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CN101173246B - 用于无蛋白无血清培养细胞的培养基 - Google Patents

用于无蛋白无血清培养细胞的培养基 Download PDF

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CN101173246B CN2007100968436A CN200710096843A CN101173246B CN 101173246 B CN101173246 B CN 101173246B CN 2007100968436 A CN2007100968436 A CN 2007100968436A CN 200710096843 A CN200710096843 A CN 200710096843A CN 101173246 B CN101173246 B CN 101173246B
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Abstract

本发明描述了一种培养基，所述培养基用于无蛋白无血清培养细胞、尤其是哺乳动物细胞，因而所述培养基含有一定比例的大豆水解产物。

Description

用于无蛋白无血清培养细胞的培养基 
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2000年9月27日；申请号：00816020.1(PCT/EP00/09453)；发明名称：“用于无蛋白无血清培养细胞的培养基”。 
发明领域 
本发明涉及用于无蛋白无血清培养细胞的培养基。 
背景技术
细胞、尤其是真核细胞或哺乳动物细胞的培养一直需要应用特殊的培养基，所述培养基使得所述细胞可获得有效生长和生产所需蛋白质需要的营养物质和生长物质。通常，在该方面，血清或源自血清(例如牛血清)的化合物用作所述培养基的组分。 
然而，在细胞培养中使用源自人或动物来源的血清或蛋白质添加剂的清况下，存在许多问题，尤其是在用于制备给予人的药物的原材料是通过细胞培养而获得时。 
因此，就这类血清制剂而论，所述组合物和质量已经是每批都不同，这正是因为用于这类制剂的供体生物的相异性所致。这是一个相当大的问题，尤其是对于细胞生产标准化以及在建立这类细胞的标准生长条件时。然而，在所有情况下都要求对所用血清材料进行广泛而恒定的质量控制。然而，这是相当耗时及昂贵的，尤其是在象血清这样复杂的成分的情况下。 
此外，这类复杂制剂含有多种可以以破坏方式起作用的蛋白质，尤其是在用于从细胞培养物中回收的重组蛋白的纯化过程的情况下。这尤其适用于与待回收的蛋白质同源或相似的那些蛋白质。不用说，这些问题尤其急待解决，因为在纯化过程中仅可以通过十分专一的差 别纯化(例如用仅特异性抗重组蛋白而不抗牛蛋白的抗体)可靠地去除培养基中所用的生物附属物(例如牛蛋白)(
Figure S07196843620070424D00002113345QIETU
，L，J.Immunol.，1988，第140卷，第1194-1197页；Nilson等，J.Immunol.Meth，1993，164，第33-40页)。 
然而，在培养基中应用血清或源自血清的化合物时一个明显的问题也是有支原体、病毒或BSE因子污染的危险。关于来源于人血的制剂，在该方面必须特别强调被病毒(例如肝炎病毒或HIV)污染的危险。就血清或源自牛材料的血清组分而论，尤其存在BSE污染的危险。除此之外，所有血清来源的材料又可能被尚未知的致病因子污染。 
为了保证细胞适当地表面粘附以及保证从细胞适当生产所需的物质，除了少数例外外，加入血清组分先前一直被认为对于在固体表面培养细胞确实是必需的。因此，例如用描述于WO91/09935的方法，已有可能通过无血清无蛋白培养表面依赖型永久细胞、最好是vero细胞(参见WO96/15231)来获得无血清无蛋白培养FSME病毒/病毒抗原的方法。然而，这些细胞不是重组细胞，而是用来在裂解过程中生产病毒抗原的宿主细胞。 
与此相反，主要用于重组制剂的细胞(例如CHO细胞)能够只在有限程度上贴壁。因此，一直通过常规方法培育的CHO细胞只在含血清的条件下与光滑微载体和多孔微载体结合(参见US4,973,616；Cytotechnology9(1992)，247-253)。然而，如果在无血清的条件下培育这类细胞，它们则丧失这一特性并且不粘附于光滑载体，或者如果在培养基中没有提供其它粘着促进添加剂，例如纤连蛋白、胰岛素或运铁蛋白，则它们变得容易地从载体中脱落下来。然而，这些粘着促进添加剂也是源自血清的蛋白。 
要不然，可以采用悬浮培养技术以及例如采用分批法或采用连续培养技术培养细胞。进行培养最好采用恒化方法(Ozturk S.S.等，1996，Abstr.Pap.Am.Chem.Soc.，BIOT164，Payne G.F.等，载于：“Large ScaleCell Culture Technology，”1987，Lydersen B.K.编著，Hauser publishers； 第206-212页)。Kattinger H.等(Advances Mol.Cell.Biology，1996，15A，193-207)描述了在无蛋白培养基中长期培养细胞，但这些细胞必需在载体上进行培养，并且没有例如连续培养技术的可供选择的方法。据说这些细胞当贴壁于载体表面时仅显示长期稳定性，因为生长减少所致，并且因此对生长因子的需求减少。 
另外，为了使细胞适应始于含血清条件的无蛋白培养基，现有技术已经屡次进行了尝试。然而，关于这种适应，已经重复地发现，与含血清的条件相比，在适应后，在无蛋白培养基中已表达蛋白的得率和重组细胞的生产率显著降低(Appl.Microbiol.Biotechnol.40(1994)，691-658)。 
也已经发现，在高细胞密度的情况下，重组蛋白的生产有时受到相当大的限制。在试图使细胞适应无蛋白或无血清培养基期间，也重复发现所用细胞的不稳定性，伴随生长减少，使得产生表达减少的细胞，或甚至产生非生产性细胞，从而这些细胞在无蛋白无血清培养基中具有相对于生产细胞的生长优势，这导致这样一个事实：这些细胞的生长超过生产细胞，然后，最终，全部培养物于是产生非常低的产物得率。 
发明内容
因此，本发明的一个目的是提高无蛋白无血清培养重组细胞以及制备药物的可能性，以及改进现有的可以用来以无血清或无蛋白方式有效培养重组细胞的方法。此外，应该因此有可能不仅培养表面依赖型细胞，而且有可能应用悬浮培养技术，因此需要尽可能地抑制细胞生产率的不稳定性。 
另外，本发明的再一个目的是有效提高重组细胞的产量。 
最后，按照本发明，需要改进重组细胞对无血清无蛋白培养基的适应并且使其配置更有效。 
按照本发明，借助无蛋白无血清培养细胞、尤其是哺乳动物细胞 的培养基完成了这些工作，所述培养基的特征在于所述培养基含有一定比例的大豆水解产物。 
令人惊奇的是，已有可能表明，通过在含有大豆水解产物的培养基中培养细胞可以达到上述目的，而不必忍受现有技术描述的无血清培养的缺点。与现有技术已知的其它水解产物(例如小麦水解产物、水稻水解产物或酵母水解产物)相反，已经发现仅大豆水解产物介导按照本发明的特性，并且导致例如显著提高重组靶蛋白的得率。当论及这些术语时，可以使用或者术语大豆水解产物或者术语大豆蛋白胨，而没有不同的含义。 
按照本发明的培养基最好含有基于所述培养基总干重的10％(重量)以上的大豆水解产物。通常，以4-40％的量提供培养基中的大豆水解产物。 
按照本发明，特定大豆水解产物的选择并不重要。按照本发明可以使用市场上将找到的许多大豆制品，例如，来自大豆粉经酶消化(例如用木瓜蛋白酶)的蛋白胨，其pH值为6.5-7.5，总含氮量为9％-9.7％，灰分含量为8-15％。这些是本领域专家一般用于细胞培养的形式的来自大豆的蛋白胨。 
按照一个优选形式的实施方案，在按照本发明的培养基中使用大豆水解产物或其粗制级分的纯化制剂。在这种纯化过程中最好消除可能干扰有效培养的杂质，或提高所述水解产物的精确度，例如就分子量而论。 
按照本发明，实际上已经证明在该纯化过程中提供超滤步骤尤其重要；为此，在按照本发明的培养基中尤其优选使用经超滤的大豆水解产物。 
超滤可以按照现有技术中全面描述的方法来进行，例如，使用具有已知截留限的薄膜滤器。 
借助“凝胶层析，例如，借助Sephadex层析，例如，用SephadexG25或Sephadex G10或等同材料，借助离子交换层析、亲和层析、大 小排阻层析或“反相”层析，可以进行经超滤的大豆蛋白胨的纯化。这些是得自现有技术的方法，并且是本领域专家熟悉的。采用该方法，可以选择含有已知分子量的大豆水解产物的那些级分，所述分子量例如≤1000道尔顿、优选≤500道尔顿、更优选≤350道尔顿。 
因此，本发明也包括用于生产无血清无蛋白细胞培养基的方法，所述方法包括获得一种大豆水解产物，采用超滤法超滤所述大豆水解产物，采用大小排阻层析纯化所述大豆水解产物的级分并且选择由分子量≤1000道尔顿、优选≤500道尔顿、更优选≤350道尔顿的大豆水解产物组成的大豆水解产物级分。 
尤其有利的大豆水解产物的特征在于，其游离氨基酸含量为10.3-15.6％、或优选12-13.5％，总含氮量为7.6-11.4％、或优选8.7-9.5％，内毒素含量为<500U/g；并且由此大豆水解产物中至少40％、或优选至少50％、或尤其优选至少55％的分子量为200-500道尔顿，大豆水解产物中至少10％、或优选至少15％的分子量为500-1000道尔顿。最优选的是，大豆水解产物中至少90％的分子量为≤500道尔顿。 
这种大豆水解产物非常好地适合于工业化生产重组蛋白，这是由于其特殊的特性所致，可以特别容易地对其进行标准化，并且它可用于常规方法中。 
除大豆水解产物外，按照本发明的培养基也可以以某种方式含有本身已知的合成培养基，例如DMEM/HAM’s F12、Medium199或RPMI，从文献中对这些已有相当的了解。 
此外，按照本发明的培养基也最好含有氨基酸，所述氨基酸最好选自L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺或其混合物。 
在按照本发明的培养基中最好也加入以下氨基酸：L-天冬酰胺(其量为每升培养基0.001-1g，优选0.1-0.05g/L、尤其优选0.015-0.03g/L)、L-半胱氨酸(0.001-1g/L、优选0.005-0.05g/L、尤其优选0.01-0.03g/L)、L-胱氨酸(0.001-1g/L、优选0.01-0.05g/L、尤其优选0.015-0.03 g/L)、L-脯氨酸(0.001-1.5g/L、优选0.01-0.07g/L、尤其优选0.02-0.05g/L)、L-色氨酸(0.001-1g/L、优选0.01-0.05g/L、尤其优选0.015-0.03/L)和L-谷氨酰胺(0.05-1g/L、优选0.1-1g/L)。 
在按照本发明的培养基中可以单独或联合加入上述氨基酸。尤其优选联合加入含有所有上述氨基酸的氨基酸混合物。 
在一个特定形式的实施方案中使用无血清无蛋白培养基，从而该培养基另外含有上述氨基酸混合物与经纯化的超滤大豆蛋白胨的组合。 
意想不到的是，例如，已经发现为了灭活病毒或其它病原体，所述培养基可以于70-95℃、或优选85-95℃加热约5-20分钟、或优选15分钟，而没有负面效应。 
按照本发明，每种已知的合成培养基都可以与所述大豆水解产物联合使用。常规的合成培养基可以含有无机盐、氨基酸、维生素、碳源和水。例如，可以使用DMEM/HAM’s F12培养基。培养基中大豆汁的浓度可能最好为0.1-100g/L、尤其优选1-5g/L。按照一个尤其优选形式的实施方案，可以使用大豆蛋白胨，所述大豆蛋白胨就其分子量而论已经被标准化。该大豆蛋白胨的分子量最好小于50kD、尤其优选小于10kD、最优选小于1kD。 
已经证明超滤大豆蛋白胨的加入对于重组细胞系的生产率尤其有利，从而所述大豆蛋白胨的平均分子量为350道尔顿(QuestCompany)。这是一种这样的大豆分离物，其总含氮量为约9.5％，游离氨基酸含量为约13％。 
尤其优选使用分子量为≤1,000道尔顿、优选≤500道尔顿、尤其优选≤350道尔顿的纯化超滤大豆蛋白胨。 
按照本发明的培养基也最好含有辅助物质，例如，缓冲物质、氧化稳定剂、对抗机械应力的稳定剂或蛋白酶抑制剂。 
尤其使用具有以下组成的培养基：合成的基本培养基(1-25g/L)、大豆蛋白胨(0.5-50g/L)、L-谷氨酰胺(0.05-1g/L)、NaHCO3(0.1-10 g/L)、抗坏血酸(0.0005-0.05g/L)、乙醇胺(0.0005-0.05g/L)和亚硒酸钠(1-15μg/L)。 
如有需要，按照本发明的培养基中可以加入作为消泡剂的非离子型表面活性剂，例如，聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)。 
由于在没有加入表面活性剂的情况下，上升和爆裂的气泡可能导致位于这些气泡(“发泡”)表面的那些细胞损伤，因此为了保护细胞免受通气的负面效应，通常使用该试剂(Murhammer和Goochee，1990，Biotechnol.Prog.6：142-148)。 
虽然非离子型表面活性剂的量可以因此为0.05-10g/L，但是尤其优选可能的最低量为0.1-5g/L。 
另外，按照本发明的培养基也可以含有环糊精或其衍生物。 
所述无血清无蛋白培养基最好含有蛋白酶抑制剂，例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们适用于组织培养并且可以来源于合成或植物。 
已经适应的细胞最好用作在按照本发明的培养基中培养的细胞，即已经适应在无蛋白无血清培养基中生长的细胞。已经发现，通过应用按照本发明的培养基，用这类预适应的细胞不仅可以达到得率增加，而且也明显提高它们对于无血清无蛋白培养的稳定性。 
然而，按照本发明，已经证明重组细胞克隆尤其具有价值，从而这些重组细胞克隆在无血清无蛋白培养基中从开头稳定至少40个世代、优选至少50个世代，并且表达重组产物。 
这样的细胞克隆可得自重组的原始细胞克隆在含血清的培养基中培养并且使所述细胞再适应无血清无蛋白培养基后获得的细胞培养物。 
术语“原始细胞克隆”可以理解为是指在用重组核苷酸序列转染宿主细胞后以稳定的方式在实验室条件下表达重组产物的重组细胞克隆转染子。在含血清的培养基中培育原始克隆，以便使其生长最佳。为了提高原始克隆的生产率，任选地在选择剂的存在下，用选择标记 和/或扩增标记进行选择，来培育所述原始克隆。对于大规模工业化生产，在含血清的培养条件下，使所述原始细胞克隆增殖至高细胞密度，然后使其恰好在生产期之前再适应无血清或无蛋白培养基。在这种情况下，培养最好在无选择压力时进行。 
可以从一开始就在无血清无蛋白培养基中进行重组原始细胞克隆的培养；结果是，再适应不再是必需的。在这种情况下，如有需要，也可以使用选择剂，并且可以用选择标记和/或扩增标记来进行选择。所述方法描述于例如EP0711835。 
对再适应无血清无蛋白培养基后获得的细胞培养物，测试细胞群体中以稳定的方式在无血清无蛋白条件、任选地在不存在选择压力下产生产物的那些细胞克隆。这可以例如借助用经标记的抗所述重组多肽或蛋白的特异性抗体的免疫荧光来进行。从所述细胞培养物分离出被鉴定为产物生产者的细胞，并且将其在最好与生产条件等同的无血清无蛋白条件下进行再培育。所述细胞的分离可以由此通过分离所述细胞并对其测试产物生产者来进行。 
可以再测试含有所述稳定细胞的细胞培养物的稳定重组克隆，从所述细胞培养物分离这些克隆并将其亚克隆。然后可以再在无血清无蛋白条件下培育在无血清无蛋白条件下获得的稳定的重组细胞克隆。 
以这种方法在按照本发明的培养基中制备的重组细胞克隆或细胞群体，尤其由于其特征为它们稳定至少40个世代、优选稳定至少50个世代、尤其稳定超过60个世代，并且表达重组产物，因此胜过其它重组细胞克隆或细胞群体。 
这种重组稳定的细胞克隆或细胞群体的一个实例已经根据布达佩斯条约提交了保藏，ECACC(UK)保藏号为98012206。 
将按照本发明进行培养的细胞培养物最好来源于重组哺乳动物细胞。因此，重组哺乳动物细胞可以是所有的含有编码重组多肽或蛋白的序列的那些细胞。在这一方面包括所有或者贴壁或者不贴壁生长的连续生长中的细胞。尤其优选重组CHO细胞或BHK细胞。重组多肽 或蛋白可以是血液因子、生长因子或其它生物医学相关制品。 
按照本发明，优选含有重组血液因子(例如因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI)、S蛋白、C蛋白、这些因子之一的活化形式或vWF的编码序列并且能够在数个世代内以稳定的方式表达这些蛋白的细胞克隆。在该方面尤其优选表达vWF或具有vWF活性的多肽、因子VIII或具有VIII活性的多肽、vWF和因子VIII、因子IX或因子II的重组CHO细胞。 
需要30个世代以建立主细胞库。至少需要约40个世代以进行1000-L规模的普通分批式培养。从单个细胞克隆开始，有可能用按照本发明的培养基制备“主细胞库”(MCB)和具有约8-10个世代的“工作细胞库”(WCB)，并且因此在生产规模(产量-生物量)下在无蛋白无血清条件下制备具有至多20-25个世代的细胞培养物，而与此相反，在用先前的细胞克隆和培养基在无血清或无蛋白培养基上生长后有些世代变得不稳定，结果是：a)具有产物生产者的均一细胞培养物是不可能得到的和b)在延长的时间内稳定的产物生产率是不可能达到的。 
然而，对比起来，甚至与已经在含血清的培养基中培养的原始细胞克隆相比，按照本发明甚至也有可能发现产物生产率提高。 
按照再一方面，本发明也涉及用于培养细胞、尤其是哺乳动物细胞的方法，其特征在于这些细胞已经被接种到按照本发明的培养基中，然后将其在该培养基中进行培养。 
因此，本发明也涉及应用按照本发明的培养基培养重组细胞、优选真核细胞、尤其是哺乳动物细胞。 
因此本发明的主题也是细胞培养物，所述细胞培养物包括按照本发明的培养基和细胞、优选真核细胞、尤其是哺乳动物细胞。 
通过以下实施例以及附图将更详细地阐述本发明，但不是用来限制本发明。
附图简述 
图1显示rFVIII-CHO细胞克隆在10-L灌注式生物反应器中的培养结果。 
a)42天内因子VIII的活性(毫单位/mL)及灌流速度(1-5/天)。 
b)灌注式生物反应器中的容积生产率(volumetric productivity)(因子VIII的单位/L/天)。 
图2显示在采用分批法在各种培养基中培养表达重组因子(rFactor)VIII的CHO细胞的情况下，因子VIII的生产率(mU/mL)的比较。Mix1由不含大豆水解产物但含有表4所列氨基酸混合物的无血清无蛋白培养基组成；Mix2由含有大豆水解产物的无血清无蛋白培养基组成；Mix3由含有大豆水解产物以及表4所列氨基酸混合物的无血清无蛋白培养基组成；Mix4由含有2.5g/l纯化超滤大豆水解产物以及表4所列氨基酸混合物的无血清无蛋白培养基组成。对于所述超滤大豆水解产物的纯化，使用
Figure S07196843620070424D000101
柱。 
图3显示在开始加入纯化超滤大豆蛋白胨(即在培养的第6天)后表达重组因子VIII的CHO细胞在无血清无蛋白培养基中连续生长的情况下，因子VIII的生产率(U/L)；和 
图4显示已经在含有大豆水解产物的无蛋白无血清培养基中培育的表达重组因子II的BHK细胞。 
实施例 
实施例1：
rvWF-CHO细胞在从含血清的培养液转移到无血清无蛋白培养液后的稳定性 
用质粒phAct-rvWF和pSV-dhfr共转染CHO-dhfr细胞，如Fischer等所述方法(1994，FEBS Letters351：345-348)亚克隆表达vWF的克隆。工作细胞库(WCB)始于所述亚克隆，该亚克隆以稳定的方式、在含血清、但不存在MTX的条件下表达rvWF，将所述细胞在含血清的条件下在多孔微载体 
Figure DEST_PATH_G07196843620080117D000011
上固定化。在细胞密度已经达到2×107细胞/mL基质后，将所述细胞转移到无血清无蛋白培养液中。在无血清无蛋白条件下将所述细胞再培养几个世代。利用免疫荧光，用标记的抗vWF抗体，在无血清无蛋白培养液中，在不同时间点测试所述细胞。采用转换培养液之前的工作细胞库，在所述无血清无蛋白培养液中10个世代后和60个世代后，评价所述细胞的稳定性。虽然所述工作细胞库仍表现为100％rvWF生产者，但rvWF生产者的比例在无血清无蛋白培养液中10个世代后减至约50％。60个世代后，超过95％的所述细胞被鉴定为非生产者。 
实施例2： 
克隆稳定的重组CHO克隆 
从按照实施例1的含有rvWF-CHO细胞的细胞培养物(根据布达佩斯条约，于1998年1月22日将名为r-vWF-CHO F7的这种稳定细胞克隆提交给ECACC(欧洲动物细胞保藏中心(European Collection ofCell Cultures，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英国)保藏，其分类命名为CLON F7(WCB 40SF/808.68/F7/20.08.97)；所获得的保藏号为98012206)制备连续稀释液，所述细胞培养物已经在无血清无蛋白培养液中培养了60个世代，然后将0.1细胞接种到微量滴定板的各孔中。将所述细胞在不加血清或不加蛋白的DMEM/HAM’s F12中在无选择压力下培养约3周，通过免疫荧光，用标记的抗vWF抗体测试所述细胞。将已经鉴定为阳性的一个细胞克隆用作制备种子细胞库的起始克隆。主细胞库(MCB)始于无血清无蛋白培养液中的所述种子细胞库，于单个安瓿中冷冻保存，用于进一步制备工作细胞库。在无血清无蛋白培养液中从单个安瓿制备工作细胞库。将所述细胞在多孔微载体上固定化后，在无血清无蛋白的条件下再培养几个世代。借助免疫荧光，用标记的抗vWF抗体，测试所述细胞在无血清无蛋白培养液中在不同时间点的生产率。在工作细胞库阶段以及在无血清无蛋白培养液中10个世代和60个世代后，评价所述细胞的稳定性。约100％的所 述细胞被鉴定为稳定的阳性克隆，所述克隆在工作细胞库阶段、10个世代和60个世代后均表达rvWF。 
实施例3：
重组细胞克隆的细胞比产出率 
在重组细胞的培养期间在特定阶段取出特定量的细胞，然后用新鲜培养液将这些细胞培养24小时。测定所述细胞培养物上清液中的rvWF：Risto-CoF-活性。表1显示，就按照本发明的稳定重组细胞克隆而论，细胞的比产出率甚至在无血清无蛋白培养液中60个世代后也是稳定的，并且与已经在含血清的培养液中培养的原始克隆相比，甚至提高了细胞的比产出率。 
表1 
  
细胞克隆 工作细胞的细胞比产出率(mU rvWF/106细胞/天) 10个世代后细胞比产出率(mU rvWF/106细胞/天) 60个世代后细胞比产出率(mU rvWF/106细胞/天)
rvWF-CHO#808.68原始细胞克隆 55 30 <10
r-vWF-CHOF7*)稳定的克隆 62 65 60
*)于1998年1月22日提交保藏(ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，英国)；保藏号98012206) 
实施例4：
合成的无血清无蛋白培养基的组成： 
表2 
  
成分 g/L 优选的量(按照我们在本专利申请时的知识)(g/L)
  
合成的基本培养基(DMEM/HAM’s F12) 1-100 11.00-12.00
大豆蛋白胨 0.5-50 2.5
L-谷氨酰胺 0.05-1 0.36
抗坏血酸 0.0005-0.05 0.0035
NaHCO3 0.1-10 2.00
乙醇胺 0.0005-0.05 0.0015
亚硒酸钠 1-15μg/l 8.6μg/l
任选的：Synperonic F68 0.01-10 0.25
实施例5： 
在无蛋白无血清基本培养基中培养rFVIII-CHO细胞 
在具有灌流的10-L搅拌釜中培养含有rFVIII-CHO细胞的细胞培养物。在这种情况下使用按照实施例4的培养基。由此将细胞在多孔微载体(
Figure S07196843620070424D000131
，Pharmacia)上固定化，然后培养至少6周。灌流速度为4倍体积换液/天；pH为6.9-7.2；O2浓度为约20-50％；温度为37℃。 
图1显示rFVIII-CHO细胞克隆在10L灌注式生物反应器中的培养结果。 
a)42天内因子VIII的活性(毫单位/mL)及灌流速度(1-5/天)。 
b)灌注式生物反应器中的容积生产率(因子VIII的单位/L/天)。 
表3 
  
培养的天数 细胞比产出率(mU/106细胞/天) 免疫荧光(％FVIII阳性细胞)
15 702 n.a.
21 1125 n.a.
28 951 >95％
35 691 >95％
42 970 n.a.
表3显示表达rFVIII的细胞的稳定性和比产出率。为了获得这些结果，于15天、21天、28天、35天和42天后取样，然后以300g将其离心，重悬于新鲜无血清无蛋白培养液中。再培养24小时后，测定细胞培养物上清液中因子VIII的浓度和细胞计数。根据这些数据计算出FVIII的比产出率。 
获得888毫单位/106细胞/天的稳定的平均生产率。在无血清无蛋白培养液中15天、21天、28天、35天和42天后，用抗FVIII抗体标记，通过免疫荧光也证实这种稳定的生产率。 
实施例6： 
比较重组FVIII-CHO细胞在含有其它培养基成分的无蛋白无血清培养液中的生产率 
分批培养含有rFVIII-CHO细胞的细胞培养物。在这种情况下，使用已经添加以下氨基酸的按照实施例4的培养基： 
表4
  
氨基酸： mg/l 优选的量(按照我们在本专利申请时的知识)(mg/L)
L-天冬酰胺 1-100 20
L-半胱氨酸·HCl·H2O 1-100 15
L-胱氨酸 1-100 20
L-脯氨酸 1-150 35
L-谷氨酰胺 50-1000 240
于37℃和pH6.9-7.2培育细胞。采用分批法在24-72小时内培育细胞。 
测定重组FVIII-CHO细胞在下列培养基组合物中的生产率： 
Mix1：包含不含大豆蛋白胨但另外含有按照上述表的氨基酸混合 物的无血清无蛋白培养基。 
Mix2：包含含有大豆蛋白胨的无血清无蛋白培养基。 
Mix3：包含含有大豆蛋白胨并且另外还含有按照上述表的氨基酸混合物的无血清无蛋白培养基。 
Mix4：包含无血清无蛋白培养基，并且另外还含有按照上述表的氨基酸混合物以及2.5g/L纯化超滤大豆蛋白胨。所述超滤大豆蛋白胨的纯化在
Figure S07196843620070424D000151
柱上用层析法进行。 
实施例7： 
采用恒化培养法在无蛋白无血清培养液中培养重组FVIII-CHO细胞 
在10-L搅拌式生物反应器中培养含有rFVIII-CHO细胞的细胞培养物。在这种情况下，使用按照实施例4的不含大豆蛋白胨但含有按照实施例6的氨基酸混合物的培养基。于37℃和pH6.9-7.2时培养细胞；氧浓度为20-50％空气饱和度。为了测定培养物上清液中因子VIII的效价和细胞浓度，每24小时进行取样。从第2天至第14天总细胞浓度是恒定的。从第6天开始在培养液中添加超滤大豆蛋白胨。因子VIII的生产率示于3中；借助CHROMOGENIX CoAFVIII:C/4系统进行所述测定。用标记的抗FVIII抗体进行免疫荧光。从所述数据可以观察到：由于添加大豆蛋白胨，因子VIII的生产率明显增加，并且因此生物反应器系统的容积生产率增加，因而这并不会导致细胞生长的明显增加。几天后，连续培养物中不存在大豆蛋白胨导致因子VIII的生产率的明显下降，而添加大豆蛋白胨的结果是生产率几乎增加10倍。然而，由于所述添加并不增加细胞计数，由此清楚地表明，超滤大豆蛋白胨的结果是导致不依赖于细胞生长的生产率的明显增加。 
实施例8： 
比较重组FVIII-CHO细胞在含有不同水解产物的无蛋白无血清培养液 中的生长速率和生产率 
分批培养rFVIII-CHO细胞培养物。在这种情况下，使用已经添加不同水解产物(来自大豆、酵母、水稻和小麦)的如实施例4所述的无血清无蛋白培养基。将没有加入水解产物的无血清无蛋白培养基用作对照。 
初始细胞密度分别为0.6×105和0.4×106。采用分批法于37℃在pH6.9-7.2下培养所述细胞。 
表5：显示在已经添加大豆水解产物(超滤的)和酵母水解产物的无血清无蛋白培养基中培养rFVIII-CHO细胞的实验结果。初始细胞密度为0.6×105细胞。将没有加入水解产物的无血清无蛋白培养基用作对照。 
表5 
  
水解产物 终细胞密度(×106/mL) FVIII效价(mU/mL) FVIII凝血活性(mU/mL)
大豆 3.6 485 508
酵母 3.3 226 230
表6：显示在已经添加大豆水解产物(超滤的)、水稻水解产物和小麦水解产物的无血清无蛋白培养基中培养rFVIII-CHO细胞的实验结果。初始细胞密度为0.6×105细胞。将没有加入水解产物的无血清无蛋白培养基用作对照。 
表6
  
水解产物 终细胞密度(×106/mL) FVIII效价(mU/mL) vWF-抗原(μg/mL)
大豆 3.7 1142 6.7
水稻 3.0 479 3.2
小麦 3.4 522 3.9
  
对照 3.0 406 3.1
表7：显示在已经添加大豆水解产物(超滤的)和小麦水解产物的无血清无蛋白培养基中培养rFVIII-CHO细胞的实验结果。初始细胞密度相当于0.4×106细胞。 
表7 
  
水解产物 终细胞密度(×106/mL) FVIII效价(mU/mL) FVIII-抗原(μg/mL) VWF-抗原(μg/mL)
大豆 1.6 1427 166 17.2
小麦 1.0 1120 92 7.9
实施例9：
在含大豆水解产物的无蛋白无血清培养液中培养BHK细胞 
通过CaPO4方法将BHK-21(ATCC CCL10)细胞用以下质粒共转染三次：25μg质粒pSV-FII(Fischer，B.等，J.Biol.Chem.，1996，第271卷，第23737-23742页)，该质粒含有在SV40启动子(SV40早期基因启动子)控制下的人因子II(凝血酶原)-cDNA；4μg氨甲蝶呤抗性的质粒pSV-DHFR和1μg介导G418/新霉素抗性的质粒pUCSV-neo(Schlokat，U.等，Biotech.Appl.Biochem.，1996，第24卷，第257-267页)。通过逐步增加氨甲蝶呤浓度直到3μM的浓度，借助在含有500μg/mLG418的培养液中进行培养来选择稳定的细胞克隆。 
对以这种方法获得的克隆进行亚克隆，并使其适应无蛋白无血清培养基。采用悬浮培养技术进行培养。 
结果可以参阅表6；在含大豆水解产物的无蛋白无血清培养基中培育的BHK细胞，表现出重组因子II的高的稳定的产率。

Claims (13)

1.一种用于培养哺乳动物细胞的无蛋白无血清培养基，所述培养基包含基于所述培养基总干重的超过10％重量的超过滤大豆水解产物，其中至少55％重量的所述大豆水解产物的分子量≤500道尔顿。
2.权利要求1的培养基，其中所述培养基包含纯化大豆水解产物。
3.权利要求1的培养基，其中所述大豆水解产物的内毒素含量＜500U/g。
4.权利要求1的培养基，其中所述培养基还含有氨基酸。
5.权利要求4的培养基，其中所述氨基酸选自L-天冬酰胺、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺或其混合物。
6.权利要求1的培养基，其中所述培养基还含有辅助物质，所述辅助物质选自缓冲物质、氧化稳定剂、对抗机械应力的稳定剂和蛋白酶抑制剂。
7.权利要求1的培养基用于培养哺乳动物细胞的用途。
8.权利要求1的培养基用于培养选自CHO细胞和BHK细胞的哺乳动物细胞的用途。
9.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括将所述哺乳动物细胞接种到权利要求1的培养基中和让所述哺乳动物细胞在所述培养基中生长。
10.一种从细胞培养物制备蛋白质的方法，所述方法包括：
将哺乳动物细胞接种到权利要求1的培养基中，其中所述哺乳动物细胞表达所需蛋白质；
让所述哺乳动物细胞在所述培养基中生长并且表达所述蛋白质，由此在所述培养基中产生所述哺乳动物细胞和所述蛋白质的混合物；
从所述混合物中纯化所述蛋白质。
11.权利要求10的方法，其中所述蛋白质是重组因子VIII。
12.一种细胞培养组合物，所述组合物包含哺乳动物细胞和权利要求1的培养基。
13.一种制备权利要求1的细胞培养基的方法，所述方法包括：
获得大豆水解产物，
采用超滤法超滤所述大豆水解产物，
采用大小排阻层析纯化所述大豆水解产物，
选择由分子量≤500道尔顿的大豆水解产物组成的大豆水解产物级分。
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