CN105002242A - 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用 - Google Patents
用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明揭示了一种用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用。该方法包括采用无血清培养基在生物反应器中悬浮培养CHO细胞株，以补料批培养的方式在CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的工艺。本发明同时揭示了上述的重组人促甲状腺激素的工业化生产方法所使用的无血清基础培养基、补料培养基和培养基添加剂。本发明的有益效果主要体现在，该重组人促甲状腺激素的工业化生产方法能够高效的生产重组人促甲状腺激素，产品质量好、安全性高、表达量高、培养工艺稳定、培养方法简洁、培养周期短、适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种糖基化修饰的重组人甲状腺激素的工业化生产方法，尤其涉及一种可以稳定提高重组促甲状腺素表达量、缩短生产周期并且保持表达产物高品质的无血清培养基，糖基化修饰的重组人甲状腺激素的工业化生产方法。
背景技术
促甲状腺激素TSH（thyrotropin，thyroid stimulating hormone）是脑垂体分泌，促进甲状腺的生长和机能的大分子糖蛋白激素。人类的TSH含210个氨基酸，整个分子由α链亚单位和β链亚单位以非共价键方式连接而成，其中α链亚单位为TSH和促性腺激素(包括卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH、HCG)共有，由92个氨基酸组成，β链亚单位是TSH特异性专有。糖链约占整个分子的15%，糖基化是TSH生物学活性所必须。
TSH作用位点主要是甲状腺细胞及含有TSH受体(TSH receptor，TSHR)的甲状腺癌细胞。TSH全面促进甲状腺的机能，其生理作用为促进甲状腺激素的合成和释放，促进T4、T3的合成，增强甲状腺细胞的钠/碘泵NIS（sodium/ iodide symporter）的活性，增强过氧化物酶的活性，增加甲状腺球蛋白Tg合成及酪氨酸碘化等多个环节。TSH还能促进甲状腺上皮细胞的代谢及胞内核酸和蛋白质合成，使细胞增生、腺体增大。
1988年，人TSH的β链克隆成功，随后的研究将人TSH基因转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)中成功表达，获得重组人促甲状腺素α（rhTSH），rhTSH和人体内生性的TSH有同样的氨基酸序列。
上市18年来，rhTSH已先后获批用于高分化甲状腺癌复发情况的诊断，以及与放射性碘（radioiodine）联合用于甲状腺癌患者摘除、破坏残余的甲状腺组织治疗，被国内外大量的临床试验研究所证实其安全有效，已在全球超过50个国家使用。在中国，甲状腺肿瘤发病率爆发性增长，但由于技术相关问题，该产品在中国没有上市。
目前国内尚无规模化生产重组人促甲状腺激素的报道。国际上，据公开资料显示，其生产工艺为使用悬浮的CHO细胞进行连续批次培养，即将细胞接种至生物反应器，培养一段时间后，从反应器中放出大部分细胞液，再接入新鲜培养基进行培养，如此重复。由于培养过程中，需要放出细胞液，接入新鲜培养基，并且需要重复进行几次，操作繁琐，因此容易产生污染的风险，并且对下游纯化造成很大负担。另外，这种生产方式存在同一个反应器培养，分批收获上清的问题，产品质量较难保证均一性。
发明内容
本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种可高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于：所述培养基包括无血清基础培养基、补料培养基和培养基添加剂，所述基础培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、表面活性剂及其他有机分子，所述补料培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、大豆水解物及其他有机分子，所述培养基添加剂为D-半乳糖、尿嘧啶、Mn2+中的一种或一种以上的组合。
优选地，所述无机盐在每升所述基础培养基含有如下成分：
CaC12 58-291mg；KCl 155-776 mg；MgSO4 24-75 mg；
MgCl2 30-142 mg；NaCl 3490-17450mg；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4 · H2O 32-158mg；Na2HPO4 36-175mg；柠檬酸铁10~55 mg；
所述氨基酸在每升所述基础培养基含有如下成分：
丙氨酸 2.2-11.1mg；精氨酸 74-368mg；天冬氨酸 100-275mg；
天冬酰胺 37-95mg；半胱氨酸 15-87mg；胱氨酸33-89mg；
谷氨酸 140-367mg；甘氨酸 19-69mg；组氨酸 65-157mg；
异亮氨酸 146-271mg；亮氨酸 143-295mg；赖氨酸 45.6-456mg；
蛋氨酸 19-86 mg；苯丙氨酸 45-177 mg；脯氨酸 21-150 mg；
丝氨酸 56-131 mg；苏氨酸 72-267 mg；色氨酸 4.5-45 mg；
酪氨酸 27-139mg；缬氨酸 44-264 mg；
所述维生素在每升所述基础培养基含有如下成分：
生物素 0.002-0.02 mg；泛酸钙 1.09-10.9 mg；叶酸1.32-13.2 mg；
烟酰胺1.01-10.1mg；吡哆醛·HCl 1.009-10.1mg；吡哆醇·HCl 0.015-0.15 mg；
核黄素0.11-1.1mg；硫胺素 1.09-11mg；维生素B12 0.35-3.5mg；
所述微量元素在每升所述基础培养基含有如下成分：
七水硫酸锌 0.22-2.2mg；五水硫酸铜0.0006-0.006mg；
氯化铝 0.0010-0.01 mg；四水钼酸铵 0.0002-0.002mg；
醋酸钡 0.0005-0.005 mg；氯化镉0.003-0.03 mg；
六水氯化铬 0.0001-0.001 mg；六水氯化钴 0.0004-0.004 mg；
二氧化锗0.0001-0.001 mg；六水氯化镍 0.00003-0.0003 mg；
溴化钾0.000021-0.00021 mg；碘化钾 0.000032-0.00032 mg；
硝酸银0.000032-0.00032 mg；柠檬酸钠 0.106-1.06 mg；
四氯化钛 0.0001-0.001 mg；八水氧氯化锆 0.00056-0.0056 mg；
所述碳水化合物及有机分子在每升所述基础培养基含有如下成分：
葡萄糖 1800-9000mg；i-肌醇 6.25-62.5mg；丙酮酸钠27.5-275 mg；
亚油酸 0.021-0.21mg；亚麻酸 0.001-0.01mg；硫辛酸 0.053-0.53 mg；
腐胺·2HC1 0.04-0.4 mg；甲醇胺0.005-0.05mg；精胺0.005-0.05mg；
硫代甘油 0.01-0.1 mg；氧化胆碱 4.48-44.8 mg；次黄嘌呤钠 1.19-11.9 mg；
胸苷 0.18-1.8 mg；酚红 0.002-0.007mg；
所述表面活性剂为Pluronic F68，其在每升所述基础培养基中的成分含量为500-2000 mg。
优选地，所述补料培养基浓度为70g/L。
优选地，所述培养基添加剂的含量分别为D-半乳糖500-5000mg/L、尿嘧啶100-1000mg/L、Mn2+ 1-20μmol/L。
优选地，所述补料培养基的成分为无机盐、氨基酸、维生素、微量元素及碳水化合物、有机分子和水解物，其中
所述无机盐在每升所述补料培养基含有如下成分：
CaC12 180-291mg；KCl 155-355 mg；MgSO4 34-80 mg；
MgCl2 80-152 mg；NaCl 1870-6750mg；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4 · H2O 95-258mg；Na2HPO4 86-200mg；柠檬酸铁44~65 mg；
所述氨基酸在每升所述补料培养基含有如下成分：
丙氨酸 8.9-11.1mg；精氨酸 234-368mg；天冬氨酸 200-275mg；
天冬酰胺 58-100mg；半胱氨酸 55-100mg；胱氨酸67-89mg；
谷氨酸 280-365mg；甘氨酸 50-70mg；组氨酸 90-160mg；
异亮氨酸 211-280mg；亮氨酸 200-300mg；赖氨酸 250-450mg；
蛋氨酸 60-90 mg；苯丙氨酸 150-180 mg；脯氨酸 95-155 mg；
丝氨酸 89-130 mg；苏氨酸 160-270 mg；色氨酸 34-45 mg；
酪氨酸 120-140mg；缬氨酸 180-280 mg；
所述维生素在每升所述补料培养基含有如下成分：
生物素 0.01-0.03 mg；泛酸钙 5.0-15.9 mg；叶酸10.2-19.2 mg；
烟酰胺8.1-25.1mg；吡哆醛·HCl 7.9-20.1mg； 吡哆醇·HCl 0.075-0.15 mg；
核黄素0.8-1.1mg；硫胺素 8.5-11mg；维生素B12 2.3-3.5mg；
所述微量元素在每升所述补料培养基含有如下成分：
七水硫酸锌 1.5-2.2mg；五水硫酸铜0.004-0.006mg；
氯化铝 0.007-0.02 mg；四水钼酸铵 0.0007-0.002mg；
醋酸钡 0.0015-0.005 mg；氯化镉0.01-0.03 mg；
六水氯化铬 0.0004-0.001 mg；六水氯化钴 0.0012-0.004 mg；
二氧化锗0.0003-0.001 mg；六水氯化镍 0.0001-0.0003 mg；
溴化钾0.00006-0.00021 mg；碘化钾 0.00009-0.00032 mg；
硝酸银0.00009-0.00032 mg；柠檬酸钠 0.3-1.06 mg；
四氯化钛 0.0003-0.001 mg；八水氧氯化锆 0.0016-0.0056 mg；
所述碳水化合物及有机分子在每升所述补料培养基含有如下成分：
葡萄糖 5400-36000mg；i-肌醇 12.5-62.5mg；丙酮酸钠55-275 mg；
亚油酸 0.06-0.21mg；亚麻酸 0.003-0.01mg；硫辛酸 0.15-0.53 mg；
腐胺·2HC1 0.12-0.40mg；甲醇胺0.015-0.05mg；精胺0.01-0.05mg；
硫代甘油 0.03-0.1mg；氧化胆碱 9-44.8 mg；次黄嘌呤钠 2.4-11.9 mg；
胸苷 0.36-1.8 mg；
所述水解物为大豆水解物，其在每升所述补料培养基中的成分含量为10~50g/L。
优选地，任意一用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基应用，所述无血清培养基应用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的工业化生产。
优选地，所述培养CHO细胞株采用补料批培养工艺。
优选地，该方法包括如下步骤，
S1、细胞接种控制，控制所述细胞起始接种密度为4-8×105cells/ml，接种体积为工作体积的1/6-1/3，搅拌转数为50-200转/分钟；
S2、培养参数控制，
温度控制在35-37℃（±0.5℃），pH控制在6.80-7.20（±0.5），溶氧控制在20-60%（±5%），转速控制在60-100转/分（±5转/分）；
S3、补料方式控制，
向生物反应器中的接种了CHO细胞的无血清培养基中补加补料培养基，每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积的2%-5%；
S4、结束培养控制，
控制所述补料批培养过程中，CHO细胞活率低于80%或培养周期达12-20天；
S5、监测培养条件，
所述监测的条件包括温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量。
优选地，所述生产方法规模为100L~10000L。
本发明的有益效果：1）反应器中的细胞通过补加补料培养基，因此整个生产过程中能维持较高的细胞密度，从而较大的提高了产品的产量；
2）本发明中的培养基避免了潜在的病毒污染，在提高产品产量的同时保证了的产品质量；
3）在培养基中使用添加剂，避免了培养后期死细胞增多影响产物的糖基化修饰程度，保证了产物的质量；
4）生产的总周期短，相对连续批培养，操作简单，大大降低了污染产生的风险；
5）细胞在反应器维持较高的活率，并且结束培养时细胞活率也不低于80%，保证较好的产品质量，减轻了下游纯化的压力；
6）大幅降低了生产成本。
附图说明
图1 是100mL摇瓶规模培养的细胞生长情况图；
图2 是10L规模培养中细胞的生长情况图；
图3 是100L规模培养中细胞的生长情况图。
具体实施方式
以下结合实施例具体说明本发明的制备方法：
本发明揭示了一种用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，一种用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，所述培养基包括无血清基础培养基、补料培养基和培养基添加剂。所述基础培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、表面活性剂及其他有机分子，所述补料培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、表面活性剂及其他有机分子
所述培养基添加剂的成分和含量分别为D-半乳糖500-5000mg/L、尿嘧啶100-1000mg/L、Mn2+ 1-20μmol/L。
所述无机盐在每升所述基础培养基含有如下成分：
CaC12 58-291mg；KCl 155-776 mg；MgSO4 24-75 mg；
MgCl2 30-142 mg；NaCl 3490-17450mg；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4 · H2O 32-158mg；Na2HPO4 36-175mg；柠檬酸铁10~55 mg；
所述氨基酸在每升所述基础培养基含有如下成分：
丙氨酸 2.2-11.1mg；精氨酸 74-368mg；天冬氨酸 100-275mg；
天冬酰胺 37-95mg；半胱氨酸 15-87mg；胱氨酸33-89mg；
谷氨酸 140-367mg；甘氨酸 19-69mg；组氨酸 65-157mg；
异亮氨酸 146-271mg；亮氨酸 143-295mg；赖氨酸 45.6-456mg；
蛋氨酸 19-86 mg；苯丙氨酸 45-177 mg；脯氨酸 21-150 mg；
丝氨酸 56-131 mg；苏氨酸 72-267 mg；色氨酸 4.5-45 mg；
酪氨酸 27-139mg；缬氨酸 44-264 mg；
所述维生素在每升所述基础培养基含有如下成分：
生物素 0.002-0.02 mg；泛酸钙 1.09-10.9 mg；叶酸1.32-13.2 mg；
烟酰胺1.01-10.1mg；吡哆醛·HCl 1.009-10.1mg；吡哆醇·HCl 0.015-0.15 mg；
核黄素0.11-1.1mg；硫胺素 1.09-11mg；维生素B12 0.35-3.5mg；
所述微量元素在每升所述基础培养基含有如下成分：
七水硫酸锌 0.22-2.2mg；五水硫酸铜0.0006-0.006mg；
氯化铝 0.0010-0.01 mg；四水钼酸铵 0.0002-0.002mg；
醋酸钡 0.0005-0.005 mg；氯化镉0.003-0.03 mg；
六水氯化铬 0.0001-0.001 mg；六水氯化钴 0.0004-0.004 mg；
二氧化锗0.0001-0.001 mg；六水氯化镍 0.00003-0.0003 mg；
溴化钾0.000021-0.00021 mg；碘化钾 0.000032-0.00032 mg；
硝酸银0.000032-0.00032 mg；柠檬酸钠 0.106-1.06 mg；
四氯化钛 0.0001-0.001 mg；八水氧氯化锆 0.00056-0.0056 mg；
所述碳水化合物及有机分子在每升所述基础培养基含有如下成分：
葡萄糖 1800-9000mg；i-肌醇 6.25-62.5mg；丙酮酸钠27.5-275 mg；
亚油酸 0.021-0.21mg；亚麻酸 0.001-0.01mg；硫辛酸 0.053-0.53 mg；
腐胺·2HC1 0.04-0.4 mg；甲醇胺0.005-0.05mg；精胺0.005-0.05mg；
硫代甘油 0.01-0.1 mg；氧化胆碱 4.48-44.8 mg；次黄嘌呤钠盐 1.19-11.9 mg；
胸苷 0.18-1.8 mg；酚红 0.002-0.007mg；
所述表面活性剂为Pluronic F68，其在每升所述基础培养基中的成分含量为500-2000 mg。培养CHO细胞株采用补料批培养工艺。
具体工艺步骤为，将CHO细胞接种到无血清培养基中，其起始接种密度为4-8×105cells/ml，接种体积为工作体积的1/6-1/3，搅拌转数为50-200转/分钟。
在补料批培养过程中，所述培养参数条件：温度控制在33-37℃（±0.5℃），pH=6.80-7.20（±0.05），溶氧控制在20-60%（±5%），转速控制在50-200转/分钟（±5转/分钟）。
所述补料方式：向生物反应器中的增殖CHO细胞的无血清培养基中补加补料培养基，每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积的2%-5%。在补料批培养过程中，CHO细胞活率低于80%或培养周期达12-20天结束培养。
在所述补料批培养工艺中需要对整个培养周期中每天的温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量的监控。本发明所提供的无血清基础培养基以及补料培养基，其中基础培养基为化学限定培养基，成分明确，无动物来源成分，并且通过D-半乳糖、尿嘧啶、Mn2+的添加，实现细胞生长好、维持时间长、表达产物糖型优化的目的。在实现这些特点的同时，该化学限定培养基的使用提高了重组人促甲状腺激素的下游分离和纯化的效率。
所述D-半乳糖、尿嘧啶、Mn2+的添加所达到的作用原理为，半乳糖和尿嘧啶的加入提高了细胞内糖链合成前体的含量，从而优化重组蛋白糖链的修饰。Mn2+能够在中性条件下提高糖链修饰通路中CMP-唾液酸合成酶的活性，从而表现为表达蛋白的唾液酸修饰增加。这三种物质的加入，使得细胞在补料批培养这种工艺下，能够表达出糖型修饰较好的目的蛋白。
细胞培养实验
本实施例提供一种生产重组人促甲状腺激素的批培养工艺，使用基础培养基及补料培养基，添加500mg/L D-半乳糖、100mg/L尿嘧啶、1μmol/L Mn2+，采用动物细胞100mL（摇瓶）规模的补料批培养，包括如下步骤：
将种子细胞复苏并扩增培养，制备细胞悬液，接种，无血清培养基为本公司自主研发的培养基。在37+0.2℃培养，进行14天的补料批实验，补料培养基为本公司自主研发的培养基A，培养第4天开始，每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积的2%；每日取细胞计数，收集培养上清液，离心去除细胞后冻存，应用ELISA的方法检测细胞的表达量。细胞生长情况如图1所示，细胞在基础培养基及补料培养基中生长良好，表达量接近250mg/L。
扩大化的细胞培养测试
使用含有以上基础培养基及补料培养基的无血清培养基，添加剂及补料培养基，采用动物细胞10L规模的补料批培养，包括如下步骤：
1、细胞接种控制
复苏一支CHO种子细胞至摇瓶，20mL；每3天传代扩增，至1.7L。当细胞处在对数生长期时（密度在3×106cells/mL左右），将1.7L种子细胞接种至生物反应器内的无血清培养基；接种后细胞密度为6.1×105cells/mL，反应器起始工作体积为8L。
2、培养参数控制
温度控制在35-37℃（±0.5℃），pH控制在6.80-7.20（±0.05），溶氧控制在20-60%（±5%），转速控制在100-150转/分（±5转/分）。
3、补料方式控制
培养至3-4天时，向生物反应器中的接种了CHO细胞的无血清培养基中补加补料培养基，每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积的2%-5%。
4、结束培养控制
培养至14天时，细胞密度为4.6×106cells/mL，细胞活率为96%，状态较好；培养到达预定培养周期，结束培养。
5、监测培养条件
培养过程中需要监测的指标有：温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量。
在10L规模培养中细胞能保持高密度及高活率，细胞的最高密度为8.3×106cells/mL，平均活率为96%，重组人促甲状腺激素的表达量为300mg/L左右。上述培养能够在10L规模中高效稳定地表达重组人促甲状腺激素。细胞生长及表达结果如图2所示。
再扩大化的细胞培养测试
本实施例提供一种重组人促甲状腺激素的工业化生产方法，使用本发明所述无血清基础培养基，添加剂及补料培养，采用动物细胞100L规模的补料批培养，包括如下步骤：
1、细胞接种控制
复苏一支CHO种子细胞至摇瓶，20mL；每3天传代扩增，至15L。当细胞处在对数生长期时（密度在3×106cells/mL左右），将15L种子细胞接种至生物反应器内的无血清培养基；接种后细胞密度为5.1×105cells/mL，反应器起始工作体积为80L，得到接种了CHO细胞的无血清培养基。
2、培养参数控制
温度控制在35-37℃（±0.5℃），pH控制在6.80-7.20（±0.5），溶氧控制在20-60%（±5%），转速控制在60-100转/分（±5转/分）。
3、补料方式控制
培养至3-4天时，向生物反应器中的接种了CHO细胞的无血清培养基中补加补料培养基，每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积的2%-5%。
4、结束培养控制
培养至14天时，细胞密度为7.2×106cells/mL，细胞活率为91%，状态较好；培养到达预定培养周期，结束培养。
5、监测培养条件
培养过程中需要监测的指标有：温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量。
在100L规模培养中细胞能保持高密度及高活率，细胞的最高密度为9.0×106cells/mL、平均活率为95%、重组人促甲状腺激素的表达量为300mg/L左右。上述培养能够在100L规模培养中高效稳定地表达重组人促甲状腺激素，成功实现从10L规模至100L规模的放大，工艺稳定。细胞生长如图3所示。
无血清培养基补料批培养方式生产重组人促甲状腺激素，不仅使生产工艺稳定且易于放大，在保证产物品质的同时明显减短生产周期，降低了污染产生的风险，减轻了生产者的劳动强度，节约了生产成本，提高了产品的安全性和均一性。
本发明的重组人促甲状腺激素的工业化生产方法中，使用的无血清基础培养基及补料培养基可稳定提高重组人促甲状腺激素表达量，同时保障CHO细胞能够高效稳定地表达重组人促甲状腺激素，工艺稳定、产物质量好、操作简便适合大规模培养。
本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
Claims (9)
1.一种用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于：所述培养基包括无血清基础培养基、补料培养基和培养基添加剂，所述基础培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、表面活性剂及其他有机分子，所述补料培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、大豆水解物及其他有机分子，所述培养基添加剂为D-半乳糖、尿嘧啶、Mn2+中的一种或一种以上的组合。
2.如权利要求1所述的用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于：所述无机盐在每升所述基础培养基含有如下成分：
CaC12 58-291mg；KCl 155-776 mg；MgSO4 24-75 mg；
MgCl2 30-142 mg；NaCl 3490-17450mg；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4 · H2O 32-158mg；Na2HPO4 36-175mg；柠檬酸铁10~55 mg；
所述氨基酸在每升所述基础培养基含有如下成分：
丙氨酸 2.2-11.1mg；精氨酸 74-368mg；天冬氨酸 100-275mg；
天冬酰胺 37-95mg；半胱氨酸 15-87mg；胱氨酸33-89mg；
谷氨酸 140-367mg；甘氨酸 19-69mg；组氨酸 65-157mg；
异亮氨酸 146-271mg；亮氨酸 143-295mg；赖氨酸 45.6-456mg；
蛋氨酸 19-86 mg；苯丙氨酸 45-177 mg；脯氨酸 21-150 mg；
丝氨酸 56-131 mg；苏氨酸 72-267 mg；色氨酸 4.5-45 mg；
酪氨酸 27-139mg；缬氨酸 44-264 mg；
所述维生素在每升所述基础培养基含有如下成分：
生物素 0.002-0.02 mg；泛酸钙 1.09-10.9 mg；叶酸1.32-13.2 mg；
烟酰胺1.01-10.1mg；吡哆醛·HCl 1.009-10.1mg；吡哆醇·HCl 0.015-0.15 mg；
核黄素0.11-1.1mg；硫胺素 1.09-11mg；维生素B12 0.35-3.5mg；
所述微量元素在每升所述基础培养基含有如下成分：
七水硫酸锌 0.22-2.2mg；五水硫酸铜0.0006-0.006mg；
氯化铝 0.0010-0.01 mg；四水钼酸铵 0.0002-0.002mg；
醋酸钡 0.0005-0.005 mg；氯化镉0.003-0.03 mg；
六水氯化铬 0.0001-0.001 mg；六水氯化钴 0.0004-0.004 mg；
二氧化锗0.0001-0.001 mg；六水氯化镍 0.00003-0.0003 mg；
溴化钾0.000021-0.00021 mg；碘化钾 0.000032-0.00032 mg；
硝酸银0.000032-0.00032 mg；柠檬酸钠 0.106-1.06 mg；
四氯化钛 0.0001-0.001 mg；八水氧氯化锆 0.00056-0.0056 mg；
所述碳水化合物及有机分子在每升所述基础培养基含有如下成分：
葡萄糖 1800-9000mg；i-肌醇 6.25-62.5mg；丙酮酸钠27.5-275 mg；
亚油酸 0.021-0.21mg；亚麻酸 0.001-0.01mg；硫辛酸 0.053-0.53 mg；
腐胺·2HC1 0.04-0.4 mg；甲醇胺0.005-0.05mg；精胺0.005-0.05mg；
硫代甘油 0.01-0.1 mg；氧化胆碱 4.48-44.8 mg；次黄嘌呤钠 1.19-11.9 mg；
胸苷 0.18-1.8 mg；酚红 0.002-0.007mg；
所述表面活性剂为Pluronic F68，其在每升所述基础培养基中的成分含量为500-2000 mg。
3.如权利要求1所述的用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于：所述补料培养基浓度为70g/L。
4.如权利要求1所述的用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于：所述培养基添加剂的含量分别为D-半乳糖500-5000mg/L、尿嘧啶100-1000mg/L、Mn2+ 1-20μmol/L。
5.如权利要求1所述的用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于，所述补料培养基的成分为无机盐、氨基酸、维生素、微量元素及碳水化合物、有机分子和水解物，其中
所述无机盐在每升所述补料培养基含有如下成分：
CaC12 180-291mg；KCl 155-355 mg；MgSO4 34-80 mg；
MgCl2 80-152 mg；NaCl 1870-6750mg；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4 · H2O 95-258mg；Na2HPO4 86-200mg；柠檬酸铁44~65 mg；
所述氨基酸在每升所述补料培养基含有如下成分：
丙氨酸 8.9-11.1mg；精氨酸 234-368mg；天冬氨酸 200-275mg；
天冬酰胺 58-100mg；半胱氨酸 55-100mg；胱氨酸67-89mg；
谷氨酸 280-365mg；甘氨酸 50-70mg；组氨酸 90-160mg；
异亮氨酸 211-280mg；亮氨酸 200-300mg；赖氨酸 250-450mg；
蛋氨酸 60-90 mg；苯丙氨酸 150-180 mg；脯氨酸 95-155 mg；
丝氨酸 89-130 mg；苏氨酸 160-270 mg；色氨酸 34-45 mg；
酪氨酸 120-140mg；缬氨酸 180-280 mg；
所述维生素在每升所述补料培养基含有如下成分：
生物素 0.01-0.03 mg；泛酸钙 5.0-15.9 mg；叶酸10.2-19.2 mg；
烟酰胺8.1-25.1mg；吡哆醛·HCl 7.9-20.1mg； 吡哆醇·HCl 0.075-0.15 mg；
核黄素0.8-1.1mg；硫胺素 8.5-11mg；维生素B12 2.3-3.5mg；
所述微量元素在每升所述补料培养基含有如下成分：
七水硫酸锌 1.5-2.2mg；五水硫酸铜0.004-0.006mg；
氯化铝 0.007-0.02 mg；四水钼酸铵 0.0007-0.002mg；
醋酸钡 0.0015-0.005 mg；氯化镉0.01-0.03 mg；
六水氯化铬 0.0004-0.001 mg；六水氯化钴 0.0012-0.004 mg；
二氧化锗0.0003-0.001 mg；六水氯化镍 0.0001-0.0003 mg；
溴化钾0.00006-0.00021 mg；碘化钾 0.00009-0.00032 mg；
硝酸银0.00009-0.00032 mg；柠檬酸钠 0.3-1.06 mg；
四氯化钛 0.0003-0.001 mg；八水氧氯化锆 0.0016-0.0056 mg；
所述碳水化合物及有机分子在每升所述补料培养基含有如下成分：
葡萄糖 5400-36000mg；i-肌醇 12.5-62.5mg；丙酮酸钠55-275 mg；
亚油酸 0.06-0.21mg；亚麻酸 0.003-0.01mg；硫辛酸 0.15-0.53 mg；
腐胺·2HC1 0.12-0.4 mg；甲醇胺0.015-0.05mg；精胺0.01-0.05mg；
硫代甘油 0.03-0.1 mg；氧化胆碱 9-44.8 mg；次黄嘌呤钠 2.4-11.9 mg；
胸苷 0.36-1.8 mg；
所述水解物为大豆水解物，其在每升所述补料培养基中的成分含量为10~50g/L。
6.如权利要求1至5中任意一用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基应用，其特征在于：所述无血清培养基应用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的工业化生产。
7.如权利要求6所述的重组人促甲状腺激素的工业化生产，其特征在于：所述培养CHO细胞株采用补料批培养工艺。
8.如权利要求7所述的重组人促甲状腺激素的工业化生产，其特征在于：该方法包括如下步骤，
S1、细胞接种控制，控制所述细胞起始接种密度为4-8×105cells/ml，接种体积为工作体积的1/6-1/3，搅拌转数为50-200转/分钟；
S2、培养参数控制，
温度控制在35-37℃（±0.5℃），pH控制在6.80-7.20（±0.5），溶氧控制在20-60%（±5%），转速控制在60-100转/分（±5转/分）；
S3、补料方式控制，
向生物反应器中的接种了CHO细胞的无血清培养基中补加补料培养基，每天添加补料培养基的量为生物反应器中实际培养体积的2%-5%；
S4、结束培养控制，
控制所述补料批培养过程中，CHO细胞活率低于80%或培养周期达12-20天；
S5、监测培养条件，
所述监测的条件包括温度、pH、葡萄糖浓度、乳酸浓度、摩尔渗透压浓度及蛋白表达量。
9.如权利要求8所述的重组人促甲状腺激素的工业化生产，其特征在于：所述工业化生产方法规模为100L~10000L。
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