JP4165329B2 - 大豆ホエー分画物の製造法 - Google Patents

Description

本発明は大豆に含まれる、生理活性を有するトリプシンインヒビター及び澱粉の糖化酵素であるβ−アミラーゼの濃縮物等の有用な分画物を簡単に製造する方法に関する。

大豆に含まれる生理活性物質の一つであるトリプシンインヒビターは、分子量約２０，０００、等電点４．５のＫｕｎｉｔｚ型及び分子量約８，０００、等電点４．２のＢＢＩ型が知られており、生理作用として癌性胸・腹水貯留抑制剤（特許文献１）、炎症性浮腫亢進抑制剤（特許文献２）、酵素インヒビターを含有するスキンケア組成物を有する使い捨て吸収性製品（特許文献３）等が報告されている。

大豆β―アミラーゼは澱粉のアミロースを非還元末端からマルトースの形で加水分解して切り出す酵素で分子量５７，０００、等電点５．５を有し、水飴やマルトースの製造へ利用されたり、澱粉の老化防止剤としてパンや和菓子に直接用いられている。また大豆にはα−アミラーゼ活性が極めて少なく、大豆β−アミラーゼは他の植物由来のβ―アミラーゼより耐熱性が強いことより、高純度のマルトース製造や食品の老化防止用途において優位性が認められている。

大豆に含まれる少糖類は生理活性を持つ糖質が多く、スタキオース、ラフィノース、ベルバスコース、ピニトール、ｃｈｉｒｏ−イノシトール、ｍｙｏ−イノシトール、ショ糖等が存在するが、この内ビフィズス菌増殖促進効果を持つ糖質はスタキオース、ラフィノース、ベルバスコースで、ビフィズス因子としての利用が特許文献４や特許文献５等に報告されている。

大豆トリプシンインヒビターの分画方法として実験室レベルでは等電点沈殿、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組み合わせにより種々の精製法が提案されている。工業的な方法として限外濾過膜とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた特許文献６、トリプシンインヒビター抽出法とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた特許文献７等がある。

大豆β−アミラーゼの分画方法として限外濾過膜を利用した特許文献８や特許文献９、吸着剤として合成ケイ酸アルミニウムを利用した特許文献１０等がある。

大豆少糖類の分画方法として大豆ホエーを塩化カルシウム存在下に水酸化カルシウムで中和し生じた沈殿と共にたん白を低減化する特許文献１１、大豆ホエーを加熱した後リン酸でｐＨ３．０以下に調整し生じた沈殿と共にたん白を低減化する特許文献１２等がある。

以上のように、大豆トリプシンインヒビター、大豆β―アミラーゼ、大豆少糖類は極めて有用な物質であり工業化へ通じる簡単な分離技術が確立できれば社会的な貢献は大きい。
一方、従来技術の大豆トリプシンインヒビターの分画法、大豆β−アミラーゼの分画法、大豆少糖類の分画方法の例を挙げてきたが、全てにおいて目的物質に特化した方法が論じられており、様々な有用成分を含む大豆ホエーを総合的に利用しようとする技術的な提案はない。

特公平６−２３１１３号公報 特開平７−１０７７２号公報 特表２００２−５０５９１６号公報 特開平３−２２９７１号公報 特開昭６０−０６６９７８号公報 特開平６−１４５１９８号公報 特開平１０−０６６５７２号公報 特公昭５７−１１６３６号公報 特開平７−１０７９７４号公報 特公昭５７−５２３８６号公報 特開昭６０−６６９７８号公報 特許第２６３５２１０号公報

大豆ホエーに塩を添加してたん白を回収する方法は実験レベルで用いられるが多量の塩を必要とするため現実的ではなく、特定成分回収のためイオン交換クロマトグラフィーへ直接多成分が混在している大豆ホエーを供するのも現実的ではない。
限外濾過膜によりたん白を分画する方法は有効ではあるが、大豆ホエーはトリプシンインヒビターを主成分とする澱が徐々に発生して限外濾過膜の目詰まりの原因となりフラックスの低下を招くため、希薄な大豆ホエーの高濃度濃縮は困難である。
また、大豆トリプシンインヒビターと大豆β−アミラーゼは分子量の差が小さく、大豆ホエーを直接限外濾過膜で処理してそれぞれを分離して利用しようとした場合には不向きである。ましてや、ＢＢＩ型トリプシンインヒビター画分、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター画分、β−アミラーゼ画分を希薄な大豆ホエーから、それぞれを限外濾過膜により分画することは不可能に近い。
以上に鑑み、本発明は、塩を添加する必要なく大豆ホエーを大豆トリプシンインヒビター濃縮物（好ましくはＢＢＩ型とＫｕｎｉｔｚ型を主体とする画分）にそれぞれ分画し、大豆β−アミラーゼ濃縮物及び大豆少糖類濃縮物とに分画することを目的とした。

本発明者らは、分離大豆蛋白の製造工程で副産される大豆ホエーを濃縮した後ｐＨを特定範囲に調整することにより大豆ホエーに存在するトリプシンインヒビターの活性の８０％以上を沈殿として回収できる知見を得た。
次に前記工程で分離した上清に極性溶剤を加えて分別を試みたところ大豆ホエーに存在するβ−アミラーゼの活性の８５％以上を沈殿として回収できる知見を得た。
また、一方、回収したトリプシンインヒビターの沈殿を特定のｐＨの範囲で加水し一部溶解させることでＢＢＩ型とＫｕｎｉｔｚ型を主体とする画分に分画できる知見を得た。
そして、次に前記工程で分離した上清を、限外濾過膜を用いてβ−アミラーゼの濃縮を試みたところ、予め発生する沈殿をトリプシンインヒビター画分として除去しているため、フラックスの低下がほとんどなく、大豆ホエーに存在するβ−アミラーゼ力価の８５％以上を濃縮液として回収できる知見を得た。

本発明は以上の知見により完成された次の方法である。
１．次の工程を含むことを特徴とする大豆ホエー分画物の製造法。
（ａ）大豆ホエーを濃縮し、酸性条件下で析出する凝集沈殿物を回収する工程。
（ｂ）得られた上清を高分子画分と低分子画分に分画する工程。
２．工程（ａ）で回収する凝集沈殿物が大豆トリプシンインヒビター濃縮物、工程（ｂ）で得られる高分子画分が大豆β−アミラーゼ濃縮物であり、低分子画分が大豆少糖類である１．の製造法。
３．工程（ａ）の大豆ホエーの濃縮を、ｐＨ３．５〜８．５で行い、固形分が３０重量％〜５０重量％の範囲まで濃縮する１．の製造法。
４．工程（ａ）の大豆ホエーの濃縮を、品温２０℃−８０℃で行う１．の製造法。
５．工程（ａ）の凝集沈殿物の析出する工程をｐＨ１．７〜５．２で行う１．の製造法。
６．工程（ａ）で得られる沈殿物へ加水しｐＨ２．０〜４．８の範囲で部分的再溶解を行い、これを固液分画する１．の製造法。
７．固液分画で得られる液体部がＢＢＩ型トリプシンインヒビター濃縮物であり、固体部物がＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター濃縮物である６．の製造法。
８．工程（ｂ）が、得られた上清に極性溶剤を添加し、新たな上清と析出する沈殿に分画する分画工程（ｂ−１）若しくは得られた上清を限外濾過膜にて処理し、濃縮液と透過液に分画する工程（ｂ−２）、又はその組み合わせたものである１．の製造法。
９．工程（ｂ−１）で、極性溶剤がエタノールであり、極性溶剤を加えた上清中の水とエタノールの合計に対するエタノール濃度が３０重量％〜８５重量％、且つ温度が−５℃〜１５℃の範囲で実施する８．の製造法。
１０．工程（ｂ−２）において限外濾過膜の分画分子量が５，０００〜２５０，０００の範囲である８．の製造法。
１１．工程（ｂ−２）を、温度が６５℃以下、ｐＨが４．０〜７．０、上清の固形分が５０重量％以下の範囲内で行う８．の製造法。
１２．工程（ｂ−１）で得られる新たな上清、或は工程（ｂ−２）で得られる透過液を固形分５０重量％〜８５重量％に濃縮する８．の製造法。

本発明により、大豆ホエーを大豆トリプシンインヒビター濃縮物、大豆β−アミラーゼ濃縮物及び／又は大豆少糖類濃縮物の３つの画分に分画することが可能となった。
更に大豆トリプシンインヒビター濃縮物よりＢＢＩ型トリプシンインヒビターとＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターの分画が可能となり、大豆β−アミラーゼをＵＦ膜によるダイアフィルトレーションを行うと高度濃縮が可能となった。
そして、これらの分画物は大豆トリプシンインヒビター、大豆β−アミラーゼ、大豆少糖類の中間原料とすることが可能になったものである。
本発明の工程を利用すれば大豆ホエーから効率良く大豆トリプシンインヒビター、大豆β−アミラーゼ、及び大豆少糖類を一連の工程で分離することができるものであり、大豆ホエーを総合的に利用することが可能になったものである。

工程（ａ）：大豆ホエーを濃縮し、酸性条件下で析出する凝集沈殿物を回収する工程。
本発明で用いる大豆ホエーは、大豆トリプシンインヒビターや大豆β−アミラーゼが活性を有している大豆ホエーを用いる。すなわち、それが生じる過程で大豆トリプシンインヒビターや大豆β−アミラーゼが失活するほどの熱履歴を受けていないものがよい。
大豆ホエーは、大豆から分離大豆蛋白、あるいは濃縮大豆蛋白を製造する過程で副生する。熱披瀝の少ない大豆ホエーは、例えば、低変性脱脂大豆を水によって中性付近で抽出後オカラ成分を除去した脱脂豆乳を、等電点付近（例えばｐＨ４．５付近）で大豆蛋白質を凝集沈殿させて除いた溶液として得ることができる。

工業的に分離大豆蛋白を製造する過程で副産される大豆ホエーは、多量に品質の安定した原料として利用することができるので好都合であり、通常このホエーは典型的には、固形分が約３％程度で、その固形分組成（以下において「ｄｒｙ％」ともいう）は粗蛋白質２０％、灰分２０％、糖質６０％程度で構成されており、脱脂大豆からの水抽出倍率が変わっても大豆ホエーの固形分組成の変動は殆ど無い傾向にある。そして、固形分が３％程度であれば、大豆トリプシンインヒビターが活性として５ｕｎｉｔ／ｍｌ程度、大豆β−アミラーゼが活性として１００ｕｎｉｔ／ｍｌ程度含まれており、本発明に好適に用いることができる。

本明細書における大豆トリプシンインヒビター活性の測定法はＡ．Ｏ．Ｃ．Ｓ．の公定法に基づいたＢＡＰＡ法を用い、大豆β−アミラーゼ活性の測定は基質として馬鈴薯澱粉を用いホエー（アミラーゼ溶液）を反応させ生成した還元糖をＳｏｍｏｇｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で定量する方法で行い、４０℃で１０分間に１ｍｇのグルコースに相当する糖を生成するのに要する酵素量を１ｕｎｉｔとした。

工程（ａ）における大豆ホエーの濃縮は、ｐＨ３．５〜８．５好ましくはｐＨ４．５〜７．０、溶液温度（品温）は２０℃〜８０℃好ましくは２０℃〜６５℃で行い、固形分を３０重量％〜５０重量％、好ましくは３５重量％〜４５重量％の範囲まで濃縮することが適当である。

ｐＨ３．５未満ではβ−アミラーゼが不安定になりやすく、ｐＨ８．５を越えるとトリプシンインヒビターが不安定になりやすい。又、溶液温度が２０℃未満となると減圧装置では機械的な限界のあることがあり、６５℃を越えるとβーアミラーゼの活性が低下する傾向にあるが、７０℃で６０％の活性を残存する。すなわち上記ｐＨ、温度と濃度の範囲外では、大豆トリプシンインヒビター活性の回収率が低下する傾向となり、また工程（ｂ）で回収するβ−アミラーゼの活性も低下する傾向となる。

なお、トリプシンインヒビターのＫｕｎｉｔｚ型はｐＨ４．５の等電点を、ＢＢＩ型はｐＨ４．２の等電点を、β−アミラーゼはｐＨ５．５の等電点を有するが、大豆ホエーをそのまま夫々の等電点でｐＨを調整して等電点沈殿を試みても目的物質の凝集沈殿は生じない、或いは極めて微量である。

固形分は上記範囲に調整することにより、ホエー中の灰分濃度が相対的に高まり塩析と同様な効果が得られ、トリプシンインヒビター画分を特異的に分画することができる。
従来は大豆ホエーより蛋白質を回収する方法として塩析法があるが、例えば大豆トリプシンインヒビターを塩によって沈殿させようとした場合、固形分が３％の大豆ホエーに対し１４％もの大量の塩の添加が必要となるため現実的ではなかった。

濃縮手段は公知の手段を利用できるが、減圧下で濃縮すると温度上昇を防ぎ効率良く濃縮できる。

上記のように濃縮した大豆ホエーは、酸性条件下、好ましくはｐＨ１．７〜５．２、より好ましくは２．７〜４．８の範囲に調整することにより析出する凝集沈殿物と上清を分画する。この凝集沈殿物は大豆トリプシンインヒビターが濃縮されている。
ｐＨ１．７〜５．２の範囲外であっても、β−アミラーゼの低ｐＨによる失活に十分注意して温度を２０℃以下で行えば可能である。

このようにして得る凝集沈殿物は大豆トリプシンインヒビター濃縮物であり、加水しｐＨ２．０〜４．８好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．４の範囲で一部溶解を行い更に固液分画することができる。この固液分画により得られる液体部がＢＢＩ型トリプシンインヒビター濃縮物、固体部物がＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター濃縮物とすることができる。これは加水により塩濃度が、濃縮ホエーのそれより低くなるため、ＢＢＩ型トリプシンインヒビターは再溶解してくるのに対してＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターは溶解せず、両者を上清と沈殿とに分画することができるのである。

加水の程度は凝集沈殿物（含水物）に対し１．５倍以上、好ましくは２から１０倍、もっとも好ましくは２．５から４倍が好ましい。

この分画（固液分離）の手段としては公知の固液分離装置、例えば遠心分離装置、膜分離装置などを利用することができる。

工程（ｂ）：工程（ａ）で得られた上清を高分子画分と低分子画分に分画する工程。
この分画は、工程（ａ）で得られた上清に極性溶剤を添加して析出する凝集物と新たな上清に分画する工程（ｂ−１）、もしくは、上清を限外濾過膜にて処理し、濃縮液と透過液に分画する工程（ｂ−２）、又はその組み合わせにより行うことができる。

先ず工程（ｂ−１）に関して説明する。
工程（ａ）で得られた上清に極性溶剤を添加して析出する凝集物と上清とに分画する。この凝集物は大豆β−アミラーゼ濃縮物として有用であり、新たに生じた上清はオリゴ糖の原料として供することができる。この新たに生じた上清は、好ましくは濃縮して固形分５０％以上にすることが好ましい。

ここに用いる極性溶剤は食用途にはエタノールが好ましく、エタノールを加えた上清中の水とエタノールの合計に対するエタノールの濃度を３０重量％〜８５重量％好ましくは５０重量％〜８０重量％に調整し、−５℃〜１５℃好ましくは０℃〜１０℃の範囲に置くことにより行われるのがよい。
上記エタノール濃度が低いとβ−アミラーゼは低濃度のエタノール溶液には溶解し、高いと糖質も析出する。殺菌効果の観点では上記エタノール濃度は６５重量％〜７５重量％で行うのがより適当である。
上記温度よりも高いとβ−アミラーゼ画分の活性低下がすすみやすい。

なお、工程（ａ）で得られる上清は固形分が概ね３０重量％〜５０重量％と高いため、母液の少糖類が工程（ｂ−１）で沈殿に多く分配されるのを避けるために、工程（ａ）の上清を適宜希釈してエタノール沈殿の際少糖類を上清へ溶解させ回収率を上げることも可能である。

工程（ｂ−１）で得られる新たな上清は少糖類画分を５０重量％以上に濃縮することにより、保管や輸送に備えた減容化と、腐敗防止をしておくのが好ましい。また少糖類の原料として流動性がありかつ腐敗の極めて少ない濃度範囲が好ましく、通常５０重量％〜８５重量％、好ましくは５５重量％〜８０重量％の固形分とすることが適当である。
この上清濃縮物から脱塩などの精製処理を行って精製少糖類とすることができる。

次に本発明の工程（ｂ−２）に関して説明する。
工程（ａ）で得られた上清を、限外濾過膜を用いて濃縮液と透過液に分画する。
この濃縮液は大豆β−アミラーゼ濃縮物として有用であり、透過液は大豆少糖類の原料として供することができる。

ここで行う限外濾過は分画分子量５，０００〜２５０，０００、好ましくは分画分子量１０，０００〜１００，０００の範囲の限外濾過膜を使用することが好ましい。
工程（ａ）で得られた上清は限外濾過工程へ希釈せずに用いることができるが、濃縮を進めて行くと濃縮液の固形分が高まりフラックス（透過流束）が低下してくるため、濃縮液の固形分を５０重量％以下、好ましくは４５重量％以下に維持するため適宜加水して限外濾過を行なうダイアフィルトレーション方式を採用できる。
限外濾過膜へ通液する溶液の温度が高い程フラックスは高くなるがβ−アミラーゼが失活しない程度の高温である６５℃、好ましくは５５℃以下で行うのが望ましく、このときのｐＨもβ−アミラーゼが安定なｐＨ４．０〜ｐＨ７．０、好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ６．０の範囲で行うのが望ましく、β−アミラーゼはｐＨ６．０以上でも安定であるがｐＨ６．０以上では酸性側で溶解しているフィチン酸の不溶化に伴う澱が発生するため好ましくない。

工程（ｂ−２）で得られる透過液は少糖類を５０重量％以上含有しているが灰分を２０重量％以上含むため脱塩を施し食品素材として提供することができる。

他方、工程（ｂ−２）で得られる透過液の少糖類画分を５０重量％以上に濃縮することにより、保管や輸送に備えた減容化と腐敗防止しておくのが好ましい。
例えば、この透過液は大豆少糖類の原料として流動性がありかつ腐敗の極めて少ない濃度範囲が好ましく、通常５０重量％〜８５重量％、好ましくは５５重量％〜８０重量％の固形分とすることが適当である。
この透過液濃縮物から脱塩などの精製処理を行って精製少糖類とすることができる。

以上の工程により大豆ホエーから効率よく大豆トリプシンインヒビター、βアミラーゼ及び大豆オリゴ糖を一連の工程で分離することができる。

以下に実施例を示し本発明の実施態様を説明する。

〔実施例１〕
（ａ）工程：
分離大豆蛋白製造工程で得られた大豆ホエー７０ｋｇ（固形分２．９重量％、ｐＨ４．６、総トリプシンインヒビター活性３５７，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性９，１２０，０００ｕｎｉｔ、粗蛋白質含有量２０．１ｄｒｙ％、灰分１９．７ｄｒｙ％、糖質６０．２ｄｒｙ％）を大川原製作所製エバポール（ＣＥＰ−Ｌ型）にて大豆ホエーの蒸発温度５０℃（加熱温度８０℃）の条件で減圧濃縮して固形分４１．３重量％、総トリプシンインヒビター活性３３３，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性８，５３０，０００ｕｎｉｔの濃縮ホエーを４，６００ｇ（付着等で約３００ｇロス）得た。
濃縮ホエーを１５℃に冷却してリン酸によりｐＨ４．０に調整して３時間静置した後遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）を行い上清と沈殿に分けた。
分離した上清（（ａ）工程上清）は４，２９７ｇ得られ固形分は４０．０重量％、総トリプシンンインヒビター活性４０，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性は８，２００，０００ｕｎｉｔとなり、沈殿（（ａ）工程沈殿）は３２４ｇ得られ、固形分は５５．０重量％、総トリプシンインヒビター活性３０５，０００ｕｎｉｔ、総βアミラーゼ活性７００，０００ｕｎｉｔであった。
従って両酵素活性の分配率は、トリプシンインヒビターは上清に１１．６％、沈殿に８８．４％、β−アミラーゼは上清に９２．１％、沈殿に７．９％の割合であった。

（ｂ−１）工程：
（ａ）工程上清４，２００ｇを８℃に冷却し１級エタノール（純度９９．５％）を４，０００ｇ（エタノール濃度は６１．３重量％）、プロペラ攪拌を行いながら静かに添加すると柔らかい餅のような凝集物を形成しそのまま分離することも可能であったが、１５分後に遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）して上清と沈殿に分けた。
分離した沈殿（（ｂ−１）工程沈殿）は２，０２８ｇ得られ、固形分５５．２重量％、総β−アミラーゼ活性は７，９７０，０００ｕｎｉｔ、総トリプシンインヒビター活性は９，８００ｕｎｉｔであった。
上清はロータリーエバポレーターで単蒸留（加熱温度６５℃）を行い、エタノールの除去を行い固形分２９．８重量％の溶液（（ｂ−１）工程上清）を２，５３０ｇ得た。

（ｂ−１）工程沈殿は３倍量程度の水を加えホモミキサー（３，０００ｒｐｍ）で攪拌溶解させるとほぼ完全に溶解するため、本沈殿を原料にβ−アミラーゼの高度精製が可能である。
（ｂ−１）工程上清２，５００ｇをさらに薄膜式フラッシュエバポレーター（東京理科製ＭＦ−１０Ａ型）にて蒸発温度６０℃、加熱温度９０℃で減圧濃縮し固形分６０．１重量％の濃縮物を１，１２０ｇ得た。
この濃縮物は固形分重量あたり糖質を７６．３重量％含み、その内の３２．０％が３糖類以上の少糖類であった。

〔実施例２〕
実施例１と同様の大豆ホエーを用い、同様の方法で減圧濃縮して固形分重量５１．５％まで濃縮した濃縮ホエー３００ｇ（総トリプシンインヒビター活性２６，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性６９８，０００ｕｎｉｔ）を１５℃に冷却しｐＨ４．０に調整し、３時間静置した後遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）により上清と沈殿に分けた。

分離した上清は２７１ｇ得られ固形分５０．９重量％、総トリプシンインヒビター活性１５，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性６１１，０００ｕｎｉｔとなり、沈殿は３４ｇ得られ固形分４８．８重量％、総トリプシンインヒビター活性１３，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性１０１，０００ｕｎｉｔであった。
固形分５１．５重量％まで濃縮するとトリプシンインヒビターの選択的な沈殿の程度が実施例１と比べ劣った。

〔実施例３〕
実施例１と同様の大豆ホエーを用い、同様の方法で減圧濃縮して、固形分２８．７重量％まで濃縮した濃縮ホエー３００ｇ（総トリプシンインヒビター活性１５，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性３６１，０００ｕｎｉｔ）を１５℃に冷却しｐＨ４．０に調整し、３時間静置した後遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）により上清と沈殿に分けた。
分離した上清は２８６ｇ得られ固形分は重量２７．９％、総トリプシンインヒビター活性は７，３００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性は３２０，０００ｕｎｉｔとなり、沈殿は１８ｇ得られ固形分３５．２重量％、総トリプシンインヒビター活性８，１００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ活性５４，０００ｕｎｉｔであった。

固形分２８．７重量％の濃度ではトリプシンインヒビターの沈殿の程度は実施例１と比べ不十分であった。

〔実施例４〕
実施例１と同様の方法で（ａ）工程を実施し、固形分４２．３重量％の（ａ）工程上清を３００ｇ（総β−アミラーゼ活性６２５，０００ｕｎｉｔ）に室温（２５℃）でエタノール２７０ｇを攪拌し静かに添加（アルコール濃度６０．６％）した後遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）により上清と沈殿に分けた。沈殿は１４５ｇ得られ、固形分は５６．４％、総β−アミラーゼ活性は３１３，０００ｕｎｉｔであった。
実施例１の（ｂ−１）工程沈殿の（ａ）工程上清からの固形物収率が６６．６％であったのに比べ実施例４の固形物収率は６４．４％とほぼ同等であった。
しかし、実施例１のβ−アミラーゼ活性の回収率は９７％とほぼ全量回収できたのに対して実施例４では５０％となり、温度による失活があったと考えられる。

〔応用例１〕
実施例１と同様に調製した（ａ）工程沈殿１００ｇ（固形分５６．１％、総トリプシンインヒビター活性９５，０００ｕｎｉｔ）へ水５００ｇを加え、ホモミキサー（３，０００ｒｐｍ×１５分）にて攪拌溶解させた後、遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）にて上清と沈殿に分けた結果、上清は５８０ｇ（固形分７．９％、総トリプシンインヒビター活性９３，０００ｕｎｉｔ）得られ、沈殿は２０ｇ（固形分５１．５％、総トリプシンインヒビター活性３，５００ｕｎｉｔ）得られた。
本結果より、（ａ）工程で凝集沈殿したトリプシンインヒビターは加水することで再溶解するため、（ａ）工程沈殿からトリプシンインヒビターの高度精製が可能である。

〔実施例５〕
（ａ）工程：
大豆ホエー２００ｋｇ（乾物固形分３．０重量％、ｐＨ４．６、総トリプシンインヒビター力価９６０，０００ｕｎｉｔ、総β−アミラーゼ力価２２，４００，０００ｕｎｉｔ、粗たん白含有量２０．３ｄｒｙ％、灰分２０．１ｄｒｙ％、糖質５９．６ｄｒｙ％）を大川原製作所製エバポール（ＣＥＰ−Ｌ型）にて大豆ホエーの蒸発温度５０℃、加熱温度８０℃の条件で減圧濃縮して乾物固形分４２．２重量％、総トリプシンインヒビター力価９３０，０００ｕｎｉｔ（６６ｕｎｉｔ／ｇ）、総β−アミラーゼ力価２２，０１０，０００ｕｎｉｔ（１５７２ｕｎｉｔ／ｇ）の濃縮ホエーを１４，０００ｇ（付着等で約２００ｇロス）得た。
濃縮ホエーを１５℃に冷却してリン酸によりｐＨ４．０に調整し１０℃にて３時間静置した後遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）を行い上清と沈殿に分けた。
分離した上清（（ａ）工程上清）は１２，８５０ｇ得られ乾物固形分は重量４１．３％、総トリプシンンインヒビター力価１１０，５００ｕｎｉｔ（８．６ｕｎｉｔ／ｇ）、総β−アミラーゼ活性は２０，５００，０００ｕｎｉｔ（１，５９５ｕｎｉｔ／ｇ）となり、沈殿（（ａ）工程沈殿）は１，１５０ｇ得られ、乾物固形分は５２．３重量％、総トリプシンインヒビター活性８２０，０００ｕｎｉｔ（７１３ｕｎｉｔ／ｇ）、総βアミラーゼ力価１，５３０，０００ｕｎｉｔ（１３３０ｕｎｉｔ／ｇ）であった。
従って両酵素活性の分配率は、トリプシンインヒビターは上清に１１．９％、沈殿に８８．１％、β−アミラーゼは上清に９３．１％、沈殿に６．９％の割合であった。

（ａ）工程沈殿の再溶解：
（ａ）工程沈殿１，０００ｇへ水２，０００ｇを加え沈殿させたｐＨ４．０を維持しながらホモミキサーを用いて（４，０００ｒｐｍ×１５分）間攪拌し溶解させた後遠心分離（５，０００Ｇ×１０分）して上清と沈殿に分けた。
上清は２，７６７ｇ得られ固形分１４．２％、総トリプシンインヒビター力価５９５，０００ｕｎｉｔ（２１５ｕｎｉｔ／ｇ）で、沈殿は２３３ｇ得られ固形分５５．８％総トリプシンインヒビター力価２２１，０００ｕｎｉｔ（９４８ｕｎｉｔ／ｇ）となった。
上清と沈殿のたん白をＳＤＳ電気泳動で分析した。

（ａ）工程上清、（ａ）工程沈殿、レクチン、（ａ）工程沈殿再溶解沈殿、（ａ）工程沈殿再溶解上清のたん白をＳＤＳ電気泳動パターンにより図１に示す。
図１より、分子量４２ｋＤａ以下のたん白の挙動を示しているが、レーン(1)にはトリプシンインヒビターがほとんど存在せず（ＢＢＩ型が若干残存する）レーン(2)へ分配されている。
レーン(2)を加水再溶解したレーン(3)の沈殿側にはＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターが、レーン(4)の上清側にはＢＢＩ型トリプシンインヒビターがそれぞれ分配された。
以上のように（ａ）工程沈殿から溶解性の違いによりＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターとＢＢＩ型トリプシンインヒビターが粗分画できることが分かった。

（ｂ−２）工程：
（ａ）工程上清の濃度を４０Ｂｒｉｘ（固形分は約３８％、β−アミラーゼ力価１，４７０Ｕ／ｇ）に加水して調整、ダイセンメンブラン（株）製限外濾過膜（分画分子量３０，０００、膜面積１．４ｍ２、中空糸モジュール）を用い、濃縮側の濃度を４０Ｂｒｉｘに維持するため適宜加水を行いながら流量１ｍ３／ｈｒ、背圧３ｋｇ／ｃｍ２、液温４５℃、ｐＨ４．５の条件下でβ−アミラーゼ力価が１０倍程度濃縮されるまで運転を行った結果を表１に示す。

（表１）

（ａ）工程上清を４０Ｂｒｉｘに調整し１２．８ｋｇを処理した。
ＵＦ膜濃縮液の濃度を４０Ｂｒｉｘ程度に維持するため、６０分、９０分、１１０分、１２０分、にそれぞれ加水を行った。
濃縮を進めて行くと濃度が高まるにつれてフラックスが低下するが、加水し濃度を調整することでフラックスが回復するため目詰まりを起こしていないと考えられ、運転は１３０分で終了したがフラックスの著しい低下が無いことより、更なる濃縮が可能である。
平均フラックスは４．１ｋｇ／ｍ２／ｈｒで、得られた濃縮液は乾物固形分３８．０％、β−アミラーゼ力価１３，５００Ｕ／ｇ（乾物換算は３５，５００Ｕ／ｇ）であった。また、ＵＦ膜透過液の組成を表２に示す。

（表２）

また、高速液体クロマトグラフ（検出器／日立製作所製Ｌ−６２００、ポンプ／Ｌ３３５０、カラム／Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＣ−１０１１）にて移動相に水を用いて糖質の分析を行った結果、乾物固形分中にはオリゴ糖（ラフィノース＋スタキオース）２７．８％、ピ二トール７．３％、ｃｈｉｒｏ−イノシトール１．０％、ｍｙｏ−イノシトール２．６％、等が含まれた大豆少糖類濃縮物であった。

〔実施例６〕
ＵＦ膜透過液を加水し乾物固形分２０％、（灰分４．５％）に調整して電気透析装置（旭化成製マイクロ・アシライザーＳ３、カートリッジ／ＡＣ−２２０−５５０）にて脱塩を行った結果、１．０ｍＳ／ｃｍ（灰分０．２％、乾物固形分１６．５％）程度まで電気伝導度を低下させると風味良好な大豆少糖類濃縮物となった。

〔実施例７〕（ＵＦ膜（限外濾過膜）濃縮とエタノール沈殿を組み合わせた実施例）
（ａ）工程上清の濃度を４０Ｂｒｉｘ（固形分は約３８％、β−アミラーゼ力価１，４７０Ｕ／ｇ）に加水して調整、ダイゼンメンブラン（株）製限外濾過膜（分画分子量３０，０００、膜面積１．４ｍ２、中空糸モジュール）を用い、濃縮側の濃度を４０Ｂｒｉｘに維持するため適宜加水を行いながら流量１ｍ３／ｈｒ、背圧３ｋｇ／ｃｍ２、液温４５℃、ｐＨ４．５の条件下でβ−アミラーゼ力価が１０倍程度濃縮されるまで運転を行い得られた、乾物固形分３８．０％、β−アミラーゼ力価１３，５００Ｕ／ｇ（乾物換算は３５，５００Ｕ／ｇ）の濃縮液１００ｇを液温８℃に調整、エタノールも８℃に調整し１５０ｇを濃縮液に添加、１０分静置後遠心分離により沈殿を得た。
沈殿は乾物固形分５９．２％、β−アミラーゼ力価２３，４００Ｕ／ｇ（乾物換算は３９，５００Ｕ／ｇ）となりβ−アミラーゼが更に濃縮された。
また、エタノール沈殿上清にβ−アミラーゼ活性は無かった。

〔実施例８〕
実施例１と同様な方法で大豆ホエーを減圧濃縮して固形分４０．６重量％まで濃縮した濃縮ホエー４５０ｇ（総トリプシンインヒビター力価３０，５００ｕｎｉｔ）を９個の１００ｍｌビーカーへ５０ｇ（総トリプシンインヒビター力価３，３００ｕｎｉｔ）ずつ分注し１５℃に冷却後、夫々をｐＨ１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５に塩酸或いは水酸化ナトリウムで調整し８時間静置した後遠心分離（１，５００Ｇ×１０分）により上清と沈殿に分け上清の総トリプシンインヒビター活性を測定した。
夫々の上清の総トリプシンインヒビター力価はｐＨ１．５／２，５００ｕｎｉｔ、ｐＨ２．０／１，６５０ｕｎｉｔ、ｐＨ２．５／１，３３０ｕｎｉｔ、ｐＨ３．０／８２０ｕｎｉｔ、ｐＨ３．５／５４０ｕｎｉｔ、ｐＨ４．０／３５０ｕｎｉｔ、ｐＨ４．５／９８０ｕｎｉｔ、ｐＨ５．０／１，４８０ｕｎｉｔ、ｐＨ５．５／２，１２０ｕｎｉｔとなりｐＨ３．０〜ｐＨ４．５の範囲で総トリプシンインヒビター力価の７割以上が沈殿側へ分配されたことになる。

〔実施例９〕
実施例１と同様な方法で調製した凝集沈殿（トリプシンインヒビター画分）５０ｇを水酸化ナトリウム或いは塩酸にてｐＨ４．０、ｐＨ４．４、ｐＨ４．８、ｐＨ５．２、ｐＨ５．６、ｐＨ６．０の夫々のｐＨを維持しながら１５０ｇの水を加えホモミキサー（４０００ｒｐｍ×２０分・２０℃）にて攪拌し再溶解を促した。
攪拌再溶解後、日立工機製高速遠心分離機にて５，０００Ｇ×２０分で遠心分離した上清のたん白をＳＤＳ−電気泳動パターン（トリプシンインヒビターの分画）を図２に示す。
図２によるとレーン(4)のｐＨ４．４ではＫＳＴＩが上清に分配されないが、レーン(5)のｐＨ４．８及びそれ以上のｐＨでは上清にＫＳＴＩが混入しＢＢＩとＫＳＴＩに分画できない。
また、ＫＳＴＩとＢＢＩの分画ｐＨ下限ではｐＨ４．０、ｐＨ３．０、ｐＨ２．０、ｐＨ１．０で検討し、図は示していないがｐＨ３．０ではＫＳＴＩは上清に分配されないが、ｐＨ２．０以下では上清にＫＳＴＩが混入した。

本発明の製造法を利用すれば大豆ホエーから効率良く大豆トリプシンインヒビター、大豆β−アミラーゼ、及び大豆少糖類を一連の工程で分離することができるものであり、大豆ホエーを総合的に利用することが可能になったものである。

（ａ）工程上清、（ａ）工程沈殿、（ａ）工程沈殿再溶解沈殿、（ａ）工程沈殿再溶解上清のたん白のＳＤＳ電気泳動パターンである。 トリプシンインヒビター画分を各々のｐＨにて再溶解させた上清のたん白のＳＤＳ電気泳動パターンである。

符号の説明

［図１］
(1) マーカー
(2)（ａ）工程の上清
(3)（ａ）工程の沈殿
(4)（ａ）工程の沈殿再溶解沈殿
(5)（ａ）工程の沈殿再溶解上清
［図２］
(1) マーカー
(2) 全沈殿
(3) ｐＨ４．０
(4) ｐＨ４．４
(5) ｐＨ４．８
(6) ｐＨ５．２
(7) ｐＨ５．６
(8) ｐＨ６．０

Claims (12)

1. 次の工程を含むことを特徴とする大豆ホエー分画物の製造法。
   （ａ）大豆ホエーを濃縮し、酸性条件下で析出する凝集沈殿物を回収する工程。
   （ｂ）得られた上清を高分子画分と低分子画分に分画する工程。
2. 工程（ａ）で回収する凝集沈殿物が大豆トリプシンインヒビター濃縮物、工程（ｂ）で得られる高分子画分が大豆β−アミラーゼ濃縮物であり、低分子画分が大豆少糖類である請求項１の製造法。
3. 工程（ａ）の大豆ホエーの濃縮を、ｐＨ３．５〜８．５で行い、固形分が３０重量％〜５０重量％の範囲まで濃縮する請求項１の製造法。
4. 工程（ａ）の大豆ホエーの濃縮を、品温２０℃−８０℃で行う請求項１の製造法。
5. 工程（ａ）の凝集沈殿物の析出する工程をｐＨ１．７〜５．２で行う請求項１の製造法。
6. 工程（ａ）で得られる沈殿物へ加水しｐＨ２．０〜４．８の範囲で部分的再溶解を行い、これを固液分画する請求項１の製造法。
7. 固液分画で得られる液体部がＢＢＩ型トリプシンインヒビター濃縮物であり、固体部物がＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター濃縮物である請求項６の製造法。
8. 工程（ｂ）が、得られた上清に極性溶剤を添加し、新たな上清と析出する沈殿に分画する分画工程（ｂ−１）、若しくは得られた上清を限外濾過膜にて処理し、濃縮液と透過液に分画する工程（ｂ−２）、又は、その組み合わせたものである請求項１の製造法。
9. 工程（ｂ−１）で、極性溶剤がエタノールであり、極性溶剤を加えた上清中の水とエタノールの合計に対するエタノール濃度が３０重量％〜８５重量％、且つ温度が−５℃〜１５℃の範囲で実施する請求項８の製造法。
10. 工程（ｂ−２）において限外濾過膜の分画分子量が５，０００〜２５０，０００の範囲である請求項８の製造法。
11. 工程（ｂ−２）を、温度が６５℃以下、ｐＨが４．０〜７．０、上清の固形分が５０重量％以下の範囲内で行う請求項８の製造法。
12. 工程（ｂ−１）で得られる新たな上清、或は工程（ｂ−２）で得られる透過液を固形分５０重量％〜８５重量％に濃縮する請求項８の製造法。