JP2851288B2 - 癌診断および管理における自己分泌運動性因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、一般に、癌診断および管理の分野に関す
る。より詳細には、本発明は、新規の腫瘍運動性因子お
よび癌診断、予防および治療への新しいアプローチを工
夫する際におけるそれらの利用に関する。

背景技術 細胞運動は、腫瘍細胞が侵入および転移の複雑なカス
ケードにおける多くの段階を横断するのに必要である。
かかる段階としては、一次腫瘍から隣接組織への細胞の
剥離および爾後の浸潤、血管壁を通して循環への細胞の
移動（血管内異物侵入）、および細胞の二次部位への血
管外遊出が挙げられている。脈管構造の内皮基底膜など
の生物学的バリヤーを通しての細胞の運動は、走化性機
構によって生ずることがある。若干の腫瘍細胞の生体外
走化性に関する研究は、各種の化合物、例えば、補体誘
導物質、コラーゲンペプチド、ホルミルペプチド、およ
び或る結合組織成分が化学誘引物質として作用できるこ
とを示している。トダロ等（Proc.Natl.Acad.Sci USA,
77:5258−5262,1980）は、転換された細胞用自己分泌成
長因子を報告している。各種の他の成長因子も、既知で
ある。しかしながら、腫瘍細胞の走化性運動性（指向
性）およびケモキネシスの（ランダム）運動性を制御す
る自己分泌因子の存在および役割は、従来、既知または
記載されていない。細胞運動は、細胞成長および増殖と
異なる細胞挙動の面であることにここで留意することは
重要であることがある。

発明の開示 それゆえ、本発明の目的は、腫瘍細胞の運動性を制御
する自己分泌因子（かかる自己分泌因子をここで「AM
F」と呼ぶ）を同定し且つ提供することにある。

本発明の更に他の目的は、AMFまたはAMF受容体に特異
的な結合親和力を有する抗体を提供することにある。

本発明のなお更に他の目的は、ヒトにおける転移およ
び腫瘍脈管形成を検出し、局在化し且つ予測するための
キットを提供することにある。

本発明のなお別の目的は、ヒトにおける転移侵入およ
び癌増殖を予測し、予防し且つ／または治療するための
方法を提供することにある。

本発明の追加の目的は、製薬上許容可能は担体中に腫
瘍細胞の運動性を抑制するたにAMFに対する有効量の中
和抗体を含む医薬組成物を提供することにある。

本発明の各種の他の目的および利点は、本発明の具体
的な説明から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および付
随の利点の多くは、添付図面と共に考慮する時に下記の
具体的な説明を読む際により良く理解されるであろう： 第１図はボイデンテストの略図を示し、 第２図は（ａ）懸濁された腫瘍細胞に結合する¹²⁵I−
AMFのスキャッチャード分析；および（ｂ）精製AMFに対
する細胞運動の用量応答曲線を示す。

発明を実施するための最良の形態 本発明の前記目的および各種の他の目的および利点
は、下記性質を有するポリペプチドによって達成され
る：（ａ）哺乳動物の細胞によって分泌され且つ生産的
細胞のランダム移動を刺激し、（ｂ）分子量＞30,000を
有し；且つ（ｃ）百日咳毒素によって抑制される。本発
明のポリペプチドは、少なくとも一部分または全部でNH
₂末端（単一文字コード）またはポリペプチドの活性フ
ラグメントのNH₂末端で下記アミノ酸配列順序を有する
ことが見出された： DKELRFRDCTKSLAEANKK 特に断らない限り、ここで使用するすべての技術的お
よび科学的用語は、当業者によって通常理解される意味
と同じ意味を有する。ここに記載の方法および材料と同
様または均等のいかなる方法および材料も本発明の実施
または試験において使用できるが、好ましい方法および
材料について今や説明する。後述のすべての刊行物は、
参照としてここに編入する。

材料および方法 細胞系 ヒトMDA231およびMDA435乳癌細胞系をATCCから得、10
％ウシ胎児血清が補給されたダルベッコ修正イーグル培
地（DMEM）中で培養した。これらのエストロゲン独立細
胞系の両方とも、外側尾静脈への５×10⁵個の細胞を注
射してから６週間後に６週齢のNIHヌードマウスの肺に
転移を生ずる。

自己分泌運動性因子の単離および精製 MDA231およびMDA435ヒト乳癌細胞を添加タンパク質の
不在下でDMEM中で60％コンフルーエンシーに成長する。
培地を凍結乾燥し、残渣を蒸留H₂O約2mlに溶解する。こ
の溶液をPD−10（セファデックスG25培地）カラムに適
用する。最初の2.5mlを捨て、次の4mlを捕集する。流出
液は、低分子量物質から分離されたAMFを含有する。こ
の捕集画分を10×ホルフェート緩衝食塩水（PBS）でpH
7.4の0.02Mホルフェート緩衝食塩水とし、PBS中のセフ
ァクリルＳ−300カラムに適用する（カラム源）。PBSで
の溶離は、分子量約54KDaを有する物質に対応する活性
画分を生ずる。この画分を透析し、25倍に濃縮する。こ
の物質をpH8.0の50mMトリス−アセテートとし、モノＱ
陰イオン交換カラム（源）に適用し、下記修正を施した
線形塩勾配（０〜1M NaCl）で溶離する:NaCl濃度が0.2
5Mに達した時に、前記勾配を取る前に、この濃度を10分
間保持する。AMFを0.3M〜0.4M NaCl画分中で溶離す
る。活性画分を透析し、小さい容量（約0.5ml）に濃縮
する。濃縮物をpH7.4の規定食塩水中の0.02Mホスフェー
トとする。これをPBS中のヘパリンカラムに適用する。
カラムは、AMFを0.35Mと0.4塩勾配との間で溶離するNaC
lの線形勾配（0.15M〜1M）で溶離する。各精製工程後、
カラム画分（塩を除去するために透析された）を修正ボ
イデンチェンバー法によって運動性刺激活性に関して検
定する。

細胞運動の検定法 運動性の検定は、修正ボイデン（ジグモンド等、J.Ex
p.Med.137:387−410,1973）チェンバーの使用によって
達成される。これは、孔径約８μを有する微孔性ポリカ
ーボネートフィルターによって水平方向に分離された２
つのウェルからなる装置（第１図）である。運動性刺激
薬（または科学誘引物質）を下部ウェルに入れてフィル
ターと接触させる。上部ウェルに約10⁶個の細胞/mlの濃
度の細胞（例えば、A2085黒色腫細胞）の懸濁液を加え
る。次いで、チェンバーを37℃で空気とCO₂約５％との
雰囲気中で加湿インキュベーターに約４時間置く。この
際に、細胞は重力によってフィルターの上側上に沈積さ
れる。しかしながら、若干の細胞（約５〜10％）は、運
動性刺激薬に応答してフィルターの下側に移動する。細
胞の平均直径が孔径よりも大きいので、エネルギーの消
費は、移動時に生じなければならない。培養期間の終わ
りに、フィルターを取り外し、固定染色操作に付す。こ
のことは、先ずフィルターをメタノール含有溶液に約２
分間浸漬し、次いで、エオシン溶液に２分間浸漬し、次
いで、ヘマトキシリン溶液に３分間浸漬することを包含
する。その後、フィルターを水中で洗浄し、上側を上に
しつつガラススライド上に置く。上側上の染色細胞のボ
タンを乾燥ティッシュペーパーの小片で完全に除去す
る。次いで、フィルターを通して移動した染色細胞は、
明らかになる。これらを約500Xの倍率で顕微鏡によって
計数する。５つの異なる高いパワーフィールドを１つの
接眼レンズにおけるグリッドで可視化し、５つのフィー
ルドにおける細胞を計数し、平均を計算する。正の制御
／負の制御の比率≧５は、細胞の運動性刺激薬への正の
応答を示す。

ランダムおよび有向（走化性）運動性の測定 ランダム運動性の測定は、細胞を固定濃度の刺激薬に
さらし、前記のように移動を測定することによって達成
される。このことは、検定培養前に、等しく増大する濃
度の誘引物質を上部ウェルと下部ウェルとの両方に加え
ることを包含する。次いで、誘引物質の量の関数として
の細胞のランダム移動を測定する。有向移動は、細胞が
負勾配（下部ウェルよりも上部ウェルにおいて高い濃
度）よりも正勾配（上部ウェルと比較して下部ウェルに
おいて高い濃度の誘引物質）でより良く移動するなら
ば、生ずる。かかる検定結果を結果の「チェッカー盤」
表に示す（表１）。ランダム運動性は、AMFに応答するA
2058黒色腫細胞の場合に全く有意であることがわかる。

「対角線」は、細胞のランダム移動を示す。下方の三
角形は、運動性刺激薬の正の勾配での細胞の有向移動を
示す。

AMF誘導運動性に包含される細胞経路の検定 材料:L−グルタミン（２μｇ）、ペニシリンおよびス
トレプトマイシンを有し熱不活性ウシ胎児血清10％を有
するか有していないDMEM補給物を市販源、例えば、メロ
イ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（バージニ
ア州スプリングフィールド）から購入した。百日咳毒素
およびコレラ毒素をリスト・バイオロジカル・ラボラト
リーズ・インコーポレーテッド（カリフォルニア州キャ
ンベル）から得た。ホルボール12−ミリステート13−ア
セテート（PMA）、ホルボール12,13−ジデカノエート
（PDD）、カルシウムイオノフォアA23187、ジルチアゼ
ム、ニフェジピン、ベラパミル、トリフルオペラジン、
ロイペプチン、フォルスコリンおよび８−Br cAMPは、
すべてシグマ・ケミカル・カンパニー（ミズーリ州セン
トルイス）から購入した。１−オレオイル−２−アセチ
ルグリセロールをモレキュラー・プローブズ（オレゴン
州オイゲン）から購入した。ヌクレオポア膜（ポリビニ
ルピロリドンを含まない）並びに48−ウェル走化性チェ
ンバーをニューロ・プローブ・インコーポレーテッド
（メリーランド州キャビン・ジョーン）から購入した。

細胞培養：ヒト黒色腫細胞系A2058を前記のトダロ等
によって記載のように維持した。

自己分泌運動性因子の産生：前記技術の修正においては
（リオッタ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:3302−3306,
1986）、A2058細胞をタンパク質補給なしにDMEMに48時
間接種した。分子量カットオフ30,000ダルトンのセント
リコン限外濾過組立体を使用して、培地を濃縮した。

走化性検定：細胞運動を測定するために使用する検定
は、ハーバス等（1980年）、前記のハーバス等（1986
年）によって記載の技術の修正法であった。この技術A2
058に従って、黒色腫細胞（全面の約75〜90％）をトリ
プシン−EDTAで収穫し、室温でウシ胎児血清10％が補給
されたDMEMに少なくとも１時間回収した。次いで、細胞
をウシ血清アルブミン1mg/mlを有するDMEMに２×10⁶ml
で再懸濁した。検定を、タイプIVコラーゲンが被覆され
た８μｍのヌクレポア膜を有する48ウェルミクロ走化性
チェンバー（前記ハーバス等、1980年）で実施した。チ
ェンバーを37℃で４〜５時間インキュベーションし、次
いで、ディフ・クイック染色剤（アメリカ・サイエンテ
ィフィック）を使用して顕色した。細胞ペレットが表面
から吹き取られるように元の細胞側を上にしつつ染色さ
れた膜をガラススライド上に置いた。細孔を通して移動
した細胞をガラスと膜との間でトラップし、高いパワー
フィールド（500X）で光学顕微鏡によって容易に計数で
きた。未刺激ランダム移動は、有向移動の＜20％であっ
た。

走化性検定前または走化性検定時、化学薬品を細胞と
同時培養して細胞代謝を変更するか、ケモキネシス応答
を刺激することができた。検定の初めに、化学薬品も下
部チェンバーに加えて走化性ポテンシャルを実証するこ
とができた。

AMFに対するネズミ抗体の産生 精製AMFタンパク質（10μｇ）をフロイント完全アジ
ュバントで乳化し、3C3Hマウスの肉趾に注射した。２週
間後、マウスを0.1mlの容量で尾静脈に静脈内注射され
たPBS中のAMF5μｇで補助注射した。１ヶ月後、マウス
を放血し、血清を腫瘍細胞運動を抑制する能力に関して
試験した。この検定においては、マウス血清をボイデン
チェンバー移動検定におけるAMFで予備培養した。1/100
0の希釈度において、マウス血清は、プールしたマウス
血清コントロールと比較して腫瘍細胞運動の抑制率90％
を生じた。精製AMFタンパク質（10μｇ）をフロイント
完全アジュバントに乳化し、ニュージーランドホワイト
ラビットの背中上の皮下部位に注射した。ブースター注
射液５μｇを６週および12週で適用した。３ヶ月および
４ヶ月に、ラビットを放血し、血清を運動性抑制活性に
関して試験した。1/1000の用量において、免疫血清は、
コントロール予備免疫血清と比較して運動性を壊滅させ
た。血清を56℃で30分間熱不活性化した。

AMF純度の測定 単離されたAMFの純度を下記判定基準によって測定し
た： （ａ）単一の54kDAバンドは、技術上周知の標準法によ
って実施された一次元および二次元ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で見出された。タンパク質は、銀染色剤で
同定された。

（ｂ）ゲルから切断されたタンパク質バンドは、運動性
刺激活性を保持する。

（ｃ）NH₂末端アミノ酸配列順序（１〜19）は、各サイ
クルにおいて１つの種類のアミノ酸残基を示す。

（ｄ）ネズミおよびウサギ抗AMF抗体は、ヒト腫瘍AMFの
運動性刺激活性を遮断する。

前記判定基準に基づいて、本発明の単離AMFは、実質
状純粋であることが見出された。ここで使用する「実質
上」なる用語は、標準技術によって得るためにできるだ
け純粋であることを意味する。

アミノ酸配列順序付け 製造業者によって与えられるトリフルオル酢酸化学を
使用して、精製AMFのエドマン分解をアプライド・バイ
オシステムズ（カリフォルニア州フォスター・シティ
ー）モデル470A気相シークエンサーで実施する。フェニ
ルチオダントインアミノ酸を、パーキング−エルマーシ
リーズ3B HPLCおよび紫外線検出を使用することによっ
て同定し、定量化した。

百日咳毒素の用量応答および時間経過および運動性に対
する効果：百日咳毒素（PT）をフラスコ中での一晩の培
養のために、検定前の各種の期間の予備培養のために、
または検定開始後の異なる時点でA2058に加えた。試験
したPT用量は、約10ng/ml〜1.5μg/mlであった。試験さ
れた用量のいずれかにおける細胞生存率は、未処理コン
トロールにおける生存率（＞90％）に匹敵した。次い
で、処理細胞および未処理細胞をA2058ならし培地に対
する運動性応答に関して試験した。DMEM単独に応答する
細胞運動は、細胞の各処理群の負のコントロールとして
包含した。

試験PT用量のいずれかでの細胞の一晩培養は、細胞運
動の有意の抑制を生じた（表２）。0.5〜1.5μg/mlの用
量での30分〜２時間の予備培養も、50％よりも高い抑制
を生じた。百日咳毒素を検定の初めまたは検定開始後に
加える時には、抑制効果の漸減があった。検定を開始し
てから１〜２時間後に、PTは、観察された運動性に対し
て最小限の効果を有していた。

PTの用量応答は、G_iおよびG₀タンパク質の場合のPTの
前記抑制量と一致した。時間経過は、PTを不適当な用量
で加えるかＧタンパク質部位を飽和するのに不十分な時
間加える時にははるかに減少された抑制を示した。従っ
て、本試験で得られたデータは、AMFが細胞を活性化す
るためにＧタンパク質を必要とする受容体を通して細胞
運動を刺激するという仮説と一致した。

コレラ毒素用量応答および時間経過：百日咳毒素と対照
的にコレラ毒素（CT）は、第二メッセンジャー、cAMPを
産生するためにアデニル酸シクラーゼを刺激するG_sタン
パク質に作用すると考えられる。コレラ毒素を、フラス
コ中での一晩の培養のために、または走化性検定開始前
の可変期間の予備培養のためにA2058細胞に加えた。コ
レラ毒素の試験用量は、約0.1〜50μg/mlであった。試
験されたすべての用量において、細胞生存率は、未処理
細胞の生存率（＞90％）に匹敵した。次いで、処理細胞
および未処理細胞をA2058ならし培地に対する走化性応
答に関して試験した。

抑制効果は決して完全ではない（抑制率30〜60％）
が、CTでの一晩の処理は、A2058ならし培地に対する応
答を減少した。細胞を走化性検定の開始直前の短期間の
予備培養のためにコレラ毒素にさらすならば、抑制は、
最小限であった（＜５％）。

細胞運動に対するアデニル酸シクラーゼ系に包含される
他の薬剤の効果：コレラ毒素は、アデニル酸イクラーゼ
を刺激することができる活性配置でG_sタンパク質のADP
リボシル化によって作用すると考えられる。A2058細胞
運動に対するコレラ毒素の効果が最小限であるので、更
に他の試験を実施して、cAMP経路に作用する他の薬剤が
抑制性であるかどうかを測定した。フォルスコリンは、
媒介Ｇタンパク質を通して作用せずにアデニル酸シクラ
ーゼを直接刺激する。cAMP類似体、８−Br cAMFは、そ
のままの細胞に入ることができる。両方の化学薬品を、
フラスコ中での一晩の培養のために、または走化性開始
前の２時間の予備培養のためにA2058細胞に加えた。両
方とも、比較できる時間コレラ毒素の抑制と本質上同一
である細胞運動の部分抑制のみを示した。

これらの細胞は血清を含まない培地中で集密的細胞を
培養することによって得られたならし培地の各種の濃度
に対する用量依存方式で応答するので、運動性因子は、
細胞に由来すると結論づけられた。修正ボイデンチェン
バー実験で得られた結果は、本発明の自己分泌因子が走
化性（指向性）とケモキネシス性（ランダムに運動性）
との両方を有することも実証する。ランダム刺激が有向
運動性よりも約３倍大きいことが見出されたので、細胞
は、運動性因子の勾配並びに誘引物質の高い均一濃度に
応答すると結論づけられた。

ゲル濾過およびゲル電気泳動によって測定する時に
は、本発明の移動刺激物質は、分子量約54キロダルトン
を有することが見出された。この形態は、活性因子の前
駆物質であってもよい。細胞成分または血清成分は、運
動性因子の作用を活性化または抑制することが可能であ
る。運動性因子は、連鎖球菌性プロテアーゼへの露出に
よって不活性化されるが、活性キモトリプシン由来フラ
グメントは産生できる（データ示さず）。活性は沸騰に
よって破壊されるが、56℃への露出時には安定である。
追加的に、活性は、pH範囲４〜11に安定である（データ
示さず）。これらの性質は、本発明の自己分泌物質（AM
F）が各種の既知の成長因子および化学誘引物質とは異
なることを示す。また、既知の成長因子、例えば、PDG
F、αTGF、βTGF、EGF、IGF、トランスフェリンまたはF
GFは、AMFを置換または遮断しないことが見出された
（データ示さず）。アミノ酸分析は、AMFの19個のアミ
ノ末端アミノ酸の独特の配列順序を示した。わずかに小
さい形態の活性物質も、独特のアミノ末端配列順序を有
することが見出された。タンパク質データベース検索
は、かかる配列順序を有する他のポリペプチドを示し損
なった。

また、AMFによる運動性誘導は、既知の成長因子また
は血清因子によって遮断または置換されないことが見出
された。1nM以下の濃度においては、AMFは、乳癌細胞の
ランダム運動性および有向運動性を顕著に刺激するが、
白血球における運動性を誘導し損なう。また、因子は、
乳癌細胞および黒色腫細胞によるランダム偽足産生を刺
激した。活性ラス腫瘍遺伝子でのトランスフェクション
後、AMFおよびその受容体は、或る細胞中で100倍以上に
高められる。ヒト乳癌細胞（正常な胸上皮はそうではな
い）は、多量のAMFを産生する。AMFを認識する抗体は、
腫瘍細胞生存率を変えずにヒト腫瘍細胞運動性を生体外
で壊滅する。

単離精製自己分泌ポリペプチド腫瘍運動性因子の入手
性は、前記運動性因子に対して特異的な結合親和力を有
する抗AMF抗体を得ることを可能にする。かかる抗体
は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかで
あることができ且つ技術上周知の標準技術ルートによっ
て産生される。また、かかる抗体は、好適な放射性同位
体または蛍光体および他のマーカーまたは配位子で標識
でき、ヒト組織または体液中のAMFの検出、定量化およ
び／または局在化に使用できる。更に、未標識AMFと一
緒の放射能標識AMFは、AMF受容体量を測定するために標
識競争検定で利用できる。受容体量を測定するためのか
かる結合検定は、次の通り実施する。

AMF結合検定： 標準バイオ・ラッド酵素ビード法を使用して、精製AM
Fを単離する。増大量の標識AMFを100倍過剰の冷競合体
の存在または不在下で100,000個のA2058黒色腫細胞を有
する1mlの容量中で培養する。培養を37℃で40分間実施
し、細胞結合放射能を遠心分離によって分離する。AMF
結合は、80％特異性結合および約30,000個の受容体／細
胞での飽和を示す。標準法に係るスキャッチャード分析
は、約0.5nMの範囲内の概算kdで特異的に結合／遊離の
比率と特異的に結合されたAMFとの間に線形関係を示
す。

また、ヒトにおける癌の検出は、本発明によって可能
にされ且つ膀胱癌患者からの尿試料を使用して、この目
的での人体試料の試験を今や例示する。

膀胱癌の患者からの尿試料を捕集し、10キロダルトン
の排除フィルターを有する遠心マイクロコンセントレー
ター（AMFICON）で処理する。処理された尿をpH7.5の無
菌ホスフェート緩衝食塩水で10倍の濃度で再構成し、使
用するまで−20℃で貯蔵する。１〜３のスケールを使用
して、腫瘍等級を病理学者によって決定する。等級１の
腫瘍は最も大きいデイファレンシエーションを示し、等
級３の腫瘍は最も小さいデイファレンシエーションを示
す。膀胱腫瘍をアメリカン・ジョイント・コミティーTN
Nクラシフィケーションに従って段階づける。

尿試料の検定： AMFに応答するいかなる細胞系も使用できるが、好ま
しい細胞系は、ヒトMDA435細胞（ATCC）である。濃縮尿
試料を前記のようなミクロウェル移動チェンバー検定に
適用する。各試料をヒト腫瘍AMFに対して方向づけられ
た抗体の添加の有無で一連の希釈度で試験する。AMF単
位は、抗体によって抑制された試料によって移動するよ
うに刺激された腫瘍細胞の割合と記録する。一般に、80
％よりも高い刺激移動は、約10μg/mlの抗体濃度によっ
て抑制される。

表３に示すように、腎石などの非新生物障害を有する
コントロール尿は、有意量の運動性因子を含有し損なっ
た。膀胱移動上皮癌症例のすべては、尿で正の運動性応
答を示した。最高量の運動性因子産生が、高等級腫瘍ま
たは段階Ｄ（転移）腫瘍を有する患者の尿に見出され
た。 表３ 尿試料 AMF単位 SE １ コントロールks75 ５ 0.5 ２ コントロールks76 ９ ２ ３ 上皮内癌 32 ５ ４ 乳頭状TCC 64 ８ ５ TCC77 44 ３ ６ TCC69 98 14 ７ TCC73 123 32 ８ Recur TCC79 130 22 ９ TCC II485 169 14 10 TCC II491 105 ８ 11 TCC II554 41 12 12 TCC III457 72 ６ 13 TCCstgD584 234 25 TCC＝膀胱の移動上皮癌 Recur TCC＝再発TCC TCC II＝等級II TCC III＝等級III TCCstgD＝転移TCC KS＝腎石 SE＝標準誤差 AMF単位とは、フィルターあたりの全移動細胞数から、
抗AMF血清存在下でのフィルターのあたりの前移動細胞
数を差し引いた数をいう。

勿論、AMFに対する抗体は、AMF活性を遮断または抑制
し、それによって、腫瘍細胞運動に依存する腫瘍侵入ま
たは転移増殖を阻止するために使用できる。また、かか
る中和抗体の入手性は、乳癌、黒色腫などの状態に罹患
したものに有効量のAMF−抗体を投与してこれらの状態
が進行するのを防止することによって、乳癌、黒色腫な
どの状態を治療することを可能にする。癌および転移を
治療するための医薬組成物は、腫瘍細胞の運動を抑制す
るのに有効な量のAMFに対する中和抗体および生理食塩
水、無毒緩衝剤などの製薬上許容可能な担体を単純に配
合することによって調製する。

また、腫瘍攻撃性および／または転移活性を検出する
ための手段は、（ａ）AMFに対して特異的な結合親和力
を有する抗体；（ｂ）標識AMF;（ｃ）体試料におけるAM
Fおよび／または受容体活性を測定するためのキットに
与えられた抗体およびAMFを利用する試験を実施するた
めの教育材料および未標識AMFを含有する別個の容器か
らなるキットによって今や可能にさせる。ミクロタイタ
ープレート、ミクロピペット、抗体タイターを読み取る
装置などのアクセサリーは、通例、かかるキットに見出
され且つ便宜上本発明のキットに組み込んでもよい。

要約すると、本発明は、腫瘍細胞侵入を制御する機構
を理解するための新しい道具を提供し且つ癌診断および
治療のために新しい戦略を開く。上皮細胞は、通常、侵
入挙動を示さない。ここに記載の運動性因子は、正常な
白血球の移動に影響を及ぼさない。それゆえ、本発明に
記載の因子を抑制することを目的とする治療薬は、正常
な休止期の組織に対して低い毒性を有しているべきであ
る。腫瘍細胞の侵入を抑制し且つその場から侵食癌への
転移を防止する本発明に従って得られた薬理学的製剤
は、効力ある癌阻止剤であることができる。また、転移
が成長する時に局所的に侵入することが必要であること
があるので、腫瘍侵入の抑制剤は、確立された転移の成
長を防止することができる。更に、かかる薬剤は、腫瘍
脈管形成を抑制することがある。運動性因子またはそれ
らの受容体に対する抗体は、組織免疫組織学、ラジオシ
ントグラフィー、または血清免疫検定によって適用して
転移を局在化し且つ個々の患者における癌攻撃性を予測
することができる。遺伝子製品として、自己分泌運動性
因子またはそれらの受容体は、新しい種類の腫瘍遺伝子
を規定する。患者の腫瘍中のこれらの遺伝子の表現水準
は、体試料中のAMFの量を監視することによって重要な
診断情報を与えることがある。

勿論、侵入およおび転移は、癌治療の失敗の主原因で
ある。本発明は、（ａ）予備侵入病変を検出し且つそれ
らの進行を防止し；（ｂ）患者の腫瘍の攻撃性を正確に
予測し、且つ（ｃ）微小転移巣を同定し且つ根絶するた
めに新しい臨床的戦略を提供する。腫瘍侵入の少なくと
も理解された面の１つは、腫瘍細胞移動である。本発明
は、腫瘍細胞運動性因子の役割の測定を可能にする。

ここに記載の例および態様は例示の目的のためのもの
であること、およびそれに徴して各種の修正または変更
は当業者に示唆されであろうし且つ本願の精神および権
限および添付請求の範囲の範囲内に包含されるべきであ
ることが理解される。

フロントページの続き (72)発明者 シッフマン，エリオット アメリカ合衆国メリーランド州、シェビ ー、チェイス、ピックウイック、レイ ン、3207 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ，83（1986），ｐ. 3302−3306

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】癌を有すると疑われる患者から取り出した
   体試料を自己分泌腫瘍運動性因子（AMF）感受性細胞系
   と接触させてAMF感受性細胞系の運動性を測定するこ
   と、および（２）AMF抗体を含む抗血清と体試料とを反
   応させたものをAMF感受性細胞系と接触させてAMF感受性
   細胞系の運動性を測定すること、を含むヒト患者内の癌
   の存在を検出する方法であって、（１）および（２）に
   おいて測定された運動性の差が患者内に癌が存在するこ
   とを示す方法。
2. 【請求項２】体試料が尿である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】癌が尿路の癌である、請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】癌が膀胱癌である、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】癌が移動上皮癌である、請求項１記載の方
   法。
6. 【請求項６】AMF感受性細胞系が、ヒトMDA435細胞であ
   る、請求項１記載の方法。