JP5458536B2 - 乳酸の製造方法及び乳酸発酵用添加剤 - Google Patents

Description

本発明は、乳酸の発酵生産に関し、特に、廃糖蜜を用いた乳酸発酵に代わる新たな乳酸発酵に用いる添加剤の提供と該添加剤を用いた乳酸の製造方法に関する。

本出願人らは、植物由来プラスチックの一つであるポリ乳酸の原料である乳酸を、発酵により低コストで製造するために、既に、アルコール発酵能の高いワイン酵母にL-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入して高効率でL-乳酸を生産する遺伝子組換え酵母の開発に成功している(特許文献１)。

一般に、工業的なスケールでの発酵においては、培地中に、ビタミンやミネラルなどの栄養源を添加して発酵効率を高めている。アルコール発酵においては、廃糖蜜が用いられている。廃糖蜜は、製糖時の副産物であって、ビタミン、ミネラルなど糖分以外の成分を含んだ黒褐色の粘ちょうな液体である。したがって、優れた発酵用の培地添加剤である。

一方、酵母を用いたアルコール発酵では、添加剤として脱脂大豆由来の大豆ペプチド素材を使用することが開示されている（特許文献２）。

さらに、大豆ペプチド素材を培地に添加することで酵母の冷凍ストレス耐性が向上することを記した報告もある（非特許文献１）。

特開2003-164295号公報 特開2006-238877号公報 Izawa et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol.75(2007), p533-537

廃糖蜜は、糖分以外の成分に富む優れた発酵用の培地添加剤であることから、乳酸発酵についても同様に培地添加剤として用いることができる。しかしながら、本発明者らによれば、廃糖蜜は黒褐色状の液体であるため、高い乳酸生産量を得るために廃糖蜜の含有量を高めると、発酵液が着色しあるいは余分な成分を含むことになり、ポリ乳酸の品質が低下するおそれがあることがわかった。このため、乳酸発酵において廃糖蜜を培地用添加剤として用いる場合、廃糖蜜に由来する着色成分を除去するために電気透析や脱色などの追加の精製プロセスが必要となることがわかった。このようなプロセスの追加は、ポリ乳酸を効率的に製造するにあたっては、大きなボトルネックとなってしまう。また、廃糖蜜使用量の増大は、乳酸生産コストに大きく影響することにもなる。

すなわち、乳酸発酵においては、廃糖蜜は栄養的には優れるがプロセスやコストの観点を考慮すると必ずしも好ましくないことがわかった。したがって、廃糖蜜の使用を回避又は抑制して糖質原料としてグルコースやスクロースなどのような汎用の原料を主体とした培地であっても効率的に乳酸を生産できることが要請される。

また、大豆ペプチド素材は、ビール様飲料などの各種発酵食品の添加剤として使用されているものの、食品の性質上、得られる食品の特性向上（風味など）の上昇のために用いられている。大豆ペプチドを貧栄養培地に用いる場合に発酵促進に影響があるかについては、全く検討されていなかった。

さらに、非特許文献１は、大豆ペプチド素材によりパン酵母の冷凍ストレスに特化した知見を開示するに留まり、発酵能や乳酸発酵に関してはなんら言及していない。

以上説明したように、現状において、工業用原料としての乳酸を得るための工業的な乳酸発酵に適した培地や培地添加剤及び乳酸製造方法は未だ提供されていない。

そこで、本発明は、こうした状況に鑑み、廃糖蜜の利用を回避又は抑制して、工業用原料としてより実用性の高い乳酸発酵技術を提供することを目的とする。

本発明者らは、大豆ペプチド素材について種々検討したところ、特定の大豆ペプチド素材につき、優れた乳酸発酵促進効果があることがわかった。すなわち、グルコースやスクロースなどの糖のみからなる培地に対して本発明らによる所定の大豆ペプチド素材の画分を含有する添加剤を加えることで高い乳酸生産性を実現できることがわかった。また、こうして得られる発酵液は、透明度も高く、特別な精製プロセスを簡素化又は省略できることもわかった。本発明者らは、こうした知見に基づき本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。

本発明によれば、乳酸の製造方法であって、炭素源と、１０００Da以下の画分が９８％以上である分子量分布を有する大豆ペプチド素材とを含有し、４００ｎｍにおける吸光度が０．１以下である培地を用いて、乳酸生産微生物を培養して乳酸発酵する工程、を備える、製造方法が提供される。

本発明においては、ペプチドとは、アミノ酸が２個以上結合１００個以下したものを意味する。また、大豆ペプチド素材とは、分離大豆タンパクや、脱脂豆乳等の大豆タンパク素材の加水分解物であって、大豆由来のペプチドを含有し、分解の程度や画分によっては大豆由来の遊離アミノ酸を含有している。

本発明の乳酸製造方法においては、前記培地が、前記培地は、前記大豆ペプチド素材を０．０１ｗｔ／ｖｏｌ％以上１．０ｗｔ／ｖｏｌ％以下含有するものであってもよい。また、前記大豆ペプチド素材は、前記分子量分布において５００Da以下の画分が９６％以上であってもよい。また、前記大豆ペプチド素材は、遊離アミノ酸を１８質量％以上含むものであってもよい。さらに、前記乳酸生産微生物は、遺伝子組換え乳酸生産酵母であってもよく、サッカロマイセス属酵母であってもよい。

本発明によれば、１０００Da以下の画分が９８％以上である分子量分布を有する大豆ペプチド素材を含有する、工業原料用の乳酸製造のための乳酸発酵用の培地添加剤が提供される。本発明の培地添加剤においては、前記大豆ペプチド素材は、前記分子量分布において５００Da以下の画分が９５％以上であってもよく、遊離アミノ酸を１８質量％以上含むものであってもよい。さらに、本発明の培地添加剤は、脱脂大豆の水可溶性成分のプロテアーゼ処理によって得られるものであってもよい。また、本発明の培地添加剤は、ポリ乳酸製造用であってもよい。

本発明によれば、工業原料用の乳酸製造のための乳酸発酵用培地添加剤の製造方法であって、脱脂大豆から水可溶性成分を回収する工程と、前記水可溶性成分をプロテアーゼ処理して、１０００Da以下の画分が９８％以上である分子量分布の大豆ペプチド素材を前記乳酸発酵用培地添加剤の少なくとも一部として得る工程と、を備える、製造方法が提供される。

本発明は、乳酸の製造方法、乳酸発酵用培地添加剤及びその製造方法に関する。本発明によれば、所定の分子量分布を有する大豆ペプチド素材を用いることで、廃糖蜜等の使用を抑制又は回避した色度を規制した培地であっても乳酸発酵を促進でき、乳酸生産量を高めることができる。また、本発明によれば、色度が抑制された発酵液を得ることができるため、発酵液について追加の精製プロセスを要請するものでもない。したがって、本発明によれば着色成分の混入を抑制又は回避して乳酸を効率良く製造することができ、ポリ乳酸原料など工業用原料としての乳酸の製造に適した乳酸発酵技術を提供することができる。

なお、本明細書において、「廃糖蜜」とは、製糖時の副産物であって、ビタミン、ミネラルなど糖分以外の成分を含んだ褐色〜黒褐色の粘ちょうな液体である。また、「廃糖蜜」は、原料糖由来の糖分を含んでいてもよい。なお、これに対して「糖蜜」とは、原料糖から糖分以外の廃糖蜜を分離して得られる液体をいう。

以下、本発明の各種実施形態につき、乳酸発酵用培地添加剤及びその製造方法についてまず説明し、次いで、乳酸製造方法について詳細に説明する。

（乳酸発酵用培地添加剤及びその製造方法）
本発明の乳酸発酵用添加剤は、所定の大豆ペプチド素材を含有することができる。以下、まず、本発明の乳酸発酵添加剤の得るのに好ましい製造方法について説明し、次いで乳酸発酵用の培地添加剤について説明する。

（乳酸発酵用添加剤の製造方法）
本発明の乳酸発酵用添加剤の製造方法は、分離大豆タンパクや、脱脂豆乳等の大豆タンパク素材から水可溶性成分を回収する工程と、前記水可溶性成分をプロテアーゼ処理して、所定の大豆ペプチド素材を前記培地添加剤の少なくとも一部として得る工程と、を備えることができる。

（水可溶性成分の回収工程）
（大豆タンパク素材）
本発明で大豆タンパク素材の原料として使用される大豆は、原産地、種類、育種方法、遺伝子操作の有無、発芽処理や発酵処理の有無、成分組成などを問わない。種類は、例えば黄大豆、白大豆、緑大豆、黒大豆などのいずれでも使用が可能である。また育種や遺伝子組み換え技術によりリポキシゲナーゼなどの特定の酵素が欠損した大豆や、イソフラボン、サポニン、ＧＡＢＡ、大豆β−コングリシニン、大豆グリシニン、大豆脂質会合蛋白などの特定の成分が富化された大豆も使用できる。

本発明で使用される大豆タンパク素材は、分離大豆タンパクや脱脂豆乳であるが、これらは、脱脂大豆を経て得られる。脱脂大豆は、全脂大豆から圧搾抽出や溶媒抽出により脂質を除去したものであり、ヘキサンで脱脂した場合の脂質含量は通常２重量％以下である。脱脂に際しては、全脂大豆中のオイルボディを壊さなければ脂質が除去されにくいため、通常は圧篇などの物理的処理によりフレーク状とし、細胞をある程度破壊した状態に加工される。なお、脱脂大豆は風味を改善するため水蒸気や乾熱による加熱処理、アルコール洗浄処理、酸洗浄処理が施され、ＮＳＩが７０％以下に低下したものであっても本発明の製造法によれば十分高収率で蛋白質を抽出できるが、７０以上の低変性脱脂大豆を使用する方がより好ましく、８０以上がさらに好ましい。

脱脂大豆から水可溶性成分を回収するにあたって、脱脂大豆から抽出した後、固液分離により水可溶性成分を回収することが好ましい。脱脂大豆からの抽出は例えば以下のようにして行うことができる。脱脂大豆に対して添加する水の量は５〜１０倍量が好ましく、６〜８倍量がさらに好ましい。添加する水の温度は特に限定されないが、５０℃以上の温水であることが好ましい。より好ましくは６０℃以上であり、最も好ましくは７０℃以上７５℃以下である。さらに、抽出時間は特に限定されないが、３０分から２時間程度とすることができるが、好ましくは１時間程度である。なお、上記温水にて抽出する場合には、脱脂大豆に温水を供給した脱脂大豆分散液を、５０℃以上、好ましくは、６０℃以上、より好ましくは、７０℃以上７５℃以下に保持するようにする。こうすることで乳酸発酵の促進に有用な水可溶性成分が効果的に抽出されるとともに、安定した組成の大豆ペプチド素材を得ることができるからである。

吸水させた脱脂大豆を含む分散液を固液分離するには、遠心分離、ろ過、プレス等の通常の固液分離手段を用いることができる。固液分離によって得られる液体画分を水可溶性成分として用いることができる。

なお、後段のプロテアーゼ処理工程に先立って、水可溶性成分を予め熱処理しておくことが好ましい。こうすることでプロテアーゼによる分解物の組成をより均質化することができる。熱処理条件は特に限定しないが、加圧下での熱処理が好ましい。例えば、蒸気直接導入型殺菌機などを用いた加圧下で１２０℃〜１４０℃近傍にまで加熱し、一定時間（典型的には、数秒〜１分程度）保持しすることができる。なお、熱処理後には、その後積極的に冷却してもよい。プロテアーゼ処理を考慮すると、冷却到達温度は、後段のプロテアーゼ処理工程で用いるプロテアーゼの作用温度近傍とすることが好ましい。

（プロテアーゼ処理工程）
プロテアーゼ処理工程は、前記水可溶性成分をプロテアーゼ処理して、所定の特性の大豆ペプチド素材を前記培地添加剤の少なくとも一部として得る工程である。用いるプロテアーゼは特に限定されないで、商業的に入手可能な各種プロテアーゼを適宜使用できる。プロテアーゼには、大別してエキソ型プロテアーゼとエンド型プロテアーゼとがあるが、好ましくは、エンド型プロテアーゼ及びエキソ型プロテアーゼの双方を用いる。これら双方を用いることで、分子量分布と遊離アミノ酸含有量の双方を調節できる。

本発明で使用することができるエンド型プロテアーゼとしては、特に制限されず動植物由来、微生物由来のエンド型プロテアーゼが挙げられる。例えば、細菌由来、麹菌由来、放線菌由来の各プロテアーゼ、植物由来のパパイン、ブロメライン、動物由来のトリプシン、ペプシン、カテプシン類などを挙げることができる。具体的には、例えば、プロテアーゼＮ（アマノエンザイム社製）、アルカラーゼ、ニュートラーゼ（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、オリエンターゼ１０ＮＬ（エイチビィアイ社製）、サーモライシン（大和化成製）などの細菌由来のプロテアーゼ；スミチームＦＰ（新日本化学工業社製、エキソ型プロテアーゼも含む（両型である））、オリエンターゼＯＮＳ（エイチビィアイ社製）、プロテアーゼＭ（アマノエンザイム社製）などの麹菌由来のプロテアーゼ；アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ社製）などの放線菌由来のプロテアーゼ；パパインＷ−４０（アマノエンザイム社製）、ブロメライン（日本バイオコン社製）などの植物由来のプロテアーゼ；トリプシンＰＴＮ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、ペプシン（日本バイオコン社製）などの動物由来のプロテアーゼ；イカ肝臓由来カテプシンDなどのカテプシン類を挙げることができる。

本発明で使用することができるエキソ型プロテアーゼとしては、特に制限されず動植物由来、微生物由来のエキソ型プロテアーゼが挙げられる。例えば、麹菌由来の酸性カルボキシペプチダーゼ、酵母由来の酸性カルボキシペプチダーゼ、イカ肝臓由来のカルボキシペプチダーゼ、小麦由来のカルボキシペプチダーゼ、および麹菌由来のアミノペプチダーゼ、細菌由来のアミノペプチダーゼ、マイタケ由来のアミノペプチダーゼなどを挙げることができる。具体的には、例えば、カルボキシペプチダーゼＰ（シグマアルドリッチ社製）、スミチームＦＬＰＡ（新日本化学工業社製）、プロテアーゼＭ（アマノエンザイム社製）などの麹菌由来の酸性カルボキシペプチダーゼ；カルボキシペプチダーゼＹ（シグマアルドリッチ社製）などの酵母由来の酸性カルボキシペプチダーゼ；イカ肝臓カルボキシペプチダーゼなどの動物由来の酸性カルボキシペプチダーゼ；カルボキシペプチダーゼＷ（ぺんてる社製）、マイタケ由来アミノペプチダーゼなどの植物由来の酸性ペプチダーゼ；サカナーゼ（科研ファルマ社製）などの麹菌由来のアミノペプチダーゼ；アクセラーゼ（萬有通商社製）などの細菌由来のアミノペプチダーゼなどを例示することができる。

プロテアーゼ処理工程の条件は、得ようとする大豆ペプチド素材の特性や、用いるプロテアーゼの至適ｐＨや至適温度等の特性によって適宜設定される。至適ｐＨや至適温度が異なる複数種類のプロテアーゼを用いる場合、プロテアーゼ処理工程は、ｐＨ及び／又は温度等の異なる複数のプロテアーゼ処理段階を備えることになる。通常、例えば、ｐＨ２．５〜９．５、２０〜７０℃温度範囲で、全体で０．５〜２４時間処理する方法を例示することができる。なお、使用するプロテアーゼは、１種類であっても２種類以上を組み合わせて用いてもよい。好ましくは２種類以上のプロテアーゼを用いる。２種類以上のプロテアーゼを用いることで、単一プロテアーゼを用いる場合に比べて分解物の分子量が特定の範囲に集中し、シャープな分子量分布となる傾向があるからである。例えば、上記したように、上記アルカラーゼ及びスミチームＦＰなど異種分解型（エンド型及びエキソ型）に加えて、異種生物起源及及び作用条件のいずれかあるいは双方が異なるプロテアーゼを用いることが好ましい。

後述するように、プロテアーゼ処理時間を調整することでプロテアーゼ処理物の分子量分布を調節することができる。例えば、エキソ型プロテアーゼによる処理時間を延長することで、１０００Da以下の低分子量画分を増大させやすくなる。特に、５００Da超１０００Da以下を減少させて、５００Da以下の画分や遊離アミノ酸含量を増大することができる。

プロテアーゼ処理工程は、エンド型プロテアーゼ処理ステップ後に、エキソ型プロテアーゼで処理することが好ましい。エキソ型プロテアーゼ処理ステップは、エキソ型プロテアーゼ及びエンド型プロテアーゼの双方による処理であってもよい。こうした順でプロテアーゼ処理を実施することで、所望の分子量分布と遊離アミノ酸含有量の大豆ペプチド素材を得られやすくなる。なお、プロテアーゼの使用量は、力価などにより一概には言えないが、例えば、脱脂大豆（固形分）の質量に対して０．０１〜〜１００％の質量の範囲の酵素剤を例示することができる。

（ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布）
プロテアーゼ処理工程は、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、プロテアーゼ処理によって得られる大豆ペプチド素材が、以下の指標のいずれかあるいは双方を充足するように実施する。
（ａ）１０００Da以下の画分が９８％以上である分子量分布を有する
（ｂ）５００Da以下の画分が９６％以上である分子量分布を有する

大豆ペプチド素材が、上記（ａ）の指標を充足するとき、乳酸発酵に適した添加剤を得ることができる。また、大豆ペプチド素材が上記（ｂ）の指標を充足するとき、特に、発酵初期において高い乳酸生産量が得られる。

ゲルろ過クロマトグラフィー条件は特に限定しないが、例えば、以下の方法によって分子量分布を得ることができる。ゲルろ過クロマトグラフィーは、好ましくはＨＰＬＣを用いる。典型的な測定条件を以下に示すが、以下の示す条件と同程度の精度及び正確性で分子量分布を測定できる条件を採用することもできる。
カラム：東ソー(株)製のカラムTSK gel G3000PWXL＋TSK gel G2５００PWXLを連結使用
溶離液：45%アセトニトリル＋0.05%TFA
流速：0.3ml/min
検出：２２０nm
分子量マーカー：Albmin６７０００、Myoglobin１８０００、Cytochrome-C１２２７０、Insulin５８０７、GlyGlyGlyGly２４６、GlyGlyGly１８９、Gly７５を用いる。

（遊離アミノ酸含量）
プロテアーゼ処理工程は、また、得られる大豆ペプチド素材が、（ｃ）遊離アミノ酸を１８質量％以上含む程度に実施することが好ましい。より好ましくは、遊離アミノ酸が大豆ペプチド素材の質量の５０％未満である。得られる大豆ペプチド素材が、この（ｃ）の特性を充足するとき、乳酸生産微生物による乳酸生産を早期に促進することができる。なお、遊離アミノ酸含量は、ＨＰＬＣ等を用いた公知の方法を用いて測定することができる。

プロテアーゼ処理工程は、上記のような分子量分布や遊離アミノ酸含量についての指標を得るのに必要なプロテアーゼ処理条件を予め設定した上で実施することが好ましい。例えば、アルカラーゼなどのエンド型プロテアーゼで処理（典型的には３０分〜１時間程度）し、その後、スミチームＦＰなどのエンド型プロテアーゼ及びエキソ型プロテアーゼや、エキソ型プロテアーゼを用いて５時間〜３０時間程度処理することにより、上記のような指標を充足するプロテアーゼ処理物、すなわち、大豆ペプチド素材を得ることができる。

プロテアーゼ処理工程後は、酵素液を８０℃〜９０℃程度、またはそれ以上に加熱して酵素を失活させる。なお、同時に、殺菌を意図した温度及び時間とすることが好ましい。

こうして得られる大豆ペプチド素材を含む酵素液は、必要に応じて固液分離を実施後、溶液画分をそのままで乳酸発酵用培地添加剤として使用することができるほか、スプレードライや凍結乾燥法等により乾燥して固体化（粉末化）して使用することができる。

（乳酸発酵用培地添加剤）
本発明の乳酸発酵添加剤は、本発明の乳酸発酵用の培地添加剤の製造方法のプロテアーゼ処理工程において指標とした以下のいずれかの指標を充足する大豆ペプチド素材を含有している。すなわち、以下の条件のいずれかを有することができる。
（ａ）１０００Da以下の画分が９８％以上である分子量分布を有する
（ｂ）５００Da以下の画分が９６％以上である分子量分布を有する
（ｃ）遊離アミノ酸を１８質量％以上含む

したがって、糖質原料としてグルコースやスクロースをのみを用いた培地に添加することで乳酸発酵を促進する添加剤として用いることができ、結果として、廃糖蜜の使用を抑制又は回避することができる。さらに、得られるプロテアーゼ処理物は、特に廃糖蜜のようにカラメルなどの着色物質を含有していないため、培地に添加しても当該添加によって発酵液を着色するものではない。したがって、本発明の添加剤の添加によって、追加の精製プロセスを要するものでもない。このため、ポリ乳酸の原料としての乳酸発酵用に好ましく用いることができる。

本発明の培地添加剤は、所定の特性の大豆ペプチド素材のほか、本発明の培地添加剤の作用を妨げない範囲で発酵において適宜添加されうる各種の成分を含んでいてもよい。

（乳酸の製造方法）
本発明の乳酸の製造方法は、炭素源と、１０００Da以下の画分が９８％以上である分子量分布を有する大豆ペプチド素材と、を混合して得られる培地を用いて、乳酸生産微生物を培養して乳酸発酵する工程、を備えることができる。本発明の乳酸製造方法によれば、糖質原料として廃糖蜜の使用を抑制又は回避しても乳酸発酵を促進し高い乳酸生産量を得ることができるほか、廃糖蜜の使用に由来する追加の精製プロセスを回避できる。このため、ポリ乳酸の原料である乳酸の製造方法として好ましい。

（乳酸発酵工程）
本発明の乳酸製造方法において用いる大豆ペプチド素材は、本発明の乳酸発酵用添加剤の大豆ペプチド素材の分子量分布及び／又は遊離アミノ含量についての指標を備えることが好ましい。

培地における大豆ペプチド素材の添加量（含有量）は、特に限定しないが、好ましくは、培地において０．０１％ｗｔ／ｖｏｌ％以上１．０％ｗｔ／ｖｏｌ％以下含有することが好ましい。この範囲であると、乳酸発酵を促進するとともに、色度が抑制された発酵液を得ることができる。より好ましくは０．１％ｗｔ／ｖｏｌ％以上０．５％ｗｔ／ｖｏｌ％以下である。

本発明の乳酸製造方法において用いる培地の炭素源は、グルコース、フルクトース及びスクロースなどの単糖又は二糖を主成分とする糖質原料であってもよいし、デンプン質原料であってもよい。糖質原料としては、ケーン（サトウキビ）搾汁、ビート（テンサイ）の搾汁等が挙げられる。また、廃糖蜜も含まれる。また、デンプン質原料としては、コーン、ムギ、カンショ、バレイショなどが挙げられる。

炭素源としては、好ましくは、グルコース、フルクトース及びスクロースから選択される１種又は２種以上を主成分（７０質量％以上、好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上、一層好ましくは９５質量％以上）とする糖質原料を用いることが好ましい。培地には、炭素源以外にペプトンや酵母抽出物などが含まれた富栄養培地とすることもできるが、精製工程を省略ないし最大限簡略化するには、こうした添加剤を含まないことが好ましい。また、栄養源として廃糖蜜を実質的に含んでいないことが好ましい。換言すれば、糖の結晶化工程等において副生するカラメル物質などの着色物質を実質的に含まないことが好ましい。上記したように、本発明の乳酸製造方法は、廃糖蜜の使用を回避するとき、より高い効果を得ることができるからである。

本発明の乳酸製造方法において用いる培地は、炭素源と上記大豆ペプチド素材とを混合して得られるものであればよい。したがって、炭素源と上記大豆ペプチド素材のみとを混合して得られるものであってもよいし、別途の他の成分が含まれていてもよい。また、その調製形態も問わない。予め炭素源と上記大豆ペプチド素材を配合した配合物を用時に適当な媒体に溶解又は懸濁して培地としてもよいし、媒体に別個に炭素源と上記大豆ペプチド素材を添加して調製したものであってもよい。

また、炭素源と上記大豆ペプチド素材とを混合して得られるものであればよいことから、上記大豆ペプチド素材については、少なくとも、培地調製時において、所定の分子量分布及び／又は遊離アミノ酸含量を充足することが好ましいが、培地を一旦調製した後の任意の時点において、培地中における大豆ペプチド素材が上記所定の分子量分布及び／又は遊離アミノ酸含量を充足していることを要求するものではない。すなわち、培地中における大豆ペプチド素材の分子量分布や遊離アミノ酸含量の経時変化は許容される。なお、培地は、液体であっても固体であってもよいが、好ましくは液体である。

最終的に得られる大豆ペプチド素材含有培地は、４００ｎｍにおける吸光度が０．１以下であることが好ましい。大豆ペプチド素材を培地添加材として用いることで前記吸光度が０．１以下の培地（例えば、貧栄養培地などが挙げられる。）であっても乳酸発酵促進効果を有する培地を容易に得ることができる。また、４００ｎｍにおける吸光度が０．１以下であれば、廃糖蜜含有培地に比較して著しく無色化されているため、着色成分の精製プロセスを相当程度簡素化することができ用途によっては省略することができる。より好ましくは当該吸光度は０．０５以下である。吸光度が０．０５以下であれば一層精製プロセスを簡略化できるかあるいは省略することができる。さらに好ましくは当該吸光度は０．０２以下である。

なお、以上のことから、本発明の他の一形態として、炭素源と上記所定の分子量分布及び／又は遊離アミノ酸含量を有する大豆ペプチド素材とを含有する、乳酸発酵培地用組成物が提供される。この乳酸発酵用培地組成物によれば、炭素源と上記大豆ペプチド素材を予め配合した粉末あるいは固形物とすることができる。必要時に適当な媒体に溶解することで乳酸発酵用培地を得ることができる。また、本発明の他の一形態として、炭素源と、上記所定の分子量分布及び／又は遊離アミノ酸含量を有する大豆ペプチド素材とを備える、乳酸発酵培地用キットも提供される。このキットの炭素源と大豆ペプチド素材と必要時に適当な媒体に溶解して乳酸発酵用培地を得ることができる。

本発明の製造方法において用いる乳酸生産微生物は、特に限定しないが、好ましくは、遺伝子組換え乳酸生産酵母である。遺伝子組換え酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ等のサッカロマイセス属を宿主とする遺伝子組換え体、カンジダ・ソノレンシス等のカンジダ属.の遺伝子組換え体、クリュイベロマイセス・ラクチス、クリュイベロミセス・サーモトレランス及びクリュイベロマイセス・マルシアヌス等のクリュイベロミセス属の遺伝子組換え体が挙げられる。なかでも、工業的な発酵生産に都合のよい酵母に高い乳酸生産能を付与した遺伝子組換え酵母を好ましく用いることができる。高い乳酸生産能を有する遺伝子組換え酵母としては、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）遺伝子（好ましくはＰＤＣ１遺伝子）プロモーターの制御下にウシ等の外来性の乳酸脱水酵素（ＬＤＨ）遺伝子を備える遺伝子組換え酵母が好ましい。

このように遺伝子組換えにより乳酸を生産する乳酸生産微生物は、特開２００１−２０４４６８、特開２００３−９３０６０、特開２００３−３３４０９２、特開２００３−２５９８７８、特開２００３−０９３０６０、特開２００３−２５９８７８、特開２００５−１３７３０６、特開２００６−４２７１９、特開２００６−２０６０２、特開２００６−２８８３１８、特開２００６−２９６３７７、特表２００５−５２８１０６、特表２００６−５２５０２５等において既に開示されている。また、Ｄ−乳酸又はＬ−乳酸を優勢的に産生する遺伝子組換え体である乳酸生産微生物としては、特表２００５−５２８１１２、再表２００４−１０４２０２、特開２００５−１８７６４３、特開２００７−０７４９３９において既に開示されている。

乳酸発酵条件は、特に限定しない。本発明における培養方法としては、特に限定しないで、従来公知の培養方法を利用できる。例えば、回分培養、半回分培養、連続培養等のいずれかあるいはこれらを組み合わせて実施することができる。また、酸素供給方式や攪拌方式も、用いる乳酸生産微生物の種類に応じて選択することができる。サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母の場合には、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、２５〜３５℃程度とし、１２〜８０時間程度行うことができる。また、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。

また、ｐＨは、用いる乳酸生産微生物の耐酸性等によって異なるが、アルカリによる中和を伴う中和条件下の場合、ｐＨ４．０〜８．０程度に設定することができる。また、遊離の乳酸を取得可能な酸性条件又は非中和条件としては、ｐＨ１．０以上４．５以下の範囲で適宜設定することもできる。

（発酵液分離工程）
培養工程後は、発酵液から乳酸生産微生物を除去することにより発酵液を分離する工程を実施することができる。本発明によれば、培地が４００ｎｍ吸光度が制限されているため、最終的に得られる乳酸発酵液も着色程度が同等に維持されている。このため、その後の乳酸分離工程において、着色成分の分離を意図した精製工程を省略することができ、効率的に乳酸を得ることができる。乳酸生産微生物は、ろ過や遠心等など公知の固液分離法により除去される。

さらに、微生物を分離後の発酵液から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることができる。乳酸の分離にあたっては、乳酸の形態（遊離であるか塩であるか）に応じて適切な分離工程を実施することができる。

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。

（大豆ペプチド素材の調製）
丸大豆を搾油した脱脂大豆を水に溶解した後、遠心分離し、上清溶液を得た。本上清溶液を加水分解酵素で処理し、得られた溶液を凍結乾燥装置にて乾燥させることで大豆ペプチド素材の粉末試料を調整した。具体的には、以下の操作を行った。

まず、丸大豆を搾油した脱脂大豆１０キロに７０℃の温水を加水して７０キロに調製後、６０〜７０℃で１時間保持し、その分散液を連続処理可能な連続遠心分離機（石川島播磨重工業製）を用い、可溶性成分と不溶性成分に分離した。この可溶性成分に８ｋｇ／ｃｍ^２圧の蒸気を吹き込んで１４２℃に昇温させ、その温度で７秒間保持した後、冷却水が通ったプレートで５０℃まで冷却して得られた処理した液を酵素分解するスタート液とした。このスタート液３０キロ（固形含量７％）を温度調整できる５０リットルの容器に移し、５０℃に保持した。このスタート液に４０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調製してアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボザイム）を２１ｇ添加（固形含量に対して１％添加）して３０分酵素分解後、次に続けて粉末クエン酸を添加してｐＨ５．３に調整後、スミチームＦＰ（新日本化学工業株式会社）を６３ｇ添加（固形含量に対して３％添加）し、５０℃で５時間酵素分解を行った。その後、この酵素分解液を８５℃で３０分間ホールドし、酵素失活および殺菌を行った後、この処理液を連続処理可能な高速遠心分離機（ＷＥＳＴＦＡＬＩＡＳＥＰＡＲＡＴＯＲ製）に通液し、不溶物を除去後、得られた遠心後の澄明な液をスプレードライヤーにて粉末乾燥して大豆ペプチド（Ａ４４Ｃ）を調製した。

（富栄養培養液への大豆ペプチド添加効果の検討）
先に出願した乳酸生産酵母TC38株（特開2003-164295、特開2003-334092、特開2006-75133を参照。この乳酸生産酵母は、ウシ由来の乳酸脱水素酵素遺伝子をＰＤＣ１遺伝子のプロモーターの制御下に酵母染色体に導入し、宿主のＧＰＤ１遺伝子及びＧＰＤ２遺伝子を破壊した酵母ＩＦＯ２２６０株である。）を用いて乳酸生産を行う場合において、培養液中に大豆ペプチド添加した効果を試験した。上記乳酸生産酵母を、YPD培養液5 mlの試験管に植菌し、30℃、18時間振盪培養して増殖させた菌体を初発菌体とした。100 ml容の三角フラスコに40 mlの培養液と中和剤として5% (wt./vol.) の炭酸カルシウム（和光純薬）を加え、これに体積比（PCV）にして0.3%になるよう上記初発菌体を植菌した。培養液は、10% (wt./vol.) のグルコース（和光純薬）を含有させたYPD培養液と、10%の糖濃度に調整した液糖糖蜜培地の2種類の培地をそれぞれ使用した。次に、これらの発酵用溶液に対し、上記実施例１にて調整した大豆ペプチド素材（A44C）を0.5 %(wt./vol.) 添加した場合と未添加の試料とを作製し、これらを振盪速度80 rpm、発酵温度30℃にて72時間、乳酸発酵させた。発酵開始から24時間毎に上清1 mlを採取し、溶液中のL-乳酸量を測定した。なお乳酸の測定には、バイオセンサBF-5（王子計測機器株式会社製）を利用し、詳細な測定方法については、付属の取扱説明書に従った。その結果を図１に示す。

図１に示すように、富栄養培養液（YPD）であっても、本大豆ペプチド素材を加えることで、乳酸生産速度、および乳酸生産量が向上することが確認された。またYPD培養液と比較して栄養源が低い液糖糖蜜培地であっても、大豆ペプチド素材を添加することによって、高い乳酸発酵効果が確認された。本大豆ペプチド素材を利用することにより、比較的栄養源の乏しい培養液であっても、乳酸発酵を促進できることがわかった。

（貧栄養培養液への大豆ペプチド素材の添加効果および他の大豆ペプチドとの比較検討）
次に、本大豆ペプチド素材を貧栄養培地へ添加した際の効果と、他の大豆ペプチド素材との比較について検討を行った。実施例２と同じ条件下で増殖させた菌体を初発菌体とし、100 ml容の三角フラスコに40 mlの培養液と中和剤として5% (wt./vol.) の炭酸カルシウム（和光純薬）を加え、これに体積比（PCV）にして0.3%になるよう上記初発菌体を植菌した。培養液は、12% (wt./vol.) のスクロース（和光純薬）のみの培養液を使用した。続いて本発酵用溶液に対し、上記実施例１にて調整した大豆ペプチド素材（A44C）および、別の調製方法にて作製した他4種類の大豆ペプチド素材（大豆ペプチド素材A、B、C、D）をそれぞれ0.5 %(wt./vol.) 添加した場合と未添加の試料とを作製し、これらを振盪速度80 rpm、発酵温度30℃にて72時間、乳酸発酵させた。発酵開始から24時間毎に上清1 mlを採取し、溶液中のL-乳酸量を測定した。なお乳酸の測定には、バイオセンサBF-5（王子計測機器株式会社製）を利用し、詳細な測定方法については、付属の取扱説明書に従った。その結果を図2に示す。

図２に示すように、12% (wt./vol.) スクロースのみからなる貧栄養培地の場合、乳酸生産酵母では発酵が進まないのに対し、0.5% (wt./vol.) 大豆ペプチド素材を加えるだけでYPD培地などに代表される富栄養培地と同じような生産速度を示すことが確認された。また製造方法の異なる複数種類の大豆ペプチド素材での試験の結果、いずれの大豆ペプチド素材であっても同様の効果を得ることができなかった。以上のことから、今回調整した大豆ペプチド（A44C）においてのみ、高い効果が認められることが確認された。

（各種大豆ペプチド素材の分子量分布及び遊離アミノ酸含量）
乳酸生産向上効果の認められた実施例１で調製した大豆ペプチド素材A44Cの酵素分解条件及びこれを一部変更した条件で、大豆ペプチド素材A44C及び６種類の大豆ペプチド素材を調製した。これら７種類の大豆ペプチド素材につき、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて分子量分布及び遊離アミノ酸含量を測定した。

本実施例において新たに調製した７種類の大豆ペプチド素材（RE00、RE01、RE05（A44C）RE03、RE07、RE10、RE24）の調製方法は、以下の通りであった。

実施例１と同様にして得られた酵素分解スタート液１０キロ（固形含量７％）に４０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調製してアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボザイム）を７ｇ添加（固形含量に対して１％添加）して３０分酵素分解液から１キロ抜き取り、ただちに８５℃、３０分加熱後、遠心分離して得られた上澄液を凍結乾燥して試験試料（ＲＥ００）とした。
残りの液９キロは引き続き、粉末クエン酸を添加してｐＨ５．３に調整後、スミチームＦＰ（新日本化学工業株式会社）を１８．９ｇ添加（固形含量に対して３％添加）し、５０℃で２４時間後まで酵素分解を行った。その途中、スミチームＦＰ添加後、１、３、５、７、１０、２４時間後、それぞれの時間で、一部酵素分解液を抜き取り、ただちに８５℃、３０分加熱後、遠心分離して得られた上澄液を凍結乾燥して試験試料ＲＥ０１（ＦＰ添加1時間後）、ＲＥ０３（ＦＰ添加３時間後）、ＲＥ０５（Ａ４４Ｃ）（ＦＰ添加５時間後）、ＲＥ０７（ＦＰ添加７時間後），ＲＥ１０（ＦＰ添加1０時間後）、ＲＥ２４（ＦＰ添加２４時間後）を調製した。

（ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分布測定）
分子量はＨＰＬＣ（日本分光株式会社製）にて測定した。測定条件は、以下の通りであった。分子量の計算は、日本分光のクロマトデータ処理によった。結果を表１に示す。
カラム：東ソー（株）製のカラムTSK gel G3000PWXL＋TSK gel G2５００PWXLを連結使用
溶離液：45%アセトニトリル＋0.05%TFA
流速：0.3ml/min
検出：２２０nm
分子量マーカー：Albmin６７０００、Myoglobin１８０００、Cytochrome-C１２２７０、Insulin５８０７、GlyGlyGlyGly２４６、GlyGlyGly１８９、Gly７５を用いる。

（遊離アミノ酸含量の測定）
各種大豆ペプチド素材の遊離アミノ酸含量は、日立アミノ酸分析機（Ｌ８９００）を用いて測定した。詳細な測定方法については、付属の取扱説明書に従った。結果を表１に併せて示す。

表１に示すように、エンド型プロテアーゼ及びエキソ型プロテアーゼの混合物であるスミチームＦＰを用いた処理時間が長くなるのにつれて、徐々に、５００Da以下の画分が増加するとともに遊離アミノ酸も増加した。また、RE00〜RE03は、１０００Da以下の画分が９７％未満（５００Da以下の画分は９７％未満）でありかつ遊離アミノ酸含量が１７％以下であったのに対し、RE05（A44C）〜RE24については、同画分が９８％以上（５００Da以下の画分は９６％以上）であり、かつ遊離アミノ酸含量が１８％以上となった。

（各種タンパク分解物A44C画分試料の乳酸発酵に対する効果の検討）
実施例４にて調製した大豆ペプチド素材を用い、乳酸生産に対する効果の検討を実施した。実施例２と同じ条件下で増殖させた菌体を初発菌体とし、100 ml容の三角フラスコに40 mlの培養液と中和剤として5% (wt./vol.) の炭酸カルシウム（和光純薬）を加え、これに体積比（PCV）にして0.25%になるよう上記初発菌体を植菌した。培養液は実施例３同様、12% (wt./vol.) のスクロース（和光純薬）のみの培養液を使用した。続いて、この発酵用溶液に対し、実施例４にて調製した７種類の大豆ペプチド素材をそれぞれ0.5%(wt./vol.) 添加した試料及び大豆ペプチド素材未添加の試料を作製した。これらを振盪速度80 rpm、発酵温度30℃にて72時間、乳酸発酵させた。発酵開始から24時間毎に上清1 mlを採取し、溶液中のL-乳酸量を測定した。なお乳酸の測定には、バイオセンサBF-5（王子計測機器株式会社製）を利用し、詳細な測定方法については、付属の取扱説明書に従った。その結果を表２及び図３に示す。

図３に示すように、大豆ペプチド素材RE05（A44C）、RE07、RE10、RE24（スミチームＦＰによる処理時間が５時間〜２４時間）を添加した試料に関して、特に24、48時間後において高い乳酸生産量を示した。これに対して、大豆ペプチド素材RE00、RE01及びRE03（スミチームＦＰによる処理時間が０時間〜３時間）を添加した試料に関しては、上記４種類のような傾向は認められなかった。また、大豆ペプチド素材の未添加試料では、乳酸生産は全く認められなかった。以上のことから、低分子ペプチド及び遊離アミノ酸を含む画分（分子量1,000Da以下の画分が９８％以上、さらには５００Da以下の画分が９６％以上）と遊離アミノ酸量１８％以上の特徴を示す大豆ペプチド素材が、乳酸発酵を促進する効果があることがわかった。

（培地の着色程度の確認）
本実施例では、廃糖蜜を用いた培地、ＹＰＤ培地及大豆ペプチド素材添加貧栄養培地（いずれも液体）をそれぞれ以下の組成にしたがって調製した。なお、廃糖蜜及びＹＰＤ培地としては、ごく一般的な方法で商業的入手が可能であり汎用品を用いた。これらの培地につき、目視にて着色度を確認するとともに、その紫外領域から可視光領域にわたってスペクトルを測定した。結果を図４に示す。

（廃糖蜜含有培地、％は質量／体積％を表す。）
グルコース １２％
廃糖蜜 ０．２５％
（富栄養培地、％は質量／体積％を表す。）
グルコース １２％
イーストエキストラクト １％
バクトトリプトン ２％
（大豆ペプチド含有貧栄養培地、％は質量／体積％を表す。）
グルコース １２％
大豆ペプチド素材 ０．５％

図４の上段に示すように、目視観察によれば、貧栄養培地に大豆ペプチド素材を添加することで調製した培地は、無色でほぼ澄明であり、着色成分などを除去する精製プロセスを要しないものであった。これに対して、廃糖蜜含有培地及び富栄養培地は、それぞれ褐色及び黄色であり、いずれも乳酸発酵後における精製工程の必要性がある着色量であった。なお、富栄養培地は廃糖蜜含有培地に比較して着色程度が１０分の１程度であるため、簡易な精製工程で着色成分の除去が可能であった。また、図４の下段に示すように、大豆ペプチド含有貧栄養培地以外は希釈して用いたが（廃糖蜜含有培地は１０倍希釈、富栄養培地は３倍希釈）、廃糖蜜含有培地は可視光の３００〜４００ｎｍにおいて、大豆ペプチド素材含有培地よりも顕著に高い吸光度を示し、富栄養培地は廃糖蜜含有培地よりも低いものの大豆ペプチド含有貧栄養培地に比べて高い吸光度を示した。４００ｎｍでは、大豆ペプチド素材含有培地は、４００ｎｍにおける吸光度が０．０１８であったのに対し、廃糖蜜含有培地では同１．０であり、富栄養培地では同０．０９７であった。

富栄養培地（ＹＰＤ培地及び液糖糖蜜培地）への大豆ペプチド素材添加効果を示す図である。 貧栄養培地（糖質原料として12 %スクロースのみを含有する培地）への大豆ペプチド素材添加効果を示す図である。 貧栄養培地（糖質原料として12 %スクロースのみを含有する培地）への各種大豆ペプチド素材添加効果を示す図である。 廃糖蜜含有培地、ＹＰＤ培地及び大豆ペプチド素材含有培地の外観及び吸光スペクトルを示す図である。

Claims (10)

1. 乳酸の製造方法であって、
   炭素源と、５００Ｄａ以下の画分が９６％以上である分子量分布を有し、遊離アミノ酸を１８質量％以上５０質量％未満含む大豆ペプチド素材と、を含有し、培地調製時における４００ｎｍにおける吸光度が０．０５以下である培地を用いて、遺伝子組換え乳酸生産酵母を培養して乳酸発酵する工程、
   を備える、製造方法。
2. 前記遺伝子組換え乳酸生産酵母は、ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＣ）遺伝子プロモーターの制御下に外来性の乳酸脱水素酵素遺伝子を備える遺伝子組換え酵母である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記乳酸生産酵母は、サッカロマイセス属酵母である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記培地は、前記大豆ペプチド素材以外に、ＹＰＤ培地、液糖蜜培地及び炭素源としてスクロースのみを有する貧栄養培地からなる群から選択される培地組成成分を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
5. 前記培地調製時における４００ｎｍにおける吸光度が、０．０２以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
6. 前記培地は、前記大豆ペプチド素材を０．０１ｗｔ／ｖｏｌ％以上１．０ｗｔ／ｖｏｌ％以下含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
7. ５００Ｄａ以下の画分が９６％以上である分子量分布を有しかつ遊離アミノ酸を１８質量％以上５０質量％未満含む大豆ペプチド素材からなり、培地調製時における４００ｎｍにおける吸光度が０．０５以下である、遺伝子組換え乳酸生産酵母による工業原料用の乳酸製造のための培地添加剤。
8. 脱脂大豆の水可溶性成分のプロテアーゼ処理によって得られる、請求項７に記載の添加剤。
9. ポリ乳酸製造用である、請求項７又は８に記載の添加剤。
10. 請求項７〜９のいずれかに記載の培地添加剤の製造方法であって、
    脱脂大豆から水可溶性成分を回収する工程と、
    前記水可溶性成分をプロテアーゼ処理して、５００Ｄａ以下の画分が９６％以上である分子量分布を有し、遊離アミノ酸を１８質量％以上５０質量％未満含む大豆ペプチド素材を前記培地添加剤の少なくとも一部として取得する工程と、
    を備える、製造方法。