CN104560893B - 一种用于培养病毒的培养基及其制备方法 - Google Patents
一种用于培养病毒的培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于培养病毒的培养基，包括培养液，其还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液85‑96％、氨基酸溶液2‑5％、胎牛血清中的小分子成分2‑10％。本发明还提供该培养基的制备方法：分别取配方量的培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品。本发明的用于培养病毒的培养基，便于病毒繁殖结束后的病毒液的纯化，降低了疫苗生产成本；此外制备方法简单、易操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基及其制备方法，具体涉及一种用于培养病毒的培养基及其制备方法。
背景技术
1996年以来，哺乳动物细胞培养已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化生产。许多生物活性物质、疫苗、载体,如单克隆抗体、药用蛋白质、高职病性蓝耳病疫苗等，都可以通过动物细胞大规模培养获得。通过细胞培养生产生物制品既能提高生物制品的质量,又能促进细胞培养技术、蛋白质表达纯化技术、病毒培养技术等的发展。从当前发展趋势来看,细胞悬浮培养、无血清培养，是近年世界范围内各大生物公司产业化生产的发展方向。
目前，兽用疫苗很多都需要通过细胞培养来进行生产，在生产过程需要使用血清。在病毒繁殖过程中，病毒裂解细胞所产生的细胞碎片、细胞和培养基的蛋白质、糖类、脂类及核酸等杂质成分，以及细胞代谢副产物等，易使接种动物产生过敏，持续发热等副作用。怎么样减少疫苗副反应，提高疫苗的安全性是目前所有兽用疫苗关注的焦点问题。在生产过程中使用血清，由于血清成分复杂，多为白蛋白和免疫球蛋白其分子量相对较大，在很大程度上影响病毒与这些杂蛋白的分离。
现有的裂解疫苗制备方法中，通常采用连续离心、沉淀等方法，如公开号为CN103721251A的发明专利申请文件，一种流感病毒裂解疫苗的纯化方法，将流感病毒株接种鸡胚，经培养收获病毒液，病毒液经灭活后进行超滤浓缩，所得超滤液用KII连续流离心机进行蔗糖密度梯度离心，得到超离液，对超离液进行超滤透析去除蔗糖后进行分子筛凝胶层析，获得的病毒纯化液用裂解剂TritonX-100和去氧胆酸钠进行病毒裂解，裂解结束后，通过超滤透析去除裂解剂，获得的裂解液离心去除杂蛋白，收集上清经过滤除菌后，即得纯化的流感病毒裂解疫苗原液。该方法虽然能够很好的去除杂质，但操作方法繁杂、步骤多，增加了生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便于病毒繁殖、培养结束后去除杂质的用于培养病毒的培养基及其制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于培养病毒(本发明中的培养病毒是指将病毒接种到宿主细胞后，移种到培养基中，病毒在宿主细胞中进行繁殖，最后使宿主细胞裂解的过程)的培养基，包括培养液(此处的培养液是指现有技术中已有的能够用于培养病毒的液体培养基，包括但不限于DMEM培养基、MEM培养基和199培养基)，其还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液85-96％、氨基酸溶液2-5％、胎牛血清中的小分子成分2-10％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤300KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为培养液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.1-1％、异亮氨酸0.5-1.5％、丝氨酸0-1％、丙氨酸0.1-1％、苯丙氨酸0.1-0.3、酪氨酸0.2-2％、缬氨酸0.2-1％、脯氨酸0-0.5％、半胱氨酸0.1-1％、亮氨酸0-1％、色氨酸0.5-2％、蛋氨酸0.5-1％、天冬酰胺0.05-0.3％、谷氨酰胺0.5-2％、苏氨酸0.2-1.2％、天冬氨酸0.05-2％、谷氨酸0-0.5％、赖氨酸0.5-1.5％、精氨酸0.1-0.5％和组氨酸0-0.5％。
本发明中，优选的方案为所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤100KDa。
本发明中，优选的方案为所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa。
本发明中，优选的方案为所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液93％、氨基酸溶液2％、胎牛血清中的小分子成分5％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为培养液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.3％、异亮氨酸0.7％、丝氨酸0.05％、丙氨酸0.1％、苯丙氨酸0.2％、酪氨酸0.2％、缬氨酸0.4％、脯氨酸0.03％、半胱氨酸0.2％、亮氨酸0.4％、色氨酸0.5％、蛋氨酸0.7％、天冬酰胺0.06％、谷氨酰胺1％、苏氨酸0.3％、天冬氨酸0.08％、谷氨酸0.5％、赖氨酸1％、精氨酸0.1％和组氨酸0.2％。
本发明中，优选的方案为所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液88％、氨基酸溶液2％、胎牛血清中的小分子成分10％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为培养液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.1％、异亮氨酸0.5％、丝氨酸0.1％、丙氨酸0.2％、苯丙氨酸0.1％、酪氨酸0.2％、缬氨酸0.3％、脯氨酸0.02％、半胱氨酸0.2％、亮氨酸0.2％、色氨酸0.6％、蛋氨酸0.6％、天冬酰胺0.06％、谷氨酰胺0.7％、苏氨酸0.3％、天冬氨酸0.06％、谷氨酸0.5％、赖氨酸0.6％、精氨酸0.1％和组氨酸0.2％。
本发明还提供该用于培养病毒的培养基的制备方法，其由如下方法制成：分别取配方量的培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品。
本发明中，优选的方案为所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制备：取胎牛血清，然后用截留分子量为10-300KD的超滤膜进行过滤，收集滤液，得到胎牛血清中的小分子成分。进一步优选的方案为所述超滤膜的截留分子量为30-100KD。更进一步优选的方案为所述超滤膜的截留分子量为30KD。
本发明中，优选的方案为所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的溶剂(即培养液)中，得到氨基酸溶液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的用于培养病毒的培养基，通过对胎牛血清进行预处理，取太牛血清中的小分子成分，然后添加氨基酸溶液，与培养液进行混合，使得病毒繁殖、培养的培养基中不会存在白蛋白和免疫球蛋白等分子量较大的物质，能够降低后续疫苗纯化的难度，病毒繁殖结束后，通过离心去除宿主细胞碎片，然后进行简单的超滤即可将去除外源性的小分子蛋白及其他物质，节约了操作步骤、简化了疫苗纯化的工艺，降低了生产成本；此外，该培养基的制备方法简单、易操作，便于实现大规模生产的需要。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
具体实施方式
实施例1
一种用于培养病毒的培养基，包括DMEM培养基(培养液)，其还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；所述DMEM培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：DMEM培养基93％、氨基酸溶液2％、胎牛血清中的小分子成分5％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为DMEM培养基，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.3％、异亮氨酸0.7％、丝氨酸0.05％、丙氨酸0.1％、苯丙氨酸0.2％、酪氨酸0.2％、缬氨酸0.4％、脯氨酸0.03％、半胱氨酸0.2％、亮氨酸0.4％、色氨酸0.5％、蛋氨酸0.7％、天冬酰胺0.06％、谷氨酰胺1％、苏氨酸0.3％、天冬氨酸0.08％、谷氨酸0.5％、赖氨酸1％、精氨酸0.1％和组氨酸0.2％。
该用于培养病毒的培养基的制备方法，其由如下方法制成：分别取配方量的DMEM培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品；
所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制备：取胎牛血清，然后用截留分子量为30KD的超滤膜进行过滤，收集滤液，得到胎牛血清中的小分子成分；
所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的溶剂中，得到氨基酸溶液。
按常规方式培养Marc-145细胞，在接种高致病性蓝耳病毒后，将Marc-145细胞移入本实施例的培养基中；病毒繁殖结束后，将病毒液离心去除细胞碎片，离心速度为4000转/分钟，离心时间30分钟；然后采用超滤的方式去除小分子蛋白质，超滤膜的截留分子量为100KD，对培养基中的蛋白量、经过超滤处理的病毒液中的蛋白量以及病毒滴度进行检测，检测结果如表1：
表1、猪高致病性蓝耳病病毒培养的病毒液及蛋白含量数据表
实施例2
一种用于培养病毒的培养基，包括MEM培养基(培养液)，其还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；所述MEM培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：MEM培养基88％、氨基酸溶液2％、胎牛血清中的小分子成分10％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶液为MEM培养基溶液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.1％、异亮氨酸0.5％、丝氨酸0.1％、丙氨酸0.2％、苯丙氨酸0.1％、酪氨酸0.2％、缬氨酸0.3％、脯氨酸0.02％、半胱氨酸0.2％、亮氨酸0.2％、色氨酸0.6％、蛋氨酸0.6％、天冬酰胺0.06％、谷氨酰胺0.7％、苏氨酸0.3％、天冬氨酸0.06％、谷氨酸0.5％、赖氨酸0.6％、精氨酸0.1％和组氨酸0.2％。
该用于培养病毒的培养基的制备方法，其由如下方法制成：分别取配方量的培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品；
所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制备：取胎牛血清，然后用截留分子量为30KD的超滤膜进行过滤，收集滤液，得到胎牛血清中的小分子成分；
本发明中，优选的方案为所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的溶剂中，得到氨基酸溶液。
按常规方式培养MDCK细胞，在接种鸡新城疫病毒后，将MDCK细胞移入本实施例的培养基中；病毒繁殖结束后，将病毒液离心去除细胞碎片，离心速度为4000转/分钟，离心时间30分钟；然后采用超滤的方式去除小分子蛋白质，超滤膜的截留分子量为30KD，对培养基中的蛋白量、经过超滤处理的病毒液中的蛋白量以及病毒滴度进行检测，检测结果如表2：
表2、鸡新城疫病毒培养的病毒液及蛋白含量数据表
实施例3
一种用于培养病毒的培养基，包括DMEM培养基(培养液)，其还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；所述DMEM培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：DMEM培养基85％、氨基酸溶液5％、胎牛血清中的小分子成分10％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为DMEM培养基，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸1％、异亮氨酸1.5％、丝氨酸1％、丙氨酸1％、苯丙氨酸0.3％、酪氨酸2％、缬氨酸1％、脯氨酸0.5％、半胱氨酸1％、亮氨酸1％、色氨酸2％、蛋氨酸1％、天冬酰胺0.3％、谷氨酰胺2％、苏氨酸1.2％、天冬氨酸0.2％、谷氨酸0.2％、赖氨酸1.5％、精氨酸0.5％和组氨酸0.5％。
该用于培养病毒的培养基的制备方法，其由如下方法制成：分别取配方量的DMEM培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品；
所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制备：取胎牛血清，然后用截留分子量为30KD的超滤膜进行过滤，收集滤液，得到胎牛血清中的小分子成分；
所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的溶剂中，得到氨基酸溶液。
按常规方式培养Marc-145细胞，在接种高致病性蓝耳病毒后，将Marc-145细胞移入本实施例的培养基中；病毒繁殖结束后，将病毒液离心去除细胞碎片，离心速度为4000转/分钟，离心时间30分钟；然后采用超滤的方式去除小分子蛋白质，超滤膜的截留分子量为100KD，对培养基中的蛋白量、经过超滤处理的病毒液中的蛋白量以及病毒滴度进行检测，检测结果如表3：
表3、猪高致病性蓝耳病病毒培养的病毒液及蛋白含量数据表
实施例4
一种用于培养病毒的培养基，包括MEM培养基(培养液)，其还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；所述MEM培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：MEM培养基95％、氨基酸溶液5％、胎牛血清中的小分子成分2％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶液为MEM培养基溶液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.2％、异亮氨酸0.7％、丝氨酸0.5％、丙氨酸0.4％、苯丙氨酸0.2％、酪氨酸0.8％、缬氨酸0.2％、脯氨酸0.2％、半胱氨酸0.1％、亮氨酸0.1％、色氨酸1.2％、蛋氨酸0.5％、天冬酰胺0.05％、谷氨酰胺0.5％、苏氨酸0.2％、天冬氨酸0.05％、谷氨酸0.1％、赖氨酸0.5％、精氨酸0.2％和组氨酸0.1％。
该用于培养病毒的培养基的制备方法，其由如下方法制成：分别取配方量的培养基、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品；
所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制备：取胎牛血清，然后用截留分子量为30KD的超滤膜进行过滤，收集滤液，得到胎牛血清中的小分子成分；
本发明中，优选的方案为所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的溶剂中，得到氨基酸溶液。
按常规方式培养MDCK细胞，在接种鸡新城疫病毒后，将MDCK细胞移入本实施例的培养基中；病毒繁殖结束后，将病毒液离心去除细胞碎片，离心速度为4000转/分钟，离心时间30分钟；然后采用超滤的方式去除小分子蛋白质，超滤膜的截留分子量为30KD，对培养基中的蛋白量、经过超滤处理的病毒液中的蛋白量以及病毒滴度进行检测，检测结果如表4：
表4：鸡新城疫病毒培养的病毒液及蛋白含量数据表
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于培养病毒的培养基，包括培养液，其特征在于还包括：氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分；
所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液85-96％、氨基酸溶液2-5％、胎牛血清中的小分子成分2-10％；
所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤300KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为培养液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.1-1％、异亮氨酸0.5-1.5％、丝氨酸0-1％、丙氨酸0.1-1％、苯丙氨酸0.1-0.3、酪氨酸0.2-2％、缬氨酸0.2-1％、脯氨酸0-0.5％、半胱氨酸0.1-1％、亮氨酸0-1％、色氨酸0.5-2％、蛋氨酸0.5-1％、天冬酰胺0.05-0.3％、谷氨酰胺0.5-2％、苏氨酸0.2-1.2％、天冬氨酸0.05-2％、谷氨酸0-0.5％、赖氨酸0.5-1.5％、精氨酸0.1-0.5％和组氨酸0-0.5％。
2.根据权利要求1所述的用于培养病毒的培养基，其特征在于：所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤100KDa。
3.根据权利要求1所述的用于培养病毒的培养基，其特征在于：所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa。
4.根据权利要求1所述的用于培养病毒的培养基，其特征在于：所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液93％、氨基酸溶液2％、胎牛血清中的小分子成分5％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为培养液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.3％、异亮氨酸0.7％、丝氨酸0.05％、丙氨酸0.1％、苯丙氨酸0.2％、酪氨酸0.2％、缬氨酸0.4％、脯氨酸0.03％、半胱氨酸0.2％、亮氨酸0.4％、色氨酸0.5％、蛋氨酸0.7％、天冬酰胺0.06％、谷氨酰胺1％、苏氨酸0.3％、天冬氨酸0.08％、谷氨酸0.5％、赖氨酸1％、精氨酸0.1％和组氨酸0.2％。
5.根据权利要求1所述的用于培养病毒的培养基，其特征在于：所述培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分按照体积百分数计分别为：培养液88％、氨基酸溶液2％、胎牛血清中的小分子成分10％；所述胎牛血清中的小分子成分的分子量≤30KDa；
所述氨基酸溶液的溶剂为培养液，溶质由按照质量百分数计的如下组分组成：甘氨酸0.1％、异亮氨酸0.5％、丝氨酸0.1％、丙氨酸0.2％、苯丙氨酸0.1％、酪氨酸0.2％、缬氨酸0.3％、脯氨酸0.02％、半胱氨酸0.2％、亮氨酸0.2％、色氨酸0.6％、蛋氨酸0.6％、天冬酰胺0.06％、谷氨酰胺0.7％、苏氨酸0.3％、天冬氨酸0.06％、谷氨酸0.5％、赖氨酸0.6％、精氨酸0.1％和组氨酸0.2％。
6.一种根据权利要求1所述的用于培养病毒的培养基的制备方法，其特征在于：分别取配方量的培养液、氨基酸溶液和胎牛血清中的小分子成分，混合，得到产品。
7.根据权利要求6所述的用于培养病毒的培养基的制备方法，其特征在于所述胎牛血清中的小分子成分由如下方法制备：取胎牛血清，然后用截留分子量为10-300KD的超滤膜进行过滤，收集滤液，得到胎牛血清中的小分子成分。
8.根据权利要求7所述的用于培养病毒的培养基的制备方法，其特征在于：所述超滤膜的截留分子量为30-100KD。
9.根据权利要求7所述的用于培养病毒的培养基的制备方法，其特征在于：所述超滤膜的截留分子量为30KD。
10.根据权利要求6所述的用于培养病毒的培养基的制备方法，其特征在于所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的溶剂中，得到氨基酸溶液。
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