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BRPI0620460A2 - composição imunogênica para bebês, vacina, processo para produzir a vacina, uso da composição ou vacina imunogênica, e, método para evitar que um hospedeiro humano idoso tenha uma doença pneumocócica causada por infecção por sorotipo 22f de streptococcus pneumoniae - Google Patents

composição imunogênica para bebês, vacina, processo para produzir a vacina, uso da composição ou vacina imunogênica, e, método para evitar que um hospedeiro humano idoso tenha uma doença pneumocócica causada por infecção por sorotipo 22f de streptococcus pneumoniae Download PDF

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BRPI0620460A2
BRPI0620460A2 BRPI0620460-0A BRPI0620460A BRPI0620460A2 BR PI0620460 A2 BRPI0620460 A2 BR PI0620460A2 BR PI0620460 A BRPI0620460 A BR PI0620460A BR PI0620460 A2 BRPI0620460 A2 BR PI0620460A2
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BR
Brazil
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immunogenic composition
composition according
saccharide
vaccine
protein
Prior art date
Application number
BRPI0620460-0A
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English (en)
Inventor
Ralph Leon Biemans
Nathalie Marie-Josephe Garcon
Philippe Vincent Hermand
Jan Poolman
Mechelen Marcelle Paulette Van
Original Assignee
Glaxosmithkline Biolog Sa
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Publication date
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Priority claimed from GB0620816A external-priority patent/GB0620816D0/en
Priority claimed from PCT/GB2006/004634 external-priority patent/WO2007068907A2/en
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Publication of BRPI0620460B1 publication Critical patent/BRPI0620460B1/pt
Publication of BRPI0620460B8 publication Critical patent/BRPI0620460B8/pt

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Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA PARA BEBêS, VACINA, PROCESSO PARA PRODUZIR A VACINA, USO DA COMPOSIçãO OU VACINA IMUNOGêNICA, E, MéTODO PARA EVITAR QUE UM HOSPEDEIRO HUMANO IDOSO TENHA UMA DOENçA PNEUMOCóCICA CAUSADA POR INFECçãO POR SOROTIPO 22F DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. A presente invenção é do campo de vacinas de conjugado de sacarídeo capsular pneumocócico. Especificamente, uma composição imunogênica para bebês é provida compreendendo uma vacina de Streptococcus pneumoniae multivalente, compreendendo 2 ou mais conjugados de sacarídeo capsular de dois diferentes sorotipos, em que a composição compreende um conjugado de sacarídeo do sorotipo 22f. Tal vacina pode ser usada em populações infantis, para reduzir a incidência de doença pneumocócica em idosos, tais como exacerbações de COPD e/ou IPD.

Description

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA PARA BEBÊS, VACINA, PROCESSO PARA PRODUZIR A VACINA, USO DA COMPOSIÇÃO OU VACINA IMUNOGÊNICA, E, MÉTODO PARA EVITAR QUE UM HOSPEDEIRO HUMANO IDOSO TENHA UMA DOENÇA PNEUMOCÓCICA CAUSADA POR INFECÇÃO POR SOROTIPO 22F DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a uma vacina de Streptococcus pneumoniae aperfeiçoada.
Fundamentos da Invenção
As crianças menores do que 2 anos de idade não montam uma resposta imune para a maioria das vacinas de polissacarídeos, de modo que tem sido necessário tornar os polissacarídeos imunogênicos por conjugação química com um veículo de proteína. O acoplamento do polissacarídeo, um antígeno independente-T, com uma proteína, um antígeno dependente-T, confere ao polissacarídeo as propriedades de dependência T, incluindo troca de isotipo, maturação de afinidade e indução de memória.
Entretanto, pode haver problemas com a administração repetida de conjugados de polissacarídeo-proteína, ou a combinação de conjugados de polissacarídeo-proteína, para formar vacinas multivalentes. Por exemplo, foi relatado que uma vacina de polissacarídeo de Haemophilus influenzae tipo b, empregando-se toxóide do tétano (TT) como o veículo de proteína, foi testada em uma faixa de dosagem com simultânea imunização com TT (livre) e uma vacina de conjugado de polissacarídeo-TT pneumocócica, em seguida a um programa infantil padrão. Quando a dosagem da vacina pneumocócica era aumentada, a resposta imune à parte de polissacarídeo PRP da vacina de conjugado Hib era diminuída, indicando interferência imune do polissacarídeo, possivelmente via o uso da mesma proteína veículo (Dagan et al., Infec Immun. (1998); 66: 2093-2098. O efeito da dosagem de proteína-veículo na resposta humoral à própria proteína também provou ser multifacetada. Em bebês humanos foi informado que aumentando-se a dosagem de um conjugado toxóide do tétano tetravalente resultou em uma resposta diminuída ao veículo do tétano (Dagan et ai. supra). Análise clássica destes efeitos de vacinas de combinação foram descritos como supressão epitópica induzida por veículo, que não é totalmente entendida, porém acredita-se resultar de uma quantidade em excesso de proteína veículo (Fattom, Vaccine 1.7: 126 (1999)). Isto parece resultar em competição para as células-Th pelas células-B para a proteína veículo e células-B para o polissacarídeo. Se as células-B para a proteína veículo predominarem, não há bastante células-Th disponíveis para prover a necessária ajuda para as células-B específicas para o polissacarídeo. Entretanto, os efeitos imunológicos observados têm sido inconsistentes, com a quantidade total de proteína veículo em alguns exemplos aumentando a resposta imune e, em outros casos, diminuindo a resposta imune.
Em conseqüência permanecem dificuldades técnicas na combinação de conjugados de múltiplos polissacarídeos em uma única formulação de vacina eficaz.
O Streptococcus pneumoniae é uma bactéria gram-positiva, responsável por considerável morbidez e mortalidade (particularmente no jovem e no idoso), provocando doenças invasivas tais como pneumonia, bacteremia e meningite e doenças associadas com a colonização, tais como Otite média aguda. A taxa de pneumonia pneumocócica nos US, para pessoas acima de 60 anos de idade, é estimada ser de 3 a 8 por 100.000. Em 20% dos casos isto resulta em bacteremia e outras manifestações tais como meningite, com uma taxa de mortalidade próxima de 30%, mesmo com tratamento antibiótico.
O pneumococo é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado, que confere especificidade de sorotipo. Há 90 sorotipos conhecidos de penumococos e a cápsula é o principal determinante de virulência para os penumococos, visto que a cápsula não somente protege a superfície interna das bactérias do complemento, mas também é ela própria fracamente imunogênica. Os polissacarídeos são antígenos dependentes-T e não podem ser processados ou apresentados em moléculas MHC para interagir com as células-T. Eles podem, entretanto, estimular o sistema imune através de um mecanismo alternativo, que envolve reticulação dos receptores de superfície nas células B.
Foi mostrado em diversos experimentos que a proteção contra doença de penumococos invasivos é correlacionada mais fortemente com anticorpo específico para a cápsula e a proteção é específica de sorotipo.
O Streptococcus pneumoniae é a causa mais comum de doença bacteriana invasiva e da Otite Média em bebês e crianças jovens. Igualmente, o idoso monta fracas respostas a vacinas pneumocócicas [Roghmann et al, (1987), J Gerontol. 42:265-270], em conseqüência a incidência aumentada de pneumonia bacteriana nesta população [Verghese e Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
As maiores síndromes clínicas causadas por S. pneumoniae são largamente reconhecidas e examinadas em todos livros didáticos médicos padrão (Fedson DS, Muscher DM In: Plotkin SA, Orenstein WA, editores. Vaccines 4a. edição. PhiladelphiaWB Saunders Co, 2004a 529 - 588). Por exemplo, a doença pneumocócica invasiva (IPD) é definida como qualquer infecção em que Streptococcus pneumoniae é isolado do sangue ou outro sítio normalmente estéril (Musher DM Streptococcus pneumoniae. Em Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds) Principies e Practice of Infectious diseases (5a. ed). New York, Churchill Livingstone, 2001, pp. 2128 - 2147). A doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é reconhecida como abrangendo diversas condições (obstrução do fluxo aéreo, bronquite crônica, bronquilite ou pequena doença das vias aéreas e enfisema) que com freqüência coexistem. Os pacientes sofrendo exacerbações de sua condição, que são usualmente associadas com falta de ar aumentada e, com freqüência, têm aumentada tosse, que pode ser produtora de muco ou catarro purulento (Wilson, Eur Respir J 2001 17:995-1007). A COPD é definida fisiologicamente pela presença de obstrução das vias aéreas irreversível ou parcialmente reversível, em pacientes com bronquite crônica e/ou enfisema (Standards for the diagnosis e care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov; 152 (5 Pt 2):S77-121). As exacerbações da COPD são com freqüência causadas por infecção bacteriana (p. ex., pneumocócica) (Sethi S, Murphy TF. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000: a state-of-the-art review. Clin Microbiol Rev. 2001 Apr; 14(2):336 - 63).
E assim um objetivo da presente invenção desenvolver uma formulação aperfeiçoada de uma vacina conjugada de polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae de múltiplos sorotipos.
Breve descrição das figuras
Figura 1 Gráfico de barras mostrando imunogenicidade de conjugado 11 valente em macacos Rhesus idosos. As barras mais claras representam GMC após duas inoculações com conjugado 11 valente em adjuvante de fosfato de alumínio. As barras mais escuras representam GMC após duas inoculações com conjugado 11 valente em adjuvante C.
Figura 2 Gráfico de barras mostrando as células B da memória para PS3 após inoculação com o conjugado 11 valente em adjuvante C ou adjuvante de fosfato de alumínio.
Figura 3 Gráfico de barras mostrando imunogenicidade anti polissacarídeo 19F em camundongos Balb/C para os polissacarídeos simples 4-valente e os conjugados dPly 4-valente.
Figura 4 Gráfico de barras mostrando imunogenicidade de polissacarídeo 22F para os polissacarídeos simples 4-valente e os conjugados PhtD 4-valente.
Figura 5 Gráfico de barras mostrando resposta IgG anti-22F em camundongos Balb/c.
Figura 6 Gráfico de barras mostrando títulos de opsono- fagocitose anti-22F em camundongos Balb/c.
Figura 7 Gráfico de barras comparando respostas IgG induzidas em camundongos C57B1 jovens após imunização com vacina conjugada 13 Valente, formulada em diferentes adjuvantes.
Figura 8 Gráfico de barras mostrando a eficácia protetora de diferentes combinações de vacina em um modelo de pneumonia de macaco.
Figura 9 Gráfico de barras mostrando resposta igG anti PhtD em camundongos Balb/c após imunização com conjugados 22F-PhtD ou 22F- AH-PhtD.
Figura 10 Proteção contra provocação pneumocócica tipo 4 em camundongos, após imunização com 22F-PhtD ou 22F-AH-PhtD.
Descrição da Invenção
A presente invenção fornece uma composição imunogênica para bebês, compreendendo uma vacina de Streptococcus pneumoniae multivalente, compreendendo 2 ou mais (p. ex., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) conjugados de sacarídeo capsular de diferentes sorotipos, em que a composição compreende um conjugado de sacarídeo 22F.
Embora a infecção da infância de pneumococo sorotipo 22F não seja muito comum, os inventores acreditam que a presença de 22F em uma vacina pneumocócica infantil será vantajosa na indução de imunidade de multidão na população, de modo que o início de séria doença em idosos, causada por este sorotipo (tal como pneumonia e/ou doença pneumocócica invasiva (IPD) e/ou exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)) possa ser evitada ou reduzida de severidade. Para fins desta invenção, "imunizar um hospedeiro humano contra exacerbações de COPD" ou "tratamento ou prevenção de exacerbações de COPD" ou "redução de severidade de exacerbações de COPD" refere-se a uma redução da incidência ou taxa de exacerbações de COPD (por exemplo, uma redução da taxa de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% ou mais) ou uma redução de severidade .de exacerbações de COPD como definido acima, por exemplo, dentro de um grupo de pacientes imunizado com as composições ou vacinas da invenção.
Assim, em uma forma de realização, um método de prevenir um hospedeiro humano idoso de ter uma doença pneumocócica causada por infecção de sorotipo 22F de Streptococcus pneumoniae (ou reduzir sua severidade) é provido compreendendo administra a um hospedeiro humano bebê (ou uma população humana infantil) uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou da vacina da invenção. Um uso da composição ou vacina imunogênica da invenção na manufatura de um medicamento para a prevenção ou redução da severidade de uma doença causada por infecção de sorotipo 22F de Streptoeoceus pneumoniae em pacientes humanos idosos, em que uma dose imunoprotetora da composição ou vacina é administrada a um humano bebê (ou população bebê).
Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende conjugados de sacarídeo capsular de Streptoeoceus pneumoniae dos sorogrupos 19A e 19F, opcionalmente em que 19A é conjugado com um primeiro toxóide bacteriano e 19F é conjugado com um segundo toxóide bacteriano.
O termo sacarídeo capsular inclui polissacarídeos e oligossacarídeos capsulares deriváveis do polissacarídeo capsular. Um oligossacarídeo contém pelo menos 4 resíduos de açúcar.
A expressão toxóide bacteriano inclui toxinas bacterianas, que são inativadas por mutação genética, por tratamento químico ou por conjugação. Os toxóides bacterianos adequados incluem toxóide do tétano, toxóide da difteria, toxóide da coqueluche, citolisinas ou pneumolisinas bacterianas. Foram descritas mutações da pneumolisina (Ply) que diminuem a toxicidade da pneumolisina (WO 90/06951, WO 99/03884). Similarmente, mutações genéticas de toxina da difteria, que diminuem sua toxicidade, são conhecidas (vide abaixo). Análogos geneticamente destoxificados de toxina da difteria incluem CRM197 e outros mutantes descritos em US 4.709.017, US 5.843.711, US 5.601.827 e US 5.917.017. CRM197 é uma forma não tóxica da toxina da difteria, porém é imunologicamente indistinguível da toxina da difteria. CRM197 é produzida por C. diphtheriae infectada pela fase não-toxigênica β197ίοχ- criada por mutagênese de nitrosoguanidina do carinefago b toxigênico (Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11). A proteína de CRM197 tem o mesmo peso molecular que a toxina da difteria, porém difere dela por uma única mudança básica no gene estrutural. Isto resulta em uma mudança de glicina para glutamina de aminoácido na posição 52, que torna o fragmento A incapaz de ligar-se a NAD e, portanto, não- tóxico (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied e Environmental Microbiology Sept 1983 p560-564).
Os primeiro e segundo toxóides bacterianos podem ser os mesmos ou diferentes. Onde os primeiro e segundo toxóides bacterianos forem diferentes, significa que eles têm uma diferente seqüência amino ácida.
Por exemplo, 19A e 19F podem ser conjugados com toxóide do tétano e toxóide do tétano; toxóide da difteria e toxóide da difteria; CRM197 e CRM197, pneumolisina e pneumolisina, toxóide do tétano e toxóide da difteria; toxóide do tétano e CRMl97; toxóide do tétano e pneumolisina; toxóide da difteria e toxóide do tétano; toxóide da difteria e CRM197; toxóide da difteria e pneumolisina; CRM197 e toxóide do tétano, CRM197 e toxóide da difteria; CRMl 97 e pneumolisina; Pneumolisina e toxóide do tétano; pneumolisina e toxóide da difteria; ou pneumolisina e CRM197 respectivamente. Em uma forma de realização, além do conjugado de sacarídeo de S. pneumoniae de 22F (e opcionalmente 19F e 19F), a composição imunogênica compreende ainda conjugados de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C e 23F.
Em uma forma de realização, além de conjugado de sacarídeo de S. pneumoniae de 22F (e opcionalmente 19A e 19F), a composição imunogênica compreende ainda conjugados de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C e 23F.
Em uma forma de realização, além do conjugado de sacarídeo de S. pneumoniae de 22F (e, opcionalmente, 19A e 19F), a composição imunogênica compreende ainda conjugados de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F e 23F.
Em uma forma de realização, além do conjugado de sacarídeo de S. pneumoniae de 22F (e, opcionalmente, 19A e 19F), a composição imunogênica compreende ainda conjugados sacarídeos capsulares de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F e 23F.
Em uma forma de realização, além do conjugado de sacarídeo de S. pneumoniae de 22F (e, opcionalmente, 19A e 19F), a composição imunogênica compreende ainda conjugados sacarídeos capsulares de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 22F e 23F.
Tipicamente, a vacina de Streptococcus pneumoniae da presente invenção compreenderá antígenos de sacarídeo capsular (preferivelmente conjugados), em que os sacarídeos são derivados de pelo menos dez sorotipos de S. pneumoniae. O número de sacarídeos capsulares de S. pneumoniae pode variar de 10 diferentes sorotipos (ou "V", valências) a 23 diferentes sorotipos (23V). Em uma forma de realização há 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 diferentes sorotipos. Em outra forma de realização da invenção, a vacina pode compreender sacarídeos de S. pneumoniae conjugados e sacarídeos de S. pneumoniae não conjugados. Preferivelmente, o número total de sorotipos de sacarídeo é menor do que ou igual a 23. Por exemplo, a invenção pode compreender 10 sorotipos conjugados e 13 sacarídeos não- conjugados. Em uma maneira similar, a vacina pode compreender 11, 12, 13, 14 ou 16 sacarídeos conjugados e 12, 11, 10, 9 ou 7, respectivamente, sacarídeos não-conjugados.
Em uma forma de realização a vacina pneumocócica multivalente da invenção será selecionada dos seguintes sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F, embora seja observado que um ou dois outros sorotipos poderiam ser substituídos, dependendo da idade do receptor recebendo a vacina e do local geográfico em que a vacina será administrada. Por exemplo, uma vacina 10-valente pode compreender polissacarídeos de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Uma vacina 11-valente pode também incluir sacarídeos do sorotipo 3. Uma vacina pediátrica (infantil) 12 ou 13-valente pode também incluir a formulação 10 ou 11 valente suplementada com os sorotipos 6A e 19A ou 6A e 22F ou 19A e 22F, ou 6A e 15B ou 19A e 15B ou 22F e 15B, enquanto uma vacina para idosos 13-valente pode incluir formulação 11- valente suplementada com os sorotipos 19A e 22F, 8 e 12F, ou 8 e 15B, ou 8 e 19A, ou 8 e 22F, ou 12F e 15B, ou 12F e 19A1 ou 12F e 22F, ou 15B e 19A, ou 15B e 22F. Uma vacina pediátrica 14 valente pode incluir a formulação 10 valente descrita acima, suplementada com sorotipos 3, 6A, 19A e 22F; sorotipos 6A, 8, 19A e 22F, sorotipos 6A, 12F, 19A e 22F; sorotipos 6A, 15B, 19A e 22F, sorotipos 3, 8, 19A e 22F; sorotipos 3, 12F, 19A e 22F, sorotipos 3, 15B, 19A e 22F, sorotipos 3, 6A, 8 e 22F, sorotipos 3, 6A, 12F e 22F, ou sorotipos 3, 6A, 15B e 22F.
A composição em uma forma de realização inclui sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (preferivelmente conjugados). Em uma outra forma de realização da invenção, pelo menos 11 antígenos de sacarídeo (preferivelmente conjugados) são incluídos, por exemplo, sacarídeos capsulares derivados dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma outra forma de realização da invenção, pelo menos 12 ou 13 antígenos de sacarídeo são incluídos, por exemplo, uma vacina pode compreender sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F ou sacarídeos capsulares derivados dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F, embora outros antígenos de sacarídeo, por exemplo, 23 valente (tais como sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F), são também contemplados pela invenção.
A vacina da presente invenção pode compreender proteína D (PD) de Haemophilus influenzae (vide, p. ex., EP 0594610). O Haemophilus influenzae é um organismo causativo chave da otite média e os presentes inventores mostraram que, incluindo esta proteína em uma vacina de Streptococcus pneumoniae, prover-se-á um nível de proteção contra Haemophilus influenzae relacionado com a otite média (publicação POET de referência). Em uma forma de realização, a composição de vacina compreende a proteína D. Em outro aspecto, a PD está presente como uma proteína veículo para um ou mais dos sacarídeos. Em outro aspecto, a PD poderia estar presente tanto como uma proteína veículo como uma proteína livre. A proteína D pode ser usada como uma proteína de comprimento total ou como um fragmento (W00056360). Em um outro aspecto, a proteína D está presente como uma proteína veículo para a maioria dos sacarídeos, por exemplo, 6, 7, 8, 9 ou mais dos sacarídeos podem ser conjugados com a proteína D. Neste aspecto, a proteína D pode também estar presente como proteína livre.
A vacina da presente invenção compreende um, dois ou mais diferentes tipos de proteína veículo. Cada tipo de proteína veículo pode atuar como veículo para mais do que um sacarídeo, sacarídeos estes podendo ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, sorotipos 3 e 4 podem ser conjugados com a mesma proteína veículo, com a mesma molécula da proteína veículo ou com diferentes moléculas da mesma proteína veículo. Em uma forma de realização, dois ou mais diferentes sacarídeos podem ser conjugados com a mesma proteína veículo,com a mesma molécula da proteína veículo ou com diferentes moléculas da mesma proteína veículo.
Quaisquer sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae presentes na composição imunogênica da invenção podem ser conjugados com uma proteína veículo independentemente selecionada do grupo consistindo de TT, DT, CRMl 97, fragmento C das fusões TT, PhtD, PhtDE (particularmente aquelas descritas em WO 01/98334 e WO 03/54007), pneumolisina e proteína D destoxificadas. Uma lista mais completa de proteínas veículo que podem ser usadas nos conjugados da invenção é apresentada abaixo.
A proteína veículo conjugada com um ou mais dos sacarídeos capsulares de S. pneumoniae dos conjugados presentes nas composições imunogênicas da invenção é opcionalmente um membro da família tríade de poliistidina (Pht)sua proteínas, seus fragmentos ou proteínas de fusão. As proteínas PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE podem ter uma seqüência amino ácida compartilhando 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma seqüência descrita em WO 00/37105 ou WO 00/39299 (p. ex., com seqüência amino ácida 1-838 ou 21-838 da SEQ ID NO 4 de WO 00/37105 para PhtD). Por exemplo, as proteínas de fusão são compostas de comprimento total ou fragmentos de 2, 3 ou 4 de PhtA, PhtB, PhtD, PhtE.
Exemplos de proteínas de fusão são PhWB, PhtA/D, PhWE, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E PhtD/A. PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B e PhtE/D, em que as proteínas são ligadas com a primeira mencionada no término-N (vide, por exemplo, WO 01/98334). Onde os fragmentos das proteínas Pht forem usados (separadamente ou como parte de uma proteína de fusão), cada fragmento opcionalmente contém um ou mais motivo(s) da tríade da histidina e/ou regiões espiraladas de tais polipeptídeos. Um motivo de tríade de histidina é a parte do polipeptídeo que tem a seqüência HxxHxH, em que H é histidina e x é um aminoácido que não histidina. Uma região espiralada é uma região predita pelo algoritmo "Coils" Lupus, A et al (1991 ) Science 252; 1162- 1164. Em uma forma de realização o ou cada fragmento inclui um ou mais motivo de tríade da histidina, bem como pelo menos uma região espiralada. Em uma forma de realização, o ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3, 4 ou 5 motivos de tríade da histidina (opcionalmente com a seqüência PhT nativa entre as 2 ou mais tríades, ou seqüência intra-tríade que é mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% idêntica a uma seqüência Pht intra- tríade pneumocócica nativa - p. ex., a seqüência intra-tríade mostrada na SEQ ID NO: 4 de WO 00/37105 para PhtD). Em uma forma de realização, o ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3 ou 4 regiões espiraladas. Em uma forma de realização, uma proteína Pht descrita aqui inclui a proteína de comprimento total com uma seqüência de sinal anexa, a proteína de comprimento total madura, com o peptídeo de sinal (por exemplo, 20 aminoácidos no término-N) removido, variantes da proteína Pht naturalmente ocorrentes e fragmentos imunogênicos da proteína pHt (p. ex., fragmentos como descritos acima ou polipeptídeos compreendendo pelo menos 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma seqüência amino ácida de WO00/37105 ou WOOO/39299, em que dito polipeptídeo é capaz de eliciar uma resposta imune específica para dita seqüência amino ácida de WO00/37105 ou WOOO/39299).
Em particular, o termo "PhtD", como aqui usado, inclui a proteína de comprimento total com a seqüência de sinal ligada, a proteína de comprimento total madura com o peptídeo de sinal (por exemplo 20 aminoácidos no término-N) removido, variantes naturalmente ocorrentes de PhtD e fragmentos imunogênicos de PhtD (p. ex., fragmentos como descritos acima ou polipeptídeos compreendendo pelo menos 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma seqüência amino ácida PhtD em W000/37105 ou WOOO/39299, em que dito polipeptídeo é capaz de eliciar uma resposta imune específica para dita seqüência amino ácida de PhtD de W000/37105 ou WOOO/39299 (p. ex., SEQ ID NO: 4 de WO 00/37105 para PhtD).
Se a proteína veículo for a mesma para 2 ou mais sacarídeos da composição, os sacarídeos poderiam ser conjugados com a mesma molécula do proteína veículo (moléculas veículo tendo 2 sacarídeos mais diferentes, conjugados com ela) [vide, por exemplo, WO 04/083251]. Alternativamente, cada um dos sacarídeos pode ser separadamente conjugado com diferentes moléculas da proteína veículo (cada molécula de proteína veículo somente tendo um tipo de sacarídeo conjugado com ela).
Exemplos de proteínas veículo que podem ser usados na presente invenção são DT (toxóide da difteria), TT (toxóide do tétano) ou fragmento C de TT, DT CRMl 97 (um mutante DT), outros mutantes pontuais DT, tais como CRMl76, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu- 148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para GIy e outras mutações descritas em US 4709017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações descritas em US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento descrito em US 5843711, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), incluindo ply destoxificado de algum modo. Por exemplo, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões das proteínas Pht. Por exemplo fusões PhtDE, fusões PhtBE (WO 01/98334 e WO 03/54007) (Pht A-E são descritas mais detalhadamente abaixo), OMPC (proteína de membrana externa meningocócica - usualmente extraída de sorogrupo B de N.meningitidis - EP0372501 ), PorB (DE N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenzae - vide, p. ex., EP O 594 610 B), ou seus equivalentes imunologicamente funcionais, peptídeos sintéticos (EP0378881, EP0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas da coqueluche (WO 98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores ou hormônios do crescimento (WO 91/01146), proteínas artificiais compreendendo múltiplos epítopos celulares de célula CD4+ T humanos de vários antígenos derivados de patógeno (Falugi et al (2001 ) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tais como proteína Nl9 (Baraldoi et al (2004) Infect 1mmun 72; 4884-7) proteína de superfície pneumocócica PspA (WO 02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (WO 00/61761).
Nurkka et al Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11): 1008-14 de nov. de 2004, descreveu uma vacina pneumocócica 11 valente com todos os sorotipos conjugados a PD. Entretanto, os presentes inventores mostraram que a atividade opsonofagocítica foi melhorada para anticorpos induzidos com conjugados tendo 19F conjugado com DT, em comparação com 19F conjugado com PD. Além disso, os presentes inventores mostraram que uma maior reatividade cruzada com 19A é vista com 19F conjugado com DT. E portanto um aspecto da composição da presente invenção que o sorotipo 19F é conjugado a um toxóide bacteriano, por exemplo, TT, pneumolisina, DT ou CRMl97. Em um aspecto, o sorotipo 19F é conjugado com DT. E também um aspecto da invenção que o sorotipo 19A é conjugado com um toxóide bacteriano, por exemplo, TT, pneumolisina, DT ou CRM 197. Os sorotipos de sacarídeo restantes da composição imunogênica podem todos ser conjugados com uma ou mais proteínas veículo que não são DT (isto é, somente 19F é conjugado com DT), ou podem ser divididos entre uma ou mais proteínas veículo que não são DT e o próprio DT. Em uma forma de realização, 19F é conjugado com DT ou CRM197 e todos os sorotipos remanescentes são conjugados com PD. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado com DT ou CRMl 97 e os sorotipos restantes são divididos entre PD, TT ou DT ou CRMl97. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado com DT ou CRMl97 e não mais do que um sacarídeo é conjugado com TT. Em um aspecto desta forma de realização, dito um sacarídeo é 18C ou 12F. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugada com DT ou CRM197 e não mais do que dois sacarídeos são conjugados com TT. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugada com DT ou CRMl97 e os sorotipos restantes são divididos entre PD, TT e DT ou CRM197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugada com DT ou CRM197 e os sorotipos restantes são divididos entre PD, TT e pneumolisina. Em um outra forma de realização, 19F é conjugada com DT ou CRMl97 e os sorotipos restantes são divididos entre PD, TT e CRM197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugada com DT ou CRM197 e os sorotipos restantes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e, opcionalmente, proteína de fusão PhtD ou PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugada com DT ou CRM197, 19A é conjugada com pneumolisina ou TT e os sorotipos restantes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e, opcionalmente, proteína de fusão PhtD ou PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado com DT ou CRM197, 19F é conjugado com pneumolisina ou TT, um outro sacarídeo é conjugado com TT, um outro sacarídeo é conjugado com PhtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados com PD. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado com DT ou CRM197, 19A é conjugado com pneumolisina, um outro sacarídeo é conjugado com TT, um outro sacarídeo é conjugado com pneumolisina, 2 outros sacarídeos são conjugados com pHtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados com PD.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende proteína D de Haemophilus influenzae. Dentro desta forma de realização, se PD não for uma das proteínas veículo usadas para conjugar quaisquer sacarídeos que não 19F, por exemplo, 19F é conjugado com DT, enquanto os outros sorotipos são conjugados com uma ou mais diferentes proteínas veículo, que não são PD, em seguida PD estará presente na composição de vacina como proteína livre. Se PD for uma das proteínas veículo usadas para conjugar sacarídeos que não 19F, então PD pode opcionalmente estar presente na composição de vacina como proteína livre.
O termo "sacarídeo" por todo este relatório pode indicar polissacarídeo ou oligossacarídeo e inclui ambos. Os polissacarídeos são isolados das bactérias e podem ser dimensionados em algum grau por métodos conhecidos (vide, por exemplo, EP497524 e EP497525) e, preferivelmente, por microfluidização. Os polissacarídeos podem ser dimensionados a fim de reduzir a viscosidade nas amostras de polissacarídeos e/ou para melhorar a filtrabilidade para produtos conjugados. Os oligossacarídeos têm um baixo número de unidades repetidoras (tipicamente 5 -30 unidades repetidoras) e são tipicamente polissacarídeos hidrolisados.
Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem unidades de oligossacarídeo repetidoras, que podem conter até 8 resíduos de açúcar. Para uma recapitulação das unidades de oligossacarídeos para os sorotipos de Streptoeoceus pneumoniae chave, vide JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bactéria. An. Acad. Bras. Cienc, junho de 2005, vol. 77, no.2, p. 293 - 324. ISSN 0001 - 3765. Em uma forma de realização, um antígeno de sacarídeo capsular pode ser um polissacarídeo de comprimento total, entretanto em outras pode ser uma unidade de oligossacarídeo ou uma cadeia de sacarídeo de comprimento mais curto do que nativa de unidades de oligossacarídeo repetidoras. Em uma forma de realização, todos os sacarídeos presentes na vacina são polissacarídeos. Os polissacarídeos de comprimento total podem ser "dimensionados", isto é, seu tamanho pode ser reduzido por vários métodos, tais como tratamento por hidrólise ácida, tratamento por peróxido de hidrogênio, dimensionamento por emulsiflex®, seguido por um tratamento por peróxido de hidrogênio, para gerar fragmentos de oligossacarídeo ou microfluidização.
Os inventores também observaram que o foco da arte tem sido usar oligossacarídeos para facilidade de produção de conjugado. Os inventores descobriram que, utilizando-se conjugados de polissacarídeo nativos ou ligeiramente dimensionados, uma ou mais das seguintes vantagens podem ser conseguidas: 1) um conjugado tendo alta imunogenicidade que é filtrável, 2) a relação de polissacarídeo para proteína no conjugado pode ser alterada, de modo que a relação de polissacarídeo para proteína (p/p) no conjugado pode ser aumentada (que pode ter um efeito sobre a supressão do veículo), 3) os conjugados imunogênicos tendentes a hidrólise podem ser estabilizados pelo uso de sacarídéos maiores para conjugação. O uso de polissacarídeos maiores pode resultar em mais reticulação com o veículo conjugado e pode encurtar a liberação do sacarídeo livre do conjugado. As vacinas conjugadas descritas na arte anterior tendem a despolimerizar os polissacarídeos antes da conjugação a fim de melhorar a conjugação. Os presentes inventores descobriram que as vacinas conjugadas de sacarídeo, retendo um tamanho maior de sacarídeo, podem fornecer uma boa resposta imune contra doença pneumocócica.
A composição imunogênica da invenção pode, assim, compreender um ou mais conjugados de sacarídeo, em que o tamanho médio (p. ex., peso molecular médio ponderai; Mw) de cada sacarídeo antes da conjugação é acima de 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa ou 1000 kDa. Em uma forma de realização um ou mais conjugados de sacarídeo da invenção devem ter um tamanho médio de pré-conjugação de 50 - 1600, 80 - 1400, 100 - 1000, 150 - 500 ou 200 - 400 kDa (observe-se que onde o tamanho médio for Mw, as unidades 'kDa' devem ser substituídas aqui com 'x103'). Em uma forma de realização, o conjugado pós conjugação deve ser prontamente filtrável através de um filtro de 0,2 micro, de modo que uma produção de mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% é obtida pós filtragem, em comparação com a amostra de pré-filtragem.
Para fins da invenção, "polissacarídeo nativo" refere-se a um sacarídeo que não foi submetido a um processo (p. ex., pós-purificação), cuja finalidade é reduzir o tamanho do sacarídeo. Um polissacarídeo pode tornar- se ligeiramente reduzido de tamanho durante os procedimentos normais de purificação. Tal sacarídeo é ainda nativo. Somente se o polissacarídeo tiver sido submetido a técnicas de dimensionamento não seria considerado nativo.
Para fins da invenção, "dimensionado por um fator de até x2" significa que o sacarídeo é sujeito a um processo destinado a reduzir o tamanho do sacarídeo, porém para reter um tamanho de mais do que metade do tamanho do polissacarídeo nativo. X3, x4 etc. são para ser interpretados da mesma maneira, isto é, o sacarídeo é submetido a um processo destinado a reduzir o tamanho do polissacarídeo, porém para reter um tamanho de mais do que um terço, um quarto etc. do tamanho do polissacarídeo nativo.
Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos de Streptococcus pneumoniae de pelo menos 10 sorotipos conjugados com uma proteína veículo, em que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou cada sacarídeo de Streptoeoeeus pneumoniae é polissacarídeo nativo.
Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos de Streptoeoeeus pneumoniae de pelo menos 10 sorotipos conjugados com uma proteína veículo, em que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou cada sacarídeo Streptoeoeeus pneumoniae é dimensionado por um fator de até x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 ou x10. Em uma forma de realização deste aspeto, a maior parte dos sacarídeos, por exemplo, 6, 7, 8 ou mais dos sacarídeos são dimensionados por um fator de até x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 oü χ 10.
O peso molecular ou peso molecular médio (ou tamanho) de um sacarídeo aqui refere-se ao peso molecular médio ponderai (Mw) do sacarídeo medido antes da conjugação e é medido por MALLS.
A técnica MALLS é bem conhecida na arte e é tipicamente realizada como descrito no exemplo 2. Para análise MALLS de sacarídeos pneumocócicos, duas colunas (TSKG6000 e 5000PWxi) podem ser usadas em combinação e os sacarídeos são eluídos em água. Os sacarídeos são detectados usando-se um detector de dispersão de luz (por exemplo, Wyatt Dawn DSP equipado com um leiser de argônio de 10 mW a 488 nm) e um refratômetro inferométrico (por exemplo, Wyatt Otilab DSP equipado com uma célula P100 e um filtro vermelho a 498 nm).
Em uma forma de realização, os sacarídeos de Streptococcus pneumoniae são polissacarídeos nativos ou polissacarídeos nativos que foram reduzidos de tamanho durante um processo de extração normal.
Em uma vaso de reação, os sacarídeos de Streptoeoceus pneumoniae são dimensionados por clivagem mecânica, por exemplo, por microfluidização ou sonicação. A microfluidização e sonicação têm a vantagem de diminuir o tamanho dos polissacarídeos nativos maiores suficientemente para fornecer um conjugado filtrável. O dimensionamento é em um fator de não mais do que x20, x10, x8, x6, x5, x4, x3 ou x2.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende conjugados de Streptoeoceus pneumoniae, que são produzidos de uma mistura de polissacarídeos e sacarídeos nativos que são dimensionados por um fator de não mais do que x20. Em um aspecto desta forma de realização, a maior parte dos sacarídeos, por exemplo, 6, 7, 8 ou mais dos sacarídeos são dimensionados por um fator de até x2, x3, x4, x5 ou x6.
Em uma forma de realização, o sacarídeo de Streptoeoceus pneumoniae é conjugado com a proteína veículo via um ligador, por exemplo, um ligador bifuncional. O ligador é opcionalmente heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um amino grupo reativo e um grupo ácido carboxílico reativo, 2 amino grupos reativos ou dois grupos ácido carboxílico reativos. O ligador tem, por exemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um ligador possível é ADH. Outros ligadores incluem B- propionamido (WO 00/10599), nitrifenil-estilamina (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), haletos de haloalquila (US4057685), ligações glicosídicas (US4673574, US4808700), hexano diamina e ácido 6- aminocapróico (US4459286). Em uma forma de realização, o ADH é usado como um ligador para conjugar sacarídeo do sorotipo 22F.
Os conjugados de sacarídeo presentes na composições imunogênicas da invenção podem ser preparados por qualquer técnica de acoplamento conhecida. O método de conjugação pode basear-se na ativação do sacarídeo com 1-ciano-4-dimetilamino piridínio tetrafluoroborato (CDAP) para formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode, assim, ser acoplado diretamente ou via um grupo espaçador (ligador) a um amino grupo da proteína veículo. Por exemplo, o espaçador poderia ser cistamina ou cisteamina para fornecer um polissacarídeo tiolado, que poderia ser acoplado ao veículo via uma ligação tioéter obtida após reação com uma proteína veículo ativada por maleimida (por exemplo, usando-se GMBS) ou uma proteína veículo haloacetilada (por exemplo, usando-se iodoacetimida [p. ex., etil iodoacetimida HCl] ou bromoacetato de N-succinimidila ou SIAB, ou SIA, ou SBAP). Preferivelmente, o éster de cianato (opcionalmente produzido por química CDAP) é acoplado com hexano diamina ou ADH e o sacarídeo amino-derivado é conjugado com a proteína veículo usando-se química carbodiimida (p. ex., EDAC ou EDC) via um grupo carboxila do veículo de proteína. Tais conjugados são descritos no Pedido PCT publicado WO 93/15760 Uniformed Services University e WO 95/08348 e WO 96/29094. Outras técnicas adequadas utilizam carbodiimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S- NHS5 EDC5 TSTU. Muitas são descritas no WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligador carbonila, que pode ser formado por reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18), seguido por reação com uma proteína para formar uma ligação carbamato. Isto pode envolver redução do término anomérico com um grupo hidroxila primário, proteção/desproteção opcional da reação do grupo hidroxila primário do grupo hidroxila primário com CDI, para formar um intermediário de carbamato de CDI e acoplamento do intermediário de carbamato de CDI com um amino grupo em uma proteína.
Os conjugados podem também ser preparados por métodos de aminação redutiva direta, como descrito nos US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos em EP-0-161-188, EP- 208375 e EP-0-477508.
Um outro método envolve o acoplamento de um sacarídeo ativado por brometo de cianogênio (ou CDAP) derivado com diidrazida de ácido adípico (ADH) o veículo de proteína por condensação de carbodiimida (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplo, usando-se EDAC.
Em uma forma de realização, um grupo hidroxila (preferivelmente um grupo hidroxila ativado, por exemplo, um grupo hidroxila ativado para produzir um éster de cianato [p. ex., com CDAP]) em um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxílico de uma proteína direta ou indiretamente (através de um ligador). Onde um ligador estiver presente, um grupo hidroxila de um sacarídeo é preferivelmente ligado ao grupo amino de um ligador, por exemplo, utilizando-se conjugação CDAP. Um outro grupo amino do ligador, por exemplo, ADH, pode ser conjugado com um grupo ácido carboxílico de uma proteína, por exemplo, utilizando-se química de carbodiimida, por exemplo, utilizando-se EDAC. Em uma forma de realização, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) pneumocócico(s) é/são conjugado(s) com o ligador primeiro antes do ligador ser conjugado com a proteína veículo. Alternativamente, o ligador pode ser conjugado com o veículo antes da conjugação com o sacarídeo.
Uma combinação de técnicas pode também ser usada, com alguns conjugados de sacarídeo-proteína sendo preparados por CDAP e alguns por aminação redutiva.
Em geral, os seguintes tipos de grupos químicos de um veículo de proteína podem ser usados para acoplamento / conjugação:
A) Carboxila (por exemplo, via ácido aspártico ou ácido glutâmico). Em uma forma de realização, este grupo é ligado a grupos amino de sacarídeos diretamente ou a um grupo amino de um ligador com química carbodiimida, p. ex., com EDAC.
B) Amino grupo (por exemplo, via lisina). Em uma forma de realização este grupo é ligado a grupos carboxila dos sacarídeos diretamente ou a um grupo carboxila de um ligador com química carbodiimida, p. ex., com EDAC. Em outra forma de realização, este grupo é ligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr de sacarídeos diretamente ou a tais grupos de um ligador, a sacarídeos ou ligadores tendo um grupo aldeído; a sacarídeos ou ligadores tendo um grupo éster de succinimida.
C) Sulfidrila (por exemplo, via cisteína). Em uma forma de realização, este grupo é ligado a um sacarídeo bromo ou cloro acetilado ou ligador com química maleimida. Em uma forma de realização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.
D) Grupo hidroxila (por exemplo, via tirosina). Em uma forma de realização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.
E) Grupo imidazolila (por exemplo, via histidina). Em uma forma de realização, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.
F) Grupo guanidila (por exemplo, via arginina).
G) Grupo indolila (por exemplo, via triptofano).
Em um sacarídeo, em geral os seguintes grupos podem ser usados para um acoplamento: OH, COOH ou NH2. Os grupos aldeído podem ser gerados após diferentes tratamentos conhecidos na arte, tais como: periodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio etc. Abordagens de acoplamento direto:
Sacarídeo-OH + CMBr ou CDAP --> éster de cianato + NH2- Prot -—> conjugado
Sacarídeo-aldeído + NH2-Prot --> base Schiff+ NaCNBH3 -- > conjugado
Sacarídeo-COOH + NH2-Prot + EDAC --> conjugado
Sacarideo-NH2 + COOH-Prot + EDAC --> conjugado
Abordagens de acoplamento indireto via espaçador (ligador):
Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP - > éster de cianato + NH2- NH2 - > Sacarídeo - NH2 + COOH-Prot + EDAC -> conjugado
Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP - > éster de cianato + NH2 - SH --> Sacarídeo - SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após modificação de amino grupos da proteína por SPDP, por exemplo) —> Sacarideo-S-S-Prot
Sacarídeo-OH + CNBr ou CDAP - > éster de cianato + NH2 - SH > Sacarídeo - SH + maleimida-Prot (modificação de amino grupos) --> conjugadoSacarídeo-OH + CNBr ou CDAP - > éster de cianato + Nffi - SH - > Sacarídeo-SH + Prot-haloacetilada —> Conjugado
Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2-—NH2--> Sacarídeo —-- NH2 + EDAC + COOH-Prot --> conjugado
Sacarídeo-COOH + EDAC+ NH2-—--SH--> Sacarídeo - SH + SH-Prot (proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após modificação com amino grupos da proteína por SPDP, por exemplo) --> sacarídeo-S-S-Prot
Sacarídeo-COOH + EDAC+ NH2—SH --> Sacarídeo—SH + maleimida-Prot (modificação de amino grupos) --> conjugado
Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2 - SH --> Sacarídeo-SH + Prot-haloacetilatada —> Conjugado
Sacarídeo-Aldeído + NH2—NH2 --> Sacarídeo—NH2 + EDAC + COOH-Prot --> conjugado
Nota: em vez de EDAC acima, qualquer carbodiimida adequado pode ser usado.
Em resumo, os tipos de grupo químico veículo de proteína que podem ser geralmente usados para acoplamento com um sacarídeo são amino grupos (por exemplo, de resíduos de lisina), grupos COOH (por exemplo, de resíduos de ácido aspártico e glutâmico) e grupos SH (se acessíveis) (por exemplo, de resíduos de cisteína.
Preferivelmente, a relação de proteína veículo para sacarídeos de Streptococcuspneumoniae é entre 1: 5 e 5: 1; p. ex., entre 1: 0,5 - 4: 1, 1: 1 - 3,5: 1, 1,2: 1-3:1, 1,5: 1 - 2,5: 1; p. ex., entre 1: 2 e 2,5: 1; 1: 1 e 2: 1 (p/p). Em uma forma de realização, a maior parte dos conjugados, por exemplo, 6, 7, 8, 9 ou mais dos conjugados têm uma relação de proteína veículo para sacarídeo que é maior do que 1: 1, Por exemplo 1,1: 1, 1,2: 1, 1,3: 1, 1,4: 1, 1,5: 1 ou 1,6: 1.
Em uma forma de realização, pelo menos um sacarídeo de Streptococcus pneumoniae é conjugado com uma proteína veículo via um ligador, usando-se CDAP e EDAC. Por exemplo, 18C ou 22F podem ser conjugados com uma proteína via um ligador (por exemplo, aqueles com dois grupos hidrazino e suas terminações, tais como ADH), usando-se CDAP e EDAC como descrito acima. Quando um ligador for usado, CDAP pode ser usado para conjugar o sacarídeo com um ligador e EDAC pode então ser usado para conjugar o ligador com uma proteína ou, alternativamente, EDAC pode ser usado primeiro para conjugar o ligador à proteína, após o que CDAP pode ser usado para conjugar o ligador com o sacarídeo.
Em geral, a composição imunogênica da invenção pode compreender uma dose de cada conjugado de sacarídeo entre 0,1 e 20 μg, 1 e 10 μg ou 1 e 3 μg de sacarídeo.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção contém cada sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae em uma dose entre 0,1 e 20 μg; 0,5-10 μg; 0,5 - 5 μg ou 1 - 3 μg de sacarídeo.
Em uma forma de realização, os sacarídeos capsulares podem estar presentes em diferentes dosagens, por exemplo, alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes em uma dose de exatamente 1 μg ou alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes em uma dose de exatamente 3 μg. Em uma forma de realização, os sacarídeos dos sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes em uma dose mais elevada do que outros sacarídeos. Em um aspecto desta forma de realização, os sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes em uma dose em torno ou exatamente de 3 μg, enquanto que outros sacarídeos da composição imunogênica estão presentes em uma dose em torno ou exatamente de 1 μg.
"Em torno de" ou "aproximadamente" são definidas como dentro de 10% mais ou menos do número dado para fins da invenção.
Em uma forma de realização, pelo menos um dos sacarídeos capsulares de S. pneumoniae é diretamente conjugado com uma proteína veículo (p. ex., usando-se uma das químicas descritas acima);
Preferivelmente, o pelo menos um dos sacarídeos capsulares de S. pneumoniae é diretamente conjugado com CDAP. Em uma forma de realização, a maior parte dos sacarídeos capsulares, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais, é diretamente ligada à proteína veículo por CDAP (vide WO 95/08348 e WO 96/29094). A composição imunogênica pode compreender proteínas de Streptococcus pneumoniae, aqui denominadas proteínas de Streptococcus pneumoniae da invenção. Tais proteínas podem ser usadas como proteínas veículo ou podem estar presentes como proteínas livres, ou podem estar presentes tanto como proteínas veículo como proteínas livres. As proteínas de Streptoeoceus pneumoniae da invenção são expostas na superfície, pelo menos durante parte do ciclo de vida dos pneumococos, ou são proteínas que são secretadas ou liberadas pelos pneumococos. Preferivelmente, as proteínas da invenção são selecionadas das seguintes categorias, tais como proteínas tendo um motivo de seqüência de Sinal Tipo II de LXXC (em que X é qualquer aminoácido, p. ex., a família tríade da poliistidina (PhtX)), proteínas de ligação da colina (CbpX), proteínas tendo um motivo de seqüência de Sinal Tipo I (p. ex., Spl01), proteínas tendo um motivo LPXTG (em que X é qualquer aminoácido, p. ex., Spl28, Spl30) e toxinas (p. ex., Ply). Exemplos preferidos dentro destas categorias (ou motivos) são as seguintes proteínas, ou seus equivalentes imunologicamente funcionais.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos 1 proteína selecionada do grupo consistindo da família Tríade da Poli Histitina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados CbpX, família LytX, truncados Lytx, proteínas quiméricas trancadas trancado CbpX-LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 e Spl33. Em uma outra forma de realização, a composição imunogênica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo da família Tríade de Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação da Colina (CbpX), trancados CbpX, família LytX, trancados LytX, proteínas quiméricas de trancado CbpX-truncado LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, e Sp 128. Em mais uma forma de realização, a composição imunogênica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo consistindo da família Tríade da Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação da Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados LytX, proteínas químicas de truncado CbPx-truncado LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply) e Sp 128.
A família de pHt (Tríade Poli Histidina) compreende proteínas PhtA, PhtB5 PhtD, e PhtE. A família é caracterizada por uma seqüência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolina e diversas tríades de histidina, possivelmente envolvidos em ligação de metal ou nucleosídeo ou atividade enzimática, (3-5) regiões de espiral-enrolada, um término-N conservado e um término C heterogêneo. Está presente em todas as cepas de pneumocócicos testados. Proteínas homólogas foram também encontradas em outros Streptococos e Neisseria. Em uma forma de realização da invenção, a proteína Pht da invenção é PhtD. E entendido, entretanto, que os termos Pht A, B, D e E referem-se a proteínas tendo seqüências descritas nas citações abaixo, bem como suas variantes naturalmente ocorrentes (e produzidas pelo homem), que têm uma homologia de seqüência que é de pelo menos 90% idêntica às proteínas referenciadas. Preferivelmente, é pelo menos 95% idêntica e, muitíssimo preferivelmente, é 97% idêntica.
Com respeito às proteínas PhtX, PhtA é descrita no WO 98/18930 e é também referida Sp36. Como citado acima, é uma proteína da família tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal do tipo II de LXXC. A PhtD é descrita no WO 00/37105 e é também referida como Sp036D. Como citado acima, é também uma proteína da família tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal LXXC tipo II. A PhtB é descrita no WO 00/37105 e é também referido como Sp036B. Outro membro da família da PhtB é o Polipeptídeo de Degradação-C3, como descrito em WO 00/17370. Esta proteína também é da família tríade da poliistidina, como descrito no WO 00/17370. Esta proteína também é da família tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal LXXC tipo II. Um equivalente imunologicamente funcional preferido é a proteína Sp42 descrita no WO 98/18930. Um truncado de PhtB (aproximadamente 79 kD) é descrito no WO 99/15675, que é também considerado um membro da família PhtX. PhtE é descrita em WO 00/30299 e é referida como BVH-3. Onde qualquer proteína Pht for referida aqui, significa que os fragmentos imunogênicos ou suas fusões da proteína Pht podem ser usados. Por exemplo, uma referência a PhtX inclui fragmentos ou imunogênicos ou suas fusões de qualquer proteína Pht. Uma referência a PhtD ou PhtB é também uma referência a fusões PhtDE ou PhtBE como constatado, por exemplo, no WO 01198334.
A pneumolisina é uma toxina multifuncional com atividades de ativação citolíticas (hemolíticas) distintas e complementares (Rubins et al Am Respi. Cit Care Med, 153: 1339 - 1346 (1996)). A toxina não é secretada pelos penumococos, porém é liberada na Iise dos pneumococos sob a influência da autolisina. Seus efeitos incluem, p. ex., a estimulação da produção de citocinas inflamatórias por monócitos humanos, a inibição dos batimentos dos cílios do epitélio respiratório humano e a diminuição da atividade bactericida e migração dos neutrófilos. O efeito mais óbvio da pneumolisina é a Iise das células sangüíneas vermelhas, que envolve a ligação ao colesterol. Em razão de ser uma toxina, ela precisa ser destoxificada (isto é, não tóxica para um humano quando provida em uma dosagem adequada para proteção) antes de poder ser administrada in vivo. A expressão e clonagem da pneumolisina tipo selvagem ou nativa é conhecida na arte. Vide, por exemplo, Walker et al. (Infect Immun, 55: 1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007: 67-72 (1989) e Mitchell et al (NAR, 18: 4010 (1990)). A destoxificação de ply pode ser conduzida por meios químicos, p. ex., submetida a tratamento com formalina ou glutaraldeído ou uma combinação de ambos (WO 04081515, PCT/EP2005/010258). Tais métodos são bem conhecidos na arte para várias toxinas. Alternativamente, ply pode ser geneticamente destoxificada. Assim, a invenção engloba derivativos de proteínas pneumocócicas que podem ser, por exemplo, proteínas mutadas. O termo "mutado" é usado aqui para significar uma molécula que sofreu deleção, adição ou substituição de um ou mais amino- ácidos, empregando-se técnicas bem conhecidas para mutagênese direcionada ao sítio ou qualquer outro método convencional. Por exemplo, como descrito acima, um mutante de proteína ply pode ser alterado de modo que seja biologicamente inativo, enquanto ainda mantendo seus epítopos imunogênicos, vide, por exemplo, WO 90/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67: 981 -985 (1999)) e WO 99/03884.
Como aqui usado, entende-se que o termo "Ply" refere-se a pneumolisina mutada ou destoxificada, adequada para uso médico (isto é, não tóxica).
Com referência à família da Proteína de Ligação da Colina (CbpX), membros dessa família foram originalmente identificados como proteínas pneumocócicas que poderiam ser purificadas por cromatografia de afinidade-colina. Todas as proteínas de ligação da colina são não- covalentemente ligadas a componentes da fosforilcolina do ácido teicóico da parede celular e ácido lipoteicóico associado com membrana. Estruturalmente, elas têm diversas regiões em comum através da inteira família, embora a exata natureza das proteínas (seqüência, comprimento etc. do aminoácido) possam variar. Em geral, as proteínas de ligação da colina compreendem uma região de terminal N (N), regiões de repetição conservadas (RI e/ou R2), uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação de colina conservada (C), produzida de múltiplas repetições, que compreende aproximadamente metade da proteína. Como usado neste pedido, a expressão "família da Proteína de Ligação da Colina (CbpX)" é selecionada do grupo consistindo de Proteínas de Ligação da Colina, como identificado no WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, e CbpG. A CbpA é descrita no W097/41151, CbpD e CbpG são descritas no WOOO/29434, PspC é descrito no W097/09994, PbcA é descrito no W098/21337, SpsA é uma proteína de ligação da colina descrita no WO 98/39450. Preferivelmente, as Proteínas de Ligação da Colina são selecionadas do grupo consistindo de CbpA5 PbcA, SpsA e PspC.
Outra forma de realização preferida são os truncados CbpX5 em que "CbpX" é definida acima e "truncados" refere-se a proteínas CbpX sem 50% ou mais da região de ligação da Colina (C). Preferivelmente, tais proteínas não têm a inteira região de ligação da colina. Mais preferivelmente, tais truncados de proteína não têm (i) a região de ligação da colina e (ii) uma parte da metade do terminal-N da proteína, bem como ainda retêm pelo menos uma região repetidora (R1 ou R2). Mais preferivelmente ainda, o truncado tem 2 regiões de repetição (R1 e R2). Exemplos de tais formas de realização preferidas são NR1xR2 e R1xR2, como ilustrado no WO 99/51266 ou WO 99/51188, entretanto, outras proteínas de ligação da colina sem uma região de ligação da colina similar são também contempladas dentro do escopo desta invenção.
A família LytX são proteínas associadas com membrana, associadas com lise celular. O domínio do terminal-N compreende domínio(s) de ligação da colina, entretanto, a família LytX não tem todas as características encontradas na família CbpA observadas acima e, assim, para a presente invenção, a família LytX é considerada distinta da família CbpX. Ao contrário da família CbpX, o domínio do terminal-C contém o domínio catalítico da família da proteína LytX. A família compreende LytA, B e C. Com respeito à família LytX, LytA é descrito em Ronda et al., Eur J Biochem, 164: 621 - 624 (1987). LytB é descrito no WO 98/18930, e é também referido como Sp46, LytC é também descrito em WO 98/18930, e é também referido como Sp91. Um membro preferido daquela família é LytC.
Outra forma de realização preferida são truncados LytX, em que "LytX" é definido acima e "truncados" refere-se a proteínas LytX sem 50% ou mais da região de ligação da colina. Preferivelmente, tais proteínas não tem a inteira região de ligação da colina. Ainda outra forma de realização preferida desta invenção são proteínas quiméricas de truncado CbpX-truncado LytX (ou fusões). Preferivelmente, estas compreendem NRlxR2 (ou R1xR2) de CbpX e da parte de terminal-C (Cterm, i.e., sem os domínios de ligação da colina) de LytX (e.g., LytCCterm ou Sp91 Cterm). Mais preferivelmente CbpX é selecionada do grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. Mais preferivelmente ainda, é CbpA. Preferivelmente, LytX é LytC (também referido como Sp91). Outra forma de realização da presente invenção é um truncado de PspA ou PsaA sem o domínio de ligação da colina (C) e expresso como uma proteína de fusão com LytX. Preferivelmente, LytX é LytC.
Com respeito a PsaA e PspA, ambas são conhecidas na arte. Por exemplo, suas variantes de deleção de PsaA e transmembrana foram descritas por Berry & Paton, Infect lmmun 1996 Dec; 64(12): 5255-62. A PspA e suas variantes de deleção de transmembrana foram descritas, por exemplo, em US 5804193, WO 92/14488 e WO 99/53940.
Sp 128 e Spl30 são descritas no WO 00/76540. Spl25 é um exemplo de uma proteína de superfície pneumocócica com o motivo de LPXTG Ancorado na Parede Celular (em que X é qualquer aminoácido). Qualquer proteína dentro desta classe de proteína de superfície pneumocócica com este motivo foi constatada ser útil dentro do contexto desta invenção e é, portanto, considerada uma outra proteína da invenção. A própria Sp 125 é descrita no WO 98/18930 e é também conhecida como ZmpB - uma metaloproteinase do zinco. SplOl é descrita no WO 98/06734 (onde tem a referência # y85993). E caracterizada por uma seqüência de sinal Tipo I. Sp 133 é descrita no WO 98/06734 (onde tem a referência # y85992). É também caracterizada por uma seqüência de sinal Tipo I.
Exemplos de antígenos de proteína de Moraxelia catarrhalis preferidos, que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) são: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; ΟΜΡ21 ou seus fragmentos (WO 0018910); LbpA &/ou LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA &/ou TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect, Immun. 61: 2003-2010]; UspA1 e/ou UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EPOO/01468); lipo06 (GB 9917977,2); lipo10 (GB 9918208,1); lipo11 (GB 9918302,2); lipol8 (GB 9918038,2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); e OmpE. Exemplos de antígenos de Haemophilus influenzae não-tipificáveis ou seus fragmentos, que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média), incluem: proteína de Fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões compreendendo peptídeos delas [p. ex., LB1 (f) fusões de peptídeo; US 5843464 (OSU) ou WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA e/ou TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; e P5 (WO 94/26304).
As proteínas da invenção podem também ser beneficamente combinadas. Por combinadas pretendemos significar que a composição imunogênica compreende todas as proteínas de dentro das seguintes combinações, como proteínas veículo ou como proteínas livre ou uma mistura das duas. Por exemplo, em uma combinação de duas proteínas, como exposto a seguir, ambas as proteínas podem ser usadas como proteínas veículo ou ambas as proteínas podem estar presentes como proteínas livres, ou ambas podem estar presentes como proteína livre ou uma pode estar presente como proteína veículo e uma proteína livre, enquanto a outra está presente somente como uma proteína veículo ou somente como proteína livre, ou uma pode estar presente como uma proteína veículo e a outra como proteína livre. Onde uma combinação de três proteínas for dada, existem possibilidades similares. Combinações preferidas incluem mas não são limitadas a proteínas quiméricas ou de fusão Cterm PhtD + NRlxR2, PhtD + NRlxR2-Sp91, proteínas quimérrics ou de fusão Cterm PhtD + Ply, PhtD + Sp 128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, PhtA + NRlxR2-Sp91, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC5 RlxR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, RlxR2 + Sp 128, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA.
Preferivelmente, NRl xR2 (ou RlxR2) é de CbpA. Outras combinações incluem combinações de 3 proteínas, tais como PhtD + NRlxR2 + Ply, e PhtA + NRlxR2 + PhtD. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina destoxificada e PhtD ou PhtDE como proteínas veículo. Em uma outra forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina destoxificada e PhtD ou PhtDE como proteínas livres.
Em um aspecto independente, a presente invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo pelo menos quatro conjugados de sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, contendo sacarídeos de diferentes sorotipos de S. pneumoniae, em que pelo menos um sacarídeo é conjugado com PhtD ou sua proteína de fusão e a composição imunogênica é capaz de eliciar uma resposta imune eficaz contra PhtD.
Uma resposta imune eficaz contra PhtD ou sua proteína de fusão é medida, por exemplo, por um ensaio de proteção, tal como aquele descrito no Exemplo 15. Uma resposta imune eficaz fornece pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de sobrevivência 7 dias após provocação com uma cepa heteróloga. Dado que a cepa de provocação é heteróloga, a proteção propiciada é devida à resposta imune contra PhtD ou sua proteína de fusão.
Alternativamente, uma resposta imune eficaz contra PhtD é medida por ELISA como descrito no exemplo 14. Uma resposta imune eficaz fornece uma resposta IgG anti-PhtD de pelo menos 250, 300, 350, 400, 500, 550 ou 600 μg/ml GMC.
Por exemplo, a composição imunogênica compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sacarídeos capsulares S. pneumoniae de diferentes sorotipos conjugados com PhtD ou sua proteína de fusão. Por exemplo, os sorotipos 22F e 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ainda selecionados dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 23F e 33F são conjugados com PhtD. Em uma forma de realização, dois ou três dos sorotipos 3, 6A e 22F são conjugados com pHtD ou sua proteína de fusão.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos um sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, conjugado com PhtD ou sua proteína de fusão, via um ligador, por exemplo, ADH. Em uma forma de realização, uma das químicas de conjugação listadas abaixo é usada.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos um sacarídeo capsular de S. pneumoniae, conjugado com PhtD ou sua proteína de fusão, em que a relação de PhtD para sacarídeo do conjugado é entre 6:1 e 1: 5, 6:1 e 2:1, 6:1 e 2,5:1, 6:1 e 3:1, 6:1 e 3,5:1 (p/p) ou é maior do que (isto é contém uma proporção maior de PhtD) 2,0:1,2,5:1,3,0:1,3,5:1 ou 4,0:1 (w/w).
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pneumolisina.
A presente invenção fornece ainda uma vacina contendo as composições imunogênicas da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
As vacinas da presente invenção podem ser auxiliadas, particularmente quando destinadas para uso em uma população idosa, porém também para uso em populações infantis. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou alume, porém podem também ser outros sais metálicos, tais como aqueles de cálcio, magnésio, ferro ou zinco ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou açúcares acilados, sacarídeos catiônica ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.
Prefere-se que o adjuvante seja selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo de resposta THl. Tais elevados níveis de citocinas tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula a um dado antígeno, enquanto elevados níveis de citocinas tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais para o antígeno.
A distinção da resposta imune tipo Thl e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo suportará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2. Entretanto, é com freqüência conveniente considerar as famílias de citocinas nos termos descritos nos clones de célula T CD4 +ve por (Mosmann, T.R. e Coffman, R. L. (1989) THl e TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion Iead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, ρ 145- 173). Tradicionalmente, as respostas tipo Thl são associadas com a produção das citocinas INF-γ e IL-2 pelos linfócitos-T. Outras citocinas com freqüência diretamente associadas com a indução das respostas imunes tipo Thl não são produzidas pelas células-T, tais como IL-12. Ao contrário, as respostas tipo Th2 são associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas adjuvantes adequados, que promovem uma resposta predominantemente Th 1, incluem: Monofosforil lipídeo A ou um seu derivativo (ou lipídeo A destoxificado em geral - vide, por exemplo, WO2005107798), particularmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para sua preparação, vide GB 2220211 A); e uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferivelmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado, junto com um sal de alumínio (por exemplo, fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão de óleo em água. Em tais combinações, o antígeno e 3D-MPL são contidos nas mesmas estruturas particuladas, permitindo mais eficiente suprimento dos sinais antigênicos e imunoestimulatórios. Estudos mostraram que 3 D-MPL é capaz de aumentar mais a imunogenicidade de um antígeno adsorvido por alume [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16: 708-14; EP 689454- Bl].
Um sistema intensificado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivativo de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como descrito no WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica, e que o QS21 é resinado bruscamente com colesterol, como descrito no WO 96/33739. Uma formulação adjuvante particularmente potente, envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo em água, é descrita no WO 95/17210. Em uma forma de realização, a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21. A formulação pode também compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (WO 95/17210). Os oligonucleotídeos contendo CpG não metilado (WO 96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (WO 0226757 e WO 03507822) são também indutores preferenciais de uma resposta THl e são adequados para uso na presente invenção.
Adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo de sais metálicos, emulsões de óleo em água, agonistas de receptores nervosos (em particular agonista de receptor nervoso 2, agonista de receptor nervoso 3, agonista de receptor nervoso 4, agonista de receptor nervoso 7, agonista de receptor nervoso 8 e agonista de receptor nervoso 9), saponinas ou suas combinações.
Um adjuvante que pode ser usado com as composições de vacina da invenção são preparações de vesícula ou de vesícula de membrana externa de cepas bacterianas gram-negativas, tais como aquelas ensinadas por WO 02/09746 - particularmente vesículas de N.meningitidis. As propriedades adjuvantes das vesículas podem ser melhoradas retendo-se LOS (lipooligossacarídeo) em sua superfície (p. ex., através da extração com baixas concentrações de detergente [por exemplo, 0-0,1% de deoxicolato]).
LOS pode ser destoxificado através de mutações msbB(-) ou htrB(-) examinadas no WO 02/09746. As propriedades adjuvantes podem também ser melhoradas retendo-se PorB (e, opcionalmente, removendo-se PorA) das vesículas meningocócicas. As propriedades adjuvantes podem também ser melhoradas truncando-se a estrutura externa do sacarídeo do núcleo de LOS em vesículas meningocócicas - por exemplo, via a mutação lgtB(-) examinada no WO 2004/014417. Alternativamente, o LOS acima mencionado (p.ex., isolado de uma cepa msbB(-) e/ou IgtB(-)) pode ser purificado e usado como um adjuvante nas composições da invenção.
Um outro adjuvante que pode ser usado com as composições da invenção pode ser selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou um seu derivativo, um oligonucleotídeo, um fosfato de alquil glicosaminida, uma emulsão de óleo em água ou suas combinações. Um outro adjuvante preferido - é um sal metálico em combinação com outro adjuvante. Prefere-se que o adjuvante seja um agonista de receptor nervoso, em particular um agonista de um receptor nervoso 2, 3, 4, 7, 8 ou 9, ou uma saponina, em particular QS21.
E ainda preferido que o sistema adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes da lista acima. Em particular as combinações preferivelmente contêm um adjuvante de saponina (em particular QS21) e/ou um agonista de receptor nervoso 9, tal como um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendo CpG. Outras combinações preferidas compreendem saponina (em particular QS21) e um agonista de receptor nervoso 4, tal como monofosforil lipídeo A ou seu derivativo 3-desacilado, 3D - MPL ou uma saponina (em particular QS21) e um ligando de receptor nervoso 4, tal como um fosfato de alquil glicosaminida. Adjuvantes particularmente preferidos são combinações de 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 BI), emulsões de óleo em água compreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), ou 3D- MPL, formuladas com outros veículos (EP O 689 454 BI). Outros sistemas adjuvantes preferidos compreendem uma combinação de 3 D MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG, como descrito nos US6558670, US6544518.
Em uma forma de realização o adjuvante é (ou compreende) um ligando de receptor nervoso (TLR) 4, preferivelmente um agonista tal como um derivativo de lipídeo A, particularmente monofosforil lipídeo A ou, mais particularmente, monofosforil lipídeo A 3 desacilado (3D - MPL). Ele pode ser produzido de acordo com os métodos descritos em GB 2 220 21 IA. Quimicamente, é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-desacilado, com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente, nas composições da presente invenção, pequena partícula de 3D-MPL é usada. O 3D-MPL de pequena partícula tem um tamanho de partícula de modo que possa ser filtrado estéril através de um filtro de 0,22 μιη. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional No. WO 94/21292. Os derivativos sintéticos do lipídeo A são conhecidos e imagina-se serem os agonistas TLR 4, incluindo mas não limitado a:
OMl 74 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3- dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-[beta]-D-glucopiranosil]-2- [(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-[alfa]-D-glicopiranosildiidrogenfosfato), (WO 95/14026)
OM 294 DP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R) dodecanoil- oxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoil-amino] decan-1,10-diol, 1,10-bis(diidrogenofosfato) (W099/64301 e W000/0462)
OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R) dodecanoil- oxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoil-amino] decan-1,10-diol, 1-diidrogenofosfato 10-(6- amino-hexanoato) (WO 01/46127) Outros ligandos TLR4 que podem ser usados são alquil Glicosaminida fosfatos (AGPs), tais como aqueles descritos em WO 9850399 ou US 6303347 (são também descritos processos para preparação de AGPs) ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs, como descrito em US 6764840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4 e alguns são antagonistas de TLR4. Pensa-se que ambos sejam úteis como adjuvantes.
Outro imunoestimulante preferido para uso na presente invenção é Quil A e seus derivativos. Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore sul-americana Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro descrito como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p. 243-254). Fragmentos purificados de Quil A foram isolados por HPLC, que retém a atividade adjuvante sem a toxicidade associada com Quil A (EP 0 362 278). Por exemplo, QS7 e QS21 (são também conhecidos como QA7 e QA21 ). QS-21 é uma saponina natural, derivada da casca da Quillaja saponaria Molina, que induz as células T citotóxicas CD8+ (CTLs), células Thl e uma resposta anticorpo IgG2a predominante e é uma saponina preferida no contexto da presente invenção.
Formulações particulares de QS21 foram descritas que são particularmente preferidas, estas formulações compreendem ainda um esterol (WO 96/33739). As saponinas fazendo parte da presente invenção podem ser separadas na forma de micelas, micelas mistas (preferencialmente porém não exclusivamente com os sais biliares) ou podem ser na forma de matrizes ISCOM (EP 0 109 942 B1), lipossomas ou estruturas coloidais relacionadas, tais como complexos multiméricos semelhante a rosca ou semelhante a anel ou estruturas lipídicas/multiencamadas e lamelas quando formuladas com colesterol e lipídeo, ou na forma de uma emulsão de óleo em água (por exemplo, como no WO 95/17210). As saponinas podem preferivelmente ser associadas com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (WO 98/15287). Preferivelmente, a saponina é apresentada na forma de um lipossoma, ISCOM ou uma emulsão de óleo em água.
Um sistema intensificado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A (ou lipídeo A destoxificado) e um derivativo de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como descrito no WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica, em que o QS21 é reprimido com colesterol, como descrito no WO 96/33739. Uma formulação adjuvante particularmente potente, envolvendo tocoferol com ou sem QS21 e/ou 3D-MPL, em uma emulsão de óleo em água, é descrita no WO 95/17210. Em uma forma de realização, a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21.
Oligonucleotídeos imunoestimulatórios ou qualquer outro AGONISTA receptor nervoso (TLR) 9 podem também ser usados. Os oligonucleotídeo s preferidos para uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção são oligonucleotídeo s contendo CpG, preferivelmente contendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um motivo VpG é um nucleotídeo de Citosina, seguido por um nucleotídeo de Guanina. Os oligonucleotídeos CpG da presente invenção são preferivelmente desoxinucleotídeos. Em uma forma de realização preferida, o internucleotídeo do oligonucleotídeo é fosforoditioato ou, mais preferivelmente, uma ligação fosforotioato, embora ligações fosfodiéster e outras estejam dentro do escopo da invenção. Também incluídos dentro do escopo da invenção estão os oligonucleotídeo s com ligações internucleotídeo mistas. Métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato são descritos nas US 5.666.153, US 5.278.302 e WO 95/26204.
Exemplos de oligonucleotídeo preferidos têm as seguintes seqüências. As seqüências preferivelmente contêm ligações internucleotídeos modificadas por fosforotioato. OLIGO 1(SEQ ID NO: 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO: 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)OLIGO 3 (SEQ ID NO: 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (SEQ ID NO: 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO: 6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)
Os oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender as seqüências preferidas acima, pelo fato de terem deleções inconsequenciais.
Os oligonucleotídeos CpG utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na arte (por exemplo, vide EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando-se um sintetizador automatizado.
O adjuvante pode ser uma emulsão de óleo em água ou pode compreender uma emulsão de óleo em água em combinação com outros adjuvantes. A fase óleo do sistema de emulsão preferivelmente compreende um óleo metabolizável. O significado da expressão óleo metabolizável é bem conhecido na arte. Metabolizável pode ser definido com "sendo capaz de ser transformado pelo metabolismo" (Dorland's Illustrated Medicai Dictionary, W. B. Sanders Company, 25a. edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou sintético, que não seja tóxico para o receptor e seja capaz de ser transformado pelo metabolismo. Nozes, sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Os óleos sintéticos são também parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis, tais como NEOBEE® e outros. Esqualeno (2,6,10,15,19, 23-Hexametil- 2,6,10,14,18,22-tetracosaexaeno) é um óleo insaturado, que é encontrado em grandes quantidades em óleo de fígado de tubarão e em quantidades mais baixas no óleo de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura e é um óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. O esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do fato de ser um intermediário na biossíntese do colesterol (Merck index, 10a. Edição, entrada no. 8619). Os tocóis (p. ex., vitamina E) são também com freqüência usados em adjuvantes de emulsões de óleo (EP 0 382 271 BI; US5667784; WO 95/17210). Os tocóis usados nas emulsões de óleo (preferivelmente emulsões de óleo em água) da invenção podem ser formulados como descrito no EP 0 382 271 BI, pelo fato de que os tocóis podem ser dispersões de gotículas de tocol, opcionalmente compreendendo um emulsificante de, preferivelmente, menos do que 1 mícron de diâmetro. Alternativamente, os tocóis podem ser usados em combinação com outro óleo, para formar a fase óleo de uma emulsão de óleo. Exemplos de emulsões de óleo que podem ser usadas em combinação com o tocol são aqui descritos, tais como os óleos metabolizáveis descritos acima.
Os adjuvantes de emulsão de óleo em água, por si, foram sugeridos serem úteis como composições adjuvantes (EP 0 399 843B), também combinações de emulsões de óleo em água e outros agentes ativos foram descritas como adjuvantes para vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241 ). Outros adjuvantes de emulsão de óleo foram descritos, tais como emulsões de água em óleo (US 5.422.109; EP 0 480 982 B2) e emulsões de óleo em água (US 5.424.067; EP 0 480 981 B). Todos formando sistemas de emulsão de óleo preferidos (em particular, quando incorporando tocóis) para formar adjuvantes e composições da presente invenção.
Muitíssimo preferivelmente, a emulsão de óleo (por exemplo, emulsões de óleo em água) compreende ainda um emulsificante tal como TWEEN 80 e/ou um esterol, tal como colesterol.
Uma emulsão de óleo preferida (preferivelmente emulsão de óleo em água) compreende um emulsificante tal como TWEEN 80 e/ou um esterol, tal como colesterol.
Uma emulsão de óleo preferida (preferivelmente emulsão de óleo em água) compreende um óleo não-tóxico metabolizável, tal como esquelano, esqualeno ou um tocoferol, tal como um alfa tocoferol (e preferivelmente tanto esqueleno e alfa tocoferol) e opcionalmente um emulsificante (ou tensoativo), tal como Tween 80. Um esterol (preferivelmente colesterol) pode também ser incluído.
O método de produzir emulsões de óleo em água é bem conhecido da pessoa hábil na arte. Comumente, o método compreende misturar a fase óleo contendo tocol com um tensoativo, tal como solução de PBS/TWEEN80™, seguido por homogeneização empregando-se um homogeneizador. Seria óbvio para uma pessoa hábil na arte que um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de uma agulha de seringa seria adequado para homogeneizar pequenos volumes de líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidificador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de 2 minutos em entrada de pressão máxima de 6 bar (pressão de produção de cerca de 850 bar)) poderia ser adaptado pela pessoa hábil na arte para produzir volumes de emulsão menores ou maiores. A adaptação poderia ser conseguida por experimentação de rotina, compreendendo a medição da emulsão resultante até uma preparação ser conseguida com gotículas de óleo do diâmetro requerido.
Em uma emulsão de óleo em água, o óleo e emulsificante devem ser em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.
O tamanho das gotículas de óleo encontradas dentro da emulsão de óleo em água estável é fórmula menor do que 1 micro, pode ser na faixa de substancialmente 30 - 600 nm, preferivelmente substancialmente em torno de 30 — 500 nm de diâmetro e muitíssimo preferivelmente substancialmente 150 - 500 nm de diâmetro e, em particular, cerca de 150 nm de diâmetro, conforme medido por espectroscopia de correlação fotônica. A este respeito, 80% das gotículas de óleo em número devem estar dentro das faixas preferidas, mais preferivelmente mais do que 90% e muitíssimo preferivelmente mais do que 95% das gotículas de óleo em número estão dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões de óleo da presente invenção são convencionalmente na faixa de 0,5 - 20% ou 2 a 20% de óleo (do volume de dose total), tal como esqualeno; e quando presentes de 2 a 10% de alfa tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensoativo, tal como monooleato de polioxietileno sorbitano. Preferivelmente, a relação de óleo (preferivelmente esqueleno): tocol (preferivelmente a- tocoferol) é igual ou menor do que 1, visto que esta fornece uma emulsão mais estável. Um emulsificante, tal como Tween80 ou Span 85, pode estar presente em um nível de cerca de 1%. Em alguns casos, pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção contenham ainda um estabilizante.
Exemplos de sistemas de emulsão preferidos são descritos nos WO 95/17210, WO 99/11241 e WO 99/12565, que descrevem adjuvantes de emulsão baseados em esqualeno, α-tocoferol e TWEEN 80, opcionalmente formulados com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL. Assim, em uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o adjuvante da invenção pode adicionalmente compreender ainda imunoestimulantes, tais como LPS ou seus derivativos e/ou saponinas.
Exemplos de outros imunoestimulantes são descritos aqui e em Vaccine
Design - The Subunit e Adjuvant Approach" 1995 Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds Powell, M.F., e Newman, M. J. Plenum Press, New York e London, ISBN 0-306-44867-X.
Em um aspecto preferido, as composições adjuvantes e imunogênicas de acordo com a presente invenção compreendem uma saponina (preferivelmente QS21) e/ou um derivativo de LPS (preferivelmente 3D-MPL) em uma emulsão de óleo descrita acima, opcionalmente com um esterol (preferivelmente colesterol). Adicionalmente, a emulsão de óleo (preferivelmente emulsão de óleo-em-água) pode conter SPAN 85 e/ou lecitina e/ou tricaprilina. Os adjuvantes compreendendo uma emulsão de óleo- em-água, um esterol e uma saponina são descritos no WO 99/12565.
Tipicamente para administração humana, a saponina (preferivelmente QS21) e/ou derivativo de LPS (preferivelmente 3D-MPL) estarão presentes em uma dose humana de composição imunogênica na faixa de 1μg - 200 μg, tal como 10-100 μg, preferivelmente 10 μg -50 μg por dose. Tipicamente, a emulsão de óleo (preferivelmente emulsão de óleo em água) compreenderá de 2 a 10% de óleo metabolizável. Preferivelmente, compreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol e de 0,3 a 3% (preferivelmente 0,4 - 2%) de emulsificante (preferivelmente tween 80 [monooleato de polioxietileno sorbitano]). Onde tanto esqueleno como alfa- tocoferol estiverem presentes, preferivelmente a relação de esqualeno: alfa tocoferol é igual a ou menor do que 1, visto que esta fornece uma emulsão mais estável. Span 85 (trioleato de Sorbitano) pode também estar presente em um nível de0,5 a 1% nas emulsões usadas na invenção. Em alguns casos pode ser vantajoso que as composições imunogênicas e vacinas da presente invenção contenham ainda um estabilizante, por exemplo, outros emulsificantes/tensoativos, incluindo ácido caprílico (merck index 10a. Edição, entrada no. 1739), dos quais Tricaprilina é particularmente preferida.
Onde esqueleno e uma saponina (preferivelmente QS21) estejam incluídos, é de benefício também incluir um esterol (preferivelmente colesterol) na formulação, visto que isto permite uma redução do nível total de óleo na emulsão. Isto resulta em um custo de manufatura reduzido, melhoria do conforto total da vacinação e também melhorias qualitativas e quantitativas das respostas imunes, tais como produção de IFN-γ melhorada. Por conseguinte, o sistema adjuvante da presente invenção tipicamente compreende uma relação de óleo metabolizável:saponina (p/p) na faixa de 200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma de "baixo óleo", cuja faixa preferida é de 1:1 a 200:1, preferivelmente 20:1 a 100:1 e, muitíssimo preferivelmente, substancialmente 48:1, esta vacina retém as propriedades adjuvantes benéficas de todos os componentes, com um perfil de reatogenicidade muito reduzido. Portanto, as formas de realização particularmente preferidas têm uma relação de esqualeno:QS21 (p/p) na faixa de 1:1 a 250:1, também uma faixa preferida é 20:1 a 200:1, preferivelmente 20:1 a 100:1 e, muitíssimo preferível substancialmente 48:1. Preferivelmente, um esterol (muitíssimo preferivelmente colesterol) é também incluído presente em uma relação de saponina:esterol como descrito aqui.
Os sistemas de emulsão da presente invenção preferivelmente têm um pequeno tamanho de gotícula de óleo na faixa submicrônica. Muitíssimo preferivelmente, os tamanhos de gotícula de óleo será na faixa de 120 a 750 nm e, muitíssimo preferivelmente, de 120 - 600 nm de diâmetro.
Uma formulação adjuvante particularmente potente (para combinação final com AIP04 nas composições imunogênicas da invenção) envolve uma saponina (preferivelmente QS21), um derivativo de LPS (preferivelmente 3D-MPL) e uma emulsão de óleo (preferivelmente esqualeno e alfa tocoferol em uma emulsão de óleo em água) como descrito no WO 95/17210 ou no WO 99/12565 (em particular formulação adjuvante 11 do Exemplo 2, Tabela 1).
Exemplos de um agonista TLR 2 incluem peptidoglicano ou lipoproteína. As imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod são agonistas TLR7 conhecidos. O RNA de filamento único é também um agonista de TLR (TLR8 em humanos e TLR7 em camundongos), enquanto que o RNA de filamento duplo e poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico - um mimético sintético comercial do RNA viral), são exemplificativos de agonistas de TLR 3. 3 D-MPL é um exemplo de um agonista de TLR4, enquanto CPG é um exemplo de um agonista de TLR9.
A composição imunogênica pode compreender um antígeno e um imunoestimulante adsorvido em um sal metálico. As formulações de vacina baseadas em alumínio, em que o antígeno e o monofosforil lipídeo A 3-de-Oacilado imunoestimulante (3D-MPL) são adsorvidos na mesma partícula, são descritas em EP 0 576 478 B1, EP 0 689 454 B1, e EP 0 633 784 B1. Nestes casos então o antígeno é primeiro adsorvido no sal de alumínio, seguido pela adsorção do 3 D-MPL imunoestimulante nas mesmas partículas de sal de alumínio. Tais processos primeiro envolvem a suspensão de 3D-MPL por sonicação em um banho de água, até as partículas alcançarem um tamanho entre 80 e 500 nm. O antígeno é tipicamente adsorvido no sal de alumínio por uma hora em temperatura ambiente sob agitação. A suspensão de 3 D-MPL é então adicionada no antígeno adsorvido e a formulação é incubada em temperatura ambiente por 1 hora e então mantida a 4°C até uso.
Em outro processo, o imunoestimulante e o antígeno estão em partículas metálicas separadas, como descrito no EP 1126876. O processo aperfeiçoado compreende a adsorção do imunoestimulante na partícula de sal metálico, seguido pela adsorção do antígeno em outra partícula de sal metálico, seguido pela mistura das partículas metálicas distintas, para formar uma vacina. O adjuvante para uso na presente invenção pode ser uma composição adjuvante compreendendo um imunoestimulante, adsorvido em uma partícula de sal metálica, caracterizado pelo fato de que a partícula de sal metálico é substancialmente livre de outro antígeno. Além disso, as vacinas são providas pela presente invenção e são caracterizadas pelo fato de o imunoestimulante ser adsorvido nas partículas de sal metálico, que são substancialmente livres do outro antígeno e pelo fato de que as partículas de sal metálico, que são adsorvidas no antígeno, serem substancialmente livres de outro imunoestimulante. Portanto, a presente invenção fornece uma formulação adjuvante compreendendo imunoestimulante que foi adsorvido em uma partícula de um sal metálico, caracterizada pelo fato de a composição ser substancialmente livre de outro antígeno. Além disso, esta formulação adjuvante pode ser um intermediário que, se tal adjuvante for usado, é necessário para a manufatura de uma vacina. Desta maneira, é provido um processo para a manufatura de uma vacina, compreendendo misturar uma composição adjuvante que é um ou mais imunoestimulantes adsorvidos em uma partícula metálica com um antígeno. Preferivelmente, o antígeno foi pré- adsorvido em um sal metálico. Dito sal metálico pode ser idêntico ou similar ao sal metálico que é adsorvido no imunoestimulante. Preferivelmente, o sal metálico é um sal de alumínio, por exemplo, fosfato de Alumínio ou hidróxido de Alumínio.
A presente invenção fornece ainda uma composição de vacina compreendendo imunoestimulante adsorvido sobre uma primeira partícula de um sal metálico e antígeno adsorvido em um sal metálico, caracterizada pelo fato de as primeira e segunda partículas de sal metálico serem partículas separadas.
Os derivativos ou mutações de LPS ou LOS ou derivativos de lipídeo A descritos aqui são projetados para serem menos tóxicos (p. ex., 3D- MPL) do que os lipossacarídeos nativos e são equivalentes intercambiáveis com respeito a quaisquer usos destes componentes aqui descritos. Eles podem ser ligandos de TLR4 como descrito acima. Outros tais derivativos são descritos nos WO020786737, WO9850399, WO0134617, WO0212258, WO03065806.
Em uma forma de realização, o adjuvante usado para as composições da invenção compreende um veículo de lipossoma (produzido por técnicas conhecidas de um fosfolipídeo (tal como dioleoil fosfatidil colina [DOPC]) e opcionalmente um esterol [tal como colesterol]). Tais veículos de lipossoma podem conter derivativos de lipídeo A [tal como 3D-MPL - vide acima] e/ou saponinas (tais como QS21 - vide acima). Em uma forma de realização, o adjuvante compreende (por dose de 0,5 ml) 0,1 - 10mg, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2, ou 0,5-1 mg (p. ex., 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 ou 1 mg) de fosfolipídeo (por exemplo, DOPC), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1 - 0,3, ou 0,125- 0,25 mg (p. ex., 0,2-0,3, 0,1 - 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (p. ex., 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg de derivativo de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL), e 5-60, 10-50, ou 20- 30 μg (p. ex., 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg)) de saponina (por exemplo QS21).
Este adjuvante é particularmente adequado para formulações de vacina de idosos. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreendendo este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e podem também compreender um ou mais sorotipos 3, 6A, 19A, e 22F), em que o título de anticorpo GMC, induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes da vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, não é significativamente inferior àquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinas humanas.
Em uma forma de realização, o adjuvante usado para as composições da invenção compreende uma emulsão de óleo em água produzida de um óleo metabolizável (tal como esqualeno), um emulsificante (tal como Tween 80) e, opcionalmente, um tocol (tal como alfa tocoferol). Em uma forma de realização, o adjuvante compreende (por dose de 0,5 ml) 0,5- 15, 1 - 13, 2-11, 4-8, ou 5-6 mg (p. ex., 2-3, 5-6, ou 10-11 mg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno), 0,1 - 10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4, ou 2-3 mg (p. ex., 0,9-1,1, 2-3 ou 4-5 mg) de emulsificante (tal como Tween 80) e opcionalmente 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 mg (p. ex., 11-13, 5-6, ou 2-3 mg) de tocol (tal como alfa tocoferol). Este adjuvante pode opcionalmente compreender ainda 5-60, 10-50, ou 20-30 μ§ (ρ. ex., 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μ§) de derivativo de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Estes adjuvantes são particularmente adequados para formulações de vacina de bebê ou idoso. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreendendo este adjuvante consiste de conjugados de sacarídeos derivados de pelo menos os seguintes sorotipos: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e podem também compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A, e 22F), em que o título de anticorpo GMC, induzido contra um ou mais (ou todos) dos componentes da vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significativamente inferior àquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Este adjuvante pode opcionalmente conter 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,125-0,25 mg (p. ex., 0,2-0,3, 0,1 - 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (p. ex., 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de derivativo de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 μg (p. ex., 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg de saponina (por exemplo QS21).
Este adjuvante é particularmente adequado para formulações de vacinas de idosos. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreendendo este adjuvante consiste de conjugados de sacarideo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5,7F (e podem também compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A, e 22F), em que o título do anticorpo GMC, induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes da vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significativamente inferior àquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Em uma forma de realização, o adjuvante usado para as composições da invenção compreende fosfato de alumínio e um derivado de lipídeo A (tal como 3D-MPL). Este adjuvante pode compreender (por dose de 0,5 ml) 100-750, 200-500, ou 300-400 μg de Al como fosfato de alumínio e 5-60, 10-50, ou 20-30 μ§ (ρ. ex., 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Este adjuvante é particularmente adequado para formulações de vacinas infantis. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreendendo este adjuvante compreende conjugados de sacarideo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e podem também compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A, e 22F), em que o título de anticorpo de GMC, induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes da vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, não é significativamente inferior àquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
As preparações de vacina contendo composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível a infecção, por meio da administração de dita vacina via sistêmica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou via administração mucosa aos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. A administração intranasal de vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferida (visto que o transporte nasofaríngeo de pneumococos pode ser mais eficazmente evitado, assim atenuando a infecção em seu estágio mais precoce. Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma única dose, seus componentes podem também ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em diferentes tempos (por exemplo, conjugados sacarídeos pneumocócicos poderiam ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para coordenação ótima das respostas imunes em relação entre si). Para co-administração, o adjuvante Th1 opcional pode estar presente em qualquer ou em todas as diferentes administrações. Além de uma única via de administração, 2 diferentes vias de administração podem ser usadas. Por exemplo, sacarídeos ou conjugados de sacarídeo podem ser administrados IM (ou ID) e as proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses de imprimação e IN para doses de reforço.
O conteúdo de antígenos de proteína da vacina tipicamente será na faixa de 1 - 100 μg, preferivelmente 5-50 μg, muitíssimo tipicamente na faixa de 5 - 25 μg. Em seguida a uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou diversas imunizações de reforço adequadamente afastadas.
A preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). A encapsulação dentro dos lipossomas é descrita por Fullerton, patente US 4.235.877.
As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizadas. Preferivelmente, a solução é liofilizada na presença de um açúcar, tal como sacarose ou lactose. E ainda mais preferível que elas sejam liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso. A liofilização pode resultar em uma composição mais estável (vacina) e pode possivelmente resultar em títulos de anticorpo mais elevados, na presença de 3D-MPL e na ausência de um adjuvante baseado em alumínio.
Em um aspecto da invenção é provida um kit de vacina, compreendendo um frasco contendo uma composição imunogênica da invenção, opcionalmente em forma liofilizada e compreendendo ainda um frasco contendo um adjuvante como aqui descrito. É considerado que neste aspecto da invenção o adjuvante seja usado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada.
Embora as vacinas da presente invenção possam ser administradas por qualquer via, a administração de vacinas descritas dentro da pele (ID) forma uma forma de realização da presente invenção. A pele humana compreende uma cutícula "calosa" externa, chamada estrato córneo, que sobrepõem-se à epiderme. Debaixo desta epiderme há uma camada chamada derme, que por sua vez reveste o tecido subcutâneo. Os pesquisadores mostraram que a injeção de uma vacina dentro da pele e, em particular, da derme, estimula uma resposta imune, que pode também ser associada com numerosas vantagens adicionais. A vacinação intradérmica com as vacinas aqui descritas forma um aspecto preferido da presente invenção.
A técnica convencional de injeção intradérmica, o "procedimento Mantoux", compreende etapas de limpeza da pele e então estiramento com uma das mãos e com o bisel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26 - 31) faceando para cima a agulha é inserida em um ângulo entre 10 - 15°. Uma vez o bisel da agulha seja inserido, o tambor da agulha é abaixado e ainda avançado, enquanto provendo uma ligeira pressão para elevá-lo sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente, formando uma bolha ou inchaço na superfície da pele, seguido por lenta retirada da agulha.
Mais recentemente, dispositivos que são especificamente projetados para administrar agentes líquidos dentro ou através da pele foram descritos, por exemplo, os dispositivos descritos no WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção a jato descritos, por exemplo, nos WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520, 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Método alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos projetados para suprimento balístico de vacinas sólidas (WO 99/27961), emplastros transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicadas na superfície da pele (suprimento transdérmico ou transcutâneo WO 98/20734; WO 98/28037).
Quando as vacinas da presente invenção são para ser administradas na pele, ou mais especificamente dentro da derme, a vacina se encontra em um baixo volume de líquido, particularmente, um volume entre cerca de 0,05 ml e 0,2 ml.
O conteúdo dos antígenos das vacinas de pele ou intradérmicas da presente invenção pode ser similar a doses convencionais, como encontrado em vacinas intramusculares (vide acima). Entretanto, é um aspecto das vacinas de pele ou intradérmicas que as formulações possam ser de "baixa dose". Portanto, os antígenos de proteína das vacinas de "baixa dose" estão preferivelmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10 μg, preferivelmente 0,1 a 5 μg por dose; e os antígenos de sacarídeo (preferivelmente conjugado) podem estar presentes na faixa de 0,01-1 μg e, preferivelmente, entre 0,01 a 0,5 μg de sacarídeo por dose.
Como aqui usado, o termo "suprimento intradérmico" significa suprimento da vacina na região da derme dentro da pele. Entretanto, a vacina não necessariamente será localizada exclusivamente na derme. A derme é a camada da pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície da pele humana, porém há uma certa quantidade de variação entre indivíduos e em diferentes partes do corpo. Em geral, pode ser esperado alcançar a derme penetrando-se 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme é localizada entre o estrato córneo e a epiderme na superfície e na camada subcutânea embaixo. Dependendo do modo de suprimento, a vacina pode finalmente ser localizada unicamente ou principalmente dentro da derme ou pode ser finalmente distribuída dentro da epiderme e da derme.
A presente invenção fornece ainda uma vacina aperfeiçoada para a prevenção ou melhoria da Otite média causada por Haemophilus influenzae, pela adição de proteínas de Haemophilus influenzae, por exemplo, proteína D em forma livre ou conjugada. Além disso, a presente invenção provê ainda uma vacina aperfeiçoada para a prevenção ou melhoria da infecção pneumocócica em bebês (p. ex., Otite média), com base na adição de uma ou duas proteínas pneumocócicas como proteína livre ou conjugada às composições conjugadas de S. pneumoniae da invenção. Ditas proteínas livres pneumocócicas podem ser as mesmas ou diferentes de quaisquer proteínas de S. pneumoniae usadas como proteínas veículo. Um ou mais antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis podem também ser incluídos na vacina de combinação em uma forma livre ou conjugada. Assim, a presente invenção é um método aperfeiçoado para eliciar uma resposta imune (protetora) contra Otite média em bebês.
Em outra forma de realização, a presente invenção é um método aperfeiçoado para eliciar uma resposta imune (protetora) em bebês (definidos como 0 — 2 anos de idade no contexto da presente invenção), administrando-se uma quantidade segura e eficaz da vacina da invenção [uma vacina pediátrica]. Outras formas de realização da presente invenção incluem a provisão das composições conjugadas de S. pneumoniae antigênicas da invenção, para uso em medicina, e o uso de conjugados de S. pneumoniae da invenção na manufatura de um medicamento para a prevenção (ou tratamento) de doença pneumocócica.
Em ainda outra forma de realização, a presente invenção é um método aperfeiçoado para eliciar uma resposta imune (protetora) na população idosa (no contexto da presente invenção, um paciente é considerado idoso se tiver 50 anos de idade ou mais, tipicamente acima de 55 anos e mais, geralmente acima de 60 anos), administrando-se uma quantidade segura e eficaz da vacina da invenção, preferivelmente em conjunto com uma ou duas proteínas de S. pneumoniae presentes como proteínas livres ou conjugadas, proteínas de S. pneumoniae livres estas podendo ser as mesmas ou diferentes que quaisquer proteínas de S. pneumoniae usadas como proteínas veículo.
Um outro aspecto da invenção é um método de imunizar um hospedeiro humano contra doença causada por S. pneumoniae e, opcionalmente, infecção por Haemophilus influenzae compreendendo administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da composição ou vacina imunogênica ou kit da invenção.
Um outro aspecto da invenção é uma composição imunogênica da invenção para uso no tratamento ou prevenção de doença causada por S. pneumoniae e, opcionalmente, infecção por Haemophilus influenzae.
Um outro aspecto da invenção é o uso da composição ou vacina imunogênica ou kit da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas pro S. pneumoniae e, opcionalmente, infecção por Haemophilus influenzae.
Os termos "compreendendo", "compreendem" ou "compreende" aqui são destinados pelos inventores serem opcionalmente substituíveis pelos termos "consistindo de", "consistem de" e "consiste de", respectivamente, em cada exemplo.
As formas de realização aqui relativas a "composições de vacina" da invenção são também aplicáveis a formas de realização relativas a "composições imunogênicas" da invenção e vice-versa.
Todas referências ou pedidos de patente citados dentro deste relatório de patente são incorporados por referência aqui.
A fim de que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são expostos. Estes exemplos são para fins de ilustração somente e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de forma alguma. Exemplos
Exemplo 1: EXPRESSÃO DA PROTEÍNA D
Construção genética para a expressão da proteína D
Materiais de partida
A proteína D Codificando DNA
A proteína D é altamente conservada entre Haemophilus influenzae de todos os sorotipos e cepas não-tipificáveis. O vetor pHIC348 contendo a seqüência de DNA codificando o inteiro gene da proteína D foi obtido de Dr. A. Forsgren, Department of Medicai Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmõ Suécia. A seqüência de DNA da proteína D foi publicada por Janson et al. (1991 ) Infect. Immun. 59: 119-125.
O vetor de expressão pMGl
O vetor de expressão pMGl é um derivativo de pBR332 (Gross et al., 1985), em que os elementos de controle derivados do bacteriófago λ para transcrição e translação de genes inseridos estranhos, foi introduzido (Shatzman et al., 1983). Além disso, o gene de resistência à ampicilina foi trocado pelo gene de resistência à Canamicina.
A cepa de E. coli AR58
A cepa E. coli AR58 foi gerada por transdução de N99 com um estoque de fago Pl previamente cultivado em um derivativo Sa500 (galE::TN10, lambdakil" cl857 ΔΗ1). N99 e SA500 são cepas Kl2 de E. coli derivadas do laboratório do Dr. Martin Rosenberg do National Institute ou Health.
O vetor de expressão pMGl
Para a produção da proteína D, o DNA codificando a proteína foi clonado dentro do vetor de expressão pMG 1. Este plasmídeo utiliza sinais de DNA de lambdafago para acionar a transcrição e translação dos genes estranhos inseridos. O vetor contém o promotor PL, operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) para aliviar os efeitos da polaridade transcricional, quando a proteína N é provida (Gross et al., 1985). Os vetores contendo o promotor PL são introduzidos dentro de um hospedeiro lisogênico de E. coli para estabilizar o DNA do plasmídeo. As cepas hospedeiras lisogênicas contêm DNA de lambdafago defeituosos de replicação integrados dentro do genoma (Shatzman et al., 1983). O DNA de lambdafago cromossomal dirige a síntese da proteína repressora cl, que se liga ao repressor OL do vetor e evita a ligação da RNA polimerase ao promotor PL e, desse modo, a transcrição do gene inserido. O gene cl da cepa de expressão AR58 contém um mutante sensível a temperatura, a fim de que a transcrição dirigida por PL possa ser regulada pela mudança de temperatura, isto é, um aumento da temperatura da cultura inativa o repressor e a síntese da proteína estranha é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada das proteínas estranhas, especialmente daquelas que podem ser tóxicas para a célula (Shimataka & Rosenberg, 1981).
A cepa de E. coli AR58
A cepa de E. coli lisogênica AR58, usada para a produção do veículo da proteína D, é um derivativo de N99 (F- su" ga1K2, lacZ- thr-) da cepa K12 E. coli NIH padrão. Ela contém uma lambdafago lisogênico defeituoso (ga1E::TN10, lambdaKil- cl857 ΔΗ1). O fenótipo Kil" evita a exclusão da síntese macromolecular do hospedeiro. A mutação cl857 confere uma lesão sensível a temperatura ao repressor cl. A deleção AHl remove o óperon direito de lambdafago e os locais bio, uvr3 e chlA do hospedeiro. A cepa AR58 foi gerada por transdução de N99 com um estoque de fago P1 previamente cultivado em um derivativo SA500 (galE::TN10, lambdaKil- cl857 ΔΗ1). A introdução do lisógeno defeituoso dentro de N99, foi selecionada com tetraciclina em virtude da presença de um transposon TN10 codificando para resistência à tetraciclina no gene galE adjacente. Construção do vetor pMGMDPPrD
O vetor pMG 1, que contém o gene codificando a proteína não-estrutural S1 do vírus influenza (pMGNSI) foi usada para construir pMGMDPPrD. O gene da proteína D foi amplificado por PCR do vetor pHIC348 (Janson et al. 1991 Infect. Immun. 59: 119-125) com iniciadores PCR contendo sítios de restrição Ncol e Xbal nas terminações 5' e 3', respectivamente. O fragmento Ncol/Xbal foi então introduzido dentro de pMGNS 1 entre Ncol e Xbal, assim criando uma proteína de fusão contendo os 81 aminoácidos do terminal-N da proteína NS1, seguido pela proteína PD. Este vetor foi rotulado pMGNS1PrD.
Com base na construção descrita acima, a construção final para a expressão da proteína D foi gerada. Um fragmento BamHI/BamHI foi removido de pMGNSIPrD. Esta hidrólise do DNA remove a região de codificação NS1, exceto quanto aos primeiros três resíduos de terminal-N. Na religação do vetor, um gene codificando uma proteína de fusão com a seguinte seqüência amino ácida foi gerado:
—MDP SSHSSNMANT— NS1 Proteina D
A proteína D não contém um peptídeo líder ou a cisteína do terminal-N, a que as cadeias lipídicas são normalmente ligadas. A proteína, portanto, não é excretada dentro do periplasma nem lipidada e permanece no citoplasma em uma forma solúvel.
A construção final pMG-MDPPrD foi introduzida dentro da cepa hospedeira AR58 por choque térmico a 37 0C. As bactérias contendo plasmídeo foram selecionadas na presença da canamicina. A presença da inserção de DNA codificando a proteína D foi demonstrada por digestão do DNA de plasmídeo isolado com endonucleases selecionadas. A cepa E. coli recombinante é referida como ECD4.
A expressão da proteína D está sob controle do promotor lambda PL/ Operador OL. A cepa hospedeira AR58 contém um gene cl sensível a temperatura no genoma que bloqueia a expressão de lambda PL a baixa temperatura, pela ligação a OL- Uma vez a temperatura seja elevada, cl é liberado de OL e a proteína D é expressa.
Preparação de pequena escala
No final da fermentação as células são concentradas e congeladas.
A extração de células colhidas e a purificação da proteína D foram realizadas como segue. A pelota da cultura de célula congelada é descongelada e ressuspensa em uma solução de rompimento de célula (tampão de citrato pH 6,0) a uma OD650 final = 60. A suspensão é passada duas vezes através de um homogeneizador de alta pressão a P = 1000 bar. O homogeneizado de cultura de célula é purificado por centrifugação e os escombros de célula são removidos por filtragem. Na primeira etapa de purificação, o lisado filtrado é aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de cátions (SP Sepharose Fast Flow). PD liga-se à matriz de gel por interação iônica e é eluída por um aumento de etapa da intensidade iônica do tampão de eluição.
Em uma segunda etapa de purificação, as impurezas são retidas em uma matriz de troca aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não se liga no gel e pode ser coletada no fluxo atravessante.
Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta é monitorada por OD. O fluxo através da cromatografia de coluna de troca aniônica, contendo a proteína D purificada, é concentrado por ultrafiltragem.
A proteína D contendo o retido de ultrafiltragem é finalmente passado através de uma membrana de 0,2 μm.
Preparação de Larga Escala
A extração das células colhidas e a purificação da proteína D foi realizada como segue. A calda colhida é esfriada e diretamente passada duas vezes através de uma homogeneizador de elevada pressão em uma pressão em torno de 800 bares. Na primeira etapa de purificação, o homogeneizado de cultura de célula é diluído e aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de cátions (contas SP Sepharose Big). PD liga-se à matriz de gel por interação iônica e é eluída por um aumento de etapa da intensidade iônica do tampão de eluição e filtrado.
Em uma segunda etapa de purificação, as impurezas são retidas em uma matriz de troca aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não se liga no gel e pode ser coletada no fluxo atravessante.
Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta de fração é monitorada por OD. O fluxo através da cromatografia de coluna de troca aniônica contendo a proteína D purificada é concentrado e diafiltrado por ultrafiltragem.
A proteína D contendo o retido de ultrafiltragem é finalmente passado através de uma membrana de 0,2 μm.
Exemplo lb: EXPRESSÃO DE PhtD
A proteína phtD é um membro da família da proteína tríade- histidina pneumocócica (pht), caracterizada pela presença de tríades de histidina (motivo HXXHXH). PhtD é uma molécula-aa 838 e contém 5 tríades de 5 histidinas (vide Melmmune WO 0037105 SEQ ID NO: 4 para seqüência amino ácida e SEQ ID NO: 5 para seqüência de DNA). PhtD também contém uma região rica em prolina no meio (posição amino ácida 348 - 380). Phtd tem uma seqüência de sinal de terminal-N-aa 20 com um motivo LXXC.
Construção genética
A seqüência genética da proteína PhtD MedImmune madura (de aa 21 a aa 838) foi transferida recombinantemente para E. coli usando-se o vetor pTCMP14 interno contendo o promotor ρλ. A cepa hospedeira de E. coli é AR58, que contém o repressor termossensível, permitindo indução térmica do promotor. A reação de cadeia de polimerase foi realizada para amplificar o gene phtD de um plasmídeo Medlmmune (contendo o gene phtD da cepa Streptococcus pneumoniae Norway 4 (sorotipo 4) - SEQ ID NO: 5, como descrito no WO 00/37105). Os iniciadores, específicos para somente o gene phtD, foram usados para amplificar o gene phtD em dois fragmentos. Os iniciadores contêm os sítios de restrição NdeI e Ppnl ou Kpnl e Xbal. Estes iniciadores não hibridizam com qualquer nucleotídeo do vetor, porém somente com seqüências genéticas específicas de phtD. Um códon de partida ATG artificial foi inserido usando-se o primeiro iniciador contendo o sítio de restrição Ndei. Os produtos PCR gerados foram então inseridos dentro do vetor de clonagem pGEM-T (Promega) e a seqüência de DNA foi confirmada. A subclonagem dos fragmentos do vetor de expressão TCMP14 foi então realizada usando-se técnicas padrão e o vetor foi transformado em E. coli AR58.
Purificação de PhtD
A purificação de PhtD é conseguida como segue:
° Crescimento de células de E.coli na presença de canamicina: crescimento 30 horas a 30 °C, em seguida indução por 18 horas a 39,5 °C
D Rompimento das células de E. Coli de culturas integrais a OD ± 115, na presença de EDTA 5 mM e PMSF 2 mM como inibidores da protease: Rannie, 2 passagens, 1000 bares.
° Captura de antígeno e remoção de escombros de células em cromatografia Streamline Q XL de modo de leito expandido em temperatura ambiente (20 °C); a coluna é lavada com NaCl 150 mM + Empigen 0,25% pH 6,5 e eluída com NaCl 400 mM + Empigen 0,25% em tampão de fosfato de potássio 25 mM pH 7,4.
Filtragem em cartucho Sartobran 150 (0,45 + 0,2 μπι) Ligação de antígeno em cromatografia Chelating Sepharose FF IMAC Zn++ em ρΗ 7,4, na presença de imidazol 5 mM a 4 0C; a coluna é lavada com imidazol 5 mM e Empigen 1% e eluída com imidazol 50 mM, ambos em tampão de fosfato de potássio 25 mM pH 8,0.
- Cromatografia de fraca troca de ânions em modo positivo em Fractogel EMD DEAE em pH 8,0 (fosfato de potássio 25 mM) a 4 0C; a coluna é lavada com NaCl 140 mM e eluída em NaCl 200 mM, enquanto os contaminantes (proteínas e DNA) permanecem adsorvidos no trocador.
- Concentração e ultrafiltragem com fosfato Na/K 2 mM pH 7,15 em membrana de 50 kDa.
- Filtragem de esterilização da massa purificada em um cartucho de filtro de 0,2 mM Millipak-20.
Exemplo lc: EXPRESSÃO DA PNEUMOLISINA
A pneumolisina pneumocócica foi preparada e destoxificada como descrito no WO2004/081515 e WO2006/032499.
Exemplo 2:
Preparação de conjugados
E bem sabido na arte como produzir polissacarídeos pneumocócicos purificados. Para fins destes exemplos, os polissacarídeos foram produzidos essencialmente como descrito na EP072513 ou por métodos estreitamente relacionados. Antes da conjugação, os polissacarídeos podem ser dimensionados por microfluidização, como descrito abaixo.
As condições de ativação e acoplamento são específicas para cada polissacarídeo. Estas são dadas na Tabela 1. O polissacarídeo dimensionado (exceto quanto a PS5, 6B e 23F) foi dissolvido em NaCl 2M, NaCl 0,2 M ou em água para injeção (WFI). A concentração ótima de polissacarídeo foi avaliada para todos os sorotipos. Todos os sorotipos exceto o sorotipo 18C foram conjugados diretamente com a proteína veículo como detalhado abaixo. Dois conjugados de sorotipo alternativo 22F foram produzidos; um conjugado diretamente, um através de um ligador ADH. De uma solução estoque de 100 mg/ml em acetonitrila ou acetonitrila/água 50%/50%, CDAP (relação CDAP/PS 0,5 - 1,5 mg/mg PS) foi adicionado à solução de polissacarídeo. 1,5 minuto mais tarde, 0,2M - 0,3 M NaOH foi adicionado para obter-se o pH de ativação específica. A ativação do polissacarídeo foi realizada neste pH durante 3 minutos a 25 0C. Proteína purificada (proteína D, PhtD, pneumolisina ou DT) (a quantidade depende da relação de PS inicial/proteína veículo) foi adicionada ao polissacarídeo ativado e a reação de acoplamento foi realizada no pH específico por até 2 h (dependendo do sorotipo) sob regulação de pH. A fim de extinguir os grupos éster de cianato não-reagidos, uma solução de glicina 2M foi então adicionada à mistura. O pH foi ajustado ao pH de resfriamento brusco (pH 9,0). A solução foi agitada por 30 minutos a 25 0C e então durante a noite a 2 - 8°C com lenta agitação contínua.
Preparação de 18C:
18C foi ligado à proteína veículo via um ligador - Diidrazida de ácido adípico (ADH). Sorotipo de polissacarídeo 18C foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivação do toxóide do tétano com EDAC
Para derivação do toxóide do tétano, TT purificado foi diluído a 25 mg/ml em NaCl 0,2M e o espaçador ADH foi adicionado a fim de alcançar uma concentração final de 0,2M. Quando a dissolução do espaçador estava completa, o pH foi ajustado a 6,2. EDAC (1-etil-3-(3-dimetil- aminopropil) carbodiimida) foi então adicionada para alcançar uma concentração final de 0,02 Mea mistura foi agitada por 1 hora sob regulação do pH. A reação da condensação foi parada aumentando-se o pH até 9,0 por pelo menos 30 minutos a 25 0C. O TT derivado foi então diafiltrado (membrana CO de 10 kDa), a fim de remover ADH residual e reagente EDAC.
A massa TTAH foi finalmente filtrada estéril até a etapa de acoplamento e armazenada a -70 °C. Acoplamento químico de TTah em PS 18C
Detalhes dos parâmetros de conjugação podem ser encontrados na Tabela 1.
2 gramas de PS microfluidizado foram diluídos na concentração definida em água e ajustados a NaCl 2M por adição de pó de NaCl.
Solução CDAP (100 mg/ml frescamente preparada em 50/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionada para alcançar a apropriada relação CDAP/PS.
O pH foi elevado até o pH de ativação 9,0 pela adição de NaOH 0,3 M e foi estabilizado neste pH até a adição de TTah.
Após 3 minutos, TTah derivado (20 mg/ml em 0,2 M NACl) foi adicionado para alcançar uma relação TTahZPS de 2; o pH foi regulado para o pH de acoplamento 9,0. A solução foi deixada uma hora sob regulação de pH.
Para resfriamento brusco, uma solução de glicina 2M foi adicionada à mistura PS/TTAH/CDAP.
O pH foi ajustado ao pH de resfriamento brusco (pH 9,0).
A solução foi agitada por 30 min a 25 0C e então deixada durante a noite a 2-8°C com continua lenta agitação.
Conjugado PS22F^AH-PhtD
Em um segundo método de conjugação para este sacarídeo (o primeiro sendo o método de conjugação direta de PS22-PhtD mostrado na Tabela 1), 22F foi ligado à proteína veículo via um ligador - Diidrazida de ácido adípico (ADH). O sorotipo de polissacarídeo 22F foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivação de PS 22F
A ativação e acoplamento são realizados a 25 °C sob contínua agitação em um banho de água controlado por temperatura.
O PS22F microfluidizado foi diluído para obter-se uma concentração de PS final de 6 mg/ml em NaCl 0,2 M e a solução foi ajustada a pH 6,05 ± 0,2 com HCl 0,1N.
A solução CDAP (100 mg/ml recentemente preparada em acetonitrila/WFI, 50/50) foi adicionada para alcançar a apropriada relação CDAP/PS (1,5/1 pp).
O pH foi elevado até o pH de ativação 9,00 ± 0,05 pela adição de NaOH 0,5M e foi estabilizado neste pH até a adição de ADH.
Após 3 minutos, ADH foi adicionada para alcançar a apropriada relação ADH/PS (8,9/1 p/p); o pH foi regulado ao pH de acoplamento 9,0. A solução foi largada por 1 h sob regulação de pH.
O derivativo de PSah foi concentrado e diafiltrado.
Acoplamento
PhtD a 10 mg/ml em NaCl 0,2m foi adicionada ao derivativo PS22Fah, a fim de alcançar uma relação PhtD/ps22fah de 4/1 (p/p). O pH foi ajustado a 5,0 ± 0,05 com HCl. A solução EDAC (20 mg/ml em 0,1 M Tris- HCl pH 7,5) foi adicionada em 10 min (250 μl/min), para alcançar 1 mg EDAC/mg PS22Fah· A solução resultante foi incubada por 150 min (embora 60 min fossem também usados) a 25°C sob agitação e regulação do pH. A solução foi neutralizada por adição de im Tris-CHl pH 7,5 (1/10 do volume final) e deixada 30 min a 25°C.
Antes da eluição em Sephacryl S400HR, o conjugado foi purificado usando-se um filtro Minisart de 5 μm.
O conjugado resultante tem uma relação final de PhtD/PS de 4,1 (p/p), um teor de PS abaixo de 1% e uma antigenicidade a-PS/a-PS) de 36,3% e antigenicidade anti-PhtD de 7,4%.
Purificação dos conjugados:
Os conjugados foram purificados por filtragem gel usando-se uma coluna de filtragem gel Sephacryl S400HR, equilibrada com 0,15M NaCl (S500HR para 18C) para remover pequenas moléculas (incluindo DMAP) e PS e proteína não conjugados. Com base nos diferentes tamanhos moleculares dos componentes de reação, os conjugados PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PS- pneumolisina ou PS-DT são eluídos primeiro, seguido por PS livre, em seguida por PD livre ou DT livre e, finalmente, DMAP e outros sais (NaCl, glicina).
Frações contendo conjugados são detectadas por UV280 nm. As frações são reunidas de acordo com seu Kd, filtradas estéreis (0,22 μm) e armazenadas a +2-8°C. As relações de PS/proteína das preparações de conjugado foram determinadas.
Condições de ativação/acoplamento/resfriamento brusco específicas de PS S.pneumoniae-Proteína D/TT/DT/PhtD/coniugados Ply
Onde "μfluido" aparece em um título de fileira, indica que o sacarídeo foi dimensionado por microfluidização antes da conjugação. Os tamanhos dos sacarídeos em seguida à microfluidização são dados na tabela 2.
Tabela 1 - Condições específicas de ativação/acoplamento/resfriamento brusco de PS S.pneumoniae-Proteína D/TT/DT/PhtD/ conjugados Ply
<table>table see original document page 68</column></row><table> <table>table see original document page 69</column></row><table>
Nota: pHa,c,q corresponde ao pH para ativação, acoplamento e resfriamento brusco respectivamente.
Caracterização:
Cada conjugado foi caracterizado e encontrou as especificações descritas na Tabela 2. O teor de polissacarídeo µg/m) foi medido pelo teste Resorcinol e o teor de proteína µg/ml) pelo teste Lowry. A relação PS/PD final (p/p) é determinada pela relação das concentrações.
Teor de polissacarídeo livre (%):
O teor de polissacarídeo livre de conjugados mantidos a 4°C ou estocados 7 dias a 37°C, foi determinado no sobrenadante obtido após incubação com anticorpos de proteína de veículo-α e sulfato de amônio saturado, seguido por uma centrifiigação.
Um ELISA PS-a/PS-a foi usado para a quantificação de polissacarídeo livre no sobrenadante. A ausência de conjugado foi também controlada por um ELISA de proteína de veículo-α/ PS-a.
Antigenicidade:
A antigenicidade dos mesmos conjugados foi analisada em um ELISA tipo sanduíche, em que a captura e a detecção de anticorpos foram PS- α e Proteína-α, respectivamente.
Teor de proteína livre (%):
A proteína de veículo não conjugada pode ser separada do conjugado durante a etapa de purificação. O teor de proteína residual livre foi determinado empregando-se cromatografia de exclusão de tamanho (TSK 5000-PWXL), seguida por detecção UV (214 nm). As condições de eluição permitiram separar a proteína de veículo livre e o conjugado. O teor de proteína livre nos volumes de conjugado foi então determinado versus uma curva de calibração (de 0 a 50 μg/ml de proteína veículo). A proteína veículo livre em% foi obtida como a seguir: % veículo livre = (veículo livre ^g/ml)/ (Concentração total de proteína veículo correspondente medida por Lowry Wml) * 100%). Estabilidade:
A distribuição e a estabilidade do peso molecular (Kav) foram medidas em uma filtração de gel HPLC-SEC (TSK 5000-PWXL) para conjugados mantidos a 4 °C e estocados por 7 dias a 37 °C.
A caracterização 10/11/13/14-valente é fornecida na Tabela 2 (vide comentário abaixo dela).
Os conjugados de proteína podem ser adsorvidos em fosfato de alumínio e reunidos para formar a vacina final. Conclusão:
Foram produzidos conjugados imunogênicos, que desde então mostraram ser componentes de uma vacina promissora. Tabela 2 — características dos conjugados
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* Tamanho de PS em seguida à microfluidização do PS nativo
Uma vacina 10 valente foi produzida misturando-se conjugados de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (por exemplo, a uma dose de 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 μg de sacarídeo, respectivamente, por dose humana). Uma vacina 11 valente foi produzida adicionando-se ainda o conjugado de sorotipo 3 da Tabela 5 (por exemplo, a 1 μg de sacarídeo por dose humana). Uma vacina 13 valente foi produzida adicionando-se ainda os conjugados de sorotipos 19A e 22F acima (com 22F diretamente ligado a PhtD ou alternativamente através de um ligador de ADH) [por exemplo, a uma dose de 3 μg cada de sacarídeo por dose humana].
Uma vacina 14 valente foi produzida adicionando-se ainda o conjugado de sorotipo 6A acima [por exemplo, em uma dose de 1 μg de sacarídeo por dose humana].
Exemplo 3: Evidência de que a inclusão da proteína D de Haemphilus influenzae, em uma composição imunogênica da invenção, pode fornecer proteção melhorada contra otite média aguda (AOM). Projeto de estudo.
O estudo empregou uma vacina 1 IPn-PD - compreendendo os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, cada um conjugado com a proteína D de H. Influenzae (reportar-se a Tabela 5 no Exemplo 4). Os indivíduos foram aleatorizados em dois grupos para receber quatro doses da vacina IlPn-PD ou Havrix a aproximadamente 3, 4, 5 e 12-15 meses de idade. Todos os indivíduos receberam vacina Infanrix-hexa (DTPa-HBV- IPV/Hib) da GSK Biological concomitantemente a 3, 4 e 5 meses de idade. A Infanrix-hexa é uma combinação de Pediarix e Hib misturados antes da administração. O acompanhamento da eficácia para a análise "de acordo com o protocolo" começou 2 semanas após a administração da terceira dose de vacina e continuou até 24-27 meses de idade. O transporte nasofaríngeo de S. Pneumoniae e H. Influenzae foi avaliado em um subconjunto selecionado de indivíduos.
Os pais foram aconselhados a consultar o pesquisador se sua criança ficasse doente, se tivesse dor de ouvido, perfuração espontânea da membrana timpânica ou descarga de ouvido espontânea. Se o pesquisador suspeitasse de um episódio de AOM, a criança era imediatamente reportada a um especialista de ouvido, nariz e garganta (ENT) para confirmação do diagnóstico.
Um diagnóstico clínico de AOM foi baseado na aparência visual da membrana timpânica (isto é, vermelhidão, inchação, perda de reflexo a luz) ou na presença de efusão de fluido do ouvido médio (como demonstrado por otoscopia simples ou pneumática ou por microscopia). Além disso, pelo menos dois dos sinais ou sintomas seguintes estavam presentes: dor de ouvido, descarga de ouvido, perda de audição, febre, letargia, irritabilidade, anorexia, vômito ou diarréia. Se o especialista de ENT confirmasse o diagnóstico clínico, um espécime de fluido do ouvido médio era coletado por timpanocentese para testagem bacteriológica. Para indivíduos com repetidas visitas de doente, um novo episódio de AOM foi considerado ter-se iniciado, se mais do que 30 dias tivessem decorridos, desde o início do episódio anterior. Além disso, um episódio de AOM era considerado ser um novo episódio bacteriano se o isolado de bactéria/sorotipo diferisse do isolado anterior, qualquer que fosse o intervalo entre os dois episódios consecutivos. Resultados dos experimentos
Um total de 4968 crianças foram inscritas, 2489 no grupo 11Pn-PD e 2479 no grupo de controle. Não houve maiores diferenças nas características demográficas ou fatores de risco entre os dois grupos.
Definição de episódios clínicos e casos de AOM
Durante o período de acompanhamento por protocolo, um total de 333 episódios de AOM clínica foram registrados no grupo 1 IPn-PD e 499 no grupo de controle.
A Tabela 3 apresenta a eficácia protetora da vacina 1 IPn-PD e tanto das vacinas 7-valente, anteriormente testadas na Finlândia (Eskola et al N Engl J Med 2001; 344: 403 - 409 e Kilpi et al Clin Infect Dis 2003 37:1155-64) contra qualquer episódio de AOM como de AOM causada por diferentes sorotipos pneumocócicos, H. Influenzae, NTHi e M. catarrhalis.
A estatisticamente significante e clinicamente relevante redução de 33,6% de carga de doença de AOM global foi obtida com IlPn- PD, independente da etiologia (tabela 3).
A eficácia global contra os episódios de AOM, devidos a qualquer dos sorotipos pneumocócicos 11 contidos na vacina 1 IPn-PD, foi de 57,6% (tabela 3).
Outra importante descoberta no estudo corrente é a proteção de 35,6% fornecida pela vacina 1 IPn-PD contra AOM causada por H. Influenzae (e especificamente 35,3% da proteção fornecida por NTHi). Esta descoberta é de maior significância clínica, dada a aumentada importância de H. Influenzae como uma causa maior de AOM na época da vacina conjugada pneumocócica. De acordo com a proteção fornecida contra AOM, a vacina 11Pn-PD também reduziu o transporte nasofaríngeo de H. Influenzae em seguida à dose de reforço no segundo ano de vida. Estas descobertas estão em contraste com as observações anteriores da Finlândia onde, para ambas vacinas conjugadas pneumocócicas 7-valente, um aumento nos episódios devido a H. Influenzae foi observado, (Eskola et al Kilpi et al) como evidência da substituição etiológica.
Uma clara correlação entre proteção contra episódios de AOM devidos a níveis Hi e de anticorpo contra a Proteína D veículo não pôde ser estabelecida, visto que as concentrações de anticorpo igG anti-PD pós- primárias das vacinas 11Pn-PD, que permaneceram livres de episódios AOM Hi, eram essencialmente as mesmas quanto aos níveis de anticorpos igG anti- PD pós-primários medidos nas vacinas 11Pn-PD que desenvolveram pelo menos um episódio de AOM Hi durante o período de acompanhamento da eficácia. Entretanto, apesar de não poder ser estabelecida a correlação entre o impacto biológico da vacina e a imunogenicidade anti-PD igG pós-primária, é razoável assumir que a proteína veículo PD, que é mais elevadamente conservada entre cepas de H. Influenzae, tenha contribuído em uma grande parte na indução da proteção contra Hi.
O efeito da doença AOM foi acompanhado por um efeito no transporte nasofaríngeo que foi de magnitude similar para pneumococos de sorotipo de vacina e H. Influenzae (Figura 1). Esta redução do transporte nasofaríngeo de H. Influenzae nas vacinas conjugadas-PD sustentam a hipótese de um efeito protetor direto da vacina conjugada-PD contra H. Influenzae, mesmo se a eficácia protetora não puder ser correlacionada à resposta imune igG anti-PD, como medida por ELISA.
Em um experimento a seguir, um modelo de otite média de chinchila foi usado com pools de soro de crianças imunizadas com a formulação 11 valente deste exemplo ou com a vacina 10 valente do exemplo 2 (vide também a Tabela 1 e 2 e comentários abaixo delas). Ambos pools induzem a uma significante redução da porcentagem de animais com otite média versus o pool de soro pré-imune. Não há significante diferença entre os pools imunes IOell valente. Isto demonstra que ambas as vacinas têm um potencial similar para induzir proteção contra otite média causada por H. Influenzae não tipificável neste modelo. Tabela 3
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NP = Nao pulicado; N = numero de individuos do coorte eficacia ATP; n = numero de episodios
* Sorotipos pneumococicos de vacina: para 11 Pn- PD = sorotipos 11, para Prevnar e 7v-OMP = sorotipos 7 MEF= Fluido de ouvido medio Exemplo 4:
Seleção de proteína veículo para sorotipo 19F
Ensaio ELISA empregado
O método ELISA de inibição 22F foi essencialmente baseado em um ensaio proposto em 2001 por Concepcion e Frasch e foi relatado por Henckaerts et al., 2006, Clinicai and Vaccine Immunology 13:356-360. Resumidamente, os polissacarídeos pneumocócicos purificados foram misturados com albumina de soro humano metilada e adsorvidos em placas de microtítulo de elevada ligação Nunc Maxisorp™ (Roskilde, DK) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) em PBS por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. As amostras de soro foram diluídas em PBS contendo 10% FBS5 10 μg/mL de polissacarídeo de parede celular (SSI) e 2 μg/mL de polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 22F (ATCC), e ainda diluídas nas placas de microtítulo com o mesmo tampão. Uma referência interna calibrada em relação ao soro padrão 89-SF, empregando-se as concentrações de igG específicas de sorotipo em 89-SF, foi tratada da mesma maneira e incluída em cada placa. Após lavagem, os anticorpos de ligação foram detectados usando- se anticorpo monoclonal igG anti-humano conjugado por peroxidase (Stratech Scientific Ltd., Soham, UK) diluído em 10% FBS (em PBS), e incubados por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando-se um kit de substrato de imunoensaio de enzima de tetrametilbenzidina peroxidase de componente único pronto para uso (BioRad, Hercules, CA, US) no escuro em temperatura ambiente. A reação foi parada com H2SO4 0,18 M, e a densidade óptica foi lida a 450 nm. As concentrações de igG específicas de sorotipo (em μg/mL) das amostras foram calculadas por pontos de densidade óptica de referência dentro de limites definidos da curva de soro de referência interno, que foi modelada por uma equação Iog logística de 4-parâmetros calculada com software SoftMax Pro™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O corte para o ELISA foi de 0,05 μg/mL igG para todos os sorotipos, levando-se em conta o limite de detecção e o limite de quantificação. Ensaio de opsonofagocitose
Na reunião de consulta da WHO em Junho de 2003, foi recomendado usar um ensaio OPA como exposto em Romero-Steiner et al Clin Diagn Lab Immunol 2003 10 (6): ppl019-1024. Este protocolo foi usado para testar a atividade OPA dos sorotipos nos seguintes testes.
Preparação de conjugados
Nos estudos de 11Pn-PD&Di-00l e 1lPn-PD&Di-007, três formulações de vacina 11-valente (Tabela 4) foram incluídas, nas quais 3 μg do polissacarídeo 19F foram conjugados com toxóide de difteria (19F-DT), em vez de 1 μg de polissacarídeo conjugado com proteína D (19F-PD). Os parâmetros de conjugação para os estudos 11Pn-PD, 11Pn-PD&Di-00l e 1lPn-PD&Di-007 são descritos nas Tabelas 5, 6 e 7, respectivamente.
As respostas anticorpo anti-pneumocócicas e a atividade OPA contra o sorotipo 19F, um mês em seguida à vacinação primária com estas formulações 19F-DT, são mostradas na Tabela 8 e 9, respectivamente.
A Tabela 10 mostra as concentrações de anticorpo 22F-ELISA e as porcentagens de indivíduos alcançando o limiar de 0,2 μg/mL, antes e após a vacinação de reforço de polissacarídeo 23-valente simples.
A atividade opsonofagocítica foi mostrada ser claramente melhorada para anticorpos induzidos com estas formulações 19F-DT, como demonstrado pelas mais elevadas taxas de soropositividade (títulos opsonofagocíticos > 1:8) e OPA GMTs um mês em seguida à vacinação primária (Tabela 9). Um mês após a vacinação de reforço de polissacarídeo 23-valente simples, a atividade opsonofagocítica de anticorpos 19F permaneceu significativamente melhor para crianças iniciadas com as formulações 19F-DT (Tabela 11).
A Tabela 12 apresenta dados de imunogenicidade em seguida à dose de reforço IlPn-PD em crianças que estão começando a andar previamente iniciados com conjugados 19F-DT ou 19F-PD, em comparação com uma 4a dose consecutiva de Prevnar®. Dados os casos de penetração relatados após a introdução de Prevnar® na US5 a atividade opsonofagocítica melhorada contra o sorotipo 19F, quando conjugado com a proteína veículo DT, pode ser uma vantagem para a vacina candidata.
A Tabela 13 fornece dados ELISA e OPA para o conjugado 19F-DT com relação ao sorotipo de reação cruzada 19A. Foi constatado que 19F-DT induz baixa, porém significante, atividade OPA contra 19A.
Tabela 4 Formulações de vacina conjugada pneumocócica empregadas em estudos clínicos.
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Tabela 5 Condições específicas de ativação/acoplamento/ resfriamento brusco de conjugados de proteína D/TT/DT de S.pneumoniae PS
<table>table see original document page 79</column></row><table> Tabela 6 Condições específicas de ativação/acoplamento/ resfriamento brusco de conjugados de proteína D/DT de S.pneumoniae PS para o estudo de 11 Pn-PD&Di-001
<table>table see original document page 80</column></row><table>
Tabela 7 Condições específicas de ativação/acoplamento/ resfriamento brusco de conjugados de proteína D/DT de S.pneumoniae PS para o estudo de 11 Pn-PD&Di-007
<table>table see original document page 80</column></row><table> Tabela 8 Porcentagem de indivíduos com concentração de anticorpo 19F ≥ 0,20 μg/mL e concentrações de anticorpo de média geométrica anticorpo 19F (GMCs com 95% Cl; μg/mL) um mês em seguida à vacinação primária 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT ou Prevnar (2 μg 19F- CRM) (Coorte total)
<table>table see original document page 81</column></row><table>
*A composição das diferentes formulações é fornecida na tabela 4.
Tabela 9 Porcentagem de indivíduos com título OPA 19F ≥ 1:8 e GMTs OPA 19F um mês em seguida a vacinação primária com 1 μg 19F- PD, 3 μg 19F-DT ou Prevnar (2 μg 19F-CRM) (Coorte total)
<table>table see original document page 81</column></row><table>
*A composição das diferentes formulações é fornecida na tabela 4.
Tabela 10 Porcentagem de indivíduos com concentração de anticorpo 19F ≥ 0,20 μg/mL e GMCs de anticorpo 19F μg/mL) antes de e um mês seguinte ao reforço de polissacarídeo 23-valente simples em crianças iniciadas com 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT ou Prevnar (2 μg 19F-CRM) (Coorte total) <table>table see original document page 82</column></row><table>
* A composição das diferentes formulações é fornecida na tabela 4.
Tabela 11 Porcentagem de indivíduos com título OPA 19F > 1:8 e GMTs OPA 19F antes de e um mês seguinte ao reforço de polissacarídeo 23-valente simples em crianças iniciadas com 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT ou Prevnar (2 μg 19F-CRM) (Coorte total)
<table>table see original document page 82</column></row><table>
* A composição das diferentes formulações é fornecida na tabela 4.
Tabela 12 Porcentagem de indivíduos com concentrações de anticorpo >0,2 μg/mL, OPA > 1:8 e GMCs/GMTs em relação a pneumocócicos 19F um mês em seguida ao reforço de IlPn-PD ou Prevnar em crianças iniciadas com 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT ou Prevnar (2 μg 19F-CRM) (Coorte total)
<table>table see original document page 82</column></row><table>
* A composição das diferentes formulações é fornecida na tabela 4. Tabela 13 Porcentagem de indivíduos com concentrações de anticorpo > 0,2 μg/mL, OPA > 1:8 e GMCs/GMTs em relação a pneumocócicos 19A um mês em seguida à vacinação primária com 1 μg 19F-PD, 3 μg 19F-DT ou Prevnar (2 μg 19F-CRM) (Coorte total)
<table>table see original document page 83</column></row><table>
*A composição das diferentes formulações é fornecida na tabela 4.
Exemplo 5: Experimentos adjuvantes em modelos preclínicos: impacto sobre a imunogenicidade de pneumococos conjugados de polissacarídeo 11-valente em macacos Rhesus idosos
Para otimizar a resposta eliciada para vacinas pneumocócicas conjugadas na população idosa, GSK formulou uma vacina conjugada (PS) de polissacarídeo 11-valente com um novo Adjuvante C auxiliar - vide abaixo.
Grupos de 5 macacos Rhesus idosos (14 a 28 anos de idade) foram imunizados intramuscularmente (IM) nos dias 0 e 28 com 500 μΐ de conjugados PS 11-valente adsorvidos em 315 μg de AIPO4 ou conjugados PS 11-valente misturados com Adjuvante C.
Em ambas formulações de vacina, cada um dos conjugados PS 11-valente foi composto dos seguintes conjugados PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14-PD, PS18C-PD, PS19F-PD e PS23F-DT e PS6B-DT. A vacina usada foi 1/5 de dose da dose humana da vacina (5 μg de cada sacarídeo por dose humana, exceto para conjugado 6B (10 μg) de acordo com as condições da Tabela 6 (Exemplo 4), exceto que 19F foi produzido de acordo com as seguintes condições do processo CDAP: sacarídeo dimensionado a 9 mg/ml, PD a 5 mg/ml, uma relação PD/PS inicial de 1,2/1, uma concentração CDAP de 0,75 mg/mg PS, pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 e um tempo de acoplamento de 60 min. Os níveis de IgG de ELISA anti-PS e os títulos de opsono- fagocitose foram dosados em soro coletado no dia 42. As freqüências de célula B de memória anti-PS3 foram medidas por Elispot de células sangüíneas periféricas coletadas no dia 42.
De acordo com os resultados mostrados abaixo, o Adjuvante C melhorou significativamente a imunogenicidade de conjugados PS 11-valente versus conjugados com AIPO4 em macacos idosos. O novo adjuvante acentuou a resposta igG para PS (Figura 1) e os títulos de anticorpo opsono- fagocitose (Tabela 14). Houve também evidência sustentável de que a freqüência de células de memória B específicas-PS3 é aumentada pelo uso de Adjuvante C (Figura 2).
Tabela 14, Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (títulos de opsono-fagocitose pós-II)
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Elispot de Célula B
O princípio do ensaio conta com o fato de que as células de memória B amadurecem dentro das células plasmáticas in vitro, seguindo-se a cultura com CpG por 5 dias. As células plasmáticas específicas de antígeno geradas in vitro podem ser facilmente detectadas e, portanto, serem enumeradas usando-se o ensaio elispot de célula-B. O número de células plasmáticas específicas reflete a freqüência de células de memória B no início da cultura.
Resumidamente, as células plasmáticas geradas in vitro são incubadas em placas de cultura revestidas com antígeno. As células plasmáticas específicas de antígeno formam manchas de anticorpo/antígeno, que são detectadas pelo procedimento imuno-enzimático convencional e enumeradas como células de memória B. No presente estudo, Polissacarídeos foram usados para revestir placas de cultura, a fim de enumerar as respectivas células de memória B. Os resultados são expressos como uma freqüência de células de memória B específicas de PS dentro de um milhão de células de memória B.
O estudo mostra que o Adjuvante C pode ser capaz de aliviar o conhecido problema de reforçabilidade PS3 (vide 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases, 2-6 de abril de 2006, Alice Springs, Central Austrália. Specificities of immune responses against a serotype 3 pneumococcal conjugate. Schuerman L, Prymula R, Poolman J. Abstract book ρ 245, PO10.06).
Exemplo 6, Eficácia de Pneumolisina destoxificada (dPly) como um veículo de proteína para aumentar a imunogenicidade de PS 19F em camundongos Balb/c jovens
Grupos de 40 camundongos Ba1b/c fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias O, 14 e 28 com 50 μl de PS simples 4- valente ou PS conjugado-dPly 4-valente, ambos misturados com Adjuvante C.
Ambas formulações de vacina foram compostas de 0,1 μg (quantidade de sacarídeo) de cada um dos seguintes PS: PS8, PS12F, PS19F e PS22F.
Os níveis de IgG de ELISA anti-PS foram dosados em soros coletados no dia 42.
A resposta anti-PS 19F, mostrada como um exemplo na Figura 3, foi fortemente aumentada em camundongos que receberam conjugados dPly 4-valente, em comparação com camundongos imunizados com o PS simples. A mesma melhoria foi observada para as respostas IgG anti-PS8, 12F e 22F (dados não mostrados).
Exemplo 7, Eficácia da Proteína D Tríade de Histidina Pneumocócica (PhtD) como um veículo de proteína para aumentar a imunogenicidade de PS 22F em camundongos Balb/c jovens
Grupos de 40 camundongos Balb/c fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μl de PS simples 4- valente ou PS conjugado-PhtD 4-valente, ambos misturados com Adjuvante C.
Ambas formulações de vacina foram compostas de 0,1 (quantidade de sacarídeo) de cada um dos seguintes PS: PS8, PS12F, PS19F e PS22F.
Os níveis de IgG de ELISA anti-PS foram dosados em soros coletados no dia 42.
A resposta anti-PS22F, mostrada como um exemplo na Figura 4, foi fortemente aumentada em camundongos que receberam conjugados PhtD 4-valente, em comparação com camundongos imunizados com o PS simples. A mesma melhoria foi observada para as respostas IgG anti-PS8, 12F e 19F (dados não mostrados).
Exemplo 8. Imunogenicidade em camundongos C57BI idosos de conjugados PS 13-valente, contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 30 camundongos C57BI idosos (>69 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados PS 11-valente ou conjugados PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (vide abaixo).
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 μg de sacarídeos de cada um dos seguintes conjugados: PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (vide Tabela 1 e comentário em vacina 11-valente examinada sob Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente continha a adição de 0,1 μg dos conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (vide Tabela 1 e comentário sobre vacina 13 valente examinada sob Tabela 2 [empregando-se 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o veículo de pneumolisina foi destoxificado com tratamento GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usada para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtD-E (a construção VP147 de WO 03/054007) foi usada. No grupo 6 19A foi conjugada com toxóide de difteria e 22F com proteína D.
Os níveis de IgG de ELISA anti-PS19A e 22F foram dosados em soros individuais coletados no dia 42. A resposta igG ELISA gerada para o outro PS, foi medida em soros armazenados. 19A-dPly e 22F-PhtD, administrados dentro da formulação de vacina conjugada 13-valente, mostraram-se imunogênicos em camundongos C57BI idosos (Tabela 15). A resposta imune induzida em comparação com o outro PS, não foi negativamente impactada em camundongos que receberam a formulação 13- valente, em comparação com aqueles imunizados com a formulação 11- valente.
Tabela 15 imunogenicidade PS em camundongos C57BI idosos (níveis de igG pós-III)
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Exemplo 9. Imunogenicidade em camundongos Balb/c jovens de conjugados PS 13-valente, contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 30 camundongos Balb/c jovens (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μl de conjugados PS 11-valente ou conjugados PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (vide abaixo).
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 μg de sacarídeos de cada um dos seguintes conjugados: PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (vide Tabela 1 e comentário em vacina 11-valente examinada sob Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente continha a adição de 0,1 μg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (vide Tabela 1 e comentário em vacina 13 valente examinada sob Tabela 2 [empregando-se 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o veículo de pneumolisina foi destoxificado com tratamento GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usada para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 de WO 03/054007) foi usada. No grupo 6 19Α foi conjugada com toxóide de difteria e 22F com proteína D.
Os níveis de IgG de ELISA anti-PS19A e 22F foram dosados em soros individuais coletados no dia 42. A resposta igG ELISA gerada para o outro PS, foi medida em soros armazenados. 19A-dPly e 22F-PhtD administrados dentro da formulação de vacina conjugada 13-valente, mostraram-se imunogênicos em camundongos Balb/c jovens (Tabela 16). A resposta imune induzida em comparação com o outro PS, não foi negativamente impactada em camundongos que receberam a formulação 13- valente, em comparação com aqueles imunizados com a formulação 11- valente.
Tabela 16 Imunogenicidade PS em camundongos Balb/c jovens (níveis de igG pós-III)
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Exemplo 10. Imunogenicidade em Porquinhos da índia de conjugados PS 13-valente, contendo 19A-dPIy e 22F-PhtD
Grupos de 20 Porquinhos da índia jovens (Sepa Hartley; 5 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias O, 14 e 28 com 125 μΐ de conjugados PS 11-valente ou conjugados PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (vide abaixo).
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,25 μg de sacarídeos de cada um dos seguintes conjugados: PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (vide Tabela 1 e comentário em vacina 11-valente examinada sob Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente continha a adição de 0,1 μg dos conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (vide Tabela 1 e comentário em vacina 13 valente examinada sob Tabela 2 [empregando-se 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o veículo de pneumolisina foi destoxificado com tratamento GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usada para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtD E (a construção VP147 de WO 03/054007) foi usada. No grupo 6 19A foi conjugada com toxóide de difteria e 22F com proteína D. Os níveis de IgG de ELISA anti-PS19A e 22F foram dosados em soros individuais coletados no dia 42. A resposta igG ELISA gerada para o outro PS, foi medida em soros armazenados.
Tabela 17 imunogenicidade PS em camundongos Balb/c jovens (níveis de igG pós-III)
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Exemplo 11: Formulações sendo feitas e testadas.
a) As seguintes formulações são feitas (usando-se a vacina 13 valente da tabela 1 e sorotipo 3 da tabela 5 - vide comentário em vacina 14 valente examinada sob Tabela 2 [empregando-se 22F diretamente conjugado ou através de um ligador de ADH]). Os sacarídeos são formulados com fosfato de alumínio e 3D-MPL5 como apresentado abaixo.
<table>table see original document page 92</column></row><table>
b) A mesma formulação de sacarídeo é auxiliada com cada um dos seguintes adjuvantes:
- Na tabela abaixo é apresentada a concentração dos componentes de emulsão por 500 μΐ dose. <table>table see original document page 93</column></row><table>
c) Os sacarídeos também são formulados com dois adjuvantes baseados em lipossoma:
Composição de Adjuvante B1
Qualitativa Quantitativa (por 0,5 mL dose)
Lipossomas:
- DOPC 1 mg
- colesterol 0,25 mg
3DMPL 50 μg
QS21 50
Tampão KH2PO413,124 mg
Tampão Na2HPO410,290 mg
NaCl 2,922 mg (100mM)
WFl q.s. ad. 0,5 ml Solvente
PH 6,1
1. Concentração de PO4 total = 50 mM
Composição de Adjuvante B2 Qualitativa Quantitativa (por 0,5 mL dose)
Lipossomas:
- DOPC 0,5 mg
- colesterol 0,125 mg
3DMPL 25 μg QS21 25 μ§
Tampão KH2FO413,124 mg Tampão Na2HPO410,290 mg NaCl 2,922 mg (100mM)
WFl q.s. ad. 0,5 ml Solvente PH 6,1
d) Os sacarídeos também são formulados com Adjuvante C (vide acima para outras composições, onde este adjuvante foi usado): Qualitativo Quantitativo (por 0,5 mL dose) Emulsão de óleo em água: 50 μΐ -esqualeno 2,136 mg -a-tocoferol 2,372 mg - Tween 80 0,97 mg - colesterol 0,1 mg 3DMPL 50 μg QSDl 50 μg
Tampão KH2PO410,470 mg Tampão Na2HPO410,219 mg NaCl 4,003 mg (137 mM) KCl 0,101 mg (2,7 mM)
WFl q.s. ad. 0,5 ml Solvente PH 6,8
Exemplo 12, Impacto de química de conjugação em imunogenicidade de conjugado 22F-PhtD em camundongos Balb/c
Grupos de 30 camundongos Balb/c fêmeas foram imunizados pela via intramuscular (IM) nos dias 0, 14 e 28 com formulações PS 13- valente contendo PS 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F (dose: 0,3 μg de sacarídeo / conjugado para PS 4, 18C, 19A, 19F e 22F e 0,1 μg de sacarídeo / conjugado para o outro PS).
18C PS foi conjugado com Tétano Toxóide, 19F com Toxóide de difteria, 19A com Ply destoxificado por formol, 22F com PhtD e o outro PS com PD.
Duas formulações, constituídas de 22F-PhtD preparadas por química CDAP direta ou 22F-AH-PhtD (PS derivado-ADH), foram comparadas. Vide exemplo 2, Tabela 1 e comentário sob Tabela 2 para características de vacina 13 valente, feita com 22F diretamente conjugada ou via um separador de ADH. As formulações de vacina foram suplementadas com adjuvante C.
Os níveis de igG de ELISA anti-PS22F e os títulos de opsono- fagocitose foram medidos em soros coletados no dia 42.
22F-AH-PhtD foi mostrado mais imunogênico do que 22F- PhtD, em termos tanto de níveis de igG (figura 5) como de títulos de opsono- fagocítico (figura 6).
Exemplo 13, impacto de novos adjuvantes sobre a Imunogenicidade de conjugados de PS capsulares de Streptoccoccuspneumoniae
Grupos de 40 camundongos Balb/c fêmeas foram imunizados pela via IM nos dias 0, 14 e 28 com formulações PS 13-valente contendo PS 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F (dose: 0,3 μg de sacarídeo / conjugado para PS 4, 18C, 19A, 19F e 22F e 0,1 μg de sacarídeo / conjugado para o outro PS).
18C PS foi conjugado com Toxóide de Tétano, 19F com Toxóide de difteria, 19A com Ply destoxificado por formol, 22F com PhtD e o outro PS com PD. Vide Exemplo 2, Tabela 1 e comentário sob Tabela 2 para características de vacina 13 valente feita com 22F diretamente conjugado. Quatro formulações, suplementadas com AIPO4, adjuvante Al, adjuvante A4 ou adjuvante A5, foram comparadas.
Os níveis de igG de ELISA anti-PS, PhtD e PD foram medidos em soros coletados no dia 42 e armazenados por grupo. A seguinte relação foi calculada para cada antígeno: nível de igG induzido com o novo adjuvante testado / nível igG induzido com AlPO4.
Todos os novos adjuvantes testados melhoraram pelo menos 2 vezes a resposta imune para conjugados 13-valente, em comparação com a formulação de AlPO4 clássica (figura 7).
Exemplo 14 Eficácia protetora de um combo PhtD/Ply destoxificado em um modelo de pneumonia de macaco pneumocócica
Grupos de 6 macacos Rhesus (3 a 8 anos de idade), selecionados como aqueles tendo os mais baixos níveis de anticorpo anti-19F pré-existentes, foram imunizados intramuscularmente nos dias O e 28 com conjugados PS 11 valente (isto é, 1 μg de PS 1, 3, 5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F, e 3 μg de PS 4,18C e 19F [de sacarídeo]) ou PhtD (10 μg) + Ply destoxificado por formol (10 μg) ou o adjuvante sozinho.
18C PS foi conjugado com Toxóide de Tétano, 19F com Toxóide de difteria e o outro PS com PD. Vide Exemplo 2, Tabela 1 e comentário sob Tabela 2 para características de vacina 11 valente. Todas as formulações foram suplementadas com adjuvante C.
Pneumococos tipo 19F (5.10 cfii) foram inoculados no pulmão direito no dia 42. As colônias foram contadas em lavagens bronco- alveolares coletadas nos dias 1, 3 e 7 pós-provocação. Os resultados foram expressos como o número de animais por grupo morto, pulmão colonizado ou purificado no dia 7 após provocação.
Como apresentado na figura 8, uma boa proteção próxima da significância estatística (apesar do baixo número de animais usados), foi obtida com conjugados 11-valente e o combo PhtD+Dply (p < 0,12, teste Fisher Exact), em comparação com o grupo adjuvante sozinho. Exemplo 15 Impacto de química de conjugação na resposta de anticorpo anti-PhtD e a eficácia protetora em comparação com uma provocação tipo 4 induzida por conjugados 22F-PhtD
Grupos de 20 camundongos OFl fêmeas foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0 e 14 com 3 μg de 22F-PhtD (preparada por química CDAP direta) ou 22F-AH-PhtD (PS derivado-ADH), ou o adjuvante sozinho. Ambos conjugados 22F monovalentes foram produzidos pelo processo do Exemplo 2 (vide também Tabela 1 e Tabela 2). Cada formulação foi suplementada com adjuvante C.
Os níveis de igG de ELISA anti-PhtD foram medidos em soros coletados no dia 27.
Os camundongos foram provocados intranasalmente com 5. IO6 cfu de pneumococos tipo 4 no dia 28 (isto é, um sorotipo pneumocócico potencialmente não revestido pelo PS presente na formulação de vacina testada). A mortalidade induzida foi monitorada até o dia 8 pós-provocação. 22F-AH-PhtD induziu uma significativamente mais elevada resposta igG anti- PhtD e melhor proteção em relação à provocação tipo 4 do que 22F-PhtD.

Claims (136)

1. Composição imunogênica para bebês, caracterizada pelo fato de compreender uma vacina de Streptococcus pneumoniae multivalente, compreendendo 2 ou mais (p. ex., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) conjugados de sacarídeo capsular de diferentes sorotipos, dita composição compreendendo um conjugado de sacarídeo de sorotipo 22F.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender conjugados de sacarídeo capsular de Streptoeoceus pneumoniae dos sorotipos 19A e/ou 19F.
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de compreender conjugados de sacarídeo capsular de Streptoeoceus pneumoniae dos sorotipos 19A e 19F, em que 19A é conjugado com uma proteína veículo, que é um primeiro toxóide bacteriano e 19F é conjugado com um segundo toxóide bacteriano.
4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de o primeiro toxóide bacteriano ser uma diferente proteína para a segunda toxina bacteriana.
5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de o primeiro toxóide bacteriano ser selecionado do grupo consistindo de toxóide do tétano, toxóide da difteria, CRM197, toxóide da coqueluche, uma citolisina e pneumolisina bacterianas.
6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de o segundo toxóide bacteriano ser selecionado do grupo consistindo de toxóide do tétano, toxóide da difteria, CRMl97, toxóide da coqueluche, uma citolisina e pneumolisina bacterianas.
7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de o primeiro toxóide bacteriano ser pneumolisina.
8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizada pelo fato de o segundo toxóide bacteriano ser toxóide da difteria.
9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de compreender ainda conjugados de sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae 4, 6B, 9V, -14, 18C e 23F.
10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de compreender ainda conjugados de sacarídeos capsulares de Streptoeoceus pneumoniae 1, 5 e 7F.
11. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações -1 a 10, caracterizada pelo fato de compreender ainda um conjugado de sacarídeo capsular 3 de Streptoeoceus pneumoniae.
12. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações -1 a 11, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo capsular 6A de Streptoeoceus pneumoniae.
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de 2 diferentes proteínas veículo serem separadamente conjugadas com pelo menos 2 diferentes sorotipos de sacarídeo capsular de Streptoeoceus pneumoniae.
14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de 3 diferentes proteínas veículo serem separadamente conjugadas com pelo menos 3 diferentes sorotipos de sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae.
15. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de 4 diferentes proteínas veículo serem separadamente conjugadas com pelo menos 4 diferentes sorotipos de sacarídeo capsular de Streptoeoceus pneumoniae.
16. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de 5 diferentes proteínas veículo serem separadamente conjugadas com pelo menos 5 diferentes sorotipos de sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae.
17. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de compreender 2 ou mais das proteínas veículo selecionadas da seguinte lista: toxóide do tétano, toxóide da difteria, pneumolisina, Proteína D e PhtD ou suas proteínas de fusão.
18. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 1 de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D.
19. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 3 de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D, pneumolisina ou PhtD ou sua proteína de fusão.
20. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 4 de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D.
21. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 5 de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D.
22. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 6B de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D.
23. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 7F de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D.
24. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 9V de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com proteína D.
25. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 14 de Streptococcus pneumoniae, conjugado com proteína D.
26. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 23F de Streptococcus pneumoniae, conjugado com proteína D.
27. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 18C de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com toxóide do tétano.
28. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 19A de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com pneumolisina.
29. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 22F de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com PhtD ou sua proteína de fusão.
30. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 6A de Streptoeoceus pneumoniae, conjugado com pneumolisina ou uma proteína de H. infíuenzae, opcionalmente proteína D ou PhtD ou sua proteína de fusão.
31. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um sacarídeo capsular 19A diretamente conjugado com a proteína veículo.
32. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pelo fato de o sacarídeo capsular 19A ser conjugado com a proteína veículo via um ligante.
33. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -32, caracterizada pelo fato de o ligante ser ADH.
34. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -32 ou 33, caracterizada pelo fato de o ligante ser ligado à proteína veículo por química de carbodiimida, preferivelmente usando-se EDAC.
35. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 31a 34, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 19A ser conjugado com a proteína veículo ou com o ligante, empregando-se química CDAP.
36. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sorotipo 19A, em que a relação de proteína veículo para sacarídeo 19A é entre 5:1 e 1:5, 4:1 e 1:1 ou 3,5:1 e 2,5:1 (p/p).
37. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um sacarídeo capsular 19F diretamente conjugado com a proteína veículo.
38. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizada pelo fato de o sacarídeo capsular 19F ser conjugado com a proteína veículo via um ligante.
39. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -38, caracterizada pelo fato de o ligante ser ADH.
40. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -38 ou 39, caracterizada pelo fato de o ligante ser fixado à proteína veículo por química de carbodiimida, preferivelmente usando-se EDAC.
41. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 40, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 19F ser conjugado com a proteína veículo ou com o ligante, empregando-se química CDAP.
42. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo 19F, em que a relação de proteína veículo para sacarídeo 19F é entre 5:1 e 1:5, 4:1 e 1:1 ou 2:1 e 1:1 (p/p) ou 1,5:1 e 1,4:1.
43. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um sacarídeo capsular 22F diretamente conjugado com a proteína veículo.
44. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizada pelo fato de compreender sacarídeo capsular 22F, conjugado com proteína veículo, via um ligante.
45. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -44, caracterizada pelo fato de o ligante ser ADH.
46. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -44 ou 45, caracterizada pelo fato de o ligante ser ligado à proteína veículo por química de carbodiimida, preferivelmente empregando-se EDAC.
47. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 22F ser conjugado com a proteína veículo ou com o ligante, empregando-se química CDAP.
48. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo 22F, em que a relação da proteína veículo para o sacarídeo 22F é entre 5:1 e 1:5, 4:1 e 1:1 ou 2:1 e 1:1 (p/p).
49. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo 19A, em que o tamanho médio (p. ex., Mw) do sacarídeo 19A é acima de 100 kDa.
50. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -49, caracterizada pelo fato de o tamanho médio (p. ex., Mw) do sacarídeo 19A ser entre 50 e 800 kDa, 110 e 700 kDa, 110 - 300, 120 - 200, 130 - 180 ou -140- 160 kDa.
51. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 19A ser um polissacarídeo nativo ou ser dimensionado por um fator de não mais do que x5.
52. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 49 a 51, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 19A ter sido dimensionado por microfluidização.
53. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo de sorotipo 19A, em que a dose do conjugado de sacarídeo 19A é entre 1 e 10 μg, 1 e 5 μg ou 1 e 3 μg de sacarídeo.
54. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de a dose do conjugado de sacarídeo 19A ser de 3 μg de sacarídeo.
55. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo 22F, em que o tamanho médio (p. ex., Mw) do sacarídeo 22F é acima de 100 kDa.
56. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de o tamanho médio (p. ex., Mw) do sacarídeo 22F ser entre 50 e 800 kDa, 110 e 700 kDa, 110 - 300, 120 - 200, 130 - 1809 ou 150- 170 kDa.
57. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 22F ser um polissacarídeo nativo ou ser dimensionado por um fator de não mais do que x5.
58. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 55 a 57, caracterizada pelo fato de o sacarídeo 22F ter sido dimensionado por microfluidização.
59. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo 22F de sorotipo, em que a dose do conjugado de sacarídeo 22F é entre 1 e 10 μg ou 1 e 3 μg de sacarídeo.
60. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de a dose do conjugado de sacarídeo 22F ser 3 μg de sacarídeo.
61. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de o tamanho médio (p. ex., Mw) dos sacarídeos ser acima de 50 kDa, p. ex., 50 - 1600, 80 - 1400, - 100 - 1000, 150 - 500 ou 200 - 400 kDa.
62. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de o sorotipo 1 (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex. Mw) entre 100 - 1000, 200 - 800, 250 - - 600 ou 300 e 400 kDa.
63. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo 4 (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 50 - 500, - 60- 300, 70 - 200 ou 75 e 125 kDa.
64. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações - 61 a 63, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo 5 (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 100 - - 1000, 200 - 700, 300 - 500 ou 350 e 450 kDa.
65. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 64, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo 6B (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 500 - 1600, 750 - 1500 ou 1000 e 1400 kDa.
66. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 65, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo 7F (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 50 - 1000, 100 - 750, 150 - 500 ou 200 e 300 kDa.
67. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 66, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo 9V (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 50 - 1000, 100 - 750, 150 - 500, 200 - 400 ou 250 e 300 kDa.
68. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 67, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo -14 (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 50 - 1000, 100 - 750, 150 - 500 ou 200 e 250 kDa.
69. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 68, caracterizada pelo fato de compreender o sorotipo -23F (conjugado de sacarídeo) tendo um tamanho médio de sacarídeo (p. ex., Mw) entre 500 - 1500, 700 - 1300, 800 - 1100 ou 900 e 100 kDa.
70. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender os sorotipos 5, 6B e 23F (e opcionalmente 6A) como sacarídeos nativos.
71. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de a dose dos conjugados de sacarídeo capsular ser entre IelO μg, 1 e 5 μg ou 1 e 3 μg de sacarídeo por conjugado.
72. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender os conjugados de sorotipos 4, 18C, 19F e 22F (e opcionalmente 19A), em dosagens de 3 μg de sacarídeo por conjugado.
73. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender conjugados de sorotipos 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F (e opcionalmente 6A e/ou -3) em dosagens de 1 μg de sacarídeo por conjugado.
74. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender ainda sacarídeos de Streptococcus pneumoniae não conjugados de sorotipos diferentes daqueles conjugados, de modo que o número de sorotipos de sacarídeo conjugado e não-conjugado seja menor do que ou igual a 23.
75. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender ainda uma ou mais proteínas de Streptoeoceus pneumoniae conjugadas ou não conjugadas.
76. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -75, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais proteínas de Streptoeoceus pneumoniae não-conjugadas.
77. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -75 ou 76, caracterizada pelo fato de dita uma ou mais proteínas de Streptoeoceus pneumoniae ser(em) selecionada(s) da família Tríade da Poli Histidina (PhtX)5 família da Proteína de Ligação da Colina (CbpX), trancados CbpX, família LytX, trancados LytX, proteínas quiméricas de trancado CbpX-trancado LytX, pneumolisina desintoxicada (Ply), PspA, PsaA, Sp 128, Sp101, Spl30, Sp 125 e Spl33.
78. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações -75 a 77, caracterizada pelo fato de compreender pneumolisina.
79. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 78, caracterizada pelo fato de compreender uma proteína PhtX.
80. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender pneumolisina como proteína livre ou veículo.
81. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender uma proteína PhtX como proteína livre ou veículo.
82. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -81, caracterizada pelo fato de dita proteína PhtX ser PhtD ou uma ponto de fusão PhtBD ou PhtDE.
83. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender ainda um adjuvante.
84. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -83, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender um veículo de lipossoma.
85. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -84, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de0,5 ml) -0,1 - 10 mg, 0,2 - 7, 0,3 - 5, 0,4 - 2 ou 0,5 - 1 mg (p. ex., 0,4 - 0,6, 0,9-1,1, -0,5 ou 1 mg) de fosfolipídeo (por exemplo, DOPC).
86. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -84 ou 85, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 0,025 - 2,5, 0,05 - 1,5, 0,075 - 0,75, 0,1 - 0,3 ou 0,125 - 0,25 mg (p. ex., -0,2 - 0,3, 0,1 - 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo, colesterol).
87. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações -84 a 86, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 5 - 60, 10 - 509 ou 20 - 30 μg (p. ex., 5 - 15, 40 - 50, 10, 20, 30, 40 ou -50 μg) de derivativo de lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL).
88. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações -84 a 87, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 5 - 60, 10 - 50 ou 20 - 30 μg (p. ex., 5 - 15, 40 - 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de saponina (por exemplo, QS21).
89. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -83, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender uma emulsão de óleo em água.
90. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -89, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) - 0,5 - 15, 1 - 13, 2 -11, 4 - 8 ou 5 - 6 mg (ρ. ex., 2 - 3, 5 - 6 ou 10 - 11 mg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno).
91. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 0,1 - 10 0,3 - 8, 0,6 - 6, 0,9 - 5, 1 - 4, ou 2 - 3 mg (p. ex., 0,9 - 1,1, 2 -3 ou 4 - 5 mg) de emulsificante (tal como Tween 80).
92. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 89 a 91, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 0,5 - 20, 1 - 15, 2 - 12, 4 - 10, 5 - 7 mg (p. ex., 11 - 13, 5 - 6 ou 2 - 3 mg) de tocol (tal como alfa tocoferol).
93. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 89 a 92, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 5 - 60, 10 - 50 ou 20 - 30 μg (p. ex., 5 - 15, 40 - 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de derivativo de lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL).
94. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 89 a 93, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 0,025 - 2,5, 0,05 - 1,5, 0,075 - 0,75, 0,1 - 0,3 ou 0,125 - 0,25 mg (p. ex., - 0,2 - 0,3, 0,1 - 0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo, colesterol).
95. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 89 a 94, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 5 - 60, 10 - 50 ou 20 - 30 μg (p. ex., 1 - 15, 40 - 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de saponina (por exemplo, QS21).
96. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender um sal metálico e derivativo de lipídeo A.
97. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) - 100 - 750, 200 - 500 ou 300 - 400 μg Al como fosfato de alumínio.
98. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -96 a 97, caracterizada pelo fato de o adjuvante compreender (por dose de 0,5 ml) 5 - 60, 10 - 50 ou 20 - 30 μg (ρ. ex., 5 - 15, 40 - 50 ou 10, 20, 30, 40 ou 50 μg) de derivativo de lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL).
99. Kit de vacina, caracterizado pelo fato de compreender uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 82 e ainda compreender, para administração concomitante ou seqüencial, um adjuvante como definido em qualquer uma das reivindicações 83 a 98.
100. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender a composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 101 a 98 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
101. Processo para produzir a vacina como definida na reivindicação 100, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de misturar a composição imunogênica de qualquer uma das reivindicações 1 a 98 com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
102. Método para imunizar um hospedeiro humano contra doença causada por infecção por Streptococcus pneumoniae, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da composição imunogênica de qualquer uma das reivindicações 1 a 98 ou a vacina da reivindicação 100.
103. Método de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de o hospedeiro humano ser idoso e a doença ser uma ou outra ou ambas de pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD).
104. Método de acordo com a reivindicação 102 ou 103, caracterizado pelo fato de o hospedeiro humano ser idoso e a doença ser exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD).
105. Método de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de o hospedeiro humano ser infantil e a doença ser otite média.
106. Método de acordo com a reivindicação 102 ou 105, caracterizado pelo fato de o hospedeiro humano ser infantil e a doença ser meningite e/ou bacteriemia.
107. Método de acordo com as reivindicações 102, 105 ou -106, caracterizado pelo fato de o hospedeiro humano ser infantil e a doença ser pneumonia e/ou conjuntivite.
108. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 1 a 98 ou a vacina de acordo com a reivindicação 100, caracterizada pelo fato de serem para uso no tratamento ou prevenção da doença causada por infecção por Streptococcus pneumoniae.
109. Uso da composição ou vacina imunogênica como definida nas reivindicações 1 a 98 ou vacina como definido na reivindicação -100, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por infecção por Streptococcus pneumoniae.
110. Uso de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de a doença ser uma ou outra ou ambas de pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD) de humanos idosos.
111. Uso de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado pelo fato de a doença ser exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) de humanos idosos.
112. Uso de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de a doença ser otite média de humanos bebês.
113. Uso de acordo com a reivindicação 109 ou 112, caracterizado pelo fato de a doença ser meningite e/ou bacteriemia de humanos bebês.
114. Uso de acordo com as reivindicações 109, 112 ou 113, caracterizado pelo fato de a doença ser pneumonia e/ou conjuntivite de humanos bebês.
115. Método para eliciar uma resposta imune protetora em bebês contra otite média, caracterizado pelo fato de compreender a administração, como componentes separados ou combinados, seqüencial ou concomitantemente (i) uma composição ou vacina imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 98 e (ii) Proteína D de Haemophilus influenzae, proteína D esta podendo ser livre e/ou conjugada.
116. Método para eliciar uma resposta imune protetora em bebês contra Streptococcus pneumoniae, caracterizado pelo fato de ser pela administração da composição ou vacina imunogênica de qualquer reivindicação precedente.
117. Método para eliciar uma resposta imune protetora em idosos contra Streptococcus pneumoniae, caracterizado pelo fato de ser pela administração em combinação, seqüencial ou concomitantemente (i) da composição ou vacina imunogênica de qualquer reivindicação precedente (ii) de uma ou mais das proteínas de superfície de Streptoeoceus pneumoniae selecionadas do grupo consistindo da família Phtx e pneumolisina.
118. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 1 a 98 ou vacina da reivindicação 100, caracterizada pelo fato de compreender conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F, em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais dos componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significativamente inferior àquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
119. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -118, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 4 não é significativamente inferior àquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
120. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação -118 ou 119, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 6B não ser significativamente inferior àquela induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
121. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 118 a 120, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 9V não ser significativamente inferior àquela induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
122. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 118 a 121, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 14 não ser significativamente inferior àquela induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
123. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 118 a 122, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 18C não ser significativamente inferior àquela induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
124. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 118 a 123, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 19F não ser significativamente inferior àquela induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
125. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 118 a 124, caracterizada pelo fato de o título de anticorpo GMC induzido contra o sorotipo 23 F não ser significativamente inferior àquela induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
126. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 118 a 125, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo de sorotipo 3.
127. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 118 a 126, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo de sorotipo 6A.
128. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 118 a 127, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo de sorotipo 19A.
129. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 118 a 128, caracterizada pelo fato de compreender um conjugado de sacarídeo de sorotipo 22F.
130. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos quatro conjugados de sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, contendo sacarídeos de diferentes sorotipos de Streptococcus pneumoniae, em que pelo menos um sacarídeo é conjugado com PhtD ou sua proteína de fusão e a composição imunogênica ser capaz de eliciar uma resposta imune eficaz contra PhtD.
131. Método para evitar que um hospedeiro humano idoso tenha uma doença pneumocócica causada por infecção por sorotipo 22F de Streptoeoceus pneumoniae (ou reduzir sua severidade), caracterizado pelo fato de compreender administrar a um hospedeiro bebê (ou uma população bebê) uma dose imunoprotetora da composição imunogênica de qualquer uma das reivindicações 1 a 98 ou a vacina da reivindicação 100.
132. Método de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de a doença ser uma ou outra ou ambas de pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD).
133. Método de acordo com a reivindicação 131 ou 132, caracterizado pelo fato de a doença serem exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD).
134. Uso da composição ou vacina imunogênica como definida na reivindicações 1 a 98 ou vacina como definido na reivindicação 100, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para a prevenção ou redução da severidade de uma doença causada por infecção por Streptoeoceus pneumoniae de sorotipo 22F em pacientes idosos, em que uma dose imunoprotetora de dita composição ou vacina é administrada em um bebê (ou população bebê).
135. Uso de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de a doença ser uma ou ambas de pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD) de humanos idosos.
136. Uso de acordo com a reivindicação 134 ou 135, caracterizado pelo fato de a doença serem exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) de humanos idosos.
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