CN110551773A - 一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法，其包括如下步骤：1）制备豆粕酶解液，2）菌株发酵。本发明采用豆粕酶解液替代培养基中的酵母膏，较采用酵母膏相比，发酵液中的苏氨酸产量和干物质均有所提升，而且成本相对低廉。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，涉及一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法。
背景技术
苏氨酸（Threonine，简写为Thr），学名2-氨基-3-羟基丁酸，属于脂肪族氨基酸，微甜，因结构与苏糖相似而得名，是构成人和动植物蛋白质的一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、营养强化剂，可以强化乳制品，具有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。近年来，随着经济的发展，市场对苏氨酸需求持续稳定增长，是需求增长最快的氨基酸品种之一，特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长迅速，大有取代色氨酸而成为除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。
随着氨基酸行业逐步发展，微生物发酵法成为苏氨酸生产最有前途的生产技术，在苏氨酸生产方面，微生物发酵法亦表现出潜在的优势，但在微生物发酵液制备过程中，存在发酵培养基成本高的缺陷。申请人之前的授权专利技术“CN201510168444，一种制备颗粒型苏氨酸的工艺”对黄色短杆菌进行了种子培养和发酵培养，其中，种子培养基为（1L）：葡萄糖6g，酵母膏3g，硫酸铵0.1g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸亚铁 0.01g，硫酸镁 0.02g，其余为水，pH值7.0；发酵培养基组分为：葡萄糖40g/L、玉米浆8g/L、酵母膏2g/L、甜菜碱1g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L，pH值7.0。上述培养基发酵效果较好，苏氨酸产量较高，但是酵母膏的价格较高，大规模发酵用量较大，如何较少或者替换酵母膏，以降低发酵成本是我们需要解决的技术问题。
豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，是重要的植物性蛋白来源，蛋白含量丰富，而且价格相对较低。现有技术大多是采用酶解的方式处理豆粕用于饲料或短肽生产中，也有部分研究通过菌株发酵豆粕来提高饲用品质，但是极少研究利用菌株对豆粕进行发酵酶解的产物来作为发酵制备氨基酸培养基组分。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中苏氨酸发酵成本较高的缺陷，提供了一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法，其包括如下步骤：1）制备豆粕酶解液，2）菌株发酵。
具体地，所述1）制备豆粕酶解液，包括如下步骤：
将豆粕和水按照1:1的质量比混合，121℃蒸汽处理10min，然后自然冷却至室温，得到豆粕培养液；将地衣芽孢杆菌种子液、产黄纤维单胞菌种子液、黑曲霉种子液以及米曲霉种子液按照2:2:1:1的体积比混合，得到混合种子液；然后将混合种子液按照10%的接种量接入到含有豆粕培养液的发酵罐中进行发酵产酶，温度为35℃，罐压为0.03MPa，风量为500L/h，发酵产酶时间为60h，超声处理，超声频率为25kHz，超声时间为30min，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到豆粕酶解液。
具体地，所述2）菌株发酵，包括如下步骤：
将黄色短杆菌接入种子罐培养基中进行培养，在温度为30℃，摇床转速为150r/min，培养24h得到种子液；然后按照种子液∶发酵罐培养基为1∶12的体积比转入发酵罐中培养，温度30℃，培养96h，得到发酵液。
具体地，所述种子罐培养基组分按照1L为：葡萄糖6g，豆粕酶解液9g，硫酸铵0.1g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸亚铁 0.01g，硫酸镁 0.02g，其余为水，pH值7.0。
具体地，所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖40g/L、玉米浆8g/L、豆粕酶解液6g/L、甜菜碱1g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L，pH值7.0。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
米曲霉和黑曲霉在单独制曲及混合培养条件下,能够产生中性蛋白酶、酸性蛋白酶、糖化酶；产黄纤维单胞菌能够产生纤维素酶，将豆粕中的纤维组分进行酶解得到还原糖；地衣芽孢杆菌产生α-淀粉酶和蛋白酶；豆粕中的碳水化合物可以在淀粉酶和糖化酶的作用下，酶解得到糖组分；豆粕中的部分蛋白和纤维交织在一起，普通的蛋白酶难以将蛋白完全与纤维分离，本发明采用产黄纤维单胞菌产生纤维素酶对纤维组分进行酶解，与其他酶协同作用，既可以得到还原糖，还可以将蛋白从纤维中分离出去，提高了蛋白的酶解效果；本发明利用的超声波的空化作用，产生局部高压高温，对菌体细胞进行冲击，导致菌体细胞变形和破裂，有助于菌体蛋白利用；本发明采用四种菌株酶解豆粕，混合培养中各菌株互不拮抗，相互协同共生，因而使得混合培养体系处于一个平衡状态；本发明的酶解产物以豆粕为主要原料获得酶解液，可以替代培养基中价格较高的酵母膏组分，营养丰富，价格低廉，降低了企业成本。
本发明采用3倍左右的酶解液来替代酵母膏，蛋白含量接近，但是成本仅为酵母膏的40％左右（按照普通工业酵母膏20元/kg、豆粕3元/kg进行计算，微生物培养的其他成本核算为2元/kg豆粕，1kg豆粕产生2倍左右的酶解液）。
本发明采用上述工艺制备出高品质的氮源，能够促进微生物生长，较采用酵母膏的对比例相比，发酵液中的苏氨酸产量提高了20％左右，发酵干物质也有所提高，表明菌株的生物量增加。
附图说明
图1：不同菌株配伍对豆粕蛋白水解度的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法，其包括如下步骤：
1）制备豆粕酶解液：
将豆粕和水按照1:1的质量比混合，121℃蒸汽处理10min，然后自然冷却至室温，得到豆粕培养液；将地衣芽孢杆菌种子液、产黄纤维单胞菌种子液、黑曲霉种子液以及米曲霉种子液按照2:2:1:1的体积比混合，得到混合种子液；然后将混合种子液按照10%的接种量接入到含有豆粕培养液的发酵罐中进行发酵产酶，温度为35℃，罐压为0.03MPa，风量为500L/h，发酵产酶时间为60h，超声处理，超声频率为25kHz，超声时间为30min，每次破停（破壁、停止）时间均为4s，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到豆粕酶解液。
所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得地衣芽孢杆菌种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，七水硫酸镁2g/L；
所述产黄纤维单胞菌种子液的制备方法为：将产黄纤维单胞菌接种到斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得产黄纤维单胞菌种子液；所述斜面培养基组分为：酵母膏60g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉30g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸镁0.05g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L；
所述黑曲霉种子液的制备方法为：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯200g/L，蔗糖30g/L，琼脂20g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉60g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L；
所述米曲霉种子液的制备方法为：将米曲霉划线接种在PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行培养，得到米曲霉种子液。
2）菌株发酵：
将黄色短杆菌ATCC14067按照10％的接种量接入种子罐培养基中进行培养，在温度为30℃，摇床转速为150r/min，培养24h得到种子液；然后按照种子液∶发酵罐培养基为1∶12的体积比转入发酵罐中培养，温度30℃，培养96h，得到发酵液。苏氨酸含量：13.4g/100ml；干物：16.1g/100ml；
所述黄色短杆菌的浓度为1×108个/mL；
所述种子罐培养基组分为（1L）：葡萄糖6g，豆粕酶解液9g，硫酸铵0.1g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸亚铁 0.01g，硫酸镁 0.02g，其余为水，pH值7.0；
所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖40g/L、玉米浆8g/L、豆粕酶解液6g/L、甜菜碱1g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L，pH值7.0。
对比例1
参照CN201510168444。
一种发酵制备苏氨酸的方法，其包括如下步骤：
1）制备苏氨酸发酵液：将黄色短杆菌ATCC14067按照10％的接种量接入种子罐培养基中进行培养，在温度为30℃，摇床转速为150r/min，培养24h得到种子液；然后按照种子液∶发酵罐培养基为1∶12的体积比转入发酵罐中培养，温度30℃，培养96h，得到发酵液；发酵液的基本参数为：pH值7；苏氨酸含量：11.2g/100ml；干物：13.5g/100ml；
所述黄色短杆菌的浓度为1×108个/mL；
所述种子罐培养基组分为（1L）：葡萄糖6g，酵母膏3g，硫酸铵0.1g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸亚铁 0.01g，硫酸镁 0.02g，其余为水，pH值7.0；
所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖40g/L、玉米浆8g/L、酵母膏2g/L、甜菜碱1g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L，pH值7.0。
实施例2
各种大豆种类产生的豆粕组分相差并不大，本发明选择带皮豆粕，各主要组分含量为：蛋白质45%，灰分7％，纤维20％，水分10％，脂肪2%，碳水化合物14％，其它为无机矿物质。
主要指标检测方法：凯氏定氮法测定总蛋白；SDS-PAGE对蛋白分子量进行区分测定；还原糖含量的测定：直接滴定法，参照GB/T5009.7-2008；常规HPLC检测游离氨基酸、寡肽以及多肽含量；蛋白水解度测定方法采用茚三酮显色法测定水解度。
设置组别验证各菌株的配伍效果，其中，对照组1为地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌和米曲霉三种菌配伍，其余同实施例1；对照组2为地衣芽孢杆菌、产黄纤维单胞菌和黑曲霉，其余同实施例1；对照组3为地衣芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉，其余同实施例1；对照组4为产黄纤维单胞菌、米曲霉和黑曲霉，其余同实施例1。
1.豆粕酶解液的蛋白组分测定，具体结果见表1：
表1
| 指标 | 低分子蛋白比例（10KD以下）% | 中分子蛋白比例（10-60KD）% | 高分子蛋白比例（大于60KD）% |
| 实施例1 | 94.7 | 3.2 | 2.1 |
| 对照组1 | 88.1 | 5.3 | 6.6 |
| 对照组2 | 86.2 | 7.9 | 5.9 |
| 对照组3 | 90.3 | 4.6 | 5.1 |
| 对照组4 | 82.6 | 9.1 | 8.3 |
2.豆粕酶解液的游离氨基酸、寡肽（2-9个氨基酸）、多肽（10-50个氨基酸）以及还原糖组分测定结果，具体见表2：
表2
| 指标 | 游离氨基酸g/L | 寡肽g/L | 多肽g/L | 还原糖g/L |
| 实施例1 | 1.7 | 4.6 | 8.4 | 7.6 |
| 对照组1 | 0.6 | 4.3 | 6.6 | 5.7 |
| 对照组2 | 0.8 | 2.9 | 5.0 | 4.6 |
| 对照组3 | 1.3 | 4.1 | 6.8 | 2.9 |
| 对照组4 | 0.9 | 3.5 | 4.1 | 6.1 |
如表1和表2所示，本发明采用四种菌合理配伍，相互促进产酶，能够充分降解豆粕蛋白，酶解液中游离氨基酸、寡肽（2-9个氨基酸）、多肽（10-50个氨基酸）以及还原糖组分均高于仅采用三种菌株的对照组1-4，总蛋白含量测定中，低分子量蛋白也明显高于对照组1-4；豆粕蛋白水解度（蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与给定蛋白质的总肽键数之比）达到47%（如图1所示）。上述结果说明本发明对豆粕蛋白的酶解效果更充分彻底，游离氨基酸、短肽以及还原糖比例更高，可用于替代培养基中的氮源以及部分碳源。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (5)
1.一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法，其包括如下步骤：1）制备豆粕酶解液，2）菌株发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1）制备豆粕酶解液，包括如下步骤：
将豆粕和水按照1:1的质量比混合，121℃蒸汽处理10min，然后自然冷却至室温，得到豆粕培养液；将地衣芽孢杆菌种子液、产黄纤维单胞菌种子液、黑曲霉种子液以及米曲霉种子液按照2:2:1:1的体积比混合，得到混合种子液；然后将混合种子液按照10%的接种量接入到含有豆粕培养液的发酵罐中进行发酵产酶，温度为35℃，罐压为0.03MPa，风量为500L/h，发酵产酶时间为60h，超声处理，超声频率为25kHz，超声时间为30min，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到豆粕酶解液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述2）菌株发酵，包括如下步骤：
将黄色短杆菌接入种子罐培养基中进行培养，在温度为30℃，摇床转速为150r/min，培养24h得到种子液；然后按照种子液∶发酵罐培养基为1∶12的体积比转入发酵罐中培养，温度30℃，培养96h，得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养基组分按照1L为：葡萄糖6g，豆粕酶解液9g，硫酸铵0.1g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸亚铁 0.01g，硫酸镁 0.02g，其余为水，pH值7.0。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述发酵罐培养基组分为：葡萄糖40g/L、玉米浆8g/L、豆粕酶解液6g/L、甜菜碱1g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L，pH值7.0。
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