nejméně 50 generací a zejména pak více než 60 generací a exprimují rekombinantní produkt.

Příklad takového rekombinantního stabilního buněčného klonu nebo buněčné populace byl v souhlase s Budapešťskou konvencí registrován pod číslem 98012206 u ECACC (UK).

Buněčná kultura, která má být podle vynálezu kultivována, pochází přednostně z rekombinantních buněk savců. Rekombinantními savčími buňkami mohou takto být všechny ty buňky, jež obsahují sekvence, které kódují rekombinantní polypeptid nebo protein. Z tohoto hlediska jsou zahrnovány všechny kontinuálně rostoucí buňky, které rostou adherentně nebo neadherentně. Preferovány jsou zejména rekombinantní CHO buňky nebo BHK buňky. Rekombinantními polypeptidy nebo proteiny mohou být krevní faktory, růstové faktory nebo jiné biomedicinsky relevantní produkty.

Podle předkládaného vynálezu jsou preferovány buněčné klony, které obsahují kódující sekvenci pro rekombinantní krevní faktor jako Faktor II, Faktor V, Faktor VII, Faktor Vlil, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein S, Protein C, aktivovanou formu některého z těchto Faktorů nebo vWF a jsou schopny tyto exprimovat po několik generací stabilním způsobem. Z tohoto hlediska jsou speciálně preferovány rekombinantní CHO buňky, které exprimují vWF nebo polypeptid s vWF aktivitou, Faktor Vlil nebo polypeptid s Vlil aktivitou, vWF a Faktor Vlil, Faktor IX nebo Faktor II.

K nastartování hlavní buněčné banky je zapotřebí 30 generací. Nejméně kolem 40 generací je třeba, aby se uskutečnila průměrná várka kultury v 1000 I měřítku. Při startu z individuálního klonu je s mediem podle vynálezu možné připravit hlavní buněčnou banku (MCB) a pracovní buněčnou banku (WCB) s přibližně 8 10 generacemi a odtud buněčnou kulturu až do 20 - 25 generací za proteinu prostých a séra prostých podmínek v produkčním měřítku (produkční biomasa), zatímco v porovnání s předchozími buněčnými klony a medii se některé generace stávají po růstu v séra prostém a proteinu prostém mediu nestálé a výsledkem je, že a) není možná jednotná buněčná kultura s producenty produktu a b) není možná stabilní produktivita produktu v dosti dlouhém časovém úseku.

Avšak ve shodě s vynálezem bylo naproti tomu dokonce možné zjistit zvýšenou produktivitu produktu i ve srovnání s originálním buněčným klonem, který byl kultivován v sérum obsahujícím mediu.

V souladu s dalším aspektem se vynález také vztahuje na způsob kultivace buněk, zejména savčích buněk, který spočívá v tom, že tyto buňky jsou zavedeny do media podle vynálezu a pak jsou v tomto mediu kultivovány.

Vynález se tudíž také týká použití media podle vynálezu pro kultivaci rekombinantních buněk, výhodně eukaryotických buněk a zejména buněk savců.

Předmětem předkládaného vynálezu je tudíž také buněčná kultura, která obsahuje medium podle vynálezu a buňky, výhodně eukaryotické buňky a zejména savčí buňky.

• · · · « · ·

Vynález bude podrobněji objasněn níže následujícími příklady stejně jako obrázky na výkresech, ale není tímto omezován.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje výsledky kultivace buněčného klonu rFVIII-CHO v průtočném bioreaktoru:

a) aktivita faktoru Vlil (milijednotky / ml) a rychlost průtoku (1-5 / den) po dobu 42 dní;

b) volumetrická produktivita (jednotky Faktoru Vlil / I / den) v průtočném bioreaktoru.

Obr. 2 ukazuje srovnání produktivity Faktoru Vlil (milijednotky / ml) při použití postupu po dávkách v různých mediích pro případ kultivace CHO buněk, které exprimují rFaktor Vlil. Mix 1 tvoří séra prosté a proteinu prosté medium bez sojového hydrolyzátu, obsahující ale směs aminokyselin jak se uvádí v tabulce 4; Mix 2 tvoří séra prosté a proteinu prosté medium se sojovým hydrolyzátem; Mix 3 tvoří séra prosté a proteinu prosté medium obsahující sojový hydrolyzát a směs aminokyselin jak se uvádí v tabulce 4 a Mix 4 tvoří séra prosté a proteinu prosté medium obsahující 2,5 g / I rafinovaného, ultrafiltrovaného sojového hydrolyzátu a směs aminokyselin jak se uvádí v tabulce 4. Pro rafinaci ultafiltrovaného sojového hydrolyzátu byla použita kolona se Sephadexem®

Obr. 3 ukazuje produktivitu Faktoru Vlil (jednotky / I) v případě kontinuálního pěstování CHO buněk, které exprimují rFaktor Vlil v séra prostém a proteinu prostém mediu po počátku přidávání rafinovaného, ultrafiltrovaného sojového peptonu, jmenovitě šestého dne kultivace a

Obr. 4 ukazuje BHK buňky exprimující rekombinantní Faktor II, které byly množeny v proteinu prostém a séra prostém mediu obsahujícím sojový hydrolyzát.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stabilita rvWF-CHO buněk po výměně ze sérum obsahujícího media do séra prostého a proteinu prostého media

CHO-dhfr buňky byly ko-transfektovány plasmidem phAct-rwWF a pSV-dhfr a vWF-exprimující klony byly subklonovány jak popisuje Fischer a spol. [FEBS Letters 351, 345-348 (1994). Ze subklonů byla startována pracovní buněčná banka (WOB), která stabilním způsobem exprimuje rvWF za sérum obsahujících podmínek, ale za nepřítomnosti MTX a buňky byly imobilizovány na mikroporézním nosiči (Cytopore®) za sérum obsahující podmínek. Přehození buněk do séra prostého a proteinu prostého media se uskutečnilo potom, až bylo na matrici dosaženo buněčné hustoty 2 χ 10⁷ buněk / ml. Buňky byly dále za séra prostých a proteinu prostých podmínek kultivovány po několik generací. Buňky byly v séra prostém a proteinu prostém mediu v různých časových intervalech testovány pomocí imunofluorescence značkovanými anti-vWF protilátkami. Zhodnocení stability buněk se uskutečnilo použitím pracovní buněčné banky před přehozením media po 10 generacích a po 60 generacích do séra prostého a proteinu prostého media. Zatímco pracovní buněčná banka stále exprimovala 100 % rvWF producentů, podíl rvWF producentů poklesl přibližně na 50 % po 10 generacích v séra prostém a proteinu prostém mediu. Po 60 generacích bylo více než 95 % buněk identifikováno jako neproduktivních.

Příklad 2

Klonování stabilních rekombinantních CHO klonů

Byly připraveny serie ředění z buněčné kultury obsahující rvWF-CHO buňky podle příkladu 1 [tento stabilní buněčný klon, který byl označen r-vWF-CHO byl podle Budapešťské konvence 22. ledna 1998 zaregistrován u ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK a získal depoziční číslo 98012206], a ty byly kultivovány po 60 generací v séra prostém a proteinu prostém mediu a 0,1 buněk bylo vysazeno do každé jamky na mikrotitrační desce. Buňky byly přibližně 3 týdny kultivovány v DMEM / HAM's F12, bez přidání séra nebo proteinu a bez nátlaku na selekci a buňky byly testovány pomocí imunofluorescence • to • * to · * · · totototo • to · * to · to · to * to toto to · · to ·· » · » toto «toto ··» to······ · · to ·· ···· značkovanými anti-vWF protilátkami. Buněčný klon, který byl shledán jako pozitivní, byl použit jako startovací klon pro přípravu semenné buněčné banky. Hlavní buněčná banka (MCB) byla počata ze semenné buněčné banky v séra prostém a proteinu prostém mediu, jednotlivé ampule byly dány stranou a zmrazený pro další preparaci pracovní buněčné banky. Pracovní buněčná banka byla připravena v séra prostém a proteinu prostém mediu z jednotlivé ampule. Buňky byly imobilizovány na porézních mikronosičích a po několik generací dále kultivovány za séra prostých a proteinu prostých podmínek. Buňky byly v séra prostém a proteinu prostém mediu v různých časových intervalech testovány pomocí imunofluorescence se značkovanými antivWF protilátkami. Zhodnocení stability buněk se uskutečnilo ve stadiu pracovní buněčné banky a po 10 a 60 generacích v séra prostém a proteinu prostém mediu. Kolem 100 % buněk bylo identifikováno jako pozitivní stabilní klony, které exprimují rvWF ve stadiu pracovní buněčné banky po 10 generacích a 60 generacích.

Příklad 3

Specifická produktivita buněk rekombinantních buněčných klonů

Definovaný počet buněk byl během kultivace rekombinantních buněk v definovaných stadiích odebrán a tyto buňky byly 24 hodin inkubovány v čerstvém mediu. V kapalinách supematantu z buněčných kultur byla stanovena rvWF: RistoCoF-aktivita. Tabulka 1 ukazuje, že v případě klonů stabilních rekombinantních buněk podle vynálezu, specifická produktivita buněk byla v séra prostém a proteinu prostém mediu stabilní i po 60 generacích a dokonce vzrostla ve srovnání s původním klonem, který byl kultivován v mediu obsahujícím sérum.

•« · * • · « · • · •99 9999 * · »9 • · · • * lf · 9 • · »

99··

Tabulka 1

Buněčný klon	Specifická buněčná produktivita pracovních buněk v milijednotkách rvWF/10⁶ buněk/ /den	Specifická buněčná produktivita po 10 generacích v milijednotkách rvWF/10⁶ buněk/ /den	Specifická buněčná produktivita po 60 generacích v milijednotkách rvWF/10⁶ buněk/ /den
rvWF-CHO č 808.68 originální buněčný klon	55	30	< 10
r-vWF-CHO F7*) stabilní klon	62	65	60

*) zaregistrován 22. ledna 1998 [ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK; depoziční číslo 98012206]

Příklad 4

Složení syntetického séra prostého a proteinu prostého media

Tabulka 2

Komponenta	g/i	Preferované množství (podle našich znalostí v době patentové přihlášky) v g /1
Minimální syntetické medium (DMEM/HAM's F12)	1 -100	11,00-12,00
Sojový pepton	0,5-50	2,5
L-Glutamin	0,05 -1	0,36
Kyselina askorbová	0,0005 - 0,05	0,0035
NaHCO₃	0,1 -10	2,00
Ethanolamin	0,0005 -0,05	0,0015
Seleničitan sodný	1 -15 pg /1	8,6 pg /1
Případně: Synperonic F68	0,1 - 10	0,25

• · • ·

Příklad 5

Kultivace rFVIII-CHO buněk v proteinu prostém a séra prostém mediu

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována v 10 I, míchaném průtočném tanku. V tomto případě bylo použito medium podle příkladu 4. Buňky byly při tom imobilizovány na porézním mikronosiči (Cytopore®, Pfi^macia) a potom kultivovány nejméně 6 týdnů. Rychlost průtoku byla 4 změny objemu za den; pH bylo 6,9 - 7,2; koncentrace O₂ byla kolem 20- 50 % a teplota byla 37°C.

Obrázek 1 ukazuje výsledky kultivace klonu rFVIII-CHO buněk v 10 I průtočném bioreaktoru.

a) Aktivita Faktoru VIII (milijednotky /1) a rychlost průtoku (1-5 / den) během periody 42 dnů.

Tabulka 3

Dny kultivace	Specifická produktivita buněk (milijednotky /10® buněk / den)	Imunofluorescence (% FVIII pozitivních buněk)
15	702	neanalyzováno
21	1125	neanalyzováno
28	951	> 95%
35	691	> 95%
42	970	neanalyzováno

Tabulka 3 ukazuje stabilitu a specifickou produktivitu rFVIII-exprimujících buněk. K získání těchto výsledků byly odebrány vzorky po 15, 21,28, 35 a 42 dnech, potom byly ceríifugovány při 300 g a znovu suspendovány v čerstvém séra prostém a proteinu prostém mediu. Koncentrace Faktoru Vlil v kapalinách supernatantu buněčných kultur a počet buněk byl stanovován po dalších 24 hodinách. Z těchto dat byla vypočítána specifická produktivita FVIII.

Byla dosažena stabilní průměrná produktivita 888 milijednotek / 10⁶ buněk / den. Tato stabilní produktivita byla potvrzena také imunofluorescencí se značkovanými anti-FVIII protilátkami po 15, 21, 28, 35 a 42 dnech v séra prostém a proteinu prostém mediu.

· ·· » 0 >0 0» « 0 0 0 » * 0 ♦

• 0 «·0 ·

Příklad 6

Srovnání produktivity rekombinantních FVIII-CHO buněk v séra prostém a proteinu prostém mediu obsahujícím další složky media

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována po jednotlivých vsádkách. V tomto případě se použilo medium podle příkladu 4 a k němu byly přidávány následující aminokyseliny:

Tabulka 4

Aminokyselina	mg /1	Preferované množství v mg /1 (podle našich znalostí v době patentové přihlášky)
L-Asparagin	1 -100	20
L-Cystein . HCI. H₂0	1 -100	15
L-Cystin	1 -100	20
L-Prolin	1 -150	35
L-Glutamin	50-1000	240

Buňky byly množeny při 37°C a pH 6,9 - 7,2. Buňky byly množeny postupem po dávkách během doby 24 - 72 h.

Produktivita rekombinantních FVIII-CHO buněk byla stanovována v následujících směsích media:

Mix 1: tvoří séra prosté a proteinu prosté medium bez sojového peptonu a obsahuje dodatečně směs aminokyselin podle tabulky 4 uvedené shora.

Mix 2: tvoří séra prosté a proteinu prosté medium obsahující sojový pepton.

Mix 3: tvoří séra prosté a proteinu prosté medium obsahující sojový pepton a dodatečně obsahuje směs aminokyselin podle tabulky 4 uvedené shora.

Mix 4: tvoří séra prosté a proteinu prosté medium a dodatečně obsahuje směs aminokyselin podle tabulky 4 uvedené shora a 2,5 g /1 rafinovaného, ultrafiltovaného sojového peptonu. Rafinace ultrafiltrovaného sojového peptonu byla provedena chromatograficky na Sephadex® koloně.

• » • · • ·

Příklad 7

Kultivace rekombinantních FVIII-CHO buněk v proteinu prostém a séra prostém mediu metodou chemostat kultury

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována v míchaném, 10 I tanku bioreaktoru. Jako medium bylo v tomto případě použito medium podle příkladu 4, bez sojového peptonu, obsahující směs aminokyselin podle příkladu 6. Buňky byly množeny při 37°C a pH 6,9 - 7, 2; koncentrace kyslíku byla 20 - 50 % nasycení vzduchu. Pro stanovení titru Faktoru Vlil a koncentrace buněk v kapalině supernatantu kultury, byly odebírány vzorky každých 24 hodin. Celková koncentrace buněk byla od druhého dne do čtrnáctého dne konstantní. Počátkem šestého dne byl do media přidán ultrafiltrovaný sojový pepton. Produktivita Faktoru Vlil je ilustrována obr. 3; měření byla prováděna systémem CHROMOGENIX CoA FVIII : C / 4. Imunofluorescence byla provedena značkovanými anti-FVIII protilátkami. Z dat lze vidět, že ke zřetelnému vzrůstu produktivity Faktoru Vlil a tedy i vzrůstu volumetrické produktivity systému bioreaktoru, došlo jako následek přidání sojového peptonu, při čemž to ke zřetelnému zvýšení růstu buněk nevedlo. Nepřítomnost sojového peptonu v kontinuální kultuře vede po málo dnech k poklesu produktivity Faktoru Vlil, zatímco přidání sojového peptonu má za následek téměř desetinásobný vzrůst produktivity. Nicméně vzhledem k tomu, že toto přidání počet buněk nezvyšuje, je tak doloženo, že ultrafiltrovaný sojový pepton má za následek zřetelný vzrůst produktivity, který je na růstu buněk nezávislý.

Příklad 8

Srovnání rychlosti růstu a produktivity rekombinantních FVIII-CHO buněk v proteinu prostém a séra prostém mediu obsahujícím různé hydrolyzáty

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována po jednotlivých vsádkách. V tomto případě se použilo séra prosté a proteinu prosté medium jak je popisováno v příkladu 4 a k němu byly přidávány různé hydrolyzáty (ze sóji, kvasnic, rýže a pšenice). Jako kontrola bylo použito séra prosté a proteinu prosté medium, ke kterému nebyl přidán žádný hydrolyzát.

Počáteční hustota buněk byla 0,6 x 10⁶, respektive 0,4 x 10⁶. Buňky byly kultivovány po jednotlivých vsádkách při 37°C a pH 6,9 - 7,2.

• · ♦ · · ·

·····«· ··

Tabulka 5 uvádí výsledky kultivačních experimentů s rFVIII-CHO buňkami v séra prostém a proteinu prostém mediu, ke kterému byl přidán sojový hydrolyzát (ultrafiltrovaný) a kvasnicový hydrolyzát. Počáteční hustota buněk byla 0,6 x 10⁶. Jako kontrola bylo použito séra prosté a proteinu prosté medium bez hydrolyzátu.

Tabulka 5

Hydrolyzát	Konečná hustota buněk (x 10⁶/ml)	Titr FVIII (milijednotky / ml)	Srážecí aktivita FVIII (milijednotky / ml)
Sója	3,6	485	508
Kvasnice	3,3	226	230

Tabulka 6 uvádí výsledky kultivačních experimentů s rFVIII-CHO buňkami v séra prostém a proteinu prostém mediu, ke kterému byl přidán sojový hydrolyzát (ultrafiltrovaný), rýžový hydrolyzát a pšeničný hydrolyzát. Počáteční hustota buněk byla 0,6 x 10⁶. Jako kontrola bylo použito séra prosté a proteinu prosté medium bez přidávání hydrolyzátu.

Tabulka 6

Hydrolyzát	Konečná hustota buněk (x 10⁶/ml)	Titr FVIII (milijednotky / ml)	vWF - antigen (pg / ml)
Sója	3,7	1142	6,7
Rýže	3,0	479	3,2
Pšenice	3,4	522	3,9
Kontrola	3,0	406	3,1

Tabulka 7 uvádí výsledky kultivačních experimentů s rFVIII-CHO buňkami v séra prostém a proteinu prostém mediu, ke kterému byl přidán sojový hydrolyzát (ultrafiltrovaný) a pšeničný hydrolyzát. Počáteční hustota buněk činila 0,4 x 10⁶.

Tabulka 7

Hydrolyzát	Konečná hustota buněk (x 10⁶/ml)	Titr FVIII (milijednotky / ml)	FVIII - antigen (pg / ml)	vWF - antigen (pg / ml)
Sója	1,6	1427	166	17,2
Pšenice	1,0	1120	92	7,9

* · • · « · « · · ·

I .· · • · · · · · ·

Příklad 9

Kultivace BHK buněk v proteinu prostém a séra prostém mediu obsahujícím sojový hydrolyzát

BHK-21 (ATCC CCL 10) buňky byly třikrát ko-transfektovány následujícími plasmidy pomocí CaPO₄ postupu: 25 pg plasmidu pSV-FII [Fischer B. a spol., J. Biol. Chem. 271, 23737- 23742 (1996)], který obsahuje lidský Faktor II (protrombin)-cDNA za kontroly SV40 promotorem (SV40 promotor počátečního genu); 4 pg plasmidu pSV-DHFR plasmidu pro methotrexatovou resistenci a 1 pg plasmidu pUCSV-neo plasmidu [Schlokat U. a spol., Biotech.Appl. Biochem. 24,_257-267 (1996)], který zprostředkovává G418 / neomycinovou resistenci. Stabilní buněčné klony byly vybrány pomocí kultivace v prostředí, které obsahovalo 500 pg /1 G418, zvyšováním koncentrace methotrexatu postupným způsobem až na koncentraci 3 pM.

Klony, které byly touto cestou získány byly subklonovány a adaptovány na proteinu prosté a séra prosté medium. Kultivace byla prováděna za použití suspenzní kultivační techniky.

Výsledky lze vidět v tabulce 6; BHK buňky, které byly množeny v proteinu prostém a séra prostém mediu obsahujícím sojový hydrolyzát, projevily vysokou a stabilní rychlost produkce rekombinantního Faktoru II.

Claims

1. Bezbílkovinné a bezsérové medium pro kultivaci buněk vyznačující se tím, že obsahuje sojový hydrolyzát, přičemž alespoň 40 % sojového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů.

2. Medium podle nároku 1 vyznačující se tím, že medium obsahuje sojový hydrolyzát v množství 10 % přebytku vztaženo na celkovou hmotnost suchého media.

3. Medium podle nároku 1 vyznačující se tím, že medium obsahuje ultrafiltrovaný sojový hydrolyzát.

4. Medium podle nároku 3 vyznačující se tím, že medium obsahuje rafinovaný sojový hydrolyzát.

5. Medium podle nároku 1 vyznačující se tím, že sojový hydrolyzát má obsah endotoxinu < 500 jednotek / g.

6. Medium podle nároku 1 vyznačující se tím, že alespoň 50 % sojového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů.

7. Medium podle nároku 6 vyznačující se tím, že alespoň 55 % sojového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů.

8. Medium podle nároku 1 vyznačující se tím, že medium obsahuje také aminokyselinu.

9. Medium podle nároku 7 vyznačující se tím, že aminokyselina je zvolena ze skupiny, kterou tvoří L-asparagin, L-cystein, L-cystin, L-prolin, L-tryptofan, L-glutamin nebo jejich směsi.

• · • ·

20 : .· · : :··:·· ······· ·* ·

10. Medium podle nároku 1 vyznačující se tím, že medium obsahuje také pomocné substance zvolené ze skupiny, kterou tvoří pufrovací substance, stabilizátory oxidace, stabilizátory působení proti mechanickému tlaku nebo inhibitory proteázy.

11. Použití media podle nároku 1 pro kultivaci buněk savců.

12. Použití media podle nároku 1 pro kultivaci savčích buněk zvolených ze skupiny, kterou tvoří CHO buňky a BHK buňky.

13. Způsob kultivace buněk vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení buněk do media podle nároku 1 a pěstování těchto buněk v tomto mediu.

14. Způsob produkce proteinu z buněčné kultury vyznačující se tím, že zahrnuje:

zavedení buněk do media podle nároku 1, přičemž tyto buňky exprimují požadovaný protein;

pěstování těchto buněk v uvedeném mediu a exprimování uvedeného proteinu a tím produkování směsi uvedených buněk a uvedeného proteinu v mediu;

rafinaci uvedeného proteinu z uvedené směsi.

15. Buněčná kultura vyznačující se tím, že zahrnuje buňky savců a medium podle nároku 1.

16. Způsob produkce media pro buněčnou kulturu vyznačující se tím, že zahrnuje:

získání sojového hydrolyzátu;

ultrafiltraci tohoto sojového hydrolyzátu při použití ultrafiltračního procesu; rafinaci frakce tohoto sojového hydrolyzátu pomocí velikostně vylučovací chromatografie;

vybrání frakcí sojového hydrolyzátu tvořených sojovým hydrolyzátem majícím molekulovou hmotnost < 500 daltonů.