KR20190125314A

KR20190125314A - 다르베포에틴 조성물의 제조 방법 및 다르베포에틴 산생 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20190125314A
Application number: KR1020197025072A
Authority: KR
Inventors: 마사요시 츠카하라; 고이치 야마모토; 다카시 이시하라; 마레토 호소노; 다이시로 나카가와; 나오후미 오쿠무라; 도모코 이소다
Original assignee: 쿄와 기린 가부시키가이샤
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2019-11-06
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: JP6258536B1; CN110462055A; TWI874295B; WO2018159842A1; KR102653666B1; TW201837050A; JP2018143157A

Abstract

본 발명은, 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 다르베포에틴 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 다르베포에틴 조성물의 총 생산량이 향상되고, 또한 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 1분자 중의 시알산 함유율을 향상시키는, 다르베포에틴 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양액을 얻는 공정 1, 및 공정 1에 의해 얻어진 배양액으로부터 다르베포에틴 조성물을 회수하는 공정 2를 포함하는 다르베포에틴 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

다르베포에틴 조성물의 제조 방법 및 다르베포에틴 산생 세포의 배양 방법

본 발명은, 다르베포에틴 조성물의 제조 방법, 및 다르베포에틴을 생산하는 능력을 갖는 동물 세포의 배양 방법 등에 관한 것이다.

최근 몇년간, 동물 세포를 사용한 유전자 재조합 단백질 등의 유용 물질의 생산이 활발히 행해지고 있지만, 최대 산생물 수량을 얻기 위해, 해당 동물 세포의 해당 단백질 등의 발현 능력 자체를 증가시킬 뿐만 아니라, 해당 동물 세포의 증식을 향상시키는 것이 요구되고 있다.

한편, 유전자 재조합 기술이 진보해도, 아직까지 생산하는 것이 곤란한 유전자 재조합 단백질의 하나로 당단백질이 있다. 단백질의 대부분은, 당쇄가 부가된 당단백질로서 존재하고 있으며, 그의 당쇄 구조의 차이가 단백질 그 자체의 기능에 큰 영향을 주는 것이 알려져 있다.

유전자 재조합 기술을 응용한 바이오 의약품에서는, 인간의 단백질의 유전자를 동물 세포에 도입함으로써 생산되고 있다. 그러나, 동물 세포를 사용하여 당단백질을 생산한 경우, 해당 생산 세포로부터 발생하는 시알리다아제 등의 당쇄 분해 효소 등에 의해 그의 당쇄 구조가 불균일해지기 때문에, 충분한 약효를 나타내지 않는 경우도 있다.

조혈 인자인 에리트로포에틴(EPO)은 3개의 N-결합형 당쇄와 1개의 O-결합형 당쇄를 갖고 있으며, 당쇄 말단의 시알산수에 따라 혈중 반감기가 변화되고, 당쇄 말단의 시알산수가 감소하면 혈중 반감기가 감소하여 거의 생리 활성을 나타내지 않는다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 또한, EPO의 혈중 반감기를 더 연장하는 것을 목적으로 EPO의 아미노산 서열의 일부를 개변하고, 추가로 시알산 부가수를 증가시킨 다르베포에틴이 발견되었다(비특허문헌 2, 특허문헌 1).

다르베포에틴은 5개의 N-결합형 당쇄와 1개의 O-결합형 당쇄를 갖고 있으며, 지속적인 적혈구 증가 작용을 갖고, 종래의 EPO 제제에 비해 투여 빈도를 저감시키는 것이 가능하게 되어, 환자의 부담을 경감할 수 있다.

그러나, 상술한 이유에 의해, EPO보다도 많은 시알산 함유 당쇄를 갖는 균일한 다르베포에틴을 효율적으로 생산하기 위해서는, 생산량의 향상과 함께 보다 고도의 당쇄 제어 기술이 요구되고 있었다.

당쇄 제어 방법으로서는, 배양액 중에 분비되는 당쇄 분해 효소에 의한 당단백질로부터의 시알산의 탈리를 저해시키기 위해, 예를 들어 시알리다아제의 저해제인 2-데옥시-2,3-데히드로-N-아세틸뉴라민산(NeuAc2en) 등의 저분자 화합물을 배지에 첨가하여 배양하는 방법이 알려져 있다.

한편, 동물 세포의 증식 및 해당 동물 세포에 의한 산생 물질의 생산량을 향상시키기 위해, 종래 해당 동물 세포를 배양할 때에 사용되는 배지에는, 알부민, 트랜스페린 또는 인슐린과 같은, 혈청 또는 혈청 유래의 물질이나 동물 유래의 단백질이 첨가되어 왔다. 혈청 또는 혈청 유래의 물질이나 동물 유래의 단백질의 배지로의 첨가는, 세포 배양물 및 그로부터 얻어지는 산생 물질이 간염, 바이러스 또는 소해면상뇌증(BSE) 등에 의해 오염될 위험성이 있다는 점에서, 혈청 또는 혈청 유래의 물질 및 동물 유래의 단백질을 포함하지 않는 완전 합성 배지(chemically defined medium)의 개발이 행해져 왔다.

전형적인 완전 합성 배지의 구성 성분으로서는, 아미노산, 유기염 또는 무기염, 비타민, 미네랄, 미량 금속, 당, 지질 및 핵산 등을 들 수 있지만, 대두 등의 식물 유래의 단백질 가수분해물을 완전 합성 배지에 첨가함으로써, 혈청 함유 배지와 동등하게 동물 세포의 증식 및 해당 동물 세포로부터 얻어지는 산생 물질의 생산량을 향상시킬 수 있다는 것이 알려져 있다(특허문헌 2, 3).

일본 특허 제2938572호 명세서 국제 공개 제2001/023527호 국제 공개 제2006/045438호

Glycoconjugate J., 1993;10;263 Nephrol. Dial. Transplant., 2001;16;3-13

그러나, 다르베포에틴 조성물의 총 생산량을 향상시키면서, 또한 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 1분자 중의 시알산 함유율을 향상시키는 방법은 알려져 있지 않았다.

따라서, 본 발명은, 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 높은 시알산 부가수의 다르베포에틴 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 조성물의 총 생산량을 향상시키고, 또한 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 1분자 중의 시알산 함유율을 향상시키는, 다르베포에틴 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 함유한 배지를 사용하여 다르베포에틴 생산 세포를 배양함으로써, 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 조성물의 총 생산량이 향상되고, 또한 배양액 중에 분비되는 시알리다아제를 저해함으로써 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 1분자 중의 시알산 부가율이 향상되고, 높은 시알산 부가수의 다르베포에틴 조성물을 현저하게 생산할 수 있다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은, 이하의 (1) 내지 (19)를 제공하는 것이다.

(1) 이하의 공정 1 및 공정 2를 포함하는 다르베포에틴 조성물의 제조 방법.

공정 1: 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 배양액을 얻는 공정

공정 2: 공정 1에서 얻어진 배양액으로부터 다르베포에틴 조성물을 회수하는 공정

(2) 이하의 공정 1 및 공정 2를 포함하는, 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리가 저해된 다르베포에틴 조성물의 제조 방법.

(3) 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 67％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 18 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, (1) 또는 (2)에 기재된 제조 방법.

(4) 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 55％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 19 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(5) 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 44％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 20 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(6) 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 18％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(7) 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 조성물의 총 생산량이 식물 유래의 단백질 가수분해물 비함유 배지 중에서 배양시와 비교하여 높은, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(8) 다르베포에틴 생산 세포가, 숙주 세포에 다르베포에틴을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입된 형질 전환 세포인, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(9) 숙주 세포가 동물 세포인, (8)에 기재된 제조 방법.

(10) 동물 세포가, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 흑색종(NS0) 세포 혹은 마우스 골수종(SP2/0) 세포, 또는 이들 세포에서 유래하는 세포인, (9)에 기재된 제조 방법.

(11) 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가하는 배지가 완전 합성 배지인, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(12) 배지 중에 첨가하는 식물 유래의 단백질 가수분해물의 농도가 1 내지 5g/l인, (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(13) 식물 유래의 단백질 가수분해물이 대두 유래의 단백질 가수분해물인, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(14) 다르베포에틴 조성물을 정제하는 정제 공정을 더 포함하는, (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(15) 정제 공정이 음이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과로부터 선택되는 적어도 하나인, (14)에 기재된 제조 방법.

(16) 얻어지는 다르베포에틴 조성물이, 1분자당 평균 18개 이상의 시알산을 함유하는 다르베포에틴인, (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.

(17) 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양액 중에 다르베포에틴 조성물을 분비시키는 것을 포함하는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양 방법.

(18) 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양 중인 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 것을 포함하는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양 방법.

(19) 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 배양액을 얻는 것을 포함하는, 배양액 보존 중인 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 방법.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양함으로써, 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 조성물의 총 생산량이 향상되고, 또한 해당 세포로부터 배양액 중에 분비되는 다르베포에틴 1분자 중의 시알산 함유율을 향상시킬 수 있다.

도 1은, 다르베포에틴의 구조를 도시하는 도면이다.
도 2는, 다르베포에틴의 N-결합형 당쇄 및 O-결합형 당쇄의 구조를 도시하는 도면이다. 도 2에 있어서, NeuAc는 시알산의 하나인 N-아세틸뉴라민산을 나타낸다.
도 3은, 대두 가수분해물 첨가 배지에서 배양한 배양 상청 및 대두 가수분해물 제거액에서의 다르베포에틴의 시알산 아이소폼 분포의 경시 변화를 도시하는 도면이다. 레인 1 및 레인 14는 시알산 부가수가 18 내지 22개인 다르베포에틴을 나타낸다. 레인 2는 대두 가수분해물 제거액을 8℃에서 0시간 보관, 레인 3은 대두 가수분해물 제거액을 8℃에서 24시간 보관, 레인 4는 대두 가수분해물 제거액을 8℃에서 48시간 보관, 레인 5는 대두 가수분해물 제거액을 8℃에서 72시간 보관한 경우의 시알산 아이소폼 분포를 각각 나타낸다. 레인 6은 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청을 8℃에서 0시간 보관, 레인 7은 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청을 8℃에서 24시간 보관, 레인 8은 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청을 8℃에서 48시간 보관, 레인 9는 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청을 8℃에서 72시간 보관한 경우의 시알산 아이소폼 분포를 각각 나타낸다. 레인 10은 대두 가수분해물 제거액에 시알리다아제의 저해제 NeuAc2en을 첨가하여 8℃에서 0시간 보관, 레인 11은 대두 가수분해물 제거액에 시알리다아제의 저해제 NeuAc2en을 첨가하여 8℃에서 24시간 보관, 레인 12는 대두 가수분해물 제거액에 시알리다아제의 저해제 NeuAc2en을 첨가하여 8℃에서 48시간 보관, 레인 13은 대두 가수분해물 제거액에 시알리다아제의 저해제 NeuAc2en을 첨가하여 8℃에서 72시간 보관한 경우의 시알산 아이소폼 분포를 각각 나타낸다.
도 4는, 시알산 부가수 12 내지 22개의 다르베포에틴 조성물의 총 면적값에 대한 각 시알산 부가수의 다르베포에틴 조성물의 면적값의 비율(％)을 측정한 표 1의 결과를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 종축은 각 시알산 부가수의 다르베포에틴 조성물의 면적값의 비율(％)을 나타낸다. 표 1의 시알산 부가수 22개의 면적값의 비율은, 도 4에 있어서의 시알산 부가수가 22개인 다르베포에틴 조성물을 나타내는 22, 22-1S 및 22-2S의 아이소폼의 면적값의 비율(％)의 합계로 표시된다.

본 발명의 다르베포에틴 조성물의 제조 방법은, 이하의 공정 1 및 공정 2를 포함한다.

이하, 각 공정을 설명한다.

[공정 1]

공정 1은, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서, 다르베포에틴을 생산하는 능력을 갖는 세포를 배양하여, 배지 중에 다르베포에틴 조성물을 분비시켜, 배양액을 얻는 공정이다.

본 발명에 있어서, 다르베포에틴은 국제 공개 제95/05465호에 있어서, 인간 에리트로포에틴의 아미노산 서열 중 30, 32, 87, 88 및 90위치의 아미노산 잔기가 각각 Asn, Thr, Val, Asn 및 Thr로 치환된, [Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰]EPO로서 표시되는 인간 에리트로포에틴 유사체이며, 도 1에 도시하는 구조를 갖는다.

다르베포에틴의 24, 30, 38, 83 및 88위치의 Asn 잔기에는 N-결합형 당쇄가, 126위치의 Ser 잔기에는 O-결합형 당쇄가 각각 결합하고 있으며, N-결합형 당쇄 및 O-결합형 당쇄의 주된 구조로서는 도 2에 도시하는 구조를 들 수 있다.

다르베포에틴 분자에 결합하는 N-결합형 당쇄에는 최대 4개의 시알산이, O-결합형 당쇄의 말단에는 최대 2개의 시알산이 포함되어 있으며, 다르베포에틴 1분자에는 최대 22개의 시알산이 포함된다.

본 발명에 있어서, 다르베포에틴으로서는, 예를 들어 다르베포에틴 알파 혹은 다르베포에틴 알파(유전자 재조합) 또는 이들의 바이오 후속품도 포함된다. 또한, 국제 공개 제2003/020299호에 개시되어 있는 신규한 적혈구생성 자극 단백질(novel erythropoiesis stimulating protein) 및 NESP(상표) 혹은 Aranesp(상표), 또는 이들의 바이오 후속품도 본 발명의 다르베포에틴에 포함된다.

본 발명에 사용되는 다르베포에틴 생산 세포의 숙주 세포로서는, 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 곤충류 등 중 어느 것에 속하는 동물 세포 등, 어느 것을 사용해도 되지만, 포유류에 속하는 동물 세포가 적합하게 사용되며, 보다 바람직하게는, 인간 또는 원숭이 등의 영장류에서 유래하는 동물 세포 또는 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 설치류에서 유래하는 동물 세포가 사용된다.

포유류에 속하는 세포로서는, 예를 들어 미엘로마 세포 또는 미엘로마 세포에서 유래하는 세포, 난소 세포, 신장 세포, 혈구 세포, 자궁 세포 결합 조직 세포, 유선 세포 또는 배성 망막 아세포 등을 들 수 있다. 특히 미엘로마 세포 또는 미엘로마 세포에서 유래하는 세포 및 난소 세포로부터 선택되는 세포가 바람직하고, 구체적으로는 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 흑색종(NS0) 세포 혹은 마우스 골수종(SP2/0) 세포, 또는 이들 세포에서 유래하는 세포를 들 수 있다.

포유류에 속하는 세포로서는, 예를 들어 인간 세포주인 HL-60(ATCC CCL-240), HT-1080(ATCC CCL-121), HeLa(ATCC CCL-2), 293(ECACC 85120602), 나말바(Namalwa)(ATCC CRL-1432), 나말바 KJM-1(Cytotechnology, 1, 151(1988)), NM-F9(DSM ACC2605, 국제 공개 제05/17130호) 혹은 PER.C6(ECACC No.96022940, 미국 특허 제6855544호 명세서), 원숭이 세포주인 VERO(ATCC CCL-1651) 혹은 COS-7(ATCC CRL-1651), 마우스 세포주인 C127I(ATCC CRL-1616), Sp2/0-Ag14(ATCC CRL-1581), NIH3T3(ATCCCRL-1658), NS0(ATCC CRL-1827), 래트 세포주인 Y3 Ag1.2.3.(ATCC CRL 1631), YO(ECACCNo:85110501) 및 YB2/0(ATCC CRL-1662), 햄스터 세포주인 CHO-K1(ATCC CCL-61), CHO/dhfr-(ATCC CRL-9096), CHO/DG44[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)] 혹은 BHK21(ATCC CRL-10) 또는 개 세포인 MDCK(ATCC CCL-34) 등을 들 수 있다.

조류에 속하는 세포로서는, 예를 들어 닭 세포주 SL-29(ATCC CRL-29) 등, 어류에 속하는 세포로서는, 예를 들어 제브라피시 세포주 ZF4(ATCC CRL-2050) 등, 곤충류에 속하는 세포로서는, 예를 들어 나방(Spodoptera frugiperda) 세포주 Sf9(ATCC CRL-1711) 등을 각각 들 수 있다. 또한, 예를 들어 초대 배양 세포로서, 초대 원숭이 신장 세포, 초대 토끼 신장 세포, 초대 닭 태아 세포 또는 초대 메추리 태아 세포 등을 들 수 있다.

미엘로마 세포 또는 미엘로마 세포에서 유래하는 세포로서는, 예를 들어 Sp2/0-Ag14, NS0, Y3 Ag1.2.3., YO 또는 YB2/0 등을 들 수 있다. 난소 세포 또는 난소 세포에서 유래하는 세포로서는, 예를 들어 CHO-K1, CHO/dhfr- 또는 CHO/DG44 등을 들 수 있다.

또한, 신장 세포로서는, 예를 들어 293, VERO, COS-7, BHK21 또는 MDCK 등을, 혈구 세포로서는 HL-60, 나말바, 나말바 KJM-1 또는 NM-F9 등을, 자궁 세포로서는, 예를 들어 HeLa 등을, 결합 조직 세포로서는, 예를 들어 HT-1080 또는 NIH3T3 등을, 유선 세포로서는, 예를 들어 C1271I 등을, 배성 망막 아세포로서는, 예를 들어 PER.C6 등을 각각 들 수 있다.

다르베포에틴 생산 세포로서는, 예를 들어 상술한 숙주 세포에 다르베포에틴을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입된 형질 전환 세포, 변이 처리를 실시하여 다르베포에틴을 산생하도록 된 세포, 또는 다르베포에틴을 산생하는 세포와 미엘로마 세포의 융합 세포인 하이브리도마 등을 들 수 있다. 또한, 상술한 세포에 다르베포에틴의 발현량을 상승시키는 변이 처리를 실시한 세포 등도 본 발명의 다르베포에틴 생산 세포에 포함된다.

다르베포에틴을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입된 형질 전환 세포는, 다르베포에틴의 생산에 관여하는 DNA와 프로모터 등을 포함하는 재조합체 벡터 등을, 상술한 본 발명에 사용되는 숙주 세포에 도입함으로써 얻어진다.

다르베포에틴의 생산에 관여하는 DNA로서는, 예를 들어 다르베포에틴을 코딩하는 DNA, 다르베포에틴의 생합성에 관계된 효소 또는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 모두 사용할 수 있다.

해당 재조합체 벡터를 제조하기 위해 사용되는 벡터로서는, 예를 들어 pcDNAI, pcDM8(후나코시사제), pAGE107[일본 특허 공개 평3-22979호 공보, Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075호 공보), pcDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNAI/Amp(인비트로젠사제), pREP4(인비트로젠사제), pAGE103[J. Biochem., 101, 1307(1987)] 또는 pAGE210 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 본 발명에서 사용하는 동물 세포 중에서 기능하는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 또는 SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서 등을 프로모터와 함께 사용해도 된다.

숙주 세포로의 재조합체 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들어 당해 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법(일본 특허 공개 평2-227075호 공보) 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987) 또는 Virology, 52, 456(1973)] 등을 들 수 있다.

식물 유래의 단백질 가수분해물로서는, 소맥, 벼 또는 대두 등의 식물 유래의 단백질 가수분해물이면, 어떠한 단백질 가수분해물을 사용할 수 있지만, 대두 유래의 단백질 가수분해물이 특히 바람직하다.

식물 유래의 단백질 가수분해물은, 원료가 되는 식물로부터 얻어지는 단백질을 분해하여 얻어지는 아미노산 및 디펩티드 혹은 트리펩티드 등의 단쇄 펩티드를 주성분으로 하는 것 이외에, 미량 금속 등을 포함하는 혼합물이다. 식물 유래의 단백질 가수분해물의 제조에 있어서는, 염산 등의 산을 사용한 산 분해법 또는 프로테아제 등의 효소를 사용한 효소 분해법을 들 수 있으며, 필요에 따라 막 처리가 행해진다.

식물 유래의 단백질 가수분해물의 평균 분자량은 800Da 이하인 것이 바람직하고, 이하 단계적으로, 보다 바람직하게는 600Da 이하, 더욱 바람직하게는 450Da 이하, 특히 바람직하게는 300Da 이하이다.

식물 유래의 단백질 가수분해물의 분자량 분포로서는, <500Da가 바람직하게는 45 내지 80％, 500 내지 1000Da가 바람직하게는 15 내지 30％, 1000 내지 2000Da가 바람직하게는 5 내지 15％, 2000 내지 5000Da가 바람직하게는 2 내지 10％이다. 또는, <2000Da가 보다 바람직하게는 90 내지 98％, <2000Da가 더욱 바람직하게는 95 내지 98％이다.

대두 유래의 단백질 가수분해물로서는, 예를 들어 Amysoy, Hy-Soy, N-Z-Soy, HyPep(이상, Quest International사), Soy peptone(Gibco사), Bac-Soyton(Difco사), SE50MK(DMV International Nutritions사), Peptone Hy-Soy T 또는 Soy Hydrolysate UF(이상, 시그마 알드리치사제) 등, 소맥 또는 벼 유래의 단백질 가수분해물로서는 HyPep(Quest International사) 등을 들 수 있다.

식물 유래의 단백질 가수분해물을 배양액에 첨가하는 시기는, 배양 개시시여도 배양 도중이어도 특별히 제한은 없지만, 배양 개시시의 배지에 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다. 유가식 배양법 또는 관류식 배양법 등에 있어서의 피드 배지로서 배양 도중에 첨가하는 경우에는, 식물 유래의 단백질 가수분해물은 단독으로 피드 배지로서 배지로 첨가해도 되고, 다른 배지 성분과 미리 혼합된 피드 배지로서 배지로 첨가해도 된다.

배양 기간으로서는 특별히 제한은 없지만, 최종 본배양의 기간으로서는 바람직하게는 8일 이상이다. 유가식 배양법에 있어서 본배양의 기간으로서는, 바람직하게는 8일 내지 1개월, 보다 바람직하게는 10일 내지 21일, 특히 바람직하게는 10일 내지 14일이다.

배지 중으로 첨가되는 식물 유래의 단백질 가수분해물의 농도는, 배양에 사용하는 세포의 종류, 식물 유래의 단백질 가수분해물의 첨가 시기 등에 따라 적절히 선택하면 되지만, 바람직하게는 0.1 내지 100g/L, 더욱 바람직하게는 1 내지 10g/L, 특히 바람직하게는 1 내지 5g/L이다.

본 발명에 사용되는 배지로서는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양에 사용할 수 있으면 어떠한 것이어도 되지만, 혈청 혹은 혈청 유래의 물질 또는 동물 유래의 단백질도 포함하지 않는 완전 합성 배지(chemically defined medium)를 사용하는 것이 바람직하다.

다르베포에틴 생산 세포의 숙주 세포가 동물 세포인 경우에는, 기초 배지로서 통상의 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지가 사용된다. 통상의 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지로서는, 예를 들어 RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[Science, 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM(DMEM) 배지[Virology, 8, 396(1959)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)], F12 배지(LTI사제)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288(1965)], 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM 배지)[J. Experimental Medicine, 147, 923(1978)] 혹은 EX-CELL325PF 배지(JRH사제) 또는 이들의 개변 배지나 혼합 배지 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 RPMI1640 배지, DMEM 배지, F12 배지, IMDM 배지 또는 EX-CELL 325PF 배지 등이 사용된다.

본 발명에 사용되는 배지로서는, 기초 배지에 필요에 따라 동물 세포의 생육에 필요한 영양 인자 또는 생리 활성 물질 등을 첨가한다. 이들 첨가물은, 배양 전에 미리 배지에 함유시키는 것이 바람직하다.

영양 인자로서는, 예를 들어 글루코오스 등의 당, 아미노산 또는 비타민 등을 들 수 있다.

아미노산으로서는, 예를 들어 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 또는 L-발린 등을 들 수 있으며, 1종 또는 2종 이상 조합하여 사용된다.

비타민으로서는, 예를 들어 d-비오틴, D-판토텐산, 콜린, 엽산, myo-이노시톨, 나이아신아미드, 피리독살, 리보플라빈, 티아민, 시아노코발라민 또는 DL-α-토코페롤 등을 들 수 있으며, 1종 또는 2종 이상 조합하여 사용된다.

그 밖에, 동물 유래물을 포함하지 않는 완전 합성 배지에 있어서, 동물 유래물 대신에 첨가되는 물질로서는, 예를 들어 유전자 재조합법으로 제조된 생리 활성 물질, 가수분해물 혹은 동물 유래물을 포함하지 않는 지질, 미네랄, 미량 금속 또는 핵산 등을 들 수 있다. 유전자 재조합법으로 제조된 생리 활성 물질로서는, 예를 들어 유전자 재조합 인슐린, 유전자 재조합 트랜스페린, 유전자 재조합 알부민 또는 유전자 재조합 증식 인자 등을 들 수 있다.

동물 유래물을 포함하지 않는 지질로서는, 예를 들어 콜레스테롤, 리놀레산 또는 리놀렌산 등을 들 수 있다.

완전 합성 배지로서는, 예를 들어 ADPF 배지(Animal derived protein free medium; HyClone사제), CD-하이브리도마 배지(인비트로젠사제), CD-CHO 배지(인비트로젠사제), IS CD-CHO 배지 또는 KINSM-10 배지(Irvine Scientific사제) 등을 들 수 있다.

장기간 또는 고밀도로 배양하는 경우에는, 아미노산류 및 비타민류를 고농도로 함유한 배지, 예를 들어 RPMI1640 배지, DMEM 배지 및 F12 배지를 1:1:1의 비율로 혼합한 배지, DMEM 배지 및 F12 배지를 1:1의 비율로 혼합한 배지, 하이브리도마 SFM 배지(인비트로젠사제) 등이 적합하게 사용된다.

본 발명에 있어서, 공정 1에서 얻어지는 배양액 중의 다르베포에틴 조성물의 총 생산량이 향상된다는 것은, 상술한 식물 유래의 단백질 가수분해물을 함유하는 배지에서 배양했을 때의 배양 종료 시점에서의 단위 배양액량 중의 다르베포에틴 조성물의 농도가, 상술한 식물 유래의 가수분해물 비함유 배지에서 배양했을 때와 비교하여 향상되는 것을 의미한다.

단위 배양액량 중의 다르베포에틴 조성물의 농도는, ELISA법 또는 HPLC법 등의 공지된 단백질 농도 측정 방법이면, 어떠한 것도 사용하여 구할 수 있지만, 예를 들어 Biacore(GE Healthcare사제)를 사용한 단백질 농도 측정 방법을 들 수 있다.

공정 1에서 얻어지는 배양액 중의 다르베포에틴 조성물로서는, 시알산이 다르베포에틴 1분자당 바람직하게는 18 내지 22개, 보다 바람직하게는 19 내지 22개, 특히 바람직하게는 20 내지 22개, 가장 바람직하게는 22개 부가된 구조를 갖는다.

공정 1에서 얻어지는 배양액 중의 다르베포에틴 조성물로서는, 바람직하게는 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 67％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 18 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물이다. 또한, 바람직하게는 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 55％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 19 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물이다. 또한, 바람직하게는 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 44％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 20 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물이다. 또한, 바람직하게는 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 18％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물이다.

공정 1에서 얻어지는 배양액 중의 다르베포에틴 조성물로서는, 구체적으로는 예를 들어, 바람직하게는 배양 개시 후 10 내지 14일째에 있어서의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 67％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 18 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물을 들 수 있다. 또한, 구체적으로는 예를 들어, 바람직하게는 배양 개시 후 10 내지 14일째에 있어서의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 55％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 19 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물을 들 수 있다. 또한, 구체적으로는 예를 들어, 바람직하게는 배양 개시 후 10 내지 14일째에 있어서의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 44％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 20 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물을 들 수 있다. 또한, 구체적으로는 예를 들어, 바람직하게는 배양 개시 후 10 내지 14일째에 있어서의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 18％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물을 들 수 있다.

다르베포에틴 조성물에 있어서의 시알산수는, 캐필러리 전기 영동 장치(Beckman Coulter사제) 등을 사용한 등전점 전기 영동법 등에 의해, 다르베포에틴의 시알산 아이소폼 분포를 측정함으로써 구할 수 있다.

[공정 2]

공정 2는, 공정 1에서 얻어진 배양액으로부터 다르베포에틴 조성물을 회수하는 공정이다. 공정 1에 있어서의 배양에 의해 배양액 중에 분비된 다르베포에틴 조성물은, 공지된 방법에 따라 정제할 수 있으며, 본 발명의 제조 방법은, 다르베포에틴 조성물을 정제하는 정제 공정을 더 포함해도 된다.

예를 들어, 공정 1에서 얻어진 배양액으로부터 원심 분리 등의 방법에 의해 배양 상청을 얻고, 해당 배양 상청으로부터 통상의 유전자 재조합 단백질의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, Q-세파로오스, 혹은 DIAION HPA-75(미츠비시 케미컬사제) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로오스 FF(파마시아사제) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 혹은 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 역상 크로마토그래피법, 크로마트 포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법, MF, UF/DF, 바이러스 제거막 등의 막을 사용한 여과법 또는 농축 혹은 용매 교환법 등을 단독 혹은 조합하여 사용함으로써, 다르베포에틴 조성물을 얻을 수 있다.

다르베포에틴 조성물로서는, 바람직하게는 1분자당 평균 18개 이상, 보다 바람직하게는 1분자당 평균 18.5개 이상의 시알산을 함유하는 다르베포에틴이다. 다르베포에틴 조성물로서는, 구체적으로는 예를 들어, 바람직하게는 배양 개시 후 10 내지 14일째의 배양액으로부터 얻어지는 1분자당 평균 18개 이상, 보다 바람직하게는 1분자당 평균 18.5개 이상의 시알산을 함유하는 다르베포에틴을 들 수 있다. 상기와 마찬가지로, 다르베포에틴 조성물에 있어서의 시알산수는, 캐필러리 전기 영동 장치(Beckman Coulter사제) 등을 사용한 등전점 전기 영동법 등을 사용하여 다르베포에틴의 시알산 아이소폼 분포를 측정하여 구할 수 있다.

본 발명은, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양액 중에 다르베포에틴 조성물을 분비시키는 것을 포함하는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 해당 배양 방법에 있어서의 다르베포에틴 생산 세포의 배양에 대해서는, 상술한 공정 1과 마찬가지이다.

또한, 본 발명은, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양 중인 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 것을 포함하는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 해당 배양 방법에 있어서의 다르베포에틴 생산 세포의 배양에 대해서는, 상술한 공정 1과 마찬가지이다.

또한, 본 발명은, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 배양액을 얻는 것을 포함하는, 배양액 보존 중인 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 배양액에 함유되는 식물 유래의 단백질 가수분해물의 작용에 의해, 시알리다아제에 의한 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하고, 배양 종료 후부터 정제가 개시될 때까지의 배양액의 보존 중에 있어서의 다르베포에틴 분자로의 시알산 부가율을 향상시킬 수 있다. 배양액의 보존 조건은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 8℃에서 72시간 보존할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 본 발명의 단순한 예시에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

[실시예 1] 대두 가수분해물 함유 배지와 불함유 배지에서의 생산되는 다르베포에틴 조성물의 시알산 부가율의 비교

다르베포에틴을 생산하는 CHO 세포를 사용하여, 1L 삼각 플라스크에서 유가식 배양을 행하고, 대두 가수분해물 함유 배지와 불함유 배지에서 다르베포에틴의 시알산 부가율을 비교하였다. 다르베포에틴 산생 CHO 세포를 EX-CELL325PF 배지(시그마 알드리치사제)를 사용하여, 125mL 용량 삼각 플라스크로부터 500mL 용량 삼각 플라스크로 확대 배양을 행한 후, 1L 용량 삼각 플라스크(코닝사제)로 더 확대 배양하여, 본 배양에 필요한 종배양액을 얻었다.

확대 배양은 각 플라스크 용량의 약 10 내지 30％의 배지량으로 2×10⁵ 세포/mL가 되도록 세포를 파종하고, 37℃에서 3일간 또는 4일간에 행하였다. KINSM-10 배지(Irvine Scientific사제)를 기본으로 하는 배지에, 3g/L의 대두 가수분해물(Soy Hydrolysate UF 시그마 알드리치사제; 분자량 분포는, <500Da가 66％, 500 내지 1000Da가 22％, 1000 내지 2000Da가 9％, 2000 내지 5000Da가 3％)을 첨가(Soy 있음) 또는 첨가하지 않음(Soy 없음)으로 조정한 생산 배지 200mL를 채운 1L 삼각 플라스크에, 종배양액을 원심 분리(1000rpm, 25℃, 5분간)하고, 상청을 제거한 세포를 2.0×10⁵ 세포/mL가 되도록 각각 파종하였다. 파종 직후의 세포 밀도는 대두 가수분해물 함유 배지에서 2.4×10⁵ 세포/mL, 대두 가수분해물 불함유 배지에서 1.8×10⁵ 세포/mL였다.

그 후, 37℃, 100rpm, 5％ CO₂를 불어 넣어 본배양을 개시하였다. 대두 가수분해물 함유 배지에는 배양 개시 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13일째에, 각각 배양액량의 2％의 피드 배지[FMDF-7 배지(Irvine Scientific사제)에 2g/L의 대두 가수분해물(Soy Hydrolysate UF 시그마 알드리치사제)을 첨가한 배지]를 첨가하였다.

한편, 대두 가수분해물 불함유 배지에는 배양 개시 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13일째에, 각각 배양액량의 2％의 피드 배지[FMDF-7 배지(Irvine Scientific사제)에 1.2g/L의 염화칼륨(와코 쥰야쿠 고교사제)을 첨가한 배지]를 첨가하였다.

배양 개시 후 7일째, 10일째 및 14일째에 배양액을 채취하고, 배양액 중의 다르베포에틴 조성물의 총 생산량을 Biacore(GE Healthcare사제)를 사용하여 측정하였다. 또한, 이들 채취 샘플을 항다르베포에틴 모노클로날 항체 칼럼을 갖는 분리 장치[AKTA explorer(GE Healthcare사제)]를 사용하여 채취 샘플 중의 다르베포에틴 조성물을 약 600μg씩 분리, 취득하였다.

캐필러리 전기 영동 장치(Beckman Coulter사제)를 사용하여, 얻어진 다르베포에틴 조성물의 시알산 아이소폼 분포를 측정하였다. 시알산 아이소폼 분포 측정은 카트리지 온도를 25℃, 전압값을 6kV로 설정하고, 10mmol/L 트리신(Tricine), 10mmol/L NaCl, 10mmol/L 아세트산나트륨, 7mmol/L 우레아(UREA), 2.5mmol/L 푸트레신(Putrescine), pH 4.7을 포함하는 버퍼를 사용하여 실시하였다. 시알산 부가수 12 내지 22개의 다르베포에틴 조성물의 총 면적값에 대한 각 시알산 부가수의 다르베포에틴 조성물의 면적값의 비율(％)을 측정한 결과를 표 1 및 도 4에 나타낸다.

표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 대두 가수분해물 함유 배지(Soy 있음)에서는 대두 가수분해물 불함유 배지(Soy 없음)에 비해 시알산 부가수가 18개 내지 22개인 다르베포에틴의 비율이 증가하였다. 배양 14일째에서는, 그의 비율은 시알산 부가수가 18개인 다르베포에틴에서는 12.3％, 시알산 부가수가 19개인 다르베포에틴에서는 11.2％, 시알산 부가수가 20개인 다르베포에틴에서는 12.4％, 시알산 부가수가 21개인 다르베포에틴에서는 13.6％, 시알산 부가수가 22개인 다르베포에틴에서는 18.6％이며, 특히 시알산 부가수가 22개인 다르베포에틴의 비율이 현저하게 증가하였다.

그 결과로서, 표 1에 나타낸 바와 같이, 대두 가수분해물 함유 배지에서는 1분자당의 평균 시알산 부가수는 18.7개였다. 또한, 시알산 부가수 12 내지 22개의 다르베포에틴 조성물의 총 생산량은, 대두 가수분해물 함유 배지에서는 대두 가수분해물 불함유 배지에 비해 약 1.7 내지 2.2배로 증가하였다.

이상의 결과로부터, 시알산 부가수가 많은 다르베포에틴 조성물을 제조하기 위한 배지 조성물로서 대두 가수분해물이 유효하다는 것이 확인되었다.

[실시예 2] 배지 중의 대두 가수분해물에 의한 다르베포에틴 분자로부터의 시알산 탈리 저해

실시예 1과 마찬가지의 방법으로 제조한 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청을 8℃에서 0 내지 72시간 보관하여 안정성 시험을 행하였다. 또한, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 제조한 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청을 농축막(Millipore사제, Amicon Ultra-4 30000MWCO)을 사용하여 농축 후에 MilliQ수로 치환하여 대두 가수분해물 제거액을 제조하고, 마찬가지로 8℃에서 0 내지 72시간 보관하였다. 또한, 제조한 대두 가수분해물 제거액에 공지된 시알리다아제의 저해제인 2-데옥시-2,3-데히드로-N-아세틸뉴라민산(NeuAc2en)을 0.5mM 첨가하고, 마찬가지로 8℃에서 0 내지 72시간 보관하였다.

각각의 보관 후의 시료를, 등전점 전기 영동법을 사용하여 해석한 결과, 대두 가수분해물 제거액에서는, 경시적인 시알산 고부가수의 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리가 인정되었다(도 3, 레인 2 내지 5). 한편, 대두 가수분해물 함유 배지에서 배양한 배양 상청(도 3, 레인 6 내지 9) 및 대두 가수분해물 제거액에 시알리다아제의 저해제인 NeuAc2en을 첨가하여 보관한 경우에는, 시알산 고부가수의 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리는 인정되지 않았다(도 3, 레인 10 내지 13).

이상의 결과로부터, 배지 중의 대두 가수분해물이 시알리다아제에 의한 시알산 고부가수의 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 것이 시사되었다.

본 발명을 특정한 양태를 사용하여 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은, 2017년 3월 3일자로 출원된 일본 특허 출원(특원2017-040747)에 기초하고 있으며, 그의 전체가 인용에 의해 원용된다.

Claims

이하의 공정 1 및 공정 2를 포함하는 다르베포에틴 조성물의 제조 방법.
공정 1: 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 배양액을 얻는 공정
공정 2: 공정 1에서 얻어진 배양액으로부터 다르베포에틴 조성물을 회수하는 공정
이하의 공정 1 및 공정 2를 포함하는, 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리가 저해된 다르베포에틴 조성물의 제조 방법.
공정 1: 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 배양액을 얻는 공정
공정 2: 공정 1에서 얻어진 배양액으로부터 다르베포에틴 조성물을 회수하는 공정
제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 67％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 18 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 55％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 19 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 44％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 20 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 1분자당 12 내지 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물의 18％ 이상이, 다르베포에틴 1분자당 22개의 시알산을 함유하는 다르베포에틴 조성물인, 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 1에서 얻어진 배양액 중의 다르베포에틴 조성물의 총 생산량이 식물 유래의 단백질 가수분해물 비함유 배지 중에서 배양시와 비교하여 높은, 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다르베포에틴 생산 세포가, 숙주 세포에 다르베포에틴을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터가 도입된 형질 전환 세포인, 제조 방법.
제8항에 있어서, 숙주 세포가 동물 세포인, 제조 방법.
제9항에 있어서, 동물 세포가, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 흑색종(NS0) 세포 혹은 마우스 골수종(SP2/0) 세포, 또는 이들 세포에서 유래하는 세포인, 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가하는 배지가 완전 합성 배지인, 제조 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중에 첨가하는 식물 유래의 단백질 가수분해물의 농도가 1 내지 5g/l인, 제조 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 유래의 단백질 가수분해물이 대두 유래의 단백질 가수분해물인, 제조 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 다르베포에틴 조성물을 정제하는 정제 공정을 더 포함하는, 제조 방법.
제14항에 있어서, 정제 공정이 음이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과로부터 선택되는 적어도 하나인, 제조 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어지는 다르베포에틴 조성물이, 1분자당 평균 18개 이상의 시알산을 함유하는 다르베포에틴인, 제조 방법.
식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양액 중에 다르베포에틴 조성물을 분비시키는 것을 포함하는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양 방법.
식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하고, 배양 중인 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 것을 포함하는, 다르베포에틴 생산 세포의 배양 방법.
식물 유래의 단백질 가수분해물을 첨가한 배지 중에서 다르베포에틴 생산 세포를 배양하여 배양액을 얻는 것을 포함하는, 배양액 보존 중인 다르베포에틴 분자로부터의 시알산의 탈리를 저해하는 방법.