JP6258536B1

JP6258536B1 - ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法

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Publication number: JP6258536B1
Application number: JP2017040747A
Authority: JP
Inventors: 正義塚原; 耕一山本; 石原　尚; 尚石原; 眞礼登細野; 泰志郎中川; 直史奥村; 智子磯田
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2018-01-10
Anticipated expiration: 2037-03-03
Also published as: KR102653666B1; CN110462055A; KR20190125314A; WO2018159842A1; TW201837050A; JP2018143157A

Abstract

【課題】本発明は、ダルベポエチン生産細胞を培養してダルベポエチン組成物を製造する方法において、ダルベポエチン組成物の総生産量が向上し、かつ、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させる、ダルベポエチン組成物の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液を得る工程１、および工程１により得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程２を含むダルべポエチン組成物の製造方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ダルベポエチン組成物の製造方法、およびダルべポエチンを生産する能力を有する動物細胞の培養方法等に関する。

近年、動物細胞を用いた遺伝子組換え蛋白質などの有用物質の生産が盛んに行われているが、最大の産生物収量を得るために、該動物細胞の該蛋白質などの発現能力自体を増加させるだけでなく、該動物細胞の増殖の向上されることが求められている。

一方、遺伝子組み換え技術が進歩しても、いまだに生産することが困難な遺伝子組換え蛋白質の一つに糖蛋白質がある。蛋白質の多くは、糖鎖の付加した糖蛋白質として存在しており、その糖鎖構造の違いが蛋白質そのものの機能に大きな影響を与えることが知られている。

遺伝子組み換え技術を応用したバイオ医薬品では、ヒトの蛋白質の遺伝子を動物細胞に導入することによって生産されている。しかし、動物細胞を用いて糖蛋白質を生産した場合、該生産細胞より生じるシアリダーゼ等の糖鎖分解酵素等によってその糖鎖構造が不均一となるため、十分な薬効を示さない場合もある。

造血因子であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は３本のＮ−結合型糖鎖と１本のＯ−結合型糖鎖を有しており、糖鎖末端のシアル酸数に応じて血中半減期が変化し、糖鎖末端のシアル酸数が減少すると血中半減期が減少しほとんど生理活性を示さないことが知られている（非特許文献１）。また、ＥＰＯの血中半減期を更に延長することを目的にＥＰＯのアミノ酸配列の一部を改変し、更にシアル酸付加数を増加させたダルベポエチンが見出されている（非特許文献２、特許文献１）。

ダルベポエチンは５本のＮ結合型糖鎖と１本のＯ−結合型糖鎖を有しており、持続的な赤血球増加作用を有し、従来のＥＰＯ製剤に比べて投与頻度を減らすことが可能となり、患者の負担を軽減することができる。

しかし、上述の理由により、ＥＰＯよりも多くのシアル酸含有糖鎖を有する均一なダルベポエチンを効率的に生産するためには、生産量の向上と共により高度な糖鎖制御技術が求められていた。

糖鎖制御方法としては、培養液中に分泌される糖鎖分解酵素による糖蛋白質からのシアル酸の脱離を阻害させる為に、例えばシアリダーゼの阻害剤である２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ２ｅｎ）等の低分子化合物を培地に添加して培養する方法が知られている。

一方、動物細胞の増殖及び該動物細胞による産生物質の生産量を向上させる為に、従来該動物細胞を培養する際に用いられる培地には、アルブミン、トランスフェリンまたはインスリンのような、血清または血清由来の物質や動物由来の蛋白質が添加されてきた。血清または血清由来の物質や動物由来の蛋白質の培地への添加は、細胞培養物およびそこから得られる産生物質が肝炎、ウイルスや牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などにより汚染される危険性があることから、血清または血清由来の物質および動物由来の蛋白質を含まない完全合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）の開発が行われてきた。

典型的な完全合成培地の構成成分としては、アミノ酸、有機塩または無機塩、ビタミン、ミネラル、微量金属、糖、脂質、および核酸等が挙げられるが、ダイズなどの植物由来の蛋白質加水分解物を完全合成培地に添加することによって、血清含有培地と同等に動物細胞の増殖及び該動物細胞から得られる産生物質の生産量を向上させることが出来ることが知られている（特許文献２、３）。

特許第２９３８５７２号明細書国際公開第２００１／０２３５２７号国際公開第２００６／０４５４３８号

ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪ．，１９９３；１０；２６３Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２００１；１６；３−１３

しかしながら、ダルベポエチン組成物の総生産量を向上しつつ、かつ、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させる方法は知られていなかった。

したがって、本発明は、ダルベポエチン生産細胞を培養して高いシアル酸付加数のダルベポエチン組成物を製造する方法において、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン組成物の総生産量を向上し、かつ、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させる、ダルベポエチン組成物の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、植物由来の蛋白質加水分解物を含有した培地を用いてダルベポエチン生産細胞を培養することによって、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン組成物の総生産量が向上し、かつ、培養液中に分泌されるシアリダーゼを阻害することによって該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸付加率が向上し、高いシアル酸付加数のダルベポエチン組成物を顕著に生産出来ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１９）を提供するものである。
（１）以下の工程１および工程２を含むダルベポエチン組成物の製造方法。
工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
（２）以下の工程１および工程２を含む、ダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離が阻害されたダルべポエチン組成物の製造方法。
工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
（３）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の製造方法。
（５）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）〜（４）のいずれか１に記載の製造方法。
（６）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の製造方法。
（７）工程１で得られた培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量が植物由来の蛋白質加水分解物非含有培地中で培養時と比較して高い、（１）〜（６）のいずれか１に記載の製造方法。
（８）ダルベポエチン生産細胞が、宿主細胞にダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、（１）〜（７）のいずれか１に記載の製造方法。
（９）宿主細胞が動物細胞である、（８）に記載の製造方法。
（１０）動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス黒色腫（ＮＳＯ）細胞若しくはマウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、（９）に記載の製造方法。
（１１）植物由来の蛋白質加水分解物を添加する培地が完全合成培地である、（１）〜（１０）のいずれか１に記載の製造方法。
（１２）培地中に添加する植物由来の蛋白質加水分解物の濃度が１〜５ｇ／ｌである、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の製造方法。
（１３）植物由来の蛋白質加水分解物がダイズ由来の蛋白質加水分解物ある、（１）〜（１２）のいずれか１に記載の製造方法。
（１４）さらにダルベポエチン組成物を精製する精製工程を含む（１）〜（１３）のいずれか１に記載の製造方法。
（１５）精製工程が陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲルろ過から選ばれる少なくとも１つである、（１４）に記載の製造方法。
（１６）得られるダルベポエチン組成物が、１分子あたり平均１８個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンである、（１）〜（１５）のいずれか１に記載の製造方法。
（１７）植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液中にダルベポエチン組成物を分泌させることを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
（１８）植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
（１９）植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得ることを含む、培養液保存中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害する方法。

本発明の製造方法においては、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養することにより、該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン組成物の総生産量が向上し、かつ該細胞より培養液中に分泌されるダルベポエチン１分子中のシアル酸含有率を向上させることができる。

図１は、ダルベポエチンの構造を示す図である。図２は、ダルベポエチンのＮ−結合型糖鎖およびＯ−結合型糖鎖の構造を示す図である。図２において、ＮｅｕＡｃはシアル酸の１つであるＮ−アセチルノイラミン酸を表す。図３は、ダイズ加水分解物添加培地で培養した培養上清およびダイズ加水分解物除去液でのダルベポエチンのシアル酸アイソフォーム分布の経時変化を示す図である。レーン１及びレーン１４はシアル酸付加数が１８〜２２個のダルベポチンを示す。レーン２はダイズ加水分解物除去液を８℃で０時間保管、レーン３はダイズ加水分解物除去液を８℃で２４時間保管、レーン４はダイズ加水分解物除去液を８℃で４８時間保管、レーン５はダイズ加水分解物除去液を８℃で７２時間保管した場合のシアル酸アイソフォーム分布をそれぞれ示す。レーン６はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で０時間保管、レーン７はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で２４時間保管、レーン８はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で４８時間保管、レーン９はダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃で７２時間保管した場合のシアル酸アイソフォーム分布をそれぞれ示す。レーン１０はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で０時間保管、レーン１１はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で２４時間保管、レーン１２はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で４８時間保管、レーン１３はダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤ＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して８℃で７２時間保管した場合のシアル酸アイソフォーム分布をそれぞれ示す。

本発明のダルベポエチン組成物の製造方法は、以下の工程１および工程２を含む。
工程１：植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得る工程
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
以下、各工程を説明する。

［工程１］
工程１は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にて、ダルベポエチンを生産する能力を有する細胞を培養して、培地中にダルベポエチン組成物を分泌させて、培養液を得る工程である。

本発明において、ダルベポエチンは国際公開第９５／０５４６５号において、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列中３０、３２、８７、８８及び９０位のアミノ酸残基がそれぞれＡｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ及びＴｈｒにそれぞれ置換された、［Ａｓｎ^３０Ｔｈｒ^３２Ｖａｌ^８７Ａｓｎ^８８Ｔｈｒ^９０］ＥＰＯとして示されるヒトエリスロポエチン類似体であり、図１に示す構造を有する。

ダルベポエチンの２４、３０、３８、８３及び８８位のＡｓｎ残基にはＮ−結合型糖鎖が、１２６位のＳｅｒ残基にはＯ−結合型糖鎖がそれぞれ結合しており、Ｎ−結合型糖鎖およびＯ−結合型糖鎖の主な構造としては図２に示す構造が挙げられる。

ダルベポエチン分子に結合するＮ−結合型糖鎖には最大４個のシアル酸が、Ｏ−結合型糖鎖の末端には最大２個のシアル酸が含まれており、ダルベポエチン１分子には最大２２個のシアル酸が含まれる。

本発明において、ダルベポエチンとしては、例えば、ダルベポエチンアルファ若しくはダルベポエチンアルファ（遺伝子組換え）またはこれらのバイオ後続品も含まれる。また、国際公開第２００３／０２０２９９号にて開示されているｎｏｖｅｌｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ及びＮＥＳＰ（商標）若しくはＡｒａｎｅｓｐ（商標）、またはこれらのバイオ後続品も本発明のダルベポエチンに含まれる。

本発明に用いられるダルベポエチン生産細胞の宿主細胞としては、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類および昆虫類などのいずれかに属する動物細胞など、いずれを用いてもよいが、哺乳類に属する動物細胞が好適に用いられ、より好ましくは、ヒトまたはサルなどの霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラットまたはハムスターなどの齧歯類に由来する動物細胞が用いられる。

哺乳類に属する細胞としては、例えば、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞または胚性網膜芽細胞などが挙げられる。特にミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞および卵巣細胞から選ばれる細胞が好ましく、具体的には例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス黒色腫（ＮＳＯ）細胞若しくはマウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞が挙げられる。

哺乳類に属する細胞としては、例えば、ヒト細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４０）、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ−１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ−２）、２９３（ＥＣＡＣＣ８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１４３２）、ＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）、ＮＭ−Ｆ９（ＤＳＭＡＣＣ２６０５、国際公開第０５／１７１３０号）およびＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣＮｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ−１６５１）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ―１６１６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ―１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ―１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣＣＲＬ−１８２７）、ラット細胞株であるＹ３Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣＣＲＬ１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣＮｏ：８５１１０５０１）およびＹＢ２／０（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６６２）、ハムスター細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ／ＤＧ４４［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］およびＢＨＫ２１（ＡＴＣＣＣＲＬ−１０）、イヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ−３４）などが挙げられる。

鳥類に属する細胞としては、例えばニワトリ細胞株ＳＬ−２９（ＡＴＣＣＣＲＬ−２９）など、魚類に属する細胞としては、例えばゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣＣＲＬ−２０５０）など、昆虫類に属する細胞としては、例えば、蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７１１）などがそれぞれ挙げられる。また、例えば、初代培養細胞として、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞または初代ウズラ胎児細胞などが挙げられる。

ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３Ａｇ１．２．３．、ＹＯまたはＹＢ２／０などが挙げられる。卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻またはＣＨＯ／ＤＧ４４などが挙げられる。

また、腎臓細胞としては、例えば、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ２１またはＭＤＣＫ等が、血球細胞としてはＨＬ−６０、Ｎａｍａｌｗａ、ＮａｍａｌｗａＫＪＭ−１またはＮＭ−Ｆ９などが、子宮細胞としては、例えば、ＨｅＬａなどが、結合組織細胞としては、例えば、ＨＴ−１０８０またはＮＩＨ３Ｔ３などが、乳腺細胞としては、例えば、Ｃ１２７１Ｉなどが、胚性網膜芽細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６などが、それぞれ挙げられる。

ダルベポエチン生産細胞としては、例えば、上述の宿主細胞にダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞、変異処理を施してダルベポエチンを産生するようになった細胞、またはダルベポエチンを産生する細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマなどが挙げられる。さらに、上述の細胞にダルベポエチンの発現量を上昇させるような変異処理を施した細胞なども本発明のダルベポエチン生産細胞に包含される。

ダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞は、ダルベポエチンの生産に関与するＤＮＡとプロモーターなどを含む組換え体ベクターなどを、上述の本発明に用いられる宿主細胞に導入することによって得られる。

ダルベポエチンの生産に関与するＤＮＡとしては、例えば、ダルベポエチンをコードするＤＮＡ、ダルベポエチンの生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡなどのいずれも用いることができる。

該組換え体ベクターを調製するために用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０などが挙げられる。

プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーなどをプロモーターとともに用いてもよい。

宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、例えば、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］などが挙げられる。

植物由来の蛋白質加水分解物としては、小麦、イネまたはダイズ等の植物由来の蛋白質加水分解物であれば、いかなる蛋白質加水分解物を用いることができるが、ダイズ由来の蛋白質加水分解物が特に好ましい。

植物由来の蛋白質加水分解物は、原料となる植物から得られる蛋白質を分解して得られるアミノ酸及びジペプチドあるいはトリペプチド等の短鎖ペプチドを主成分とする他、微量金属等を含む、混合物である。植物由来の蛋白質加水分解物の製造においては、塩酸等の酸を用いた酸分解法またはプロテアーゼ等の酵素を用いた酵素分解法が挙げられ、必要に応じて膜処理が行われる。

ダイズ由来の蛋白質加水分解物としては、例えば、Ａｍｙｓｏｙ、Ｈｙ−Ｓｏｙ、Ｎ−Ｚ−Ｓｏｙ、ＨｙＰｅｐ（以上、ＱｕｅｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、Ｓｏｙｐｅｐｔｏｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｂａｃ−Ｓｏｙｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ社）、ＳＥ５０ＭＫ（ＤＭＶＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎｓ社）、ＰｅｐｔｏｎｅＨｙ−ＳｏｙＴ、ＳｏｙＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅＵＦ（以上、シグマ―アルドリッチ社製）等、小麦またはイネ由来の蛋白質加水分解物としてはＨｙＰｅｐ（ＱｕｅｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）等が挙げられる。

植物由来の蛋白質加水分解物を培養液に添加する時期は、培養開始時でも培養途中でも特に制限はないが、培養開始時の培地に添加して用いることが好ましい。フェドバッチ培養法またはパーフュージョン培養法等におけるフィード培地として培養途中に添加する場合は、植物由来の蛋白質加水分解物は単独でフィード培地として培地へ添加してもよいし、他の培地成分と予め混合されたフィード培地として培地へ添加してもよい。

培養期間としては、特に制限はないが、最終の本培養の期間としては好ましくは８日以上である。フェドバッチ培養法において本培養の期間としては、好ましくは８日〜１ヵ月、より好ましくは１０日〜２１日、特に好ましくは１０日〜１４日である。

培地中へ添加される植物由来の蛋白質加水分解物の濃度は、培養に用いる細胞の種類、植物由来の蛋白質加水分解物の添加時期等により適宜選択すればよいが、好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１０ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜５ｇ／Ｌである。

本発明に用いられる培地としては、ダルベポエチン生産細胞の培養に用いることができればいかなるものでもよいが、血清あるいは血清由来の物質または動物由来の蛋白質も含まない完全合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）を用いることが好ましい。

ダルベポエチン生産細胞の宿主細胞が動物細胞である場合には、基礎培地として通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地が用いられる。通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］若しくはＥＸ−ＣＥＬＬ３２５ＰＦ培地（ＪＲＨ社製）またはこれらの改変培地や混合培地等が挙げられるが、好ましくはＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地およびＥＸ−ＣＥＬＬ３２５ＰＦ培地等が用いられる。

本発明に用いられる培地としては、基礎培地に必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、生理活性物質等を添加する。これらの添加物は、培養前にあらかじめ培地に含有させることが好ましい。

栄養因子としては、例えば、グルコース等の糖、アミノ酸、ビタミン等が挙げられる。

アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−バリン等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。

ビタミンとしては、例えば、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ−α−トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。

その他、動物由来物を含まない完全合成培地において、動物由来物の代わりに添加される物質としては、例えば、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質、加水分解物若しくは動物由来物を含まない脂質、ミネラル、微量金属または核酸等が挙げられる。遺伝子組換え法で製造された生理活性物質としては、例えば、遺伝子組換えインシュリン、遺伝子組換えトランスフェリン、遺伝子組換えアルブミンまたは遺伝子組換え増殖因子等が挙げられる。

動物由来物を含まない脂質としては、例えば、コレステロール、リノール酸、リノレイン酸などが挙げられる。

完全合成培地としては、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ；ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ−ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳＣＤ−ＣＨＯ培地、ＫＩＮＳＭ−１０培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）などが挙げられる。

長期間または高密度で培養する場合は、アミノ酸類およびビタミン類を高濃度に含有した培地、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地を１：１：１の比率で混合した培地、ＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地を１：１の比率で混合した培地、ハイブリドーマＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）などが好適に用いられる。

本発明において、工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量が向上する、とは、上述の植物由来の蛋白質加水分解物を含有する培地で培養した時の培養終了時点での単位培養液量中のダルベポエチン組成物の濃度が、上述の植物由来の加水分解物非含有培地で培養した時と比較して向上することを意味する。

単位培養液量中のダルベポエチン組成物の濃度は、ＥＬＩＳＡ法またはＨＰＬＣ法等の公知の蛋白質濃度測定方法であれば、いかなるものも用いて求めることが出来るが、例えばＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた蛋白質濃度測定方法が挙げられる。

工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物としては、シアル酸がダルベポエチン１分子あたり好ましくは１８〜２２個、より好ましくは１９〜２２個、特に好ましくは２０〜２２個、最も好ましくは２２個付加した構造を有するものが好ましい。

工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物としては、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。また、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。また、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。また、好ましくはダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である。

工程１で得られる培養液中のダルベポエチン組成物としては、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０〜１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。また、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０〜１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。また、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０〜１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。また、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０〜１４日目におけるダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物が挙げられる。

ダルベポエチン組成物におけるシアル酸数は、キャピラリー電気泳動装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）等を用いた等電点電気泳動法等により、ダルベポエチンのシアル酸アイソフォーム分布を測定することにより求めることができる。

［工程２］
工程２は、工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程である。工程１における培養により培養液中に分泌されたダルベポエチン組成物は、公知の方法に従って精製することができ、本発明の製造方法は、さらに、ダルベポエチン組成物を精製する精製工程を含んでもよい。

例えば、工程１で得られた培養液から遠心分離等の手法により培養上清を得て、該培養上清から、通常の遺伝子組換え蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、Ｑ−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、逆相クロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法、ＭＦ、ＵＦ／ＤＦ、ウイルス除去膜等の膜を用いたろ過法または濃縮あるいは溶媒交換法等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、ダルベポエチン組成物を得ることができる。

ダルベポエチン組成物としては、好ましくは１分子あたり平均１８個以上、より好ましくは１分子あたり平均１８．５個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンである。ダルベポエチン組成物としては、具体的には例えば、好ましくは培養開始後１０〜１４日目の培養液から得られる１分子あたり平均１８個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンが挙げられる。上記と同様に、ダルベポエチン組成物におけるシアル酸数は、キャピラリー電気泳動装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）等を用いた等電点電気泳動法等を用いてダルベポエチンのシアル酸アイソフォーム分布を測定し求めることができる。

本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養液中にダルベポエチン組成物を分泌させることを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法に関する。該培養方法におけるダルベポエチン生産細胞の培養については、上述した工程１と同様である。

また、本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養し、培養中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することを含む、ダルベポエチン生産細胞の培養方法に関する。該培養方法におけるダルベポエチン生産細胞の培養については、上述した工程１と同様である。

また、本発明は、植物由来の蛋白質加水分解物を添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を培養して培養液を得ることを含む、培養液保存中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害する方法に関する。本発明の方法によれば、培養液に含有される植物由来の蛋白質加水分解物の作用により、シアリダーゼによるダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害し、培養終了後から精製が開始されるまでの培養液の保存中におけるダルベポエチン分子へのシアル酸付加率を向上させることができる。培養液の保存条件は特に限定されないが、好ましくは８℃にて７２時間保存することができる。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

［実施例１］ダイズ加水分解物含有培地と不含有培地での生産されるダルベポエチン組成物のシアル酸付加率の比較
ダルベポエチンを生産するＣＨＯ細胞を用いて、１Ｌ三角フラスコでフェドバッチ培養を行い、ダイズ加水分解物含有培地と不含有培地とでダルベポエチンのシアル酸付加率を比較した。ダルベポエチン産生ＣＨＯ細胞をＥＸ−ＣＥＬＬ３２５ＰＦ培地（シグマ―アルドリッチ社製）を用いて、１２５ｍＬ容量三角フラスコから５００ｍＬ容量三角フラスコに拡大培養を行った後、更に１Ｌ容量三角フラスコ（コーニング社製）で拡大培養し、本培養に必要な種培養液を得た。

拡大培養は各フラスコ容量の約１０〜３０％の培地量で２×１０^５細胞／ｍＬとなるように細胞を播種し、３７°Ｃで３日間または４日間で行った。ＫＩＮＳＭ−１０培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を基本とする培地に、３ｇ／Ｌのダイズ加水分解物（ＳｏｙＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅＵＦシグマ―アルドリッチ社製）を添加（Ｓｏｙあり）または添加せず（Ｓｏｙなし）に調整した生産培地２００ｍＬを満たした１Ｌ三角フラスコに、種培養液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）し、上清を取り除いた細胞を２．０×１０^５細胞／ｍＬとなるようにそれぞれ播種した。播種直後の細胞密度はダイズ加水分解物含有培地で２．４×１０^５細胞／ｍＬ、ダイズ加水分解物不含有培地で１．８×１０^５細胞／ｍＬであった。

その後、３７°Ｃ、１００ｒｐｍ、５％ＣＯ_２を吹き込んで本培養を開始した。ダイズ加水分解物含有培地には培養開始後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３日目に、それぞれ培養液量の２％のフィード培地［ＦＭＤＦ−７培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に２ｇ／Ｌのダイズ加水分解物（ＳｏｙＨｙｄｒｏｌｙｓａｔｅＵＦシグマ―アルドリッチ社製）を添加した培地］を添加した。

一方、ダイズ加水分解物不含有培地には培養開始後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３日目に、それぞれ培養液量の２％のフィード培地［ＦＭＤＦ−７培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１．２ｇ／Ｌの塩化カリウム（和光純薬工業社製）を添加した培地］を添加した。

培養開始後７日目、１０日目及び１４日目に培養液を採取し、培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量をＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。更に、これらの採取サンプルを抗ダルベポエチンモノクローナル抗体カラムを有する分離装置［ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）］を用いて採取サンプル中のダルベポエチン組成物を約６００μｇずつ分離、取得した。

キャピラリー電気泳動装置（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、得られたダルベポエチン組成物のシアル酸アイソフォーム分布を測定した。シアル酸アイソフォーム分布測定はＣａｒｔｒｉｄｇｅ温度を２５°Ｃ、電圧値を６ｋＶに設定し、１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｃｉｎｅ、１０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム、７ｍｍｏｌ／ＬＵＲＥＡ、２．５ｍｍｏｌ／ＬＰｕｔｒｅｓｃｉｎｅ、ｐＨ４．７から成るバッファーを用いて実施した。シアル酸付加数１２〜２２個のダルベポエチン組成物の総面積値に対する各シアル酸付加数のダルベポエチン組成物の面積値の割合（％）を測定した結果を表１に示す。

表１に示すように、ダイズ加水分解物含有培地（Ｓｏｙあり）ではダイズ加水分解物不含有培地（Ｓｏｙなし）に比べてシアル酸付加数が１８個〜２２個のダルベポエチンの割合が増加した。培養１４日目では、その割合は、シアル酸付加数が１８個ダルベポエチンでは１２．３％、シアル酸付加数が１９個のダルベポエチンでは１１．２％、シアル酸付加数が２０個のダルベポエチンでは１２．４％、シアル酸付加数が２１個のダルベポエチンでは１３．６％、シアル酸付加数が２２個のダルベポエチンでは１８．６％であり、特にシアル酸付加数が２２個のダルベポエチンの割合が顕著に増加した。

その結果として、表１に示すように、ダイズ加水分解物含有培地では１分子当たりの平均シアル酸付加数は１８．７個であった。また、シアル酸付加数１２〜２２個のダルベポエチン組成物の総生産量は、ダイズ加水分解物含有培地ではダイズ加水分解物不含有培地に比べて約１．７〜２．２倍に増加した。

以上の結果から、シアル酸付加数の多いダルベポエチン組成物を製造するための培地組成物としてダイズ加水分解物が有効であることが確認された。

［実施例２］培地中のダイズ加水分解物によるダルベポエチン分子からのシアル酸脱離阻害
実施例１と同様な方法で調製したダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を８℃にて０〜７２時間保管して安定性試験を行った。また、実施例１と同様な方法で調製したダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清を濃縮膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４３００００ＭＷＣＯ）を用いて濃縮後にＭｉｌｌｉＱ水で置換してダイズ加水分解物除去液を調製し、同様に８℃にて０〜７２時間保管した。さらに、調製したダイズ加水分解物除去液に公知のシアリダーゼの阻害剤である２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ２ｅｎ）を０．５ｍＭ添加し、同様に８℃にて０〜７２時間保管した。

それぞれの保管後の試料を、等電点電気泳動法を用いて解析した結果、ダイズ加水分解物除去液では、経時的なシアル酸高付加数のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離が認められた（図３、レーン２〜５）。一方、ダイズ加水分解物含有培地で培養した培養上清（図３、レーン６〜９）およびダイズ加水分解物除去液にシアリダーゼの阻害剤であるＮｅｕＡｃ２ｅｎを添加して保管した場合には、シアル酸高付加数のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離は認められなかった（図３、レーン１０〜１３）。

以上の結果より、培地中のダイズ加水分解物がシアリダーゼによるシアル酸高付加数のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することが示唆された。

Claims

工程１：ダイズ由来の蛋白質加水分解物を１〜５ｇ／ｌ添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を少なくとも１０日間培養して培養液を得る工程、および
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程
を含み、
工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、ダルベポエチン組成物の製造方法。
工程１：ダイズ由来の蛋白質加水分解物を１〜５ｇ／ｌ添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を少なくとも１０日間培養して培養液を得る工程、および
工程２：工程１で得られた培養液からダルベポエチン組成物を回収する工程を含み、
工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、ダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離が阻害されたダルべポエチン組成物の製造方法。
工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の５５％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１９〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１または２に記載の製造方法。
工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の４４％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２０〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
工程１で得られた培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の１８％以上が、ダルベポエチン１分子あたり２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
工程１で得られた培養液中のダルベポエチン組成物の総生産量がダイズ由来の蛋白質加水分解物非含有培地中で培養時と比較して高い、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
ダルベポエチン生産細胞が、宿主細胞にダルベポエチンをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
宿主細胞が動物細胞である、請求項７に記載の製造方法。
動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス黒色腫（ＮＳＯ）細胞若しくはマウス骨髄腫（ＳＰ２／０）細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞である、請求項８に記載の製造方法。
ダイズ由来の蛋白質加水分解物を添加する培地が完全合成培地である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
さらにダルベポエチン組成物を精製する精製工程を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
精製工程が陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲルろ過から選ばれる少なくとも１つである、請求項１１に記載の製造方法。
得られるダルベポエチン組成物が、１分子あたり平均１８個以上のシアル酸を含有するダルベポエチンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
ダイズ由来の蛋白質加水分解物を１〜５ｇ／ｌ添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を少なくとも１０日間培養し、培養液中にダルベポエチン組成物を分泌させることを含み、該培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
ダイズ由来の蛋白質加水分解物を１〜５ｇ／ｌ添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を少なくとも１０日間培養し、培養中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害することを含み、該培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、ダルベポエチン生産細胞の培養方法。
ダイズ由来の蛋白質加水分解物を１〜５ｇ／ｌ添加した培地中にてダルベポエチン生産細胞を少なくとも１０日間培養して培養液を得ることを含み、該培養液中のダルベポエチン１分子あたり１２〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物の６７％以上が、ダルベポエチン１分子あたり１８〜２２個のシアル酸を含有するダルベポエチン組成物である、培養液保存中のダルベポエチン分子からのシアル酸の脱離を阻害する方法。