CN104244969A

CN104244969A - 含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法

Info

Publication number: CN104244969A
Application number: CN201380018355.7A
Authority: CN
Inventors: 亚伯拉罕·赫斯赫克
Original assignee: Oramed Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Oramed Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2014-12-24
Also published as: US20240358647A1; HUE066433T2; US20190321303A1; HK1200727A1; ES2912138T3; CN113769074A; CN112755002A; WO2013114369A1; EP2814504A1; EP4082530B1; JP2020117518A; JP7064226B2; US20210369626A1; DK2814504T3; JP2018104443A; JP6567827B2; DK4082530T5; EP4082530A1; US20140377344A1; DK4082530T3

Abstract

本发明提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生前者的方法，和包含前者的组合物。

Description

含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法

本申请要求2012年2月1日提交的美国临时申请61/632,868和2012年3月6日提交的美国临时申请61/634,753的权益，所述文献通过引用方式完整并入本文。

技术领域

本申请提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生所述组合物的方法，和包含所述组合物的组合物。

背景技术

基于蛋白质/肽的药物一般易在胃肠道中降解和/或不被从小肠以生物活性形式有效吸收到血流中。正在开发用于基于蛋白质的药物(如胰岛素)的口服递送制剂(Ziv等人,1994；Nissan等人,2000，Kidron等人,2004，Eldor等人,2010A，Eldor等人,2010B)。一种此类口服胰岛素产品安排了II期试验的测试并且目前正在就IND状态评审。

源自大豆(Glycine max)的胰蛋白酶抑制物可容易获得并且认为它们对人类消费是安全的。所述胰蛋白酶抑制物包括由抑制胰蛋白酶的KTI(Kunitz胰蛋白酶抑制物)和抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的BBI(Bowman-Birk抑制物)组成的SBTI(大豆胰蛋白酶抑制蛋物)。这类胰蛋白酶抑制物可获自，例如美国Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.。用于制备BBI的方法描述在，例如US7,404,973中。

发明概述

发明人已经发现在药物组合物中使用时，市售SBTI制备物产生高度可变的结果。据推测，KTI和BBI的活性应当是各自优化的，以改善药物组合物的活性。为此目的，从商业来源获得SBTI作为KTI和BBI的独立制备物。但是，发现这些制备物均遭受另一种活性污染。使问题复杂化的是，发现制备物，特别是在大规模制备物中，BBI活性存在明显变异性，这一点通过防止肠道酶降解蛋白质(例如胰岛素)的可变能力得到印证。

因此，根据本申请描述的某些实施方案，开发了纯化SBTI的改进方法，其中将每种产物按其自身规格制备达到高水平活性，并且使高分子量(MW)杂质的水平最小化。根据其他实施方案，该方法避免使用PEG和第二色谱步骤并且以较高产率为特征。根据其他实施方案，该产物特别合适用于药物组合物(例如口服施用治疗性蛋白的组合物)中。此外，根据其他实施方案，KTI活动和BBI活性的完全分离允许更精确调节包含治疗性蛋白和BBI和/或KTI的药物组合物的抗胰蛋白酶活性和抗胰凝乳蛋白酶活性，从而获得药物组合物的更稳健和/或可重复更高的体内活性。

进一步发现需要乳化剂以便利地制备含有肽/蛋白质的药物的大规模制备物。然而，需要根据经验检验添加特定乳化剂是否可以在不影响制剂的口服功效情况下有效的防止在基于油的制备物中的沉淀。所描述的其他实施方案因此涉及特定乳化剂或乳化剂组合与改进的SBTI一起存在于含有治疗性肽和治疗性蛋白质的基于油的药物组合物中。

术语“蛋白质”和“肽”在本文中互换使用。除非明确地指出限制，否则这两种术语的任一个均不旨在对存在的氨基酸的数目加以限制。

附图说明

以下图是说明性例子并且不意在视为限制要求保护的发明。

图1.SBTI纯化的流程图。A.SBTI中间生产。B.产生BBI和KTI的下游纯化。

图2.DEAE琼脂糖凝胶^TM(Sepharose^TM)柱分离的色谱图。在DEAE柱洗脱期间收集0.3L级分。

图3.纯化的BBI和KTI的SDS-PAGE分析。进行电泳，扫描凝胶，并且使用ImageScanner^TMIII和ImageQuant^TMTL(二者均来自General Electric)定量条带。将每毫升1毫克(mg/ml)的样品加载于20％Phastgel^TM上。泳道1：对照(老旧SBTI制备物)。泳道2：纯化的KTI，条带量＝100％。泳道3：纯化的BBI，下部条带量＝89.2％，上部条带量＝10.8％。

图4.使用改进的流程的小规模柱层析运行报道。方框、圆圈和三角形分别表示电导率曲线、pH和OD₂₈₀。垂直轴：电导率曲线(毫西门子)、pH和OD₂₈₀(任意单位)。水平轴：柱体积和级分编号。

图5.来自图4中所示层析的级分的20％SDS-PAGE。A.从左至右显示级分4-18和汇集的级分5-11。“C”指现有技术的胰蛋白酶抑制物(Sigma-Aldrich目录号T9003)。B.从右至左显示级分6-15，包括洗液+通流物(flowthrough)(W+FT)和标准物(来自大豆(Glycine max)的胰蛋白酶抑制物；“ST”)。

图6.仅额外纯化BBI的步骤的SDS-PAGE分析。ST＝标准物(见图5图注)，2mg/ml。泳道：1：来自柱的BBI汇集物。2：30KDa过滤的渗透物。3：1:40稀释的30KDa过滤的截留物质。4：1:4稀释的5KDa浓缩的截留物质。

图7.仅纯化BBI的1mg/ml终产物的SDS-PAGE分析。ST＝标准物(见图5图注)，1mg/ml。

图8.下游纯化BBI和KTI的改进方案的流程图。

图9.使用替代工序的柱层析运行报告。

图10.相对于标准物(通道3)，使用替代工序(泳道1-2)纯化的BBI的两份重复样品与标准物(泳道3)的SDS-PAGE分析。

图11.各种乳化剂制剂的检验结果。泡沫形成评分为1-5，其中1表示无泡沫，5表示因泡沫而见不到液体。对于混悬试验，数字1-5分别表示完全相分离；具有一些较大油泡的部分相分离；小油泡，乳状稠度；起初无泡，稍后相分离；和稳定乳液。

图12.施用含有多种乳化剂的口服胰岛素制剂后的血糖曲线。A.制剂A(左上)、B(左下)、C(右上)和D(右下)。B.制剂E(左)和F(右)。

图13.患者记录薄。A.血糖记录。B.调查问卷。

图14.低血糖评审薄。对记录的低血糖的每次出现给予分数，同时根据经受的神经低血糖症状或缺少神经低血糖症状给予额外的评分。症状的定义的例子如下：视觉，眼不能凝视、视力受损、复视；行为，不能睡眠、易怒、压力大、神经、“喜卧懒动(want to sit down and do nothing)”；其他神经学，头晕、眩晕、虚弱、疲劳、犯困、行走或说话困难、反应迟缓、运动技巧迟缓、丧失平衡；意识模糊，不能进行简单算术、感觉“寂寞”。即便也存在一些神经低血糖症状，但如果存在充分警示即将发生低血糖的自主症状，则不给予分数。对需要外部帮助以确认或处理这个事件，给予额外分数。

图15.用各种剂量口服胰岛素治疗的受试者中的葡萄糖反应。

实施方案的具体描述

在一个方面，提供从大豆产品分离的BBI，根据在多种实施方案中通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、亮蓝染色或成像仪定量法的测量，其中所述BBI是至少85％纯的。在某些实施方案中，大豆产品是大豆粉。

在又一个方面，提供从大豆粉分离的BBI，其中通过BCA(双喹啉-4-羧酸)测定法测量，BBI的蛋白质含量大于95％。

在又一个方面，提供从大豆粉分离的BBI，其中BBI含有小于0.1％的高分子量杂质，例如，通过SDS-PAGE和成像仪定量法所测定。

在其他实施方案中，分离的BBI中存在的抗胰蛋白酶活性对抗胰凝乳蛋白酶活性的比率在1.5:1和1:1之间，包括1.5:1和1:1。在更具体的实施方案中，该比率可以在1.4:1-1.1:1之间，包括1.4:1和1.1:1。在更具体的实施方案中，该比率可以在1.35:1-1.2:1之间，包括1.35:1和1.2:1。在更具体的实施方案中，该比率可以是1.28:1。

除非另外指明，否则将本文中提及的抗胰凝乳蛋白酶活性利用具有40BTEE单位/mg胰凝乳蛋白酶活性的胰凝乳蛋白酶测量，并且以每mg的测试蛋白抑制的胰凝乳蛋白酶的mg数(mg抑制的胰凝乳蛋白酶/mg测试蛋白)表示。BTEE指N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(见Sigma-Aldrich第B6125号产品说明)。

除非另外指明，否则将本文中提及的抗胰蛋白酶活性利用具有10,000BAEE单位/mg胰蛋白酶活性的胰蛋白酶测量，并且以每mg的测试蛋白抑制的胰蛋白酶的mg数(mg抑制的胰蛋白酶/mg测试蛋白)表示。BAEE指Na-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯溶液(见Sigma-Aldrich第B4500号产品说明)。例如，在常见的测定法中，一单位对应于将胰蛋白酶活性减少一个苯甲酰基-L-精氨酸乙酯单位(BAEE-U)的抑制物的量。一个BAEE-U是在pH7.6和25℃将253nm处吸光度增加0.001/分钟的酶量。参见，例如，K.Ozawa,M.Laskowski,1966,J.Biol.Chem.241:3955；和Y.Birk,1976,Meth.Enzymol.45:700。

本领域技术人员理解，在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前，通常对关于其蛋白质含量、杂质水平或效力的上述每种纯度要求进行评定。

在再一个方面，提供从大豆粉分离的KTI3，其中所述KTI3是至少85％纯的，如在多种实施方案中通过SDS-PAGE、亮蓝染色或成像仪定量法所测量。

在又一个方面，提供从大豆粉分离的KTI3，其中KTI3的蛋白质含量大于95％，如通过BCA测定法所测量。

在又一个方面，提从大豆粉分离的KTI3，其中KTI3含有小于0.1％的高分子量杂质，例如，如通过SDS-PAGE和成像仪定量法所评定。

本领域技术人员理解，在KTI3与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前，通常对关于其蛋白质含量、杂质水平或效力的上述每种纯度要求进行评定。

在某些实施方案中，含有KTI3的药物组合物还包含在其与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前满足至少一种以上纯度要求的BBI。

在某些实施方案中，配制上述的药物组合物用于口服施用。在更具体的实施方案中，该药物组合物还包含抵抗胃中降解的包衣。在甚至更具体的实施方案中，该包衣是pH敏感胶囊或可选地，是软明胶胶囊。

在其他实施方案中，上述的药物组合物还包含达100千道尔顿的治疗性蛋白作为活性成分活性成分。在其他实施方案中，活性成分活性成分是对人消化道中降解或失活敏感的非蛋白质分子。

在另一个实施方案中，提供一种包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿(kDa)的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的BBI。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100kDa的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的BBI和油组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100kDa的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的BBI、油和乳化剂组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100kDa的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的BBI、油和两种乳化剂组成。

在另一个方面，提供一种包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿(kDa)的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和源自大豆的BBI，其中所述液态制剂含有小于0.05％的分子量大于30,000的源自大豆的物质。

在另一个方面，提供一种包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中基于油的液态制剂包含达100kDa的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂，并且所述液态制剂具有至少抑制50mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，该液态制剂具有至少抑制35、40、45、55或60mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。在另外的实施方案中，该液态制剂具有抑制35-70、40-70、45-70、50-70或40-60mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，该液态制剂还包含至少抑制25mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性。在其他实施方案中，该液态制剂还包含至少抑制30、35、40、45或50mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性。或者，该液态制剂还包含抑制25-50、30-50、35-50、25-40或25-45mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性。

在另一个方面，提供一种用于制备药物组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供分离的BBI、达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂的制备物；和(b)将所述分离的BBI、治疗性蛋白和螯合剂混合至基于油的液态制剂中。可以将分离的BBI的鉴定(identity)、纯度和效力的本文所述每个实施方案并入该方法。此外，可以将其他成分的和可以存在的额外成分的本文所述每个实施方案并入该方法。在其他实施方案中，提供通过这种方法制备的药物组合物。

在另一个方面，提供用于制备药物组合物的方法，包括将分离的BBI、达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂混合至基于油的液态制剂中的步骤。可以将分离的BBI的鉴定、纯度和效力的本文所述每个实施方案并入该方法。此外，可以将其他成分的和可以存在的额外成分的本文所述每个实施方案并入这种方法。在其他实施方案中，提供通过这种方法制备的药物组合物。

如本文所用的“液体”指在20℃的粘度为1-1000(包含1和1000)毫帕斯卡秒的组合物。例如，鱼油在环境条件下是液体。该术语包括基于油的溶液、悬液及其组合。

如本文所用的“分离的”BBI指相对于其他组分而言富含BBI的制备物。在更具体的实施方案中，BBI指Bowman-Birk抑制物；Uniprot编号P01055[2013年1月28日获得的数据库])。

BBI的代表性前体序列是：

MVVLKVCLVL LFLVGGTTSA NLRLSKLGLL MKSDHQHSND

DESSKPCCDQ CACTKSNPPQ CRCSDMRLNS CHSACKSCIC

ALSYPAQCFC VDITDFCYEP CKPSEDDKEN(SEQ ID NO:1)。

这110个残基当中，残基1-19是信号肽，20-39是前肽并且成熟链BBI链由残基40-110(71个AA)组成。

在多个实施方案中，在所述的方法和组合物中利用的BBI的制备物是至少85％、90％、92％、94％或95％纯的，如通过SDS-PAGE、亮蓝染色或成像仪定量法(例如根据本文所述的方案)所评定。在药物组合物的情况下，该值涉及在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前BBI的特征。在可选实施方案中，可以利用SDS-PAGE和银染法，任选地随后利用成像仪定量法。

在其他实施方案中，分离的BBI具有至少0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3或1.4mg抑制的胰凝乳蛋白酶/mg抑制物的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中、抗胰凝乳蛋白酶活性处于0.8-1.8、0.9-1.8、1.0-1.8、1.1-1.8、1.2-1.8、1.3-1.8或1.4-1.8mg抑制的胰凝乳蛋白酶/mg抑制物的范围内。在更具体的实施方案中，该活性是0.8-1.8mg抑制的胰凝乳蛋白酶/mg抑制物。在其他实施方案中，该活性处于0.8-1.5mg抑制的胰凝乳蛋白酶/mg抑制物的范围内。在药物组合物的情况下，该值涉及在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前BBI的特征。

在多种实施方案中，BBI制备物含有5％或更少的KTI，如通过SDS-PAGE、亮蓝染色或成像仪定量法(根据本文所述的方案)所评定。在可选实施方案中，可以利用SDS-PAGE和银染法。

在其他实施方案中，分离的BBI具有至少抑制0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3或1.4mg胰凝乳蛋白酶/mg抑制物的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，抗胰凝乳蛋白酶活性为抑制0.8-1.8、0.9-1.8、1.0-1.8、1.1-1.8、1.2-1.8、1.3-1.8或1.4-1.8mg胰凝乳蛋白酶/mg抑制物。在更具体的实施方案中，该活性是抑制0.8-1.8mg胰凝乳蛋白酶/mg抑制物。在其他实施方案中，该活性为抑制0.8-1.5mg胰凝乳蛋白酶/mg抑制物。在药物组合物的情况下，该值涉及在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前BBI的特征。

在更具体的实施方案中，如本文所用的KTI指KTI3(Uniprot编号P01070；2013年1月3日获得数据库)。KTI3的代表性前体序列是：

MKSTIFFLFL FCAFTTSYLP SAIADFVLDN EGNPLENGGT YYILSDITAF

GGIRAAPTGN ERCPLTVVQS RNELDKGIGT IISSPYRIRF IAEGHPLSLK

FDSFAVIMLC VGIPTEWSVV EDLPEGPAVK IGENKDAMDG

WFRLERVSDD EFNNYKLVFC PQQAEDDKCG DIGISIDHDD

GTRRLVVSKN KPLVVQFQKL DKESLAKKNH GLSRSE(SEQ ID NO:2)。

以上序列当中，残基1-24是信号肽，206-216是前肽，成熟KTI链由残基25-205(181个AA)组成。

在其他实施方案中，BBI制备物的蛋白质含量大于95％，通过BCA测定法测量(例如使用Micro BCA蛋白质分析试剂盒[目录号#23225，ThermoScientific Rockford，IL])。在药物组合物的情况下，该值涉及它与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前的特征。在其他实施方案中，BBI制备物含有小于0.1％的高分子量杂质(换而言之，分子量大于30,000的物质)。在其他实施方案中，BBI已经在不使用聚乙二醇(PEG)的情况下分离。

在其他实施方案中，在所描述的方法和组合物中的分离的BBI是重组BBI，例如已经工程化以表达BBI的微生物(如细菌)产生并随后分离的BBI。在另外的实施方案中，BBI是合成性BBI。合成性BBI的例子是已经在无细胞装置如肽合成仪中产生的BBI。肽合成仪，例如自动肽合成仪，是本领域熟知的并且是商业可获得的。本文还提供包含合成BBI的药物组合物。本文还提供包含合成性BBI的药物组合物。

在某些实施方案中，描述的BBI是所描述的方法和组合物中的唯一蛋白酶抑制物。尽管较低效力的SBTI需要额外的蛋白酶抑制物，例如抑蛋白酶肽(aprotinin)，以有效地在人消化道中保护某些治疗性蛋白，但是认为描述的分离的BBI能够减少在这个方面对额外蛋白酶抑制物的需求。

额外的蛋白酶抑制物

在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的基于油的液态制剂还包含不同于分离的BBI的胰蛋白酶抑制物。在其他实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的基于油的液态制剂还包含不同于分离的KTI3的胰蛋白酶抑制物。根据本申请公开的内容，本领域技术人员理解，可以利用多种胰蛋白酶抑制物。在胰蛋白酶抑制物是蛋白质的情况下，大小一般将达100kDa。

如本文所用，术语“胰蛋白酶抑制物”指能够抑制胰蛋白酶对底物的作用的任何物质。可以使用本领域熟知的测定法测量某物质抑制胰蛋白酶的能力。

本领域已知的一些胰蛋白酶抑制物对胰蛋白酶特异，而其他则抑制胰蛋白酶和其他蛋白酶如胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶抑制物可以源自动物来源或植物来源：例如大豆、玉米、利马豆和其他豆类、南瓜(squash)、向日葵、牛和其他动物的胰和肺、鸡和火鸡的卵清、基于大豆的婴儿配方食品和哺乳动物血液。胰蛋白酶抑制物也可以是微生物来源的：例如，抗痛素(antipain)；见，例如，H.Umezawa,1976,Meth.Enzymol.45,678。胰蛋白酶抑制物也可以是精氨酸模拟物或赖氨酸模拟物或其他合成性化合物：例如芳基胍、苯甲脒、3,4-二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸酯、甲磺酸加贝酯或苯基甲磺酰氟。如本文所用，精氨酸模拟物或赖氨酸模拟物是能够与胰蛋白酶的P¹袋结合和/或干扰胰蛋白酶活性部位功能的化合物。

在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的额外胰蛋白酶抑制物选自：利马豆胰蛋白酶抑制物、抑蛋白酶肽(又称作胰腺胰蛋白酶抑制物或碱性胰腺胰蛋白酶抑制物[BPTI]；Uniprot编号P00974[2013年1月2日访问数据库])、Kazal抑制物(胰分泌性胰蛋白酶抑制物)、Kazal抑制物(胰分泌性胰蛋白酶抑制物)、卵类粘蛋白、α1抗胰蛋白酶、皮质醇结合球蛋白、中心素([SERPINA9/GCET1(生发中心B细胞表达的转录物1)]、PI-6(Sun等人1995)、PI-8(Sprecher等人1995)、Bomapin、进化枝A丝氨酸蛋白酶抑制蛋白[例如Serpina3(NCBI基因ID：12)、Serpina6(NCBI基因ID：866)、Serpina12(NCBI基因ID：145264)、Serpina10(NCBI基因ID：51156)、Serpina7(NCBI基因ID：6906)、Serpina9(NCBI基因ID：327657)、Serpina11(NCBI基因ID：256394)、Serpina13(NCBI基因ID：388007)、Serpina2(NCBI基因ID：390502)和Serpina4(NCBI基因ID：5104)]、Yukopin(Serpinb12；基因ID：89777)、抗痛素、苯甲脒、3,4-二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸酯和甲磺酸加贝酯。在其他实施方案中，选择以上抑制物之一。

抑蛋白酶肽的代表性前体序列是：

MKMSRLCLSV ALLVLLGTLA ASTPGCDTSN QAKAQRPDFC

LEPPYTGPCK ARIIRYFYNA KAGLCQTFVY GGCRAKRNNF

KSAEDCMRTC GGAIGPWENL(SEQ ID NO:3)。

这100个残基当中，残基1-21是信号肽，22-35和94-100是前肽并且成熟链BBI链由残基36-93(58个AA)组成。

在其他实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的基于油的液态制剂包含分离的BBI和分离的KTI两者，在更具体的实施方案中包含分离的BBI和分离的KTI3两者。如本文所用的“分离的KTI”指相对于其他组分富含KTI的制备物。在多种实施方案中，在所述的方法和组合物中利用的KTI制备物是至少85％纯的，如通过SDS-PAGE、亮蓝染色或成像仪定量法(例如根据本文所述的方案)所评定。在其他实施方案中，KTI制备物的蛋白质含量大于95％，如通过BCA测定法所测量。在药物组合物的情况下，这些值涉及在KTI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前KTI的特征。在其他实施方案中，KTI制备物含有5％或更少的BBI，如通过SDS-PAGE所评定。在其他实施方案中，KTI制备物含有小于0.1％高分子量杂质(换而言之，分子量大于30,000的物质)。在其他实施方案中，KTI已经在不使用PEG的情况下分离。

在仍更具体的实施方案中，所描述的方法和组合物包含所描述的BBI和KTI，在更具体的实施方案中包含BBI和KTI3，作为仅有的蛋白酶抑制物。在其他实施方案中，所描述的方法和组合物包含KTI和抑蛋白酶肽，在更具体的实施方案中包含KTI3和抑蛋白酶肽，作为仅有的蛋白酶抑制物。在其他实施方案中，分离的BBI、分离的KTI和抑蛋白酶肽均存在于该基于油的液态制剂中。

在其他实施方案中，分离的KTI3具有至少抑制0.8、0.9、1.0、1.1、1.2或1.3mg胰蛋白酶/mg抑制物的活性。在其他实施方案中，KTI3的活性为抑制0.8-1.8、0.9-1.8、1.0-1.8、1.1-1.8、1.2-1.8或1.3-1.8mg胰蛋白酶/mg抑制物。在更具体的实施例中，KTI3的活性是抑制0.8-1.7mg胰蛋白酶/mg抑制物。在其他实施方案中，该活性是抑制0.8-1.4mg胰蛋白酶/mg抑制物。

在其他优选实施方案中，分离的KTI是重组KTI，例如由已经工程化以表达KTI的微生物(如细菌)产生的KTI。在其他仍优选的实施方案中，KTI是合成性KTI。合成性KTI的例子是已经在无细胞装置如肽合成仪中产生的KTI。

其他实施方案涉及所述药物组合物中存在的抗胰凝乳蛋白酶活性对组合物的抗胰蛋白酶活性的比率。在一些实施方案中，这个参数在1.5:1和1:1之间，包括1.5:1和1:1。在更具体的实施方案中，该比率可以在1.4:1-1.1:1之间，包括1.4:1和1.1:1。在更具体的实施方案中，该比率可以在1.35:1-1.2:1之间，包括1.35:1和1.2:1。

在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的BBI和/或KTI(如果存在的话)已经随防腐剂一起储存。在其他实施方案中，BBI和/或KTI已经在不使用防腐剂的情况下制备并储存。

在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的BBI和/或KTI(如果存在的话)从大豆粉获得。术语“大豆粉”指从大豆(Glycine max)物种获得的粉末。在其他实施方案中，可以利用来自大豆属(Glycine)的任何物种。用于获得大豆粉的方法是本领域熟知的。所述的方法被认为适用于任何类型的大豆粉，而无论它怎样产生。

治疗性蛋白

在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的治疗性蛋白在纳入所述的药物组合物中之前分离。在这个方面，“分离”排除将治疗性蛋白作为含有大量掺杂性蛋白质的均化组织制备物或其他形式提供。分离的蛋白质或肽的优选例子是重组蛋白或肽。一个甚至更优选的实施方案是合成性蛋白质，换而言之在无细胞装置中产生的蛋白质。本领域技术人员根据本申请公开的内容理解，野生型和突变的治疗性蛋白均可以利用。

某些蛋白质和肽已知是胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的特异性抑制物，包括但不限于本文所述的作为胰蛋白酶抑制物和/或胰凝乳蛋白酶抑制物的那些。这类蛋白质不旨在用作所述组合物中的治疗性组分，并且从本文所用的“治疗性蛋白”定义排除。

本领域技术人员根据本申请公开的内容理解，多种治疗性蛋白可以用于所描述的方法和组合物中。在某些实施方案中，治疗性蛋白的大小是达100千道尔顿(kDa)，一般在1-100kDa之间，包括1和100kDa。在更具体的实施方案中，该大小是达90kDa。在其他实施方案中，该大小是达80kDa。在其他实施方案中，该大小是达70kDa。在其他实施方案中，该大小是达60kDa。在其他实施方案中，该大小是达50kDa。优选地，该大小在1-90kDa之间，包括1和90kDa。在其他实施方案中，该大小在1-80kDa之间，包括1和80kDa。在其他实施方案中，该大小在1-70kDa之间，包括1和70kDa。在其他实施方案中，该大小在1-60kDa之间，包括1和60kDa。在其他实施方案中，该大小在1-50kDa之间，包括1和50kDa。

适用于本文中的治疗性蛋白包括经修饰(即，通过非氨基酸部分与蛋白质共价连接)的衍生物。例如，但不限于，该蛋白质包括已经例如通过用已知保护基团/封闭基团糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化或衍生化所修饰的蛋白质。高分子量PEG可以在采用或不采用多功能接头的情况下，通过PEG与其N末端或C末端的位点特异性连接或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基，与治疗性蛋白连接。另外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。

在某些更具体的实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的治疗性蛋白选自胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子(例如，因子VII、因子VIIIC、因子DC、组织因子(TF)和凝血酶)、抗凝血因子(例如蛋白质C)、心钠素(atrial natriuretic factor)、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤维蛋白溶酶原激活物(例如，尿激酶或人尿或组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA))、铃蟾肽(bombesin)、造血生长因子(又称作集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白(例如，TNF-α、TNF-β、TNFβ-2、4-1BBL)、脑啡肽酶、RANTES(活化时受调节、通常由T-细胞表达和分泌)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、缪勒管抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子(例如，脑衍生神经营养因子[BDNF])、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(例如，α-FGF和β-FGF)、转化生长因子(TGF)(例如，TGF-α和TGF-β、包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4和TGF-5)、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(包括IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5和IGFBP-6)、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-7、集落刺激因子(CSF)(例如，M-CSF和GM-CSF)、白介素(IL)(例如IL-1至IL-13和IL-15、IL-18和IL-23)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化因子家族成员(例如嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)和MCP-1)和补体因子(例如C3和C5)。

在仍更具体的实施方案中，治疗性蛋白是胰岛素。可选地，治疗性蛋白可以是GLP-1抑制物。在一个更具体的实施方案中，治疗性蛋白是胰高血糖素样肽。在其他实施方案中，胰岛素和艾塞那肽(exenatide)存在于所描述的组合物中。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的BBI和油组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的BBI、至少一种乳化剂和油组成。在另外的实施方案中，该液态制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的KTI3、抑蛋白酶肽和油组成。在另外的实施方案中，该液态制剂基本上由胰岛素、艾塞那肽、二价阳离子螯合剂、分离的KTI3、抑蛋白酶肽、至少一种乳化剂和油组成。

本领域技术人员根据本申请公开的内容理解，多种类型的胰岛素适用于所描述的方法和组合物。示例性胰岛素蛋白质包括但不限于野生型和突变的胰岛素蛋白，包括合成人胰岛素、合成牛胰岛素、合成猪胰岛素、合成鲸胰岛素和胰岛素的金属复合物，如胰岛素的锌复合物、鱼精蛋白锌胰岛素和珠蛋白锌。

也可以利用多种类别的胰岛素，例如速效胰岛素、慢胰岛素、半慢胰岛素、特慢胰岛素、NPH胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素或以上类型胰岛素的两种或更多种的组合。

在一个特别优选的实施方案中，所描述的方法和组合物的胰岛素是野生型人胰岛素(Uniprot ID P01308；SEQ ID NO:4)。110个氨基酸当中，第1-24氨基酸是信号肽，第25-54氨基酸形成胰岛素B链，第57-87氨基酸形成C肽，并且第90-110氨基酸形成胰岛素A链。在一个优选的实施方案中，人胰岛素作为重组蛋白在细菌细胞中产生。在另一个优选实施方案中，合成产生人胰岛素。

GLP-1类似物在本领域中也称作GLP-1模拟物。本领域技术人员根据本申请公开的内容理解，所描述的组合物可以包含至少一种以下GLP-1类似物：艾塞那肽(Byetta^TM；CAS编号141732-76-5；SEQ ID NO:5)、利西拉来(lixisenatide)(CAS编号320367-13-3)、利拉鲁肽(CAS编号204656-20-2)、艾塞那肽-9(CAS编号133514-43-9)、AC3174([Leu(14)]促胰岛素分泌肽-4，Amylin Pharmaceuticals,Inc.)、他司鲁泰(CAS编号275371-94-3)、阿必鲁肽(albiglutide)(CAS编号782500-75-8)、索马鲁肽(semaglutide)(CAS编号910463-68-2)、LY2189265(dulaglutide^TM；CAS编号923950-08-7)和CJC-1134-PC(与重组人白蛋白缀合的修饰艾塞那肽-4类似物，由ConjuChem^TM制造)。全部CAS记录均在2011年12月19日访问。因此，在某些实施方案中，所描述的方法或组合物利用任一种上文列出的GLP-1类似物。在其他实施方案中，选择上文列出的GLP-1类似物之一。根据本文中展示的研究结果，本领域技术人员理解，其他GLP-1类似物也可以用于所描述的方法和组合物中。

乳化剂

本文中提及乳化剂和去垢剂的“重量/重量”百分比利用制剂中油基础物(oil base)(例如鱼油)的量作为分母；因此，将500mg鱼油中的60mg Gelucir视为12％w/w，而无论其他组分的重量。类似地，将与500mg鱼油混合的50mg Tween-80视为10％Tween-80。

在某些实施方案中，除治疗性蛋白，螯合剂和BBI之外，在所描述的方法和药物组合物中利用的基于油的液态制剂，或在其他实施方案中，存在的每种基于油的液态制剂还包含脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯，例如单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油的PEG酯或其混合物。在更具体的实施方案中，PEG酯可以作为以下的混合物提供：(a)游离单酰甘油、游离二酰甘油、游离三酰甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的PEG酯，例如单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油的PEG酯或其混合物。在这个方面，术语“单酰甘油”、“二酰甘油”和“三酰甘油”各自不必指单个化合物，而可以包括化合物的混合物，例如具有长度不同的脂肪酸的单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油的混合物。在某些优选的实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的单酰甘油，二酰甘油或三酰甘油，例如用来生成PEG酯的那些，来自通常视为安全(GRAS)的油源。GRAS油的例子是椰油、玉米油、花生油、大豆油、Myvacet9-45(C-18脂肪酸的二乙酰化单酰甘油)。(a)的更具体实施方案是C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的混合物。组分(b)的更具体实施方案是一种或多种C₈-C₁₈脂肪酸的PEG单酯和二酯的混合物。

在更具体的实施方案中，除脂肪酸的PEG酯之外，液态制剂还包含游离PEG。在仍更具体的实施方案中，除PEG酯和游离PEG之外，存在额外的非离子型去垢剂，例如基于聚山梨醇酯的去垢剂。

在所述方法和组合物的仍更具体的实施方案中，液态制剂包含：(a)C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的混合物；(b)C₈-C₁₈脂肪酸的混合物的PEG-32单酯和二酯；和(c)游离PEG-32。在甚至更具体的实施方案中，组分(a)对组分(b)+(c)的总和的重量/重量比在10:90-30:70之间(包括10:90和30:70)；更具体地在15:85-25:75之间(包括15:85和25:75)；更具体地是20:80。在某些实施方案中，组分(a)-(c)一起占基于油的液态制剂的8-16％重量/重量(包括8％和16％)。在更具体的实施方案中，该量是9-15％(包括9％和15％)。在更具体的实施方案中，该量是10-14％(包括10％和14％)。在更具体的实施方案中，该量是11-13％(包括11％和13％)。在更具体的实施方案中，该量是12％。

在其他实施方案中，除治疗性蛋白、螯合剂和BBI之外，在所描述的方法和药物组合物中利用的基于油的液态制剂还包含自乳化组分。尽管自乳化组分的一些实施方案是前述段落中描述的组分的混合物，但是这些混合物不限制本文所用的术语“自乳化组分”的定义。本文所用的“自乳化组分”指自发形成乳液的组分。一般，与含水介质接触时，这类组分将形成乳液，形成细分散体，即微乳液(SMEDDS)。这类组分的某些实施方案包括三酰甘油和高亲水/亲油平衡值(HLB；见Griffin WC：Griffin WC:"Calculation of HLBValues of Non-Ionic Surfactants,"J Soc Cosmetic Chemists 5:259(1954))表面活性剂的三酰甘油混合物。自乳化组分的其他实施方案具有蜡状、半固态稠度。

优选地，在所描述的方法和组合物中利用的自乳化组分的HLB是10或更大。在其他实施方案中，HLB在11-19之间(包括端值)。在其他实施方案中，它在12-18之间(包括端值)。在其他实施方案中，它在12-17之间(包括端值)。在其他实施方案中，它在12-16之间(包括端值)，表示水包油(O/W)乳化剂。在其他实施方案中，它在13-15之间(包括端值)。在其他实施方案中，它是14。自乳化组分的仍更具体的实施方案具有12-16(包括端值)的HLB并且包含与PEG、游离三酰甘油和游离PEG结合的中等链和长链三酰甘油。在其他实施方案中，自乳化组分具有12-16(包括端值)的HLB并且由与PEG、游离三酰甘油和游离PEG结合的中等链和长链三酰甘油的混合物组成。在其他实施方案中，自乳化组分具有14的HLB并且包含与PEG、游离三酰甘油和游离PEG结合的中等链和长链三酰甘油。在其他实施方案中，自乳化组分具有14的HLB并且由与PEG、游离三酰甘油和游离PEG结合的中等链和长链三酰甘油的混合物组成。

某些更具体的实施方案利用包含(a)单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯的自乳化组分。在这个方面，术语“单酰甘油”、“二酰甘油”和“三酰甘油”均不需要指单个化合物，而可以包括化合物的混合物，例如具有不同长度的脂肪酸的单酰甘油、二酰甘油或三酰甘油的混合物。更具体的实施方案是C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的混合物。组分(b)的更具体实施方案是C₈-C₁₈脂肪酸的混合物的PEG单酯和二酯的混合物。

在其他更具体的实施方案中，自乳化组分还包含游离PEG。

用于所描述的组合物和方法中的某些PEG部分含有5-100个单体。在更具体的实施方案中，PEG可以含有15-50个单体。在仍更具体的实施方案中，PEG可以含有25-40个单体。在更具体的实施方案中，PEG可以含有32个单体。

在所述方法和组合物的仍更具体的实施方案中，本文中所用的自乳化组分包含：(a)C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的混合物；(b)C₈-C₁₈脂肪酸的混合物的PEG-32单酯和二酯；和(c)游离PEG-32；并且组分(a)对组分(b)+(c)的重量/重量比是20:80。在某些实施方案中，这种组分占基于油的液态制剂的8-16％重量/重量(包括端值)。在更具体的实施方案中，该量是9-15％(包括端值)。在更具体的实施方案中，该量是10-14％(包括端值)。在更具体的实施方案中，该量是11-13％(包括端值)。在更具体的实施方案中，该量是12％。

符合上述的自乳化组分的例子是Gelucire^TM44/14、Gelucire^TM53/10和Gelucire^TM50/13。更具体的实施方案是Gelucire^TM44/14。后缀44和14分别指其熔点和其亲水/亲油平衡值(HLB)。通过利用PEG-32对氢化椰油(中等链和长链三酰甘油)的聚乙二醇解获得Gelucire^TM44/14(Gattefossé SAS，Saint-Priest，法国)。它的亲水/亲油平衡值为14。它由C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油的限定混合物(20％w/w)；PEG-32单酯和二酯以及游离PEG-32(80％w/w)组成。存在的主要脂肪酸是月桂酸，平均占总脂肪酸含量的45％。它是由处于层状相具有螺旋构象的PEG酯部分和处于六方堆积的酰基甘油部分组成的固态分散体。Gelucire^TM44/14的模拟胃肠道脂解作用的主要产物是PEG-32单酯和二酯。在更具体的实施方案中，所描述的组合物包含约12％Gelucire44/14作为唯一乳化剂，或在其他实施方案中，连同另一种乳化剂。在其他实施方案中，所描述的组合物包含约12％Gelucire44/14和约10％Tween-80。

非离子型去垢剂

在某些实施方案中，除自乳化组分之外，在所描述的方法和药物组合物中利用的基于油的液态制剂还包含非离子型去垢剂。在某些实施方案中，非离子型去垢剂选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-80、聚桂醇400(lauromacrogol400)、硬脂酸聚乙二醇40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、正辛基葡糖苷、正-十二烷基葡糖苷、正-十二烷基麦芽糖苷、辛酰-N-甲基葡萄糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡萄糖酰胺、Triton^TM-X-100、Triton^TM-X-114、Thesit^TM、异十三酰基聚(乙二醇醚)_n、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟-1-丙磺酸盐(CHAPSO)和N-十二烷基＝N,N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯。在其他实施方案中，选择上文列出的非离子型去垢剂之一。

在某些更具体的实施方案中，在所描述的方法和组合物中使用的非离子型去垢剂是基于聚山梨醇酯的去垢剂。基于聚山梨醇酯的去垢剂的例子是通过聚乙氧基化脱水山梨糖醇与脂肪酸共价结合所衍生的去垢剂。基于聚山梨醇酯的去垢剂的更具体实施方案是聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40和聚山梨醇酯-80。

例如，聚山梨醇酯80(Tween-80)是从聚乙氧基化脱水山梨糖醇和油酸衍生并具有以下结构的非离子型去垢剂：

在聚山梨醇酯80的情况下，在右侧显示的部分是含有60-70％油酸的脂肪酸的混合物(如所示)，平衡物主要是亚油酸、棕榈酸和硬脂酸。

在一个更具体的实施方案中，在所描述的方法和组合物中使用的基于油的液态制剂中，聚山梨醇酯80占3-15％重量/重量(包括端值)。在一个更具体的实施方案中，该百分数是5-14％(包括端值)。在一个更具体的实施方案中，该百分数是7-12％(包括端值)。在更具体的实施方案中，该百分数是10％或可选地5％。

二价阳离子的螯合剂

在一个实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的二价阳离子的螯合剂是对钙离子、镁离子和锰离子至少之一具有高亲和力的任何生理可接受的化合物。在另一个实施方案中，螯合剂选自柠檬酸或其盐；乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐(例如EDTA二钠和EDTA二钠钙)；EGTA(乙二醇四乙酸)或其盐；二乙三胺五乙酸(DTPA)或其盐；和BAPTA(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)或其盐。在其他实施方案中，利用上文列出的螯合剂之一。在更具体的实施方案中，螯合剂是EDTA。

油

根据本研究结果，本领域技术人员将理解，可以利用多种油作为所述组合物的液相的基础。在某些实施方案中，油可以是在环境温度为液态的任何生理可接受的油。

在更具体的实施方案中，油包含ω-3脂肪酸。在其他实施方案中，ω-3脂肪酸是ω-3多不饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是DHA，一种又称作4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸的ω-3多不饱和22-碳脂肪酸。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是--亚麻酸(9,12,15-十八碳三烯酸)。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是硬脂艾杜糖酸(6,9,12,15-十八碳四烯酸)。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是二十碳三烯酸(ETA；11,14,17-二十碳三烯酸)。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是二十碳四烯酸(8,11,14,17-二十碳四烯酸)。在一个实施方案中，ω-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA；5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是二十二碳六烯酸(也称作5,7,9,11,14,17-二十二碳六烯酸)。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是二十二碳五烯酸(DPA；7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)。在另一个实施方案中，ω-3脂肪酸是二十四碳六烯酸(6,9,12,15,18,21二十四碳六烯酸)。

在其他实施方案中，油是包含ω-3脂肪酸的天然存在油。在更具体的实施方案中，油选自鱼油、卡诺拉油、亚麻籽油、藻油和大麻籽油。在更具体的实施方案中，油是鱼油。已经在描述的组合物中测试了几个类型的鱼油并且已经发现它们均同等良好地发挥作用。

在其他实施方案中，在描述的方法或组合物中利用的液态制剂是无水的。在某些实施方案中，“无水”指未向其中有意添加水性组分的制剂。不排除存在已经从空气吸收至其组分中的痕量水。在另一个实施方案中，液态制剂不含水性组分。在另外的其他实施方案中，一种或多种油是液态制剂的仅有的液态组分。在更具体的实施方案中，鱼油是液态制剂的仅有的液态组分。

包衣

根据本文研究结果，本领域技术人员将理解，各种pH敏感性包衣均可以用于所描述的方法和组合物中。在某些实施方案中，可以利用抑制组合物在受试者的胃中消化的任何包衣。

在其他实施方案中，包衣包含生物可降解多糖。在其他实施方案中，利用水凝胶。在其他实施方案中，包衣包含以下赋形剂之一：壳聚糖、乙基纤维素水分散体ECD包衣(aquacoat ECD coating)、偶氮-交联型聚合物、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、乙酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、醋酸纤维素丁酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯。

在其他实施方案中，利用定时释放系统如Pulsincap^TM。

在优选的实施方案中，当pH达到肠中存在的范围(其相对于胃中pH呈碱性)时，所描述的包衣剂型释放核芯(含有基于油的制剂)。在更具体的实施方案中，包衣包含pH-敏感聚合物。在多种实施方案中，可以利用单层或多层包衣。

在一个实施方案中，包衣是肠衣。用于肠包衣的方法是本领域熟知的(见，例如，Siepmann F等人,2005)。在更具体的实施方案中，利用Eudragit^TM包衣作为肠衣。Eudragit^TM包衣是丙烯酸聚合物，其用途是本领域熟知的。

在另一个实施方案中，使用微包囊化作为所描述的组合物中的抗胃酸包衣。用于微包囊化的方法是本领域熟知的。

在其他实施方案中，包衣是胶囊，其中明胶胶囊是更具体的实施方案。用于将基于油的制剂插入明胶胶囊的方法是本领域熟知的。在另外的实施方案中，包衣是软凝胶、肠包衣胶囊。

在另一个实施方案中，提供包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿(kDa)的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂、分离的胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制物、分离的胰蛋白酶抑制物和脂肪酸的PEG酯。在其他实施方案中，该液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性为抑制至少50mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂。在其他实施方案中，该液态制剂具有抑制至少50mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性和抑制至少25mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性两者。在其他实施方案中，还存在游离PEG。在其他实施方案中，还存在非离子型去垢剂。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂和脂肪酸的PEG酯组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、脂肪酸的PEG酯和游离的PEG组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂、胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、脂肪酸的PEG酯、游离的PEG和非离子型去垢剂组成。

代表性制剂

某些代表性胰岛素制剂包含包覆于胶囊中的在鱼油中的胰岛素、Gelucire44/14、EDTA、SBTI和抑蛋白酶肽。某些代表性艾塞那肽制剂包含了包覆于胶囊中的在鱼油中的艾塞那肽、Gelucire44/14、EDTA、SBTI和抑蛋白酶肽。一个更具体的实施方案是具有以下组分的制剂：8-20％Gelucire44/14；50-100mg分离的BBI，或分离的BBI/分离的KTI混合物；20-30mg抑蛋白酶肽/每胶囊；和100-200mg EDTA；其中将治疗性蛋白全部合并至0.5-0.7ml鱼油中，所述治疗性蛋白可以是8-32mg胰岛素/每胶囊和/或150-600mcg艾塞那肽/每胶囊。另一种代表性液体胰岛素制剂含有在鱼油中的胰岛素、Gelucire44/14、EDTA、BBI、KTI和抑蛋白酶肽。在其他实施方案中，液态制剂基本上由胰岛素、Gelucire44/14、EDTA、BBI、KTI、抑蛋白酶肽和鱼油组成。更具体的制剂含有在0.5-0.7ml鱼油中的8mg胰岛素、12％Gelucire44/14、150mg EDTA、总计75mg的BBI和KTI，以及24mg抑蛋白酶肽；在0.5-0.7ml鱼油中的16mg胰岛素、12％Gelucire44/14、150mg EDTA、总计75mg的BBI和KTI，以及24mg抑蛋白酶肽；和在0.5-0.7ml鱼油中的16mg胰岛素、12％Gelucire44/14、150mg EDTA、总计150mg的BBI和KTI，以及24mg抑蛋白酶肽。在一种仍更具体的制剂中，组合物的抗胰蛋白酶活性对抗胰凝乳蛋白酶活性的比率是约1.28:1。在其他实施方案中，以上组合物还包含非离子型去垢剂。在更具体的实施方案中，该非离子型去垢剂是基于聚山梨醇酯的去垢剂。在甚至更具体的实施方案中，基于聚山梨醇酯的去垢剂是聚山梨醇酯80。优选地，聚山梨醇酯80占基于油的液态制剂的3-10％重量/重量(包括端值)。液态制剂可以由软凝胶、肠衣胶囊包覆。在某些实施方案中，在这个段落中描述的具体制剂还涵盖以相同比率含有相同组分的放大和缩减制剂。

一些代表性口服艾塞那肽制剂包含在鱼油中的艾塞那肽、EDTA、BBI、KTI和抑蛋白酶肽。在其他实施方案中，液态制剂基本上由艾塞那肽、Gelucire44/14、EDTA、BBI、KTI、抑蛋白酶肽和鱼油组成。更具体的制剂含有在0.5-0.7ml鱼油中的150微克(mcg)艾塞那肽、150mg EDTA、总计75mg的BBI和KTI，以及24mg抑蛋白酶肽；在0.5-0.7ml鱼油中的300mcg艾塞那肽、150mg EDTA、总计75mg的BBI和KTI，以及24mg抑蛋白酶肽；和在0.5-0.7ml鱼油中的300mcg艾塞那肽、150mg EDTA、总计150mg的BBI和KTI，以及24mg抑蛋白酶肽。在一种仍更具体的制剂中，组合物的抗胰蛋白酶活性对抗胰凝乳蛋白酶活性的比率在1.5:1和1:1之间(包括端值)。在甚至更具体的实施方案中，该比率是约1.28:1。液态制剂可以由软凝胶、肠衣胶囊包覆。在其他实施方案中，上述组合物还包含非离子型去垢剂。在更具体的实施方案中，非离子型去垢剂是基于聚山梨醇酯的去垢剂。在甚至更具体的实施方案中，基于聚山梨醇酯的去垢剂是聚山梨醇酯80。优选地，聚山梨醇酯80占基于油的液态制剂的3-10％重量/重量(包括端值)。液态制剂可以由软凝胶、肠衣胶囊包覆。

治疗适应症

在另一个方面，提供本文所述的BBI在制备用于向受试者口服施用活性成分的药物中的用途。在另一个方面，提供本文所述的KTI3在制备口服施用活性成分的药物中的用途。

在又一个方面，提供用于产生药物组合物的方法，所述方法包括步骤：(a)产生包含本文所述的BBI和活性成分的混合物；和(b)将所述混合物配制成可药用制剂。

在又一个方面，提供用于产生药物组合物的方法，所述方法包括步骤：(a)产生包含本文所述的KTI3和活性成分的混合物；和(b)将所述混合物配制成可药用制剂。

如本文提到的，配制步骤包括以下步骤：在适于期望的药物组合物时，任选地添加赋形剂、磨剂(milling)和包衣等。这些步骤完全处于本领域技术人员的能力范围内。

在某些实施方案中，本文提到的活性成分活性成分对人消化道中的降解或失活敏感。

在另一个方面，提供本文所述的用于向受试者口服施用活性成分的口服药物组合物。在某些优选的实施方案中，活性成分对人消化道中降解或失活敏感。在更具体的实施方案中，活性成分可以是治疗性蛋白。在其他实施方案中，活性成分是对人消化道中降解或失活敏感的非蛋白质分子。

在另一个方面，提供本文所述的口服药物组合物在制备向受试者口服施用治疗性蛋白的药物中的用途。

在另一个方面，提供一种用于口服施用治疗性蛋白至受试者的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用本文中所述的口服药物组合物，从而口服施用治疗性蛋白至受试者。

在另一个方面，提供本文所述的药物组合物用于治疗人类中糖尿病，而在一些实施方案中，治疗性蛋白在多种实施方案中是胰岛素、艾塞那肽或其组合。

在又一个方面，提供本文所述的成分的组合在制备用于治疗人类中糖尿病的药物组合物中的用途，其中在一些实施方案中，治疗性蛋白在多种实施方案中是胰岛素、艾塞那肽或其组合。

在又一个方面，提供一种用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括以下步骤：向需要这种治疗的受试者施用本文所述的药物组合物，其中在一些实施方案中，治疗性蛋白在多种实施方案中是胰岛素、艾塞那肽或其组合，由此治疗糖尿病。在某些实施方案中，受试者是人受试者，而在其他实施方案中，受试者是非人类哺乳动物。

在一个额外的方面，提供本文所述的药物组合物用于治疗人类中的不稳定型糖尿病。在另一个方面，提供本文描述的药物组合物用于治疗人类中升高的空腹血糖水平。

在又一个方面，提供本文所述的成分的组合在制备用于治疗人类中不稳定型糖尿病的药物组合物中的用途。另外，提供本文所述的成分的组合在制备用于治疗人类中升高的空腹血糖水平的药物中的用途。

另外，提供用于治疗不稳定型糖尿病的方法，所述方法包括以下步骤：向需要这种治疗的受试者施用本文所述的药物组合物，由此治疗不稳定型糖尿病。另外，提供用于降低升高的空腹血糖水平的方法，所述方法包括步骤：向需要这种治疗的受试者施用本文所述的药物组合物，由此降低升高的空腹血糖。在某些优选的实施方案中，受试者是人受试者。

不稳定型糖尿病

本领域熟练的医师将理解，可以通过许多种可接受的标准方法诊断不稳定型糖尿病，也称作血糖不稳定。这样一个方法出现在Ryan等人,2004中。在这种方法中，要求受试者监测其葡萄糖水平，一日最少2个毛细血管葡萄糖读数。患者在记录薄上记录在4周时间内的所测量的全部葡萄糖值以及关于低血糖出现的细节(图11A-B)。在记录的葡萄糖为<3.0mmol/l的任何情况下，要求受试者在调查问卷上描述事件细节(图12)，包括出现了哪种症状以及是否从第三方获得外部帮助以识别或治疗低血糖反应。如果个人已经丧失对情况的控制并且需要外部帮助以处理低血糖事件，则认为反应严重。其他这类方法包括计算MAGE指数(Service等人,1970)或“M值”(Schlichtkrull等人)或利用连续葡萄糖监测系统(Kessler等人)。不稳定型糖尿病一般与升高的空腹血糖和/或低血糖发作相关。

分离蛋白酶抑制物的方法

在又一个方面，提供一种用于从大豆产物(例如大豆粉)纯化BBI的方法，所述方法包括步骤：a)获得包含来自大豆产物的提取物的液体混合物，其中所述液体混合物是pH缓冲的水溶液，具有5.5-7.5之间(包括端值)的pH，盐浓度小于50mM；和b)利用包含带正电荷树脂和多糖聚合物材料的固定相，使所述溶液经历大小排阻层析，其中所述大小排阻层析包含不连续阶梯式盐梯度，其中第一步骤中所用的溶液的盐浓度小于40mM，优选小于20mM，并且后续步骤(一般但不必然是第二步骤)中所用的溶液的盐浓度在40-85mM之间，更优选地是50-80mM，更优选地是60-80mM，更优选地是65-75mM，最优选地是70mM。

可选的或另外，上述方法还包括以下在先步骤：在80-120mM NaCl、更优选100mM NaCl存在下，在pH4.5的缓冲液下提取大豆粉，并且在一些实施方案中，随后调节pH至4.5，可选的或额外的接着在压滤机中澄清。可选的或另外，所述方法还包括以下的在先步骤(在获得pH为5.5-7.5的液体混合物的前述步骤之前，在提取大豆粉之后)：使用30-40％饱和硫酸铵(AS)，更优选35％饱和硫酸铵，在一些实施方案中在冷却(例如在12-17℃的温度)下沉淀大豆粉的初始液态制备物。在其他实施方案中，随后通过离心收集沉淀物，例如在连续管式离心机中。在另外的实施方案中，提取AS沉淀物，在某些实施方案中，在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液中提取，接着任选地通过离心澄清。在多种其他实施方案中，将所得到的上清液对水或可选地对10mM磷酸钠、pH6.0-7.0缓冲液透析，通过离心澄清，和/或冻干。

在更具体的实施方案中，上述方法还包括步骤：通过用90-120mM、更优选100mM的缓冲液洗涤柱并用超过150mM、优选180mM的缓冲液洗脱KTI，从而分离KTI。可选的或者另外，所述方法还包括通过过滤(非限制性例子是0.45/0.2μm滤器)移除微生物的步骤。可选的或者另外，该方法还包括以下步骤：通过20,000-40,000MWCO滤器、优选地30,000MWCO过滤并且保存渗透物。这个步骤优选地在0.15-0.5M盐浓度，更优选地0.18M盐浓度存在下进行。可选的或者另外，所述方法还包括以下步骤：用5000MWCO滤器浓缩所产生的溶液并且保存渗透物。可选的或者另外，所述方法还包括以下步骤：用10,000MWCO滤器渗滤所产生的溶液并且保存截留物质，例如在7.0-8.0pH的磷酸钠缓冲液中。可选的或者另外，所述方法还包括冻干最终液体产物的步骤。

在又一个方面，提供一种用于从大豆产物(例如大豆粉)纯化KTI3(Kunitz胰蛋白酶抑制剂3)的方法，所述方法包括步骤：a)获得包含来自大豆产物的提取物的液体混合物，其中该液体混合物是pH缓冲的水溶液，pH为6-7(包括端值)，盐浓度小于50mM；和b)利用包含带正电荷树脂和多糖聚合物材料的固定相，对所述溶液进行大小排阻层析，其中所述大小排阻层析包含不连续阶梯式盐梯度，其中洗涤步骤(第一步骤或后续步骤)中所用的溶液的盐浓度大于80mM，并且后续步骤(其中KTI3被洗脱)的盐浓度为140-250mM(包括端值)，优选为160-220mM(包括端值)，更优选为170-200mM(包括端值)，更优选是180mM。

可选的或者另外，上述方法还包括以下在先步骤：在80-120mM NaCl、更优选地100mM NaCl存在下，用pH4.5的缓冲液提取大豆粉。可选的或者另外，所述方法还包括以下的在先步骤：使用30-40％饱和硫酸铵，更优选地35％饱和硫酸铵沉淀大豆粉的起始液体制备物。可选的或者另外，所述方法还包括通过过滤(非限制性例子是0.45/0.2μm滤器)移除微生物的步骤。可选的或者另外，所述方法还包括以下步骤：用5000MWCO滤器浓缩所产生的溶液并且保存渗透物。可选的或者另外，所述方法还包括以下步骤：用10,000MWCO滤器渗滤所产生的溶液并且保存渗透物。可选的或者另外，所述方法还包括冻干最终液体产物的步骤。

上文所提及的“液体混合物”可以在某些实施方案中是溶液、悬液或其组合。在优选的实施方案中，其盐浓度小于40mM，更优选地小于30mM，更优选地小于20mM，更优选地小于10mM。最优选地，没有添加盐。在其他实施方案中，液体混合物的pH在6-7之间(包括端值)。

在上文方法中使用的带正电荷树脂可以在一些实施方案中是二乙基氨乙基(DEAE)叔胺官能团。可选的或者另外，多糖聚合物材料经赖氨酸侧链交联。这种材料的一个非限制性例子是琼脂糖凝胶^TM，一种从海草提取的交联型珠形式的多糖聚合物物质。

在某些实施方案中，所述的分离蛋白酶抑制物的方法不利用含有PEG的试剂。

产生药物组合物的方法

本文中还提供产生药物组合物的方法。在某些实施方案中，所述方法包括如下步骤：任选地将与熔融的Gelucire(例如Gelucire44/14)与鱼油合并，冷却混合物，随后以粉末形式添加EDTA、SBTI、抑蛋白酶肽和治疗性蛋白或肽，例如胰岛素，或在其他实施方案中，艾塞那肽，虽然根据本研究结果，本领域技术人员将理解也可以使用其他治疗性蛋白或肽。在其他实施方案中，所述方法包括如下步骤：任选地将熔融的Gelucire(例如Gelucire44/14)与鱼油合并，冷却混合物，随后以粉末形式添加EDTA、BBI和治疗性蛋白或肽。在某些实施方案中，以所列的顺序添加粉末组分。在其他实施方案中，将所产生的混合物被任选地混合和/或均化。

在列出单个特征如BBI纯度、KTI纯度、蛋白质性质或液体组分性质等的可选物作为“实施方案”的情况下，应当理解这类可选物可以自由的组合以形成本文提供的完整制剂的独立实施方案。

如本文所用，“基本上由……组成”将本发明的范围限于指定的材料或步骤以及不实质影响要求保护的发明的基本特征和新特征的那些。

根据容许的权限，本文中(无论上文还是下文)提及的全部专利、专利申请和出版物均通过引用方式并入本文。

实验详述部分

实施例1：小规模生产改进的KTI和BBI制剂

概述

从大豆粉产生SBTI的先前方案以1％的产率产生粗制蛋白酶抑制物。进行以下实验以开发如下的生产方法：具有胰蛋白酶抑制物(TI)活性的KTI(Kunitz胰蛋白酶抑制物)和具有胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制物(CTI)活性的BBI(Bowman-Birk抑制物)的独立散料(separate bulk materials)，其中每种产物按照其自身规格制备以达到高水平酶活性，产率得到改善并且高分子量(MW)杂质最小化。

生产工艺涉及两个主要阶段：

部分1：从大豆粉生产SBTI中间物。用硫酸铵(AS)从上清液析出粗制SBTI并通过离心收集。将所述蛋白质提取并透析以除去过多的AS。将透析的提取物冻干，分析并称作“SBTI中间物”(图1A)。

部分2：SBTI中间物的下游纯化以产生纯化的BBI和KTI。将SBTI中间物加载于DEAE-琼脂糖凝胶^TM快流柱上。通过阶梯式盐梯度分别洗脱KTI和BBI。通过经30,000分子量截断值(MWCO)滤器过滤以进一步纯化BBI以减少高分子量杂质。在冻干之前，在磷酸盐缓冲液中制备最终制剂(图1B)。

改变图1中显示的工艺的各种参数，包括：作为原料使用的大豆粉的类型、提取缓冲液的pH和盐水平、沉淀用AS的百分数、用于柱加载的缓冲液的pH和盐水平以及洗脱条件(连续盐梯度对比阶梯式梯度)。

使用7B大豆粉(脱脂和最少加热处理的大豆粉，由Archer DanielsMidland Company Decatur，IL生产)。用于提取的优选pH是4.5，这产生水平低得多的无关蛋白质，同时保持KTI和BBI的水平相对高。在盐不存在的情况下观察到连续物料析出；向提取缓冲液添加盐通过防止沉淀而大幅度改善了工艺。使用35％AS用于蛋白质沉淀导高分子量蛋白质的水平低得多，同时最小影响KTI和BBI的水平。pH-6.5柱上样缓冲液的使用减少与DEAE-琼脂糖凝胶柱结合的无关蛋白质的量。在盐梯度步骤中的洗脱导致BBI从KTI和其他无关蛋白质更好地分离。通过在0.5M NaCl存在下经30,000MWCO滤器过滤，有效地纯化BBI。

实施例2：改进的较大规模SBTI生产

使用25千克(kg)大豆粉，进行三个较大规模的实验。用盘堆式离心机(diskstack centrifuge)(Westfalia；前两个实验)或用压滤机(第三个实验)进行提取物收集。采用Westfalia离心机时，损失50％物料，而用压滤机时，未观察到提取物损失。表1-2中分别显示第三实验的方案和分析结果。

表1.大规模SBTI中间物制备

*基于透析2.1升(L)等分试样的计算值。

表2.SBTI中间物的分析结果。

接着，使SBTI中间物经历表3中显示的下游纯化工艺。表4-5中分别显示所获得的KIT和BBI的分析结果。

表3.纯化的BBI和KTI的大规模下游制备。

表4.纯化的KTI的分析结果。

表5.纯化的BBI的分析结果。

实现KTI级分和BBI级分的明显分离(图2)。用0至0.14M、0.14至0.18M和0.18至0.4M的NaCl梯度进行洗脱。确定每个级分的电导率和OD₂₈₀。从级分18-28收集BBI的汇集物。从级分42-57收集KTI的汇集物。

通过SDS-PAGE分析每种汇集物的产物。在每种情况下均获得高纯度产物(图3)。

因此，实现合成方法和所得产物的显著改善。

表6：不同制备物的特征的概述。

实施例3：BBI和KTI替代性下游纯化方案

对改变的描述

对下游纯化方案作出几种改变：

1.向从柱收集的汇集物添硫柳汞。

发现在无硫柳汞情况下制备的BBI批次含有高于生物负载规格≤100CFU/G的高的需氧微生物总计数(CFU/g)。需氧微生物总计数结果(CFU/G)是：KTI，批次1：0；BBI，批次2：15.4；BBI，批次3：61.6；BBI，批次4：15.4。因此，将硫柳汞添加至从柱收集的汇集物至0.01％终浓度。发现全部后续批次均处于生物负载规格内。全部批次的酵母和霉菌总计数均是零。

2.改善的盐梯度。

为了更好地使BBI与KTI分离，使用预先制备的电导率已知的缓冲液执行步进盐梯度(stepwise salt gradient)。

3.改进的过滤工艺

改造30,000MWCO过滤工艺以用于系统外部的KVICK^TM储存器替代Uniflux10^TM系统。KVICK储存器的使用使物料能够经滤器循环并一次处理巨大的量。过滤以内含方式(contained fashion)进行至可能的程度。

发现这种改变使蛋白质和BBI活性的丧失最小化。在改变之前，每个纯化批次获得具有0.4-0.6/mg的BBI活性的40-70克终产物。此后，获得具有0.8-1.4/mg的BBI活性的85-135克终产物。另外，将用于超滤的溶液从0.5MNaCl改变成0.18M NaCl。

详细方案

下游纯化在cGMP设施中进行，始于800克和350克SBTI中间物批料。将中间物用40L缓冲液A悬浮并加载于DEAE柱(37L＝CV)上。加载物料的质量控制(QC)结果是31.47mgP/ml；KTI：0.97；BBI：0.09。将柱用以下缓冲液依次洗涤：

1)4x CV缓冲液A(10mM磷酸钠pH6.5，1.5mSi(毫西门子/米)；

2)2.1x CV缓冲液A1(10mM磷酸钠pH6.5+75mM NaCl，9.9mSi)；

3)3x CV缓冲液A2(10mM磷酸钠pH6.5+100mM NaCl，12mSi)；和

4)4x CV缓冲液A3(10mM磷酸钠pH6.5+180mM NaCl，21mSi)。

BBI汇集物由级分F5-F11组成并具有130L体积和1.46mgP/ml。KTI汇集物由级分F15-F18组成并具有85L体积。向两种汇集物添加硫柳汞至终浓度0.01％。向BBI汇集物添加NaCl母液至终浓度0.5M NaCl。

接下来，使用具有5个30,000MWCO盒的Kvick储存器，过滤BBI汇集物。渗透物留下。通过具有3个10,000MWCO盒的Uniflux系统，将KTI汇集物浓缩5倍至终体积17.5L。将浓缩的汇集物由具有3个10,000MWCO盒的Uniflux10系统针对水透滤。

为了检验以上方案的有效性，进行小规模柱层析，并检验不同级分，产生图4-5中分别显示的改进结果。发现这些结果在几个试验范围可重复。

重复一个相似的方案以仅纯化BBI，不同之处在于使用具有12.4mSi的3.5x缓冲液A并且不进行缓冲液A3洗脱。另外，在使用30,000MWCO滤器(2x0.55m²)，以2个KVICK储存器超滤BBI汇集物(135L)后，将渗透物随后使用相同的但具有5,000MWCO滤器的系统浓缩4.5倍。将浓缩的截留物质在Uniflux系统中针对水透滤。根据以下方案，通过SDS-PAGE检验每个纯化步骤的样品和终产物；图6和图7中分别显示结果。

SDS-PAGE利用在Phast^TM系统(Pharmacia)中运行的即用型凝胶(PhastGels^TM，20％，来自Amersham Pharmacia)。染色液是50％甲醇、10％乙酸和0.05％亮蓝。脱色液是30％甲醇、10％乙酸。

分析来自每个步骤的样品的蛋白质浓度和BBI活性。表7中汇总结果。就终产物而言，对于BBI条带，定量成像法显示84.4％-84.9％。

表7：BBI纯化步骤期间蛋白质的产率和活性。

*所述物质包含10％水，活性结果由此基于干重为0.9。

图8中显示改进方案的流程图。

在实施例1-3中所描述的改进之前，大规模SBTI纯化产生每个纯化批次40-70克终产物，BBI活性为0.4-0.6/mg(虽然在较小规模制备中获得稍高的活性，但这不能成功地放大)。这些改变能够产生具有0.8-1.4/mg的BBI活性的85-135克终产物。

实施例4：使用微过滤的BBI和KTI下游纯化方案

在这个实施例中的方案在无硫柳汞的情况下进行。以SBTI中间物开始，与最后实施例相似的方式如下进行DEAE柱层析，但采用略微不同的参数：

3x CV缓冲液A(10mM磷酸钠pH6.5，1.5mSi)

2.1x CV缓冲液A1(10mM磷酸钠pH6.5+70mM NaCl，9.9mSi)

3.5x CV缓冲液A2(10mM磷酸钠pH6.5+100mM NaCl，12.4mSi)

3.5x CV缓冲液A3(10mM磷酸钠pH6.5+180mM NaCl，21mSi)

图9中显示结果。

BBI汇集物

收集130L BBI汇集物并经Sartobran^TM0.45/0.2μm滤器(0.6m²)过滤。

KTI汇集物

收集95L KTI汇集物并经Sartobran^TM0.45/0.2μm滤器(0.6m²)过滤并且贮存在–20℃。终体积＝20L。

BBI纯化：

30,000MWCO过滤

将BBI汇集物调节至0.18M NaCl浓度并使用各自具有5个30,000MWCO盒的2x Kvick^TM储存器进行过滤。在4次洗涤后，收集渗透物，总计195L。

浓缩

将30,000MWCO的渗透物经2个KVICK储存器浓缩5倍，每个储存器中各自具有5个5,000MWCO盒。终体积＝34L。

透滤

使用具有5x10,000MWCO滤器的Uniflux10系统，将浓缩的物料针对纯化水透滤至电导率小于1mSi/cm。

添加配制缓冲液(0.5M磷酸钠缓冲液，pH7.6)，并使样品通过0.45/0.2μm滤器直接进入冷冻干燥盘。

冻干

在冻干后，获得95克干燥材料并将其收集至棕色玻璃瓶中。

对全部瓶进行QC采样：通过Karl Fischer法发现含水量为8％。

通过SDS-PAGE测试两个重复样品，并使用成像仪对凝胶定量。两个泳道中的BBI具有93.5-93.8％纯度(图10)。

对来自每个BBI纯化步骤的样品测试蛋白质浓度、BBI活性和生物负载。表8汇总BBI量和质量连同纯化工艺：

表8：BBI纯化步骤、量、特征和生物负载。

TNTC＝太多无法计数

KTI纯化：

KTI的浓度

将微过滤的KTI汇集物从冷储存取出并使用各自具有55KDa MWCO滤器的2x KVICK储存器浓缩。终体积＝17L。

KTI的透滤

通过具有5x10,000MWCO滤器，将浓缩的物料针对纯化水透滤。终体积＝20L。

添加配制缓冲液，并使样品通过0.45/0.2μm滤器直接进入Gore冻干盘。

冻干

取出冻干的产物并转移至4只棕色玻璃瓶。

对来自每个KTI纯化步骤的样品测试蛋白质浓度、KTI活性和生物负载。表9汇总KTI量和质量连同纯化工艺：

表9：KTI纯化步骤、量、特征和生物负载。

结论

1.SBTI中间物具有相对高的生物负载，这可以通过二次微过滤移除。

2.微过滤后的终产物在要求的规格内。

3.微过滤的使用对BBI和KTI的产率或比活性没有显著影响。

实施例5：鉴定用于匀质的胰岛素/鱼油制备物的有效乳化剂

发现在鱼油中的胰岛素的在先制剂缓慢沉淀；因此它们不适于大规模药物剂型制备。测试含有3.375g SBTI/22.5g鱼油并含有以下乳化剂的新制剂：单独或彼此组合或与单硬脂酸甘油酯(GMS)组合的卵磷脂(试验顺序1)、聚山梨醇酯80(Tween-80)(顺序2)或Gelucire44/14(顺序3)(图11)。随后，通过熔化Gelucire(其在环境温度为蜡状固体)，随后添加至鱼油，再次产生最有前景的制剂(以星号指示)。在冷却这种混合物后，以粉末形式按以下顺序添加固态组分：EDTA、SBTI、抑蛋白酶肽和胰岛素；并且在辊式磨机上混合并均化所产生的液体。

实施例6：多种乳化剂制剂的体内动物试验

材料和实验方法

制剂

下表10中显示测试的制剂。给出的乳化剂百分数是相对于存在的液体的重量而言的重量/重量。

表10.该实施例中使用的制剂。

饲养

动物：如由临床兽医师认证，仅健康猪用于本研究。居住状况：当采用CVC时独居并在其他时间分组。垫料：混凝土+木屑。光照：12-12小时光照循环。温度：19-25℃。

鉴定

通过耳标唯一识别每头动物。

实验设计

动物在检验之前24-36小时和后续监测期间禁食。随意饮水。

将动物用20mg/kg氯胺酮+2mg/kg赛拉嗪麻醉。将空腹和麻醉的猪以左侧位安置，之后将液态制剂在内窥镜引导下直接施用至十二指肠。在注射制剂后，注射1ml鱼油，随后注射10ml空气以冲洗装置，由此确保施用全部材料。随后将猪返回它们的围栏以使其从麻醉处理苏醒，这需要10-15分钟。在240分钟后续监测期内从中线导管(CVC)定期抽取血液样品(测试0.5ml)。在每个时间点，针对每份样品测定血糖浓度。在每个实验日后用庆大霉素(100mg/10kg)静脉内处理仔猪以避免感染。在葡萄糖浓度降低小于30mg/dL的情况下，向仔猪饲喂商品猪常规饲料(commercial pig chow)，并且此后监测葡萄糖浓度额外30分钟。

在测试日之间执行至少2日的清洗期。

结果

在2个独立实验中测试10种具有不同乳化剂的胰岛素-鱼油制剂对血糖水平的体内活性。表11中显示结果。

表11.实验6A的结果。每个框中的三个数字表示基线值、最低值和终值(20mg/dL)。“低”表示小于20mg/dL的值。

*见图11图注。

图12中描述的实验6B结果显示，尽管全部制剂均有效，但是来自表10的制剂E和F引起葡萄糖水平最均匀地明显降低。

实施例7：含有改进SBTI的口服蛋白质制剂的临床测试

进行研究以确定所描述的口服胰岛素制剂在健康志愿者中的安全性、药物代谢动力学和药效动力学。受试者在独立就诊时接受以下口服胰岛素片剂制剂之一的单次给药。每次给药后接72小时清洗期。在8小时过夜禁食后清晨施用剂量。

治疗组

1.1粒8mg胰岛素制剂的胶囊：8mg胰岛素，150mg EDTA，总计75mg纯化BBI和纯化KTI的混合物，150000U抑蛋白酶肽和12％Gelucire44/14。

2.1粒16mg胰岛素制剂的胶囊：16mg胰岛素，150mg EDTA，总计75mg纯化BBI和纯化KTI的混合物，150000U重组抑蛋白酶肽和12％Gelucire44/14。

3.2粒8mg胰岛素制剂的胶囊剂。

筛查期：

在受试者签署知情同意书后进行以下评价：

·医疗史

·体格检查

·用药史

·ECG

·生命体征(血压，心率)。在休息至少5分钟后以坐姿测量生命体征。

·临床实验室评价(化学，血液学)

治疗期

受试者在8小时过夜禁食后给药日清晨于门诊部集中。

在研究药物施用之前：

·插入留置导管用于血液样品采集。

·在研究药物施用之前15分钟(min)进行葡萄糖检验(1滴)。

·在研究药物施用之前20分钟记录生命体征。在休息至少5分钟后以坐姿测量生命体征。

·在研究药物施用之前15分钟采集血液样品用于分析胰岛素、血浆葡萄糖和c-肽。

药物施用方案：

用至少300mL水口服施用实验药物。在服用研究药物后，受试者保持直立或坐姿至少1小时。

·在研究药物施用之后大约2和5小时(hr)记录生命体征(血压，心率)。在休息至少5分钟后以坐姿测量生命体征。

·在研究药物施用之后第1小时期间每隔20分钟并且此后每隔15分钟直至5.0小时采集血液样品用于分析胰岛素、血浆葡萄糖和c-肽。

对每个阶段完成评价后，受试者就餐并离开，随后要求他们在最短72小时清洗期后返回进行下一个阶段。

研究结束/早期中止：

从研究单位离开之前，受试者接受以下研究结束评价：

·在休息至少5分钟后以坐姿测量生命体征。

·临床实验室评价(血液学，化学)

早期终止受试者在中止时完成研究结束评价。

结果

多种剂量的胰岛素耐受良好，在任何治疗后未报告或观察到不良事件。在7/10受试者中证明了反应，从施用起≥60分钟迟滞后观察到全部治疗的最大血糖反应。与8mg组(64.6±6.2mg/dL)相比时，在8+8mg(47.9±11.3mg/dL，p＝0.006)和16mg(57.3±8.4mg/dL，p＝0.001)治疗后，观察到显著更低的平均血糖C_min。与8mg组(分别p＝0.003和0.008)相比时，在8+8mg治疗和16mg治疗后，观察到葡萄糖曲线下面积(AUC)值显著减少(分别13.2％和8.1％)。利用含有现有SBTI制备物的制剂未见此差异。

胰岛素施用后的曲线下面积(AUC)数据汇总

实施例8：含有改进SBTI的口服蛋白质制剂的动物试验

以类似于本文所述的一个或多方案的方式对包含高度纯化的SBTI的制剂和蛋白质药物(例如胰岛素或艾塞那肽)进行额外的动物试验。在一些实验中，液态制剂用可以口服施用的明胶和/或肠溶胶囊包衣。在其他实验中，将液态制剂通过导管插入术等直接施用至十二指肠。在某些实验中，允许动物在施用制剂之前或之后采食，以模拟餐前条件或餐后条件。

在其他的实验中，使用如上文描述的重组SBTI。在其他的实验中，使用如上文描述的合成性SBTI。

实施例9:在人类受试者中测试含有改进SBTI的口服艾塞那肽制剂

正在进行以下研究以评定包含纯化的BBI和KTI和任选12％Gelucire44/14的口服艾塞那肽制剂在健康志愿者中和T2D受试者中的安全性、药物代谢动力学和药效动力学，筛查和治疗以类似于实施例7的方式进行：

I期：I期由两个阶段组成：阶段1将评定递增剂量的口服艾塞那肽在健康志愿者中的安全性、可耐受性和PK/PD。在第一阶段中，两个较低剂量的艾塞那肽(150和300μg)将随机地施用至全部健康禁食受试者。如果认为安全，将在阶段2中批准进一步剂量递增(450和600μg艾塞那肽)。随后最高可耐受剂量将在标准餐食之前60分钟施用至全部健康患者(随访5)。

II期：这个时期将评定在标准餐食之前60分钟递送时，T2DM患者对递增剂量艾塞那肽的反应。可以在该研究中包括安慰剂对照，同样包括用标准餐食之前30分钟皮下递送的有效对照Byetta(5μg)治疗。此外，在两个独立的研究随访时，在提供标准餐食之前60分钟，全部T2D M受试者将均用含有16mg胰岛素的口服胰岛素胶囊剂治疗和用口服胰岛素/口服艾塞那肽的组合治疗。

解释：

葡萄糖减少和胰岛素漂移的AUC将在不同治疗之间计算并比较。制剂的有效性将由口服GLP-1-治疗组的胰岛素漂移(其大于非GLP-1-治疗组)和/或口服GLP-1-治疗组中较小的葡萄糖漂移显示。

在其他的实验中，使用如上文描述的重组BBI(任选地连同KTI和/或抑蛋白酶肽一起)，替代纯化的BBI和KTI。在其他实验中，使用如上文描述的合成BBI(任选地连同KTI和/或抑蛋白酶肽一起)，替代纯化的BBI和KTI。

实施例10：在人类受试者中测试含有改进SBTI的口服胰岛素制剂

正在进行以下研究以评定口服胰岛素制剂的多次夜间给药在采用膳食和二甲双胍未充分控制的成年T2DM患者中的安全性和药效动力学，所述口服胰岛素制剂包含纯化的BBI和KTI和任选12％Gelucire44/14，筛查和治疗以类似于实施例7的方式进行：

主要目的：评价该制剂对平均夜间葡萄糖水平和安全性参数(例如，低血糖)的药效动力学影响，并评价安全性，包括低血糖和心血管事件的发生率。主要功效终点将由以下确定：

·24mg胰岛素对基于两个夜晚(连续葡萄糖监测(CGM))的数据*的加权平均夜间葡萄糖水平的影响，所述数据通过如下比较来确定：

a)基线(准备期)和24mg胰岛素治疗之间的平均变化百分数与

b)基线和接受安慰剂的组的安慰剂治疗之间的平均变化百分数。

*如本文所用的“CGM数据”总是完全基于口服药物治疗后前6个小时内采集的数据。

·16mg胰岛素对基于两个夜晚的CGM数据的加权平均夜间葡萄糖水平的影响，所述数据通过如下比较来确定：

a)基线(准备期)和16mg胰岛素治疗之间的平均变化百分数与

b)基线和接受安慰剂的组的第4周安慰剂治疗之间的平均变化百分数。

次要目的：评价空腹血糖(FBG)、清晨空腹血清胰岛素、c-肽、甘油三酯和HbA1c的基线变化。次要功效终点将由以下决定：

·通过比较胰岛素治疗组与接受安慰剂的组的加权平均夜间葡萄糖水平，确定24mg胰岛素和/或16mg胰岛素对加权平均夜间葡萄糖水平的影响。

·24mg胰岛素和/或16mg胰岛素对清晨空腹血糖、清晨空腹血清胰岛素、清晨空腹c-肽、HbA1c和甘油三酯从基线至治疗期的变化的影响。

·24mg胰岛素和/或16mg胰岛素对通过CGM评定的平均葡萄糖从基线至治疗期的变化的影响。

实施例11：在治疗不稳定型糖尿病中测试含有改进SBTI的口服胰岛素制剂

使用盲态连续葡萄糖监测仪(CGM)，监测患有不稳定型糖尿病的受试者(例如，具有8-10％糖化血红蛋白[HgA1c]水平的受试者)几日以建立基线。在后续几日期间，在就餐之前，向他们施用本文所述的含有胰岛素的制剂，任选地使用现有制剂作为对照组。进行盲态CGM以确定制剂的有效性。

实施例12：在不存在其他蛋白酶抑制物的情况下测试含有改进BBI的口服胰岛素制剂

在KTI(例如BBI和抑蛋白酶肽作为仅有的蛋白酶抑制物)不存在的情况下，并且在其他实验中，在任何其他蛋白酶抑制物不存在的情况下，进行与上文描述的那些研究相似的额外研究，但是使用如本文所述那样制备的BBI。单独的改进BBI在其他蛋白酶抑制物不存在的情况下保护所述制剂中蛋白质药物的能力证实了如本文所述那样制备的BBI的优效性。

在权利要求中，术语“包含”及其变体如“含有”、“包括”等表示包括列出的要素，但是通常不排除其他要素。

参考文献

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Ziv E,Kidron M,Raz I等人，Oral administration of insulin in solid form tonondiabetic and diabetic dogs.J Pharm Sci.Jun 1994；83(6):792-794.

Claims

1.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂和分离的BBI。

2.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测量，所述BBI已经纯化到至少85％的纯度。

3.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过BCA(二羧基二喹啉)的测定法，所述BBI已经纯化到大于95％的蛋白质含量。

4.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述BBI含有小于0.1％高分子量杂质。

5.根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含不同于所述BBI的胰蛋白酶抑制物。

6.根据权利要求5所述的口服药物组合物，其中，所述胰蛋白酶抑制物是KTI3。

7.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，通过SDS-PAGE测量，所述KTI3已经纯化到至少85％的纯度。

8.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3已经纯化到通过BCA测定法所测量的大于95％的蛋白质含量。

9.根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3含有小于0.1％高分子量杂质。

10.包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子的螯合剂，并且所述液态制剂具有抑制至少40mg胰凝乳蛋白酶/ml液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。

11.根据权利要求10所述的口服药物组合物，其中，所述液态制剂还包含抑制至少20mg胰蛋白酶/ml液态制剂的抗胰蛋白酶活性。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述治疗性蛋白选自：胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素γ、干扰素β、干扰素α、生长激素、促红细胞生成素、GLP-1、GLP-1类似物、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心钠素、表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋白C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、纤维蛋白溶酶原激活物、铃蟾肽、造血生长因子(集落刺激因子，多种)、肿瘤坏死因子(TNF)蛋白、脑啡肽酶、RANTES(活化时受调节，通常是T-细胞表达和分泌)、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、血清白蛋白、缪勒管抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-7、集落刺激因子(CSF)、白介素(IL)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化因子家族成员和补体因子。

13.根据权利要12求所述的口服药物组合物，其中，所述治疗性蛋白选自胰岛素和GLP-1类似物。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述螯合剂是EDTA。

15.根据权利要求中1-14任一项所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物的聚乙二醇(PEG)酯。

16.根据权利要求15所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含游离的PEG。

17.根据权利要求15所述的口服药物组合物，其中，所述PEG酯作为以下的混合物提供：(a)单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物；和(b)脂肪酸的聚乙二醇(PEG)酯。

18.根据权利要求17所述的口服药物组合物，其中所述混合物的部分(a)包含C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油。

19.根据权利要求17所述的口服药物组合物，其中，所述混合物的部分(b)包含C₈-C₁₈脂肪酸的混合物的PEG单酯和二酯。

20.根据权利要求17所述的口服药物组合物，其中，所述混合物的部分(a)包含C₈-C₁₈单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油；所述混合物的部分(b)包含C₈-C₁₈脂肪酸的混合物的PEG-32单酯和二酯；所述基于油的液态制剂还包含(c)游离PEG-32；并且所述混合物的部分(a)对所述混合物的部分(b)和(c)的总和的重量/重量比在10:90和30:70之间，包括端值。

21.根据权利要求20所述的口服药物组合物，其中，(a)、(b)和(c)一起占所述基于油的液态制剂的8-16％重量/重量，包括端值。

22.根据权利要求15-21中任一项所述的口服药物组合物，还包括非离子型去垢剂。

23.根据权利要求22所述的口服药物组合物，其中，所述非离子型去垢剂是基于聚山梨醇酯的去垢剂。

24.根据权利要求23所述的口服药物组合物，其中，所述基于聚山梨醇酯的去垢剂是聚山梨醇酯80。

25.根据权利要求24所述的口服药物组合物，其中，所述聚山梨醇酯80占所述基于油的液态制剂的3-10％重量/重量，包括端值。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述油是鱼油。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂是无水的。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的口服药物组合物，还包含抵抗胃中降解的包衣。

29.根据权利要求28所述的口服药物组合物，其中，所述包衣是pH敏感胶囊。

30.根据权利要求28所述的口服药物组合物，其中，所述包衣是软明胶胶囊。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的口服药物组合物，用于向受试者口服施用治疗性蛋白。

32.根据权利要求1-30中任一项所述的口服药物组合物在制备向受试者口服施用治疗性蛋白的药物中的用途。

33.向受试者口服施用治疗性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用根据权利要求1-30中任一项所述的口服药物组合物，由此向受试者口服施用治疗性蛋白。